purificación y propiedades de la nad aldehído
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Tesis de Posgrado
Purificación y propiedades de laPurificación y propiedades de laNAD aldehído deshidrogenasa deNAD aldehído deshidrogenasa de
levadura de panaderíalevadura de panadería(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces cerevisiae)
Schwarcz, Martha Norma
1964
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:Schwarcz, Martha Norma. (1964). Purificación y propiedades de la NAD aldehídodeshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae). Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
Cita tipo Chicago:Schwarcz, Martha Norma. "Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa delevadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1964.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES .
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WPUBIFICACION Y PROPIEDADES DE LA NAD ALDÉHIDO DESÉIDROGENÁSA DE
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RESUMEN
Purificggión de la enzigg.Obtención del polvo cetónico gg levadura: de acuerdo a ln
técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza levedura de panadería (Sachnromyces Cerevisiee) producto comercial,prensado y libre de fécula.
Extracciqnudg_la enzima: con solución de fosfato bipotásico 0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante 5 dias, manteniendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado deamoniaco concentrado.
ggggulgción pqg_gglor de proteina inactiva: se ajusta elpHdel sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico1 My se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamente y se centrifuga.
Precipitación_ágidg¿ sobrenadante de la etapa anterior sele baja el pH a 4.5 mediante el agreg do lento de ácido cítrico1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en elprecipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico0.025 M pH 6.3.
Fraccionggiento salido con sulfato de amonio: se hace me—diante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de seturación. Precipitedo se redisuelve en solución amortiguadorade fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAlmM, pH 7.0.
Filtrggióu a través de gel de dextrgggt Sephedex G-200en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro depotasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer.
Fracciones de mayoractividad especifica se recronatografianpor la misma columna en iguales condiciones.
Propiedadegpde la enzigg.1.- Eggggifieidgd de sustrato: La enzima presenta una es
pecificidad muyamplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1dehidos alifáticos o aroméfiicos. Entre los primeros son oxidardos el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y orotonaldehido; entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido(p-metoxibeqaldehido). Nose oxidan el gliceraldehido, p-dimetilaminobenzaldehidoni el salicilaldehido.
Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensayados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dardo que son inhibidores del sistema enzimática cuandoéste oxidaal acetaldehido.
2.- Especificidad de coenzigg¿ la aldehido deshidrogenasaademás del NAD reduce al NADP, deamNAD, APADy APdeamAD. El
deamNADes el más activo, la velocidad de la reacción es del
88%respecto a.la del testigo con NAD,la del NADPes del 33%,APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos
por el sistema enzinático si bien pueden ser reducidos quimicamente o por acción de otras íeshidrogenasas.
3.- Necesidad de aptivadores de la enzigg: la NADaldehidodeshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximode suactividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacciónes sólo del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia deeisteina l mM.Si en esas condiciones se agrega al sistema enzimático aquellos complejantes de metales que en presencia de cisteina inhiben la acción Catalitica (OP, HOQy DDC)se ve que enausencia de la mismala activan. La adición de cisteina l mMa
una preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramente la actividad, pero no tanto comocuando actúa sola. La activación de la enzima en función de la concentración de OPllegaa un máximo, concentraciones de 0P por encima de ese valor(1 mM)producen inhibición.
El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD.
se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausenciade activador depende de la coenzima presente en el sistema enzimática , así con APADla reacción no se produce, con NADy APdeam ADla velocidad de la reacción enzimática es 9 y con
deanNADes de 18. Los complejantee no tienen el mismo efecto activador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemas enzimátieos a los cuales se agregen tienen distintas coenzimasasí,con HOQse tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (deamNAD), 87 (AIPdeamASD) y 67 (APAD).
El estudio de la cinética de activación indica que la OP
actúa sobre el KNAD,aumentando la asociación de la coenzimaa la enzima.
4.- inhibidores de la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clasesde compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, análogos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sustrato y III) compuestoscuya estructura no está relacinada nicon el sustrato ni con la coenzimu, este grupo comprende: a)sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejoscon metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles.
I) Análogos del NAD.derivados piridinicos y adenílicos:los componentes de la molécula iel NAD,adenina, nicotinamiday sus derivados, asi como los análogos del NAD( ¿PAD, APdean
AD, NABP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibidores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP,ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN,pirofosfato y fosfato nomodifican la velociiad de la reacción enzimática.
II) Inhibición por sustratogy sustancias análogas al sustrato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (glicolaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores delmismocuando se los agrega junto con acetaldehido. El salieilaldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidadoepor la enzima.son inhibidores de la misma, especialmente elúltimo de los nombrados, que cuando se agrega concentración i
gual a la del acetaldehido inhibe el 100%de la actividad. Encambio el glicerqldehido, que no es oxidado, tampoco es un inhibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de estos aldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetaldehido, no revela un comportamiento definido.
III) Compuestoscuya estructura no está relacionada nicon las coenzimgí ni con el sustrato:a) Sustancias comclejantes de metales: la inhibición por agentes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos gcn¿y
metales indica que hay un metal involucrado en la reacción catalizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, eldqrí’-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ningunaacción.
Estudios detallados de la influencia de la OPsobre la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa muestran que esta gustancia produce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversible y otra dependiente del tiempo e irreversible. Tambiénel dietilditiocurbamato produce una inibición irreversible dependiente del tiempo. No se obserVa lo mismo con el zincón.
La inhibición irreversible por OPdepende del tiempo de incubación, del grado de pureza de la preparación enzimática. cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de la temperatura de incubación, aumenta con la misma.
Estudios de protección por distintas sustancias de la inhibición irreversible por OPconducen a los siguientes resultados;la cisteinc. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolino previenencompletamente la acción de la OP; cianuro y EDTAson tambiénfuertemente protectores. De la coenzima. análogos de la mismay mononucleótidos que la componen sólo el PyAlADy el Pynlicxn—ADactúan como protectores, los demás o bien potencian la acciónde la 0P como el NAD. NADP, ADP y APADo no ofrecen ninguna
acción comola adenina. El pirofosfato es ligeramente protector.El único catión que protege totalmente la enzima de la acciónde la 0P es el Zn++3el K+; Rb+ y Sr*+ son algo protectores. Elacetaldehido aumenta lige3amente el efecto inhibidor de la 0P.
Estudios oinóticos de la acción de la 0P, HOQy DDCsobre
los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que lainhibición instantánea es competitiva con el NADy mixta deltipo competitivo-no competitivo con el acetaldehido. La cinética es consistente con la suposición de que se forma un complejo entre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambosestín en relación 1:1.
b) Mxilnmina: la inhibición de lo. NADaldehido deshidrogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NADactúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90%con elAPADo APdeamADpara una concentración de hidroxilamina de 10
mm. En iguales condiciones con el NADo deamNADla inhibición
obserVada es sólo del 15%.E1 estudio cinética indica que la hidroxilanino presenta
una inhibición incompetitIVa respecto de las coenzimas mientrasque para el acetaldehido si la cocnzima es NADo deamNADse ob
serva una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo.casi purzuc¡üe competitivo. mientras que cuando el sistema enzimática actúa con APADla inhibición es del tipo competitivo.
c) Beastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani yMilstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sensible a los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamiento de los complejnntes de metales frente a la acción del o-iodosobenzoato y del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQaufmentan ln sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tioles.
También se vió qué efecto tienen los análogos y componentes del NADcuando se los incuba en presencia de los mismos; el
NAD, NADP, PyAlAD, PyAldennAD y deamNADactúan protegiendo a la
enzima. E1 ABADy APdeanAD, sustancias que se sabe que se combi
nan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan lainhibición por los reactivos de tiolea utilizados. Los uononucleótidos adenilicos AMP.ADPy ATPson protectores, aunque no
tanto comoel dinucleótido; el piridinico es muchomenosefi082.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
.PURIFICACION Y PROPlEDADES DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE
LEVADURA DE PANADERIA ( Saccharomyces cerevisiae )
MARTHA NORMA SCHWARCZ
75m; 1 1 8-1
Tesis presentada para optar al título de Doctora en Química
1964
'El presente trabajo se realizó en el Instituto de QuimicaBiológica de la Facultad deCiencias Médicas de la Universidad de Buenos
Aires bajo la dirección del Dr Andrés O. M.Stoppani quien propuso el tema y a quien estoy profundamente agradecida por su apoyo ydedicación en la conducción del mismo.
Al Consejo Nacional de InvestigacionesCientificas y Técnicas por las becas otorgadas durante los años 1958 y 1959.
Al Dr T. R. Selix del Instituto Nacionalde Microbiologia y al Dr H. Isnardi de laComisionde Investigaciones Cientificas de laProvincia de Buenos Aires, por haber autorizado al Sr. T. Giovambatista, quienes realizaron los estudios de ultracentrifugación.
A las señoritas Lilia B. Viñas y MariaInés Tassara y al Sr Alberto Schwarcz la ayuda prestada en la preparación de los originales.
CAPITULO I
INTRODUCCION
Las aldehido deshidrogenasas catalizan un conjunto de reacciones que se pueden resumir en la siguiente ecuación:
n-cso + PN++ AH R-COA + PNH + H+
en el cual PNrepresenta al piridin nucleótido.De acuerdo a la naturaleza de A se puede dividir a estas
enzimas en tres grupos; I) A = OH, es decir el término AHrepre
senta H20. Históricamente la primera aldehido deshidrogenasa caracterizada es la aislada por Racker, a partir de higado de vacuno (4); esta enzima unida al NAD_oxidauna serie de aldehidosalifáticos y aromáticos. el sistema no es activo con NADP,es estimulado por mercaptanes y EDTA.De higado de conejo se han aislado dos aldehido deshidrogenasas que se asemejan por su ampliaespecificidad de sustrato, pero se diferencian en su sensibilidad hacia los esteroides, solubilidad en soluciones salinas yefecto que sobre ellas produce el ión magnesio (91). A partirde levadura se han preparado dos aldehidos deshidrogenasas depropiedades bien diferenciadas; una activada por potasio o rubidio (2) puede actuar ya sea con NAD como con NADP, aunque con
esta última la reacción es muchomás lenta, ademásnecesita cisteina para desarrollar totalmente su actividad; la otra activadapor magnesio o calcio (3) es especifica para el NADP.También seincluyen en esta categoria a las semialdehido deshidrogenasas,entre las queise.encuentran las succinico semialdehido deshidrogenasas, enzimas especificas de la oxidación del semialdehidosuccinico a ácido succinico, aisladas a partir de bacterias(93) o de cerebro de mono (93), y la malónico semialdehido CoAdeshidrogenasa presente en el Clostridium kluyveri. La aldehidodeshidrogenasa aislada de Pseudomonasfluorescens (92) tieneuna amplia especificidad de sustrato, requiere arsenato o fosfato para su actividad asi comotambién un mercaptan; el producto final es el ácido libre. II) A a fosfato, arsenato o mercaptán. A este grupo pertenece una enzima aislada del Clostridiumkluyveri (94) que cataliza la oxidación dependiente delNADy de CoAde varios aldehidos alifáticos dando comoresultado la formación del derivado acil-CoA respectivo; la formaldehído deshidrogenasa de higado de vacuno (95) que cataliza la oxidación del formaldehído en presencia de glutation dando como
producto S-formiglutation y la aspártico ssmialdehido deshidrogenaaa de levadura (103) que cataliza 1a conversión de L-aspárticofi-semialdehido a fi»aspartilfosfsto, ligado a fosfato inorgánicoy NADP.III) Aquellas enzimas que combinan otra función con lasarriba mencionadascomopor ejsmllo la decarboxilación'oxidativadel semialdehido malónico (96): la enzima es especifica para laoxidación y decarboxilación del semialdehido malónico a acetilCoA, reacción que necesita 00A y NADo NADP.
La reacción se puede representar por:
9OOH 983
(¡mz + COASH + m1" a COSCoA + 002 + PNH + H+CHO
La enzima no actúa ni sobre el malonil-COA, ni sobre acetaldehido.
Ninguna de las aldehido deshidrogenasas descriptas se obtiene suficientemente pura comopara poder estudiar en forma adecuada el mecanismode la reacción que catalizan; por lo tanto parapoder esbozar un mecanismo común de acción de todas las aldehidodeshidrogenasas debe tenerse en cuenta las propiedades comunesa todas ellas. Estas propiedades, que si bien no han sido ensayadas 001 todas las enzimas disponibles pertenecientes a estegrupo, son comunes a un número de ellas; son las siguientes;1) Transferencia directa del hidrógeno del sustrato al piridinnucleótido siendo la mismaestereoespecifica para la posición mdel anillo nicotinamida (88, 89).2) Grupos sulfhidrilos. Todas las aldehido deshidrogenasas ensayadas son inhibidas por una serie de reactivos de grupos tioles.No todas reaccionan de la misma manera, algunas son más susceptibles que otras, y no todos los reactivos tienen el mismoefecto siendo algunos más inhibidores que otros. Ademásalgunas delas enzimasnecesitan sulfhidrilos exógenospara desarrollar suactividad, mientras que otras son estimuladas por los mismos; esde suponer por lo tanto. que estas enzimas tienen grupos sulfhidrilos cuya destrucción conduce a la inactivación de las mismas.
Las causas por las que al oxidarse o bloquearse los grupostioles, disminuye o desaparece la actividad de la enzima son varias; se pueden producir cambios en la estructura secundaria oterciaria de la proteina, el grupo unido al sufhidrilo puede ejercer efectos estéricos o quimicos sobre el centro activo o
bien se puede destruir un sulthidrilo presente en el centrode unión del sustrato o la ooenzina. por lo tanto el hecho deque las enzimas sean sensibles a los reactivos de tioles noes una evidencia suficiente para afirmar de que éstas tengan grupos tioles en el centro activo.
La protección de 1a enzima frente a la inhibición por reactivos de tioles por los sustratos que intervienen en la reacciónse puede interpretar postulando que esos últimos tienen mayorafinidad por un sulfhidrilo particular que el inhibidor. Se sabeque tres aldehido deshidrogenasas de higado de Vacuno y de levadura son protegidos por los piridin nucleótidos especificosde la reacción (6, 72),así la enzima de leVaduraiespecifica para el NADes protegida solamente por el NADy no por el NADP,
en cambio la de higado. que puede actuar con ambos, es protegida tanto por el NADcomo por el NADP.El grado de protecciónvaria con la enzima y el inhibidor (6, 72).3) Inhibición por arsenito. El arsenito es un inhibidor de lasaldehido deshidrogenasas a una concentración relativamente bajapero solamente en presencia de mercaptanes exógenos; la inhibición desaparece por adición de dimercaptanes, pero no en presencia de monomercaptanes(92). Está claramente establecido que elarsenito forma un complejo relativamente no disociable con grupos sulfhidrilos situados muycerca en sistemas de .cetoácidooxidasas ligadas a ácido lipoico. En base a estas obserVacionesse sugiere que la acción inhibidora del arsenito sobre las aldehido deshidrogenasas se debe a que se combina con dos grupos-SH muycereanos, necesarios para la actividad de la enzima.Comose sabe que en estas enzimas no hay ácido lipoico se postula que los grupos sulfhidrilos involucrados están muypróximosunos a otros comoconsecuencia del enroscamiento de la cadena
proteica (104). La necesidad de mercaptanes exógenos para lainhibición por arsenito, se explica suponiendo que estos reduciwrian una unión disulfuro previamente a la adición del arsenito.
De esto se puede deducir en forma razonable que la actividad enzimática no tiene que depender necesariamente de la secuencia de aminoácidos de la cadena lineal, sino que puede estarpresente en centros que se encuentran próximos en virtud a laforma helicoidal de la cadena proteica. Por lo tanto la neutralización de un grupo -SH o la ruptura de un puente disulfuro
alejados del centro activo puede resultar en un cambio de laconfiguración de la proteina, siendo la nueva configuraciónde la mismacataliticamente inactiva.4) Inhibición por concentraciones relativamente bajas de aldehido. Este efecto se puede explicar comodebido al bloqueo degrupos sulfhidrilos necesarios para la actividad enzimática,por el exceso de aldehido que sirve de sustrato para la enzimacorrespondiente (88, 92). El hecho de que aparezca un máximoen las curvas de actividad en función de la concentración desustrato, se puede deber a la formación de dos compuestos enzima-sustrato. El primero, activo. constituido por una moléculade acetaldehido, por cada centro activo de 1a enzima; el segun
dojinactivo, formado por dos moléculas de acetaldehido por centro activo de la enzima (40); la segunda molécula de acetaldehido bloquearia un grupo esencial para la actividad de la enzima.
5) Enzima, piridin nucleótido y aldehido forman un complejoternario activo. Se ha estudiado la cinética de oxidación de aldehidos por cuatro enzimas asociadas con piridin nucleótidos,tres de las cuales se obtienen a partir de Pseudomonasy sonespecificas para el semialdchido succinico (93, 99); la otraaislada de levadura oxida aldehidos alifáticos de bajo peso
molecular 69). Los resultados obtenidos son consistentes conla formación de un complejo ternario. enzima, coenzima y sustrato, comoparticipante activo; se excluye la existencia deun complejo binario.
No exhne una evidencia directa que permita postular laformación ordenada del compuesto ternario. El argumento a favor de un mecanismo de orden ¿ompulsivo se basa en el hecho deque muchas de las aldehido deshidrogenasas deben incubarse conpiridin nucleótido previamente a la adición del sustrato comoes el caso de las aldehido deshidrogenasas de Pseudomonas. Sinembargoeste requisito puede deberse solamente a la naturalezainhibidora de los aldehidos que al combinarse con un sufhidri-.lo de la enzima.necesark>para su unión con la coenzima, inhiben la reacción. La preincubación con piridinnucleótido proteygeria a la enzima de la formación de hemimercaptales inactivoscon el sustrato.
De acuerdo con las propiedades enumeradas y teniendo encuenta la gran reactividad de los grupos sulfhidrilos con aldehidos Yacoby (97) propone el siguiente esquema para representarel mecanismode acción de las aldehido deshidrogenasas:
oH oH |SH R-CHO--Ï-g-S-Ii->G—S-Ó—R -C—R s-c-a
Ï 4*
-——-——% H i (III)PN N PNH
(I) (HI; | íH o I-R-GOQH2 ,L ..;.RI-5H‘* .AÑ\/._/«_a—-*
r-—SH IIR-COOH + L- Rï-S-C-R
'--PNH.(IV)
Es decir, postula la formación de un tiohemiacetal enzimático (II) por la adición directa de un aldehido a un grupo tiolde la enzima o por intercambio con un intermediario del tipode tiohemiacetal que se forma entre glutation y aldehido. Comoresultado de la oxidación se formaría un éstertiólico de la proteina (III) el que puede romperse ya sea por hidrólisis o poracción de un mercaptan (por ej. glutation o CoA) para formarla enzima reducida (IV) y el producto respectivo ya sea el ácido libre o el éster tiólico del mismo.
Una omisión de este esquema cs que no explica le funciónde los dos grupos sulfhidrilos situados muypróximos entre si.A pesar de que el arsenito y el aldehido compiten por el mismocentro de la enzima, sugiriendo que existe una relación entre la oxidación del aldehido y la inhibición por arsenito, sedebe tener en cuenta que ésta última sólo tiene lugar en presencia de un mercaptan exógeno mientras que la actividad oxidantede la enzima, en muchos casos, se evidencia en :usencia delos mismos. Una forma de eXplicar este efecto es que el sulfhi
drilo exógeno rompa un puente disulfuro de la proteina dandogrupos tiolcs libres, uno de los cuales estaria disponible paracombinarse con arsenito el cual se uniria además con el sufhidrilo de la proteina involucrado en la formación del tiohemiacetal (97). Nirenberg y Jacoby (86) proponen otra explicaciónpara el papel de los dos grupos sulfhidrilos próximos de laproteina, que implica la formación de un compuesto intermedio
enzima-ortoácido.
r--NA.DP NABP vam + NADP—-SH Boi“? s-p-R —-—> S-‘Ï-R :1) s.\ ,R
. OH OH ,‘c\SH SH s OH
B c D
NADPH, Héo r-—NADPH +1,20 l___¿> ______;
H -R—Coorf t SH—R—COOH
S-g-R SHE o F
SHA
Este mecanismono puede diferenciarse experimentalmente delanterior en el que participa un sólo grupo tiol, y es el tiohemiacetal formadoel que se oxida directamente a tiol-éster.
Por su parte Hacker, estudiando las propiedades de la 3-fosfogliceraldehido deshidrogenasa (100) observa que cuando se agrega NADa la enzima, se produce un cambio espectral con un má
ximo en 360 mu, que coincide con el valor hallado por Van Eysy Kaplan (101) para el complejo NAD-glutation, compuesto que seobtiene en forma no enzimática; Si en esas condiciones se agregan al sistema reactivos de tioles, iodoacetato o p-cloromercuribenzoato o el sustrato, desaparece 1a banda de absorción a 360 mu(102). El cambio de abosrción por agregado de coenzima se interpretó comoresultado de la formación de un complejo entre elNADy los grupos sulfhidrilos de la enzima. El primer paso de laadición de sustrato seria una "aldehidólisis" de la unión NAD
SH, con la formación directa de 1a coenzima reducida y de untiol-éster sobre la enzima, mecanismoque se puede esquematizarde la siguiente manera:
PN r-PNH PNH
+ R-CHO hs-g-rz Hzo ama-00011
Este tipo de mecanismosupone el ataque de un azufre electronegativo sobre el C electropositivo del carbonilo. La necesidad dealgunas aldehido deshidrogenasas de ser preincubadns con NADantes de la adición de eldehidos y la protección de las enzimas
por la coenzimacontra_la inhibición por los reactivos de tioles)están de acuerdo con el concepto de aldehidólisis.
Los resultados obtenidos por Stoppani y Milstein (72) estánen total desacuerdo con estos mecanismos dado_que si estos secumplieran con las aldehido deshidrogenasas estudiadas por ellos,el sustrato tendria que ser capaz de preservar a la enzima enforma efectiva de la acción inhibidora de los reactivos de tioles.
En las tres enzimas ensayadas, dos de levadura y la tercera de higado de vacuno, se ha demostrado la presencia de sulfhidrilos esenciales (72); en ningún caso el acetaldehido fue capazde una protección general frente a todos los reactivos de tioles.
Sólo frente a algunos, la acción protectora del sustrato sobre la enzima de higado fue suficientemente significativa. Encambio los resultados obtenidos con NADy NADPaldehido deshidro
genasas de levadura son bien concluyentes especialmente si setiene en cuenta los valores de las constantes aparentes de Michaelis del complejo enzima-sustrato que,siendo del orden de 10'.5 Mindican que la reacción está netamente desplazada hacia la formación del complejo enzima-sustrato. Más aún, los valores de lasconstantes aparentes de Michaelis para el complejo enzima-coenzima son del orden de 10-4M,sin embargo siempre protegieron a laenzima frente a los reactivos de tioles ensayados.
Los experimentos cinéticos realizados con la NADaldehidodeshidrogenasa de leVadura por Stoppani y Milstein (40) conducena dos posibilidades respecto a la acción del acetaldehido, siendo el resultado final de ambosun complejo ternario activo. Laprimera posibilidad seria que los compuestosbinarios enzima-acetaldehido y enzima-coenzima se formaran independientemente, prevaleciendo para el sistema condiciones de equilibrio. Estos compuestos binarios formarian a su vez el complejo ternario, uniéndose al sustrato o a la coenzima a igual velocidad que la enzimalibre.
La segunda posibilidad, que requiere condióiones de flujoestacionario y coincidencia en algunas constantes, sería que elacetaldehido se uniera al compuesto enzima-NAD,porejemplo através del NAD,proceso que se puede esquematizar de la siguiente manera:
HO OH 0 .OH\ /0/ -———> ¡1+ + \CH/\ “_ / \CH H CH
3 3
4 H '*
’ CONH
í i 2Ü J
N-HS-E
v á
OH
H_ H H‘ .. (i; x\ /\)\ f. 3
/9H ICONHQ ¿5' ._CONH2
° =°.., + ii ll .P- ¡I ¡ECH3 fl I; : :\
IÏ-HS-E x — HS -ER R'
En un primer paso, la forma aniónica del hidrato de aldehido se uniría al compuesto enzima-NADa través de la coenzima,ya que el acetaldehido en solución acuosa, a temperatura ambientaestá hidratado en un 60%aproximadamente y el hidrato está enequilibrio con su forma aniónica en solución de pH alto.
En el presente trabajo se continúa con la investigacióndel centro activo de las tres aldehido deshidrogenasas en estudio en este laboratorio; NAD(2) y NADP(3) aldehido deshidrogenasas de levadura y NADaldehido deshidrogenasa de higado devacuno (4).
Comose conoce que una serie de deshidrogenasas ligadasa piridin nucleótidos; alcohol deshidrogenasa de hígado y delevadura, glutámico deshidrogenasa de higado y láctico deshidrogenasa de músculo de esqueleto de conejo (27) contienen
cinc comocomponente estructural y funcional, se pensó que otras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido podrian contener un metal en su centro activo o manteniendo la estructura activa de los mismos. Por ello se ensayóla presencia de metal en las tres enzimas.
Uncriterio funcional para determinar si ciertos gruposde la enzima son necesarios para su acción catalitica, es verqué efecto producen sobre la actividad enzimática reactivos que
se conocen que actúan especificamente sobre el gripo en estudio.En base a esto se ensayo el efecto que tienen una serie de agen
tes orgánicos e inorgánicos eapaces de formar complejos coniones metálicos, sobre las aldehido deshidrogenases en estudio.
Se completó además el estudio de las progiedides de laNADaldehido deshidrogenasa de leVadura en relación a 1) especificidad de sustrato, 2) especificidad de coenzima, 3) necesidadde activadores de la enzima, 4) inhibidores de la reacción, entre los que se encuentran análogos del NAD,derivados piridinicos y adenilicos, sustratos y sustancias análogas al sustrato,sustancias complejantes de metales, hidroxilamina y reactivosde tioles. .
En base a los resultados obtenidos se pudieron sacar algunas conclusiones sobre; grupos esenciales de la enzima y lacoenzima, mecanismo por el cual actúa la cisteina y mecanismode la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.
HAB
NADH
NADP
AMP
ADP
ATP
Nm:deamNAD
AÏñD
¿PadáEAD
PyAlAD
PyAldeathIrisOP
OHQ
DDC
BAL
EDTA
DEAE- celulosa
TEAE- celulosa0M - celulosa
ABREVIATURAS
:Nicotinamida udenina dinuoleátido:Nicotinamida adenina dinucleótido reducido:Niootinamida adenina dinuoleótido fosfato:Adenosina monofosfato:Adenosina difosfato:Adenosinatrifosfato:Niootinamida mononucleótido
.:Desamino NAD
:3 aoetilpiridina AD ,:3 acetilpiridina desamino AD:Piridina 3 aldehido AD
:Piridina-3-aldehido desamino AD:2-amino-2-hidroximetilprOpane-l,3-diol21,10 - fenantrolina:8 —hidroxiquinolina:Dietilditiocarbamato:Dimercaptopropanol:Etilendiaminotetraacetato:Dietilamino otil-celulosa:Trietilamino etil-celulosa:Onrboximetil-celulosa
CAPITULO II
MATERIALES Y METOH)S
MATERIALES l
NADy NADH(95 % de pureza) de Sigma Chemical Co.
NADE:(90 % de pureza) de Sigma Chemical Co.Tris: de Sigma Chemical Oo. Tris 7-9
Olorhidrato de cisteina: de la British Drug HousesLtd.01K: de The Coleman and Bell Co. I
Acetaldehido: de la British Drug Houses Ltd.Análogos de NAD:de Pabsm Laboratories Co.
Nucleótidos: de Sigma Chemical Oo. lEDTAy Azida Sódica: de British Drug Houses Ltd.Glicina y Histidina: de Eastman Kodak Co.
Glicil-glicina y Diglicil-glicina: de Hoffman-LaRoche1,10 fenantrolina: Fluka A.G.8 hidroxiquinolina: de RiedelltDietil ditiocarbamato: de B.D.H.
Cupferrón: de la Eastman Kodak Co.Md'-dipiridilo: H;M.ChemicalCo.,grado PHidroxilamina: Anular 4Oxido de melarsen: Mhyy Baker Ltd.;Dagenham,InglaterraSephadex: de Pharmacia Uppsala Sweden
G-25;coarse,Lot No To 8024 0, Wr: 2,5 gffl2qfig.de gel secoG-50;medium,Lot N° To 8341 M, Wr: 4,7 g,E20/g.de gel seco
G-75;medium,Lob N° To 8869 M, wr: 7,3 g.H20/g.de gel secoA-25;finc,Lot N° To 6891 F, Capacidad 2,9 m.cq/g
A-50gmedium,Lot N° 5307874M Capacidad 3,9 mcg/g
G-lOO,140-4OO mesh Lot N° mo 33,w;-: 10 g Ego/gnc gel seco
G-200,40—400mesh Wr: 20 g.H20/g.de gel secoO-iodosobenzoato preparado según Askenasy y Meyer
Oxido de melarsen: May y Baker,Ltd I \Adenina: Nutritional Biochemicals Corporation.Piridina: Merck
BAL: de Boot Pure Drug Co.Nottingham.
Levadura de panadería (Sacharomyces cerevisiae) producto comer
cial prensado y libre de fécula obtenida de 1a Cía.Argcntina deLevadura E.N.
METODOS
Medición de la concentragiégfprotéiqg: Se midió espectrofotométricamente a 280 mAcon corrección para ácidos nucléicos segúniWarburgy Christian (1).
Medición de EH: Se le hizo potenciométricamente utilizandoindistintamente los aparatos de Beckman,modeloH2 y Metrohm,modeloE 166. Las mediciones de pH de extractos enzimáticos se hicieron
colorimétricamonte por comparación con las soluciones buffer deSürensen, utilizando rojo de fenol (pH 6.3-8.0) comoindicador.
Medidasggpectrofotométricas: Se utilizó un espectrofotómetro Beckman,modeloD.U. provisto de cámara termostatizada,coneo—
tado a un potenciómetro (10 m V) registrador Leeds y Northrup"Speedomax", modelo G.
Oentrifugación en 35i938eutilizó una centrífuga refrigerada de la International Equipment Co. modelo PR-2, provista delrotor 840a.
ggperiencias de electroforesis libre:Se llevaron a cabo enun aparato de electroforesis libre del tipo ideado por Tiselius,fabricado por Perkin-Elmer Corp.,modelo 38 A,utilizándose la celda de 2 ml de sistema abierto.
Egggrioneia de ultracgntrifugación:8e lleVaron a cabo en unaultradontrifuga Spinco ModeloE.,rotor AN-D.
Determinación de lq‘_actividades enzimáticas: Las actividades de las deshidrogenasas se midieron por la velocidad de reducción del NADo NADP,medida con el espectrofotómetro, en celdas
de corex de l cm.de espesor óptico, a temperatura ambiente (l7°25°) siendo el volumen final de la mezcla de reacción 3.0 ml.Sotoma comocororla densidad óptica del blanco (mezcla de reaccióncon todos los componentes menos el aoetaldehido) y la reacciónse inicia añadiendo el acataldehido; a partir de ese instante semide el aumento de absorción cada 10-30 segundos.La medida dela NADaldehido deshidrogenasa de levadura se realiza según'
Black (2). La concentración final de los_reaetivos es la siguiente: Tris 0.1M, pH8.0; NAD;0.45 mM;01K 0.05 M;cisteina 0.001 My acetaldehido 17 x 10_5M. La medida de la NADPaldehido deshi
drogenasa de levadura se realiza segun Seegmiller (3) si bien laglicil-glicina se sustituye por Tris. Cohpentracionesfinalesusadas son: Tris 0.915 M, pH 7.7;012 mg 0.015 M;NADP0.12 mMyacetaldehido 0.5 mM.
La medida de la DPNaldehido deshidrogenaea de higado, se
efectúa según Racker (4), con las siguientes concentraciones finales: pirofosfato 0.01 M, pH 9.3, NAD0,45 mMy acetaldehido3.5 mM.
Determinación del acetaldehido (5): Aldehidos pueden ensayar
se espectrofotométricamente con enzimas relacionadas con NAD,mi
diendo la absorción del NADHa 340 mk. Se usó indistintamente laNADaldehido deshidrogenasa de higado o de levadura. Cantidadde acetaldehido a agregarse debe estar entre 0.02 y 0.4 micromo
les; las lecturas de densidad se hacen hasta que la reacción sedetiene. Los cálculos se hacen teniendo en cuenta que la oxidaciónde 0.1 micromoles de acetaldehido producen un cambio de la densidad óptica de 0.21.
Métodosgenerales de inhibición y protección de las deshigrgggnggag: En los experimentos de preincubación de la enzima conlos complejantes de metales se procede de la siguiente manera.En un tubo de ensayo pequeño se coloca Tris 0.1 M; pHBO; ClK0.05 M, el complejante de metales en la concentración que se
indica en cada caso,agua destilada hasta completar un volumen de0.5 m1 y por último la enzima. A1 cabo del tiempo indicado, me
dido con cronómetro a partir de la adición del extracto enzimático, se toman alicuotas de 0.02 ml que se diluyen en la mezcla
utilizada para medir la actividad enzimática de cuyos componentes solo falta el acetaldehido.Cuando se trabaja con reactivos de
tioles se procede de la mismamanera,solo que los tubos de incubación no tienen cloruro de potasio. En cada caso se hace un
testigo que se incuba en las mismas condiciones pero sin complejante de metales.
Las actividades (V) se expresan comovariación de densidadóptica a 340 m/ por minuto «AE340 x 103/min). Comola actividad decrece a través del tiempo (especialmente con la NADaldehido deshidrogenasa de levadura) se representan gráficamente lasvariaciones de absorción (ordenadas) en función del tiempo(abscisas) tomandoel valor de la tangente de la curva en elorígen de coordenadas, comola velocidad inicial de la reacción.
La inhibición (I) de la actividad enzimática se calculacon la ecuación:
1% = 100 (1 — Vi/Vt )
donde Vi y Vt representan las actividades de la enzima en presencia del infiibidor y del testigo‘respectivamente.El error de I, e tI 100 2 2 2 2
eI — /Vt\\V// e Vi+ (Vi.evt/Vt)
y disminuir Vi. LaPuede verse que e disminuye al aumentar Vvelocidad del testigo está limitada por la: concentraciones delsustrato y de la enzima, mientras que la velocidad de la enzima
inhibida está limitada además,por la concentración del inhibidor.
En los experimentos de protección el complejante de metalesse agrega a la enzima en presencia del protector y el porcentaje
de inhibición (I ) se calcula con relación a un testigo tratadocon protector solamente.El porcentaje de protección (P) de la
enzima se calcula de la ecuación p = lOO (IuIP)/Idonde I es la inhibición e I es la disminución de actividad de
la enzimatratada con protector/Ïnhibidor,respecto a la actividadde la enzima con protector solamente.
El error de p,e e = lOO/I e2 i (Ip e2 ) / Ip p IPs Iepaumenta a medida que aumenta I
2
y disminuyeI.Por lo tanto las protecciones observadas frente areactivos de bajo poder inhibidor resultan afectadas de un error
tanto mayorcuanto menores la actividad inicial del testigo yla inhibición observada.
Ereparación de la acetaldehido deshidroggggsa de higadoi3acker2.: Se sigue el método de Hacker (4) modificado por
Stoppani Milstein (6) hasta la etapa de fraccionamiento conetanol inclusive.Se introduce a continuación un fraggiggamigntgcon ácidos nucléicos: por cada 20 ml de sobrenadante que contiene 20 mgs de proteina por mililitro se agrega 1.5 ml de soluciónneutralizada de ácido nucléico al 5%. Se ajusta el pH a 5.2 conacético 0.1M, se deja l5 minutos y se centrífuga. El precipitado formado se descarta. Al sobrenadante se le agrega 5 ml de so
lución de ácido nucléico por cada 20 ml de extracto originaly se baja el pH a 4.7. Se centrífuga y el precipitado se disuelve en solución amortiguadora de pirofosfato 0.05 MpH 8.3 y se
le agrega sulfato de protamina 1%(Roche) en fracciones pequeñas a pH 6.5 hasta que la relación de absorción de 280 mP/260 mdindique la eliminación del ácido nucléico.
Fraccionagiento con sulfato de amonio: In solución se llevahasta 45%de saturación con solución saturada de sulfato de amo
nio obteniéndose un precipitado que se centrífuga y se redisuelve en un volumen minimo de agua destilada.
Esta solución conservada a -17°C se utilizó en experimentosque se describen más adelante.
Preparación de la NADPaldehido dgghidroggggsa de levgggga
(Seegmiller): Se sigue el método de Seegmiller (3) modificadopor Stoppani y Milstein (6).
gggparación de 1a NADaldggido deshidrogenasa de_levadura(Black): Se procede de acuerdo al método de Black (2) modificada
por Stoppani y Milstein (6) hasta 1a etapa de la coagulación porel calor de la proteína inactiva.La precipitación ácida usadapor cotos aútbreBJSÏha modificado comose describe en el capítu
lo siguiente. La etapa de precipitación acetónica descripta porlos mismos autores se usó solamente al comienzo en determinaciones cinéticae y de la acción de diversas sustancias sopre la en:zima por cuanto permite 1a eliminación de electrolitos. Másade
lante se lo sustituyó por el método muchomás conveniente decromatografía a través de Sephadex G-25.
CAPITULOIII
PURIFICACIONïgNALISIS FISICOQUIMICO Y ANALISIS DE METALES
DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE_ÉEVADURA.
El sobrenadante proveniente de la centrifugación del extracto calentado a 55° durante 15 minutos de acuerdo al método
de Black (4) se somete a una precipitación ácida: agregandosele acido cítrico 1Mlentamente y con agitación para evitar concentraciones locales altas de ácido que desnaturalizan la enzima; hasta alcanzar el pH 4,7 medido con potenciómetro. Sc trabaja con el extracto en baño de hielo. Se lo lleva a la cámarade 2° donde se lo deja alrededor de dos horas al cabo de lascuales se centrífuga a 0° a 3.500 r.p.m. durante 20 minutos.El precipitado que se forma contiene parte de la enzima. Alsobrenadante se le baja el pH a 4,5 y luego de dejarlo mediahora en la cámara fria se centrífuga igual que en el paso anterior. Conlos precipitadbo obtenidos a pH 4.7 y 4.5 se procede de la siguiente manera: se los suspende en 30 ml de solución de fosfato bipotúsico 0.025Majustándose el pH a 6.3 conamoniaco 3M, se centrífuga y se vuelve a suspender el precipitado en la solución de fosfato bipotasico, se centrifuga y el sobrenadante se une con el anterior. La solución contiene la enzima y se puede conservar bien congelada a -20° durante un mes.No se puede determinar la actividad específica de los extractosresultantes dado que la alta concentración de ácidos nucléicosque contiene, alrededor del 40%, introduce un error muygrandeen la determinación de proteínas por el método espectrofotométrico. La actividad especifica aproximadade los extractos obtenidos por precipitación ácida es de alrededor de 3.000 unidades/mg y tiene un promedio de 150.000 unidades/m1.
De acuerdo con el método de Black (4) la etapa siguientees un fraccionamiento por solventes orgánicos, pero la fracción acetónica que se obtiene es muyinestable, pierde actividad aún durante el transcurso de los experimentos por lo que sebusca un método que dé comoresultado un extracto más estable.
Cromatografía en columna dg_gg¿yoximgtilgglulggg_1_ggégcelulosa del extracto obtenido por precipitación ácida: Entodos los experimentos se usa una CMFcelulosapreparada porWhatman,Floc CM70 que puede utilizarse directamente sin pre
vio lavado. Para la preparación de las columnas se procede de lasiguiente manera: se suspende la celulosa en amortiguador fosfato 0.1M, pH 6.8, EDTAlmMen la proporción de l gramo en 50 ml
de amortiguador y se deja en reposo; el materhll que no sedimenta en 45 minutos se elimina deeantando la suspensión sobrenadante. La celulosa se resuspende en el mismoamortiguador y se elimina el aire ocluído colocándolo en un desecador en el que sehace el vacio. Para el llenado de la columna de 1 cm de diáme
tro interno por 15 cmde largo, se obtura el extremo inferiorde la misma con un pequeño tapón de algodón o de lana de vidrio.A la parte superior de la columna se le ajusta mediante una unión de gomaun reservorio cónico y se llena todo rápidamente con
la suspensión de celulosa en cantidad suficiente comopara queuna vez compactada la columna, tenga la altura deseada (lO cm.),permitiendo simultáneamente que el líquido fluya por la parteinferior. En caso de que el flujo sea demasiado rápido se puede
regular con un tubo de gomaajustado al extremo inferior de lacolumna y una pinza de Mohr.El compactado de la columna se completa mediante la aplicación de una presión hidrostática equivalente a 0.05 atmósferas mediante la aplicación en la parte superior de la columna de un tubo de vidrio de un metro de longitudlleno de amortiguador.Antes de utilizarse la columnase lavacon el amortiguador que se va a emplear en la corrida hasta queel pH del efluyente sea igual al del amortiguador usado.Velocidad de elusión varía entre 5 y 7 ml en 10 minutos. Se cromatografía el extracto ácido sin dializar,o dializado durante 12 horascontra amortiguador de fosfato de potasio l mMpH 6.8,EDTA l mMen columna de CM-celulosa equilibrada con el mismo amortiguador.En ninguno de los dos casos se adsorbe la enzima,pues eluye enel primer tubo con amortiguador fosfato bipotásico 5 mM,pH 6.8,
EDTAl mM,con una purificación aproximada de dos veces y conun rendimiento del 70%. No se eliminan los ácidos nucléicos.
Extracto ácido dializado durante 12 horas contra amortiguador fosfato bipotásico l mMpH 6.8, EDTAl mMse cromatografíaen columna de DEAE-celulosa equilibrada con el mismo amortiguador. Enzima eluye en los dos primeros tubos con fosfato hipotésico 5 mMpH 6.8 EDTAl mM,purificada una vez y media y se eliminan completamente los ácidos nucléicos que en el extracto
ácido exceden el 20%.
Los resultados obtenidos por cromatografía del extractoácido a través de columnas de derivados celulósicos no es satis
factoria, por lo que se ensaya el fraccionamiento con sulfatode amonio.
Fraccionamiento con sulfato de aggjíp: Se debe tener especial cuidado en el control del pH de la solución saturada delsulfato de amonioa utilizar. Los fraccionamientos se llevan acabo mediante el agregado de solución saturada a la temperatura
de precipitación (entre Oy 5°) a pH 7, preparada con soluciónde EDTA5 mM.La concentración de sulfato de amonio se expresa,como es comúnen estos casos, comoporcentaje de saturación total. El cálculo de la cantidad de solución saturada necesariapara alcanzar un dado porcentaje de saturación total se realizacon la siguiente fórmula:
¿”8.235%f
en la que Va es el volumen de solución saturada de sulfato deamonio que es necesario agregar a un volumen VS de solución conun porcentaje de saturación total Si, para que el mismose eleve a SÍ. En esta fórmula se consideran despreciables los efectosde la contracción de volumen. El añadido de sulfato de amonio
seïhace lentamente con agitación continua. Se deja en reposo nomenos de 2 horas, generalmente una noche y se centrífuga a 3.500r.p.m. Los precipitados obtenidos se redisuelven en soluciónamortiguadora de fosfato de potasio 0.5 M, EDTA1 mMpH 7.0.Sehacen dos cortes: en el primero se lleva al extracto a 45%desaturación, se procede en la forma descripta y luego a1 sobrenadante se le agrega solución saturada de sulfato de amoniohastaalcanzar el 68%de saturación. En esta fracción cae el gruesode la actividad con una purificación término medio de tres veces y un rendimiento del 80-85%siempre que se trabaje en presencia de EDTA5 mM.La actividad específica de los extractos obtenidos es en promedio de 12.000 unidades/mg, la concentración deácidos nucleicos sigue siendo alta, entre lO y 20%, aunque notanto comoen los extractos obtenidos después de la precipitación ácida porque gran parte de los mismoscae en el primer corte del fraccionamiento.
Eliminación de sales del extracto obtenido por precipitación con sulfato de amonio: El paso preliminar para poder cromatografiar estos extractos es eliminarlos el sulfato de amonioremanente que impide su adsorción en las columnas. Para ello seensayan distintos métodos.ADiálisis: se estudia 1a estabilidadde la enzimadializándola contra distintas soluciones: Tris lO
mMa pH 7.0 y 8.0 y fosfato bipotásico lO mMpH 6.0 solos yagregando a cada uno: EDTAl mMy 50 mM, cisteina l mM, ZnÏÏ x
10-4My KT 50 mM.Se dializa durante 4 horas sin agitación. Ninguno de los extractos pierde actividad capecifica, la que se mantiene hasta 3 dias si se lo conserva congelado a -16°C. Los dializados contra fiH 6.0 no son estables. Rendimiento es de 70%.á_Precipitación con acetona: se diluye el extracto obtenido luegode la precipitación con sulfato de amoniohasta tener una concentración de proteina de 3.5 mg/ml con solución de citrato lO mM,pH 5.4 en presencia de EDTAl mM.La acetona se agrega lentamen
te cuidando que la temperatura no suba de 0°C. La enzima precipita cuando se alcanza el 45%de saturación con acetona, se centrifuga a -8°C durante 5 minutos y el precipitado se redisuelve enTris 0.015 MpH 8.0. La actividad específica es la misma que ladel extracto dc sulfato de amonio 68%de saturación y el rendimiento de la Operación es bajo.c, gramatografia a través de la columna de Sepnadex G:gfi: previamente equilibrada con una solución amortiguadora adecuada, seeluyc con el mismoamortiguador,Este mótodo es altamente satisfactorio puesto que el sulfato de amoniose elimina totalmente,se recupera el 100%de la actividad enzimática, el extracto sediluye muypoco y la operación es muy rapida.
Cromatografía en 1a columna de DEAEx TEAE-celulosa del extracto obtenido por precipitación con sulfato de amonio: el extracto acetónico que se obtiene después del fraccionamiento consulfato de amonio se cromatografía en una columna de DEAE-celu
losaquuilibrada con amortiguador de Tris 10 mMpH 7.5, EDTAl mM.Secluye con el mismoamortiguador al cual se le agrega01K 50 mM;enzima sale en el segundo tubo con una purificaciónde casi dos veces y un rendimiento del 100%.Laconcentración deácidos nucleicos baja de 26 a 3%.
Si bien la purificación obtenida por pasaje a través decolumna de DEAE-celulosano es satisfactorio, se eliminan casicompletamente los ácidos nucleicos, por lo que se ensaya separarloe agregando directamente al extracto obtenido por precipitación con sulfato de amonioel derivado oelulósico, se dejaequilibrar ea frio durante quince minutos, se centrífuga y sedetermina la actividad del sobrenadante. El método no dá resul
tado, no se eliminan los ácidos nucloieos y disminuye la actividad especifica.
Se prueba pasar la fracción sulfato de amonio 68%sin dializar por una columna pequeña, de l cm de diámetro interno
por 3 cm de alto, de DEAE-celulosa equilibrada con amortiguador Tris 10 mM, pH 7.5, EDTAl mM. Se cluye con el mismo amortiguador al que se le agrega ClK 50 mM.Actividad comienza a sa
lir inmediatamente deepuós de agregado el eluyente con EEGgggismiente del 95%y una purificación de 1.3 veces. Los ácidos/seeliminan casi completamente.
También se eliminan los ácid>e nucleieos cuando se cremato
grafía la fracción sulfato de amonio por una columna de TEAEcelulosa equilibrada con amortiguador de fosfato lO mMpH 6.0
EDTAl mM; el eluyente contiene ademas 01K 50 mM. Enzima eluye
inmediatamente después de agregado el mismosin purificarse.Que la enzima no ee adsorba a la columna de DEAE-celulosa
puede deberse a que la fuerza iónica del extracto enzimáticoes alta, por lo que so bajó a 5 mMla concentración de la solución amortiguadora de Tris en que se resuspcnde la fracciónque precipita entre 45 y 68%de saturación con sulfato de amo
nio. Contra esta mismasolución se dializa el extracto obtenido y con ella se equilibra la columna. Se trabaja a pH 7.7. Enestas condiciones la enzima se adsorbo. Se eluye aumentando lafuerza iónica de la solución amortiguadora de equilibrio mediante el agregado de cloruro de potasio on concentración creciente; la enzima comienza a eluir con una solución de Tris5 mMEDTAl mMcloruro de potasio 140 mM; los resultados de
la purificación no son satisfactorios: 1.5 veces con un rendimiento del 50%. Se ensaya la elución con gradiente lineal entre concentraciones do Tris 5 mM,EDTAl mMy cloruro de potasio 50 nM y Tris 5 mM, EDTAl mMy cloruro do potasio 400 mM
ambos a pH 8.0. La enzima comienza a cluir cuando la concentra
ción del eluyente llega a 120 mMde cloruro de potasio pero sale muydiluída y tanto el rendimiento comola purificación sonmalos. Si se pasa por la columna un extracto mucho más crudo,el que se obtiene después del calentamiento a 55°C, y se eluyecon gradiente lineal en las condiciones anteriores, la coneentración de la elución es la misma, la purificación es de 6 veces pero el rendimiento es sólo del 50%, el eluído está muydiluido por lo tanto es muyinestable; no se eliminan los ácidos nueléicos.
Llama la atención que el rendimiento de las columnas deDEAEsea tan bajo, por lo que se hacen ensayos de estabilidadde la enzima a distintos pH en Trio 5 mM,EDTA1 mM, cloruro
de potasio 50 mm, pH 7.0 y 8.0 y fosfato potásico 5 mM,EDTA
l mM, cloruro de potasio 50 mm, pH 7.0. La enzima es mucho másestable a pH 7.0 tanto en fosfato bipotásico comoen Tris. Luego de preeipitar con sulfato de amonio se suspenden alicuotasdel precipitado en cada una de las soluciones amortiguadores yse dializan centra las mismas. La ensima resuspendida y dializada durante 12 horas a pH 7.0 mantiene su actividad, no asi laque se encuentra a pH 8.0, la que se va inactivando paulatinamente;
Se repite la cromatografía en columna de DEAE-celulosa pcro equilibrada con fosfato bipotdsico lO mM,EDTAl mMpH 7.0.
La fuerza iónica de los eluyentes se aumenta, aumentando laconcentración de fosfato. Actividad eluye con fosfato bipotásico 50 mM,EDTAl mM,la actividad especifica se duplica, losrendimientos mejoran notablemente (alrededor del 80%).
El eluido está muydiluido y, al tratar de coneentrarlose pierde parte de la actividad. Se han ensayado distintos mótodos de concentración: precipitación con solución saturada dosulfato de amonio, diálisis del egtracto contra solución desulfato de amoniode concentración adecuada, liofilizaeión,Plasdone, y pasaje por columna de DEAE-celulosa de dimensionesreducidas pero con todos ellos, excepto con la liofilizaeiónen que la disminución de la actividad cepecifiea es del 14%,la perdida es de 20 a 30%.
Electroforesis de Zona en columna de celulosa: A fin de
aumentar la purificación alcanzada hasta ese momentose ensaya
la electroforesis de zona en columnade celulosa de acuerdo ala técnica de Porath (12). Comosoporte se utiliza polvo de celulosa Whatmanpara cromatografía. Columnaelectroforética utilizada tiene un diámetro interno de l cmy una longitud efectiva de 40 cm. Una vez completada la electroforesis se separa lacolumnaelectroforética del resto del aparato y se eluye el contenido de la misma en cámara fria. con el mismo amortiguador conel que se equilibró la columna, recogiendo fracciones de l m1.Se trabaja con los extractos provenientes de la precipitacióncon sulfato de amonio de 68%de saturación que se resuspendeny se dializan contra la solución amortiguadora con la que estáequilibrada la columna de celulosa: Tris 5 mm,EDTAl mM,cloruro de potasio 50 mMpH 8.0 y Tris 5 mM,cloruro de potasio 50
mM.EDTAl mMpH 7.0 en sendos experimentos. La electroforesisdura 7 horas con un voltaje de 500 V y un amperaje de 23 mA. la
purificación es de 2 veces y se recupera el 85%de la actividady el 74%de la proteina.
Comola actividad especifica máximaalcanzada es de 20.000unidades/mg. ya sea por el método de electroforesis de zona como por cromatografía a través de columna de DEAE-celulosa, se
estudia el comportamientoelectroforético de muestras obtenidaspor ambosmétodos. Los resultados obtenidos con el extracto cromatografiado por la columna de DEAEse ven en la figura 4. Elextracto obtenido por electroforesis de zona se precipita consolución saturada de sulfato de amonio, el precipitado se suspende en solución amortiguadora de fosfato potásico 0.1 M, EDTA1 mM,pH 7.1 y se dializa contra la misma solución durante 15horas y se estudia su comportamientoelectroforético en el aparato de Perkin-Elmer. La actividad específica del extracto antes de dializar: 15.000 unidades/m5., concentración de proteinas: 6.4 mg/ml, concentración de ácidos nucléicos 1%. Las fotos obtenidas muestran dos componentesprotéicos.
En vista de los resultados obtenidos, debe continuarse conla purificación a fin de eliminar la probable impureza que seevidencia en los modeloselectroforéticos y de ultracentrifugación.
Egitración a través deggel_gextrang: El métododifierede otros procesos cromatográficos tales comocromatografía de
adsorción o de partición, en que los volúmenes de elución sonmuypequeños y que el gel es insensible a la variación de concentración de eoluto. Por lo tanto la separación de los componentes depende muchode las propiedades fisicas de la columna armada. Una zona debe pasar a través de la columna comouna banda angosta, sin distorsionarse. Esto requiere un cuidadosopretratamiento del gel y armado de la columna. Una vez armada una columnapuede usarse durante largos periodos sin necesidad de rearmado.
Para armar una columna de Sephadex se procede de la siguiente manera: el gel seco tiene un grado de solvatación que dependedel grado de entrecruzamiento y del poder de solvataoión que esfunción de la interacción gel-solvente; por lo tanto al poner elgel en contacto con el agua, se hincha. Por eso un paso preliminar al armado de la columna es el de echar al gel on un excesode la solución amortiguadora con la que se va a equilibrar lacolumna, agitando para evitar la formación de grumos. El equilibrio se alcanza muylentamente por lo que conviene dejarlo nomenos de 24 horas a temperatura ambiente; si no se procede asílas particulas del gel continuan hinchándose una vez en la columna lo que conduce.a una velocidad de flujo muybaja o al taponamiento de la misma.
Durante el proceso de aumento de tamaño del gel es conveniente eliminar las partículas másfinas. para ello se agita la suspensión y se la deja sedimentar hasta que se forma una capa limite neta. se decanta el sobrenadante y se repite el proceso hasta que el sobrenadante quede claro. Generalmente alcanza con 4 o5 tratamientos con un volumen de sobrenadante de 10 a 20 vecesel del gel. Antes de introducirla en la columna, la suspensiónde gel se diluye hasta que su viscosidad sea tal que las burbujas de aire puedan pasar a través de ella y se la coloca en undesecador en el cual se hace el vacio para eliminar el aireocluido.
Armadode la columna: 1a columna utilizada es un tubo de vi
drio cilíndrico de 1.5 cmde diámetro interior y 25 cm de largo,uno de cuyos extremos es un capilar y el otro un cierre esmerilado. Para evitar la dilución de lae zonas durante su remoción dela columna, debe tenerse un cuidado especial con la salida dela misma. Se obtura el capilar con un pequeño tapón de lana de
vidrio de 0.1 mm.Una vez montada la columna en forma perfectamentevertical, se cierra la salida. Se la llena hasta un terciocon la solución amortiguadora a usar en este caso fosfato de potasio 0.5 M, EDTAl mMy cloruro de potasio 0.5 M, pH 7.0 y secoloca en su sitio la lana de vidrio y las perlitas. Unidoporel esmeril se adiciona un tubo de extensión que termina en unreservorio cónico. Tanto la columna comoel tubo de extensión
se llenan con 1a suspensión de gel, la que comienza a sedimentar inmediatamente. Una vez que se ha formado una capa de 2-5
cmse abre la salida dejando pasar una corriente lenta de solución. A medida que el tubo de extensión se vacia de gel, se elimina el sobrenadante y se la vuelve a llenar con la suspensión,
cuidando de que en ningún momento haya sedimentado todo el gel
antes de agregar más suspensión. Ésto se repite hasta que el gelalcance la altura deseada en 1a columna. Una vez armada se lava
la columna con la solución amortiguadora a emplearse, hasta queel pHdel efluyente sea igual a la de ésta. Se usa una solución
amortiguadorade fuerza iónica alta para evitar la interacciónentre las moléculas de proteina. Antes de agregar la mezcla secoloca sobre la superficie del gel un disco circular de papelde filtro de diámetro ligeramente menorque el diámetro interiordel tubo de vidrio.
Introducción de la muestra: Se elimina todo el sobrenadante,se cierra la salida y mediante una jeringa se agrega lentamentela muestra. Se abre la salida y se deja que la solución penetreen el gel, en el momentoque desaparece de la superficie se a
grega un pequeño volumen de eluyente para lavar la misma; unavez que se absorbió se comienza con la elución. Para evitar que
las zonas se extiendan mucho1a velocidad de elución no depeser grande. Se recogen fracciones de 0.5 ml cada 3 minutos.
Se prepararon columnas de l cm de diámetro interno y ll cmde largo de cada uno de los siguientes geles: Sephadex G-2S,
G-50, G-7S, G-lOO y G-200; DEAE-Sephadex A925 y A-SO equilibrav
das y eluidas con amortiguador de fosfato potásico 5 mMpH 7.0,EDTA l mM.
Excepto con los Sephadex G-lOOy 6-200 los resultados obtenidos no son muysatisfactorios, los rendimientos son altos,entre 85 y 10o%, pero la purificación no pasa de una vez y me
dia.Los distintos Sephadexempleados difieren entre si en el
grado de entrecruzamiento de las cadenas de polisacáridos quefonman la red, lo que determina la porosidad de la misma. Delgrado de porosidad depende el rango de tamaños moleculares expresados comopesos moleculares, que pueden separarse, asi el Sephadex 6-25 que es el de mayor grado de entrecruzamiento separa fracciones de pesq molecular de hasta 5.000 mientras que con Sepha
dex 6-200 muyporoso, se pueden separar fracciones de pesos molecular arriba de los 100.000. Si se observa la figura S se veque los dos componentes proteicos corren muyJuntos, vale decirque sus pesos moleculares no difieren considerablemente; además
la velocidad de sedimentación indica que el peso molecular delos mismosno es bajo. Esto explica por que se obtiene resultados más satisfactorios con el Sephadex G-200.
Las columnas de Sephadex G-lOO y G-200 y las de DEAE-Sepha
dex separan los ácidos nueleicos, en las dos primeras la separa
ción es total, primero eluye la fracción con actividad enzimáticay luego los ácidos nucleicos.
Cromatografía en columna de Sephadex G-200 en las condicio
nes indicadas en las figuras l y 2 conduce a la obtención de unextracto de actividad específica 31.000 unidades/mg. el que so
metido a un análisis en la ultracentrífuga reVela la presenciaaparentemente de un solo componente.
FIGURA 1
Ï Ï Ï I I l I I I I l(17.500)
0.600- (19.000 -200
ahoo- 4601l
ICC?
(17.500)
(8.000)
l 80
(15.000)
e8 ldadenzimat(12.500)
Densidado'ptíca280;”¡wl l l l l L l l4 e 31012114161820222u
Fracción númeroCromatografía en columna de Sephadex 6-200 de ln NADaldehi
Act
de deshidrngenasn de levadura.Columna de 18 x 1.5 cm.Se siembran 34 m1 de un extracto quecantiene 150 mgde proteína y 1.250.000 unidades totalas(actividad específica “.200 unidades/mgr).Columns se aluyecon solución amortiguadorn de fosfato de potasia O.5M,EDTA1 mM,clorurn de potasio 0.5M.Se recogen volúmenes de 0.5 m1.Se recupera el 70%de la actividad totu1.Los valores entreparéntesis corresponden a las actividades específicas de ca»da fracción.Fracciones 7,8 y 9 se uniersn,liofilizaron y volvieron a cromatografiar.
FIGURA 2
/)x70‘
- l l l l l l L l
o 4012 m 4a 4a zo 22 24
Fracción número
Ls:1 I l I l I l l r
0300 _ _8N ' ' ELÜ " " Ü.20200- _gox x\C) - ‘CJ_ _eoÜ Nbalon- _ Q
TD <1)a — -ao
s — — sQ a :9
.>s:C)q
Cromatografía en columna de Sephadex G - 200de la NADaldehido deshidrogenasa de leVadúra.Iguales condiciones que en figura 1.Eraccionesde mayor actividad específica obtenidos en celumnade ln Fig.l se liéfilizaron y se volvieran a cromatografiar.8c siembra l m1. que tiene 19 mgr. de preteína y 300.000 unidades (IC
'tividnd específica 16.000 unidades/mgr.).80 recupera el 85%de la protein. y el 100%de ll actividnd total,el 67%del mismocae en las fracciones de mayer actividad específica mientrasque 8610 el 37%de la proteína corresponde alos mismeS.Va-loresentre paréntesis cerrasponden a las actividades específicas de cada fraccián.
RESUMEM DEL METODO QUE SE EMPLEA PARA PURIFICAR LA NAD ALDEHIDO
DESHIDROGEHASADE ppvwmm.
gptgggión del polvo cetónioo de levadura: de acuerdo a latécnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza leva
dura de panaderia (Sacharomyces Cerevisae) producto comercial,prensado y libre de fécula.
' Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico
0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante S dias, mante-.niendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de amoniaco concentrado.
Coagulaciónpor calor de proteing_igggtiïg: se ajusta elpH del sobrenadante de la extracción a 6.3 con ácido cítrico l M
y se Calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamentey se centrífuga.
Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior sele baja el pH a 4.5 mediante el agregado lento de ficido cítricol M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el
precipitado cue se redisuelve andalución de fosfato bipotásico0.025 M pH 6,3
Fraccionamiento salino con sulfato deágmggig: se hace merdiante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.
El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de saturación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadora dcfesfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA1 mM,pH 7.0.
Filtragión a travég_ge gel de dextrano: Sephadex G-200 enuna columna de 1.5 cm de diámetro y 18 cm de largo equilibradacon amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAl mM,pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fra
cciones de mayoractividad especifica se recrouatografian porla misma columna en iguales condiciones.
FIGURA 3
_Mpdeloelectroforético de la NADaldehido deshidrogengggde levadura de pangfiería correspondiente a la etagg de precipimtación acetónica. Concentración proteica 5.3 mg/ml. Actividadespecifica 3.200 unidades/mg. Amortiguadorutilizado: veronalveronal sódico pH 8.6, fuerza iónica 0.1. Duración 105 minutos,a 105 V y 7 mA. Temperatura 1° m 2°. Limbo ascendente.
¿«‘IGURA 4
Modelo electroforético de la NADaldehido deshidrogengggde leVadura de panadería purificgfia por crqggtografía en colgana de QEAE-celulosa. Concentración proteiCa lO mg/ml. Actividad especifica 18.000 unidades/mg. Amortiguador utilizado:Tris-citrato 0.1 M, pH 7.35. Duración 30 minutos, a 150 V y 7mA. Temperatura 1° —2°. Limbo ascendente.
ANALISIs_g;g;gggggggggs“pgp_ggnno DE PUREZADE LAS PREPARACIO
ygg_ggg;g¿ggg¿s_pp LEVADURAQE PANADERIA CON ACTIVIDAD DE NAD
¿EQEDIDO DESHIDROQENASA DE LEVADURA:
1.Enggigentos de Electroforesis: en varias etapas de lapurificación de la enzima se realizaron experimentos de electro“
foresis libre para investigar el comportamientoelectroforéticode los distintos componentesde los extractos obtenidos. Seutilizó a tal efecto el modelo 38 A de Perkin Elmer. Aproximadamente 3 ml del extracto a analizar se dializan previamente duran
te una noche a O°Ccontra 600 m1 de amortiguador a utilizar cnel experimento.
El extracto proveniente de la precipitación acetónica deactividad especifica 3.000 unidades/mg, muestra una gran heterogeneidad proteica (Figura 3). El modelo electroforético se simplificó bastante (Figura 4) después de cromatografiar el extrac
to obtenido por precipitación con sulfato de amonio, a travésde una columna de DEAE-oelulosa. Actividad especifica del extraoto analizado: 18.000 unidades/mg.
II.Estudios de Ultracentrifugación: La preparación obtcniw
da deepués del pasaje a través de la columna de DEAE-cclulosa,fue sometida a un análisis de pureza en la ultracentrifuga. Pa
ra ello se liofiliza a las fracciones de mayoractividad especi»fica. La actividad específica de los eluidos de columnaes de17,000 y el del liofilizado baJó a 13.000. El lioÍilizado tiene'26.4 mgs de proteina por ml, se lo diluye con solución de clorurc de potasio 0.075 Mhasta concentración protóica de 6.15mg/ml. El modelo que se obtiene revela la presencia de 2 compo
nentes proteicos que corren (Figura 5) muyJuntos, semejantesal modeloelectrofcrético de la figura. 4.
En la figu a 6 se ve los resultados obtenidos al sometera ultracentrifugación la preparación obtenida por cromatogra-.fia a través de la columna de Sephadex G;2OOen las condicionesindicadas en la figura 2. Actividad especifica de los eluidos:29.000 unid/mg; luego de liofilizar la mismabaja a 20.000unidades/mg. Concentración proteica 5.25 mg/ml. El modelo quese obtiene revela la presencia de aparentemente un solo compo
nente que se desplaza lentamente y no se resuelve en otros componentes a lo largo de su trayectoria.
Observando la figura 5, se Ve que lo que se supone es la
ComportamientoenlaultracentrifugadelaNADaldehidgdeshidrogenasadelevadugg.
“.wi
Concentraciónproteica6.15mg/ml.Actividadespecíficadelapreparaciónenzimática 13.000unidades/mg.Temperaturadelrotor8°.Velociiaümáxina58.500rpm.Lasedimenta ciónprocededederechaaizquierda.Lasfotosfuero:tomaóqscada16minutos.
EMMA
ComportamientoenlaultracentrífugadelaNAD¿ldehidodeshidrogenasadeleVadura.Con
centraciónproteica5.2mg/ml.Actividadespecíficadelapreparación20.000unidades/mg. Temperaturadelrotor21°.Velocidadmáxima59.000rpm.“asedimentaciónprocededederecha aizquierda.Lasfotosfuerontomadasalos:1,9,17,5,33,41,49,57,73,89,105,121, 137,153,169,185,201,y217minutosdehabersealcanzadolavelocidadmáxima.
FIGURA 6
impureza tiepe aproximadamente dos quintoe de la concentracdónde la enzima. La actividad especifica de esta muestra es 17.000,
por lo tanto la enzimapura_debería tener_una actividad específica de alradedor de 26.000. Esto corroboraría lo observado en1a figura 6.
ANALISÏS DE METALES DE LA NAD ALEQHIDO DESHIDROGENASA DE LEVADU
RA POR ESPECTROGRAFIA DE EMISION. .
El extracto de actividad especifica 28.000 unid/hg, que sometida a un análisis de pureza en la ultracentrífuga aparentemen
te revela un solo componente, se recupera y se lo somete a un_análisis cualitativo de metales en un espectrógrafo de emisión.
Se trabaja con un eSpectrógrafo Varrell Ash, modelo Ebert
de 3,40 m de longitud focal; con electrodos rotatorios de grafito por lo que no es necesario calcinar la muestra.
Fuente de excitación usada para provocar y controlar lachispa: Varisource, condición: arco interrumpido. Intensidad dechispa: 5A; intensidad de arco: 2A.
Red: 15.000 lineas/pulgada. _Placa fotográfica: Ilford ordinary N° 30.
Se preparó un testigo con 012 Zn 12 X/bl, espectrográficamente puro. Comola muestra está disuelta en solución de fosfato
de potasio l My cloruro de potasio 1 M, también se analizan lassoluciones respectivas.
Elementos
Soluciones: K Mg Ag Na Zn Cu Al Fe Si
P0 41m2 + + - + - + .- + + +ClK + + + - p + + + +
Extracto + + + + + + + + + +
Estos resultados, si bien no son concluyentes, corroboran1a hipótesis de la presencia de Zn en la enzima.
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s‘.......—-.._.¡.
m """M'ÚKPÏTIÉO'"HIM"
7 ¿CCION DE AGENTES COMPLEJANTES QE
METALES SOBRE ALDEHIDO DEgfiggROGENASAS
_ La relación que existe entre sistemas que contienen metalo;‘ con los procesos vitales ha sido reconocido desde hace muchotien"
po, ya en 1869 Raulin encontró que el ASpergilus Niger necesita Í
‘ Zn para sulorecimiento. La explicación de la funciénlfirdógica délos metales se ha buscado en su asociación con prcteinas particu&
Iarmente con aquellas que tienen actividad enzimática (14-17). íLSe pueden diferenciar dos grupos de proteinas asociadas con meta}Eles que tienen*ono actividad enzimática (15). '
gggplgigg_ggjgl;pggtgigg. En los cuales la proteina se com?íbina revereiblemente con uno de varios cationes diferentes. Ï. El significado funcional de la asociación entre metales y fpreteina se.ve facilitada cuandola proteina pura tiene función'
enzimática. A este grupo pertenecen los complejos metal-enzimacuya.actividad depende de una combinaciün rápidamente disociablé
I con una variedad de iones metálicose,La constante de asociación del metal con el grupo reactivo
de la proteina es bajo,pon ¡logica¡el metal puede eliminarse fácilmentepor diálisis con pérdida parcial de la actividad; éstaÏpuede restablecerse por agregado del metal. Diferentes metalespueden sustituirse mutuamenteen la activación de la enzima. Po.
Mg++,Zn++, Mn++ ó Fe++.
Metaloproteina . La proteina está combinada con un dado me
Eeji la enolasa puede activarse con..__...—...
.tal de una manera determinada, de modo que se puede considerara ambas como una entidad.
í Cuando.la proteina que esta unida al metal en las condicio%ïnes de la definición tiene actividad enzimática especifica, se513 denomina metaloenzima.
Él metal, en todos los casos oonócidos hasta ahora, anhi- 5drasa carbónica (18), carboxipeptidasa (19), alcohol deshidrom ¡genasa de levadura (20) y de hígado de caballo (21), glutámico Ïdeshidrogenasa de hígado de vaca (22), láctico deshidrogenasa
(‘- LSLL1 .1de músculo esquelético de conejo (23) y fo asa alcalina deI -u . ñ . . . .irinón de pOÏClHO(¿4), es un grupo reactivo de la analma, La a
i dición de sustancias que se cónoca que tzenen gran afinidad put;' i
¡el metal y propiedades estéricas compatibles con la configura» í._n. .u .-4._. ._-—-- . .- -.-- .—- ... _ . ... -_-..... ..
ción del centro de localización del metal. da comoresultado unainhibición parcial o total de la actividad enzimática (15). Lainhibición es reversible cuando se forma un complejo disociableentre el inhibidor y el metal y este queda unido a la proteina.
Los dos tipos de interacción metal-enzima probablemfldé secorrespondan con los complejos metálicos y los quelatos metálicosque se encuentran en sistemas más simples. En la formación de
complejos con otros iones o moléculas no cargadas, llamñdes ligantes, se considera que los iones de metal actúan comoaceptores de pares de electrones de átomos dadores en el ligante.En el quelato, dos o más átomos dadores de una molécula de ligante están unidos al mismo ión metálico, lo que los provee deuna estabilidad adicional (25).
En los últimos años se ha dedicado un gran esfuerzo a dilucidar el rol de los metales en la cetálisis enzimática. Históricamente la inhibición de enzimas por agentes quelantes ha serhvido comoun medio clásico para establecer si un metal es o noesencial en el proceso cetalitico. Ultimamentese sintetizaronVarios agentes complejantes cuyo empleo ha permitido ampliar elestudio de este importante aspecto del comportamiento.del metal.Tales agentes quelantes inhiben la actividad catalitica debidoa una interacción especifica con el metal a través de la formación de un complejo mixto enzima-metal quelante
' [E Tie] + InÉLE Me) InEl empleo de estos inhibidores se basa en su conocida inter
acción con iones en solución para formar complejos de coordinación estables, unido al hecho de que los metales incorporados alas proteinas retienen gran parte de su actividad quimica especi»fica (26).
En este laboratorio (8) se ha estudiado el área activa detres aldehido deshidrogenasas, a saber, NADaldehido deshidrogenasa de levadura (2), NAD?aldehido deshidrogenasa de levadura(3) y NADaldehido deshidrogenasa de higado de vacuno (4) conrespecto e la presencia de grupos sulffihidridos. El hecho de quese encontró que una serie de deshidrogenasas dependientes de NAD(27) contienen cinc, sugiere que un metal puede ser el campo»nente funcional de otras deshidrogenasas. Por esa razón se probóel efecto de los complejantes de metales sobre las tres enzimasen estudio.
BesultadosSe exPondránpor separado los resultados obtenidos con Cada
una de las enzimas.
NADaldehido deshidrogenasa de levadura. De los complejantefiensayadosla 8-hidroxiquinolina, la l,lO-fenantrolina y el dietilditrocarbamato tienen acción inhibidora en el orden indicado
(Tabla l). En cambioel cupferrón, eláÏgE'-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ninguna acción. Estos resultados seobtienen en presencia de cisteina que es necesaria para la actividad de la enzima.
En ausencia de cisteina, la actividad de la enzima es sólodel 14 al 16%de la correspondiente a la presencia de cisteina1 mMen el tubo de medida. Si en esas condiciones se agrega los
complejantes de metales en las concentraciones indicadas en laTabla 2, se ve que la B-hidroxiquinolina, la 1,10-fenantrolina_yel dietilditrooarbamato, que en presencia de cisteina inhibela acción catalitica, en ausencia de la mismala activan aunqueno en la mismaproporción que la cisteina. Es de notar que alorden decreciente de inhibición corresponde un orden decrecientede activación. La edición de cisteína l mMa una preparación par
“cialmente activada por 1,10 fenantrolina aumenta ligeramente laactividad pero no tanto comocuando actúa sola.
El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.Si se estudia cuantitativamente la acción de la fenantroliw
na en presencia y en ausencia de cisteina se vé (Table 3, figuraproyencla de
l) que on/tisteina, la inhibición aumenta con el aumentode concentración de la fenantrolina, mientras que sin cisteina la aetivación llega a un máximo cuando la concentración de OP es apro—ximadamente l mMy luego comienza a decrecer, lo cual es de esperar si se supone que comoactivadores ambas sustancias actuande la misma manera. En la Tabla 4 se vé comovaria la activacion
de la enzima, en ausencia de cisteína, con la concentracion dedietilditiccarbamato.
NADP-aldehidodeshidrogenagg ie levadura. Esta enzima requiere comoactivador esencial un catión bivalente, calcio o mag"nesio, pero comola oxiquinolina precipita en presencia de magnewsio se lo ha reemplazado por calcio en algunos do los experimentos. Los rcsu ados obtenidos por la accion de los complejantesse resumen en la Tabla 5, donde se ve que son inhibidores: el
í Tabla l{Acción de agentes complejantes de metales sobre la actividad dqÏ' "‘—-2
i¡la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.
Bolug de proteina dieuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0, en pre;sencia de cisteina 0.001 m, NAD0.45 my, 01K 0.050 M, las edicion
nee que se indican y acetaldehido 17 x 10-5g. Actividad del tee
“tigo (¿EMO x 103/min.)exp. A: V124, exp. B: 118 y exp. c: 14o.
Adiciones Inhibición enzimática_(%)Exp. A Exp.B Exp. C ;
1,10-Fenantrolina 1.o mM —- -- 7 '
1,10-Fenantrolina 2,5 my —- 24 191,10-Fenantrolina 5.0 mM 42 -- 398-Hidroxiquinolina 1.0 mM -— —— lO
8-Hidroxiquinolina 2.5 mm -- -- 458-Hidroxiquinolina 5.0 mM 87 —- 90
Cupferrón 1.0 mM -- -- 13
Cupferrón 2.5 mE —- ll ——
Cupferrón 5.0 mM 9 -- -Dietilditiccáz‘bámaio .2.5 mM -— 13 _— Í
Dietilditiocarbemato 5.o un 35 —— 36 ï'
¿CX-°('-Dipiridilo 2.5 m1_VI_ —- o —-
0(-o(’-Dipiridilo 5.o mM 10 -- --'Tiourea 2.5 mE —- 0 - 3
Tiourea 5.0 mM O —— -- ¡
,Azida Bódica 2.5 mM -- 0 P- í
¿Azida sódica 5.o m1]; 7 _— -
-- á .1 Hb—-.<su n-u-av-- n co. . ans-um“... 'F’v--'v n- v A-Uds \*“_h* -—-’-—-.—
Tabla 2
Efecto de los cgmplejantes de mptales sobre la activacióg gp ln-n...-_
NADaldehido deshidrqgenasa de levadura en ausencia de cisygígí
50 ¡ug de proteína _en exp. A y Ski/ug en exp. B, disuel'ta en 3 mlde Tris 0.1 M pH 8.0 en presenc1a de NAD0u45 mE, ClK 0.059 M,las ediciones en las concentraciones indicadas y acetaldehido17 x 10'5 Magregado al fina].
Exp. Adiciones . v Actividad Actividadïéenzimática en relación
¿3 Ew‘x 10-3.) ‘In. as.-n--.-——a la enzima
min tratada con
of 531;eri na m};
A Ningvxa 39 16
Cisteina l mfi \ 248 100
BWHidroxiquinolina 2.1 my, 154 62
Cupferrón 4 my 34 14
1,10-Fenantrolina 5 mE 126 511,1ümFenantrolina 5mM+ Cisteínal.OmM 156 64
B Ninguna 18 I 14
Cisteína l mm 125 100
Dietilditiocarbamato 5 mM 40 32
Tabla 3Influencia de la concentración de 1.1.-:gnantrqlina sobre la ac“tividad de la NADaldehidodfleshidrogenagg de levadura en presenmcia y ausencia de cisteína.
fiolpg de proteina disuelta en 3 ml de Tris 9,1 MpH 8.0 en presencia de NAD0.45 mM, 01K @.oso M, cisteina 0.001 M (exp.A) y
sin cisteina (exp.B); 1,10 fenantrolina en las concentracicnesindicadas y acetaldehido 17 x 10-5Magregado al final.
AActividad vñnhia"Actividad Actividad
enzimática bición enzimática en relaAdioianes f E34ex lO % __E34Ox19 016? a la_ ensima
mr“ mÏH tratadacon cistoína'mM
ma)
Ninguna 145 — 4 3
l,lO-Fenantrolina 10,5 mM 28 81 lO 7l,l®-Fenantrolina 5,2 mM 75 48 42 291,18-Fenantralina 1,3 mM 119 18 61 421,10-Fenantrolina 0,3 mM 98 32 29 20
FIGURA 1
l l l l l l l l l l l
0.2 0,4 0.6 0,8 1.o 1.2 1,4 1.61.823 2.2 ?.4
[1,70- Fenantro/¡na] [mM/Influencia de la cencontración de 1.10-fenantrolina sobrela actividad de la NADaldehido deshidrogenasa de levaduraen presencia y ausencia de cisteína. l7,ug de proteína diauelta en 3 m1 de Tri: 0.1 M pH QQOen presencia de NAD0945 mM,ClK0.050 M,l,10-fenqntrolina según se indica yacefqldehido 17 x 164%agregado al flnql Línea A.c0n Cigteinn 1.0 mm;líneq B,sin cisteína.
Tabla 4
Efecto del dietilditiocarbaggto sobre la actividad de La NADa1"--.-r1-231dehido deshidregenasa de levadura en ausencia de cisteina;
60)pg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0 en presencia de NAD0.45 mg, ClK 0.650 M. las adiciones en la concentración indicada y ecetaldehido 17 x 18*5Magregado al final.
Actividad Actividad en relación' . . enzimática a la enzima tratadaAdiCiones . ,
GEE x l®3\: con Cistelra mM= 346-) (%;\(-mímr--y
Ninguna 10 7
Cisteína 1.0 mM 145 100
Dietilditiocarbamata 5.0 mM 49 35Dietilditiocarbamatn 2.0 mM 53 38Dietilditiocarbamato 1.0 mE .48 34Dietilditiocarbamato 0.5 mM 40 29Dietilditiocarbamato 0.1 my 32 23
/dietil ditiocarbamato, la renantrolina, el cupferron y ¿lagridipiridilo siendo el primero el más fuerte y decreciendc la ac
, ción en el orden indicado. No tienen acción 1a B-hidroxiquinolinala tiourea y la azida sódica.
NAD-aldehido deshidrogenasa de hígado: Esta enzima es lamás sensible a la acción de los complejantes; el de mayor acciónes el cupferrón y le siguen en orden decreciente el dietilditrocarbamato, la hidroxiquinolina, 1a 1,10 fenantrolina. Muchomenos efecto tienen la tiourea,ï¿]—dipirirhfijaSanazida sódica.
M3221Las tres enzimas estudiadas son sensibles a la acción de los
complejantes de metales, pero son afectadas en distinto grade porcada complejante. Asi la aldehido deshidroganasa ae hígado y laNADPaldehido deshidrogenasa de levadura, son en general más sen"sibles que la NADaldehido deshidrogenasa de levadura. Además,esta última enzima es inhibida preferentemente por la 1,10 fensa
.trolina, la hidroXiquinolina y el dietilditiocarbamate, la desmhidrogenasa de levadura especifica para el NAD?es afectada parla 1,10—fenantrolina, el dietil ditiocarbamato y'el cupferrón pero no es sensible a la 8-hidroxiquinolina. Por último la enzima
manos pbr la l,10—fenantrolina.
' Es imposible establecer la naturaleza del metal en base alos resultados obtenidos. Las sustancias que tienen acción inhibidora muestran afinidad por los elementos del 1er. grupo detransición y del grupo II b de la tabla periódica (Fe, Co, Ni,Be, Mg, Zn, Cd, y Hg) con los que forman complejos fuertemente
asociados; pero no se puede comparar la acción de los complejanétes sobre los metales libres con su acción sobre las metaloenzimas pues la naturaleza de los grupos que fijan el metal a la prevteina, o los que lo rodean pueden afectar la constante de asociación del metal al complejante (15). Esto explicaría también ladiferenciación de los complejantes sobre las tres enzimas.
Sin embargocomparandolos resultados de inhibición señaiaidos en'este capitulo con los resultados de Valle y colab (27)con otras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adeninadinucleótido en las que además de la inhibición por los complejan—
tes mencionados, se ha demostrado la presencia de Zn por métodos
Tabla?5
Acción de agentes comglejantes de metales sobre la actividad qela NADPaldehido deggidrogenasa de levadura.
0.4 ng de proteína (exp.A), 0.10 mg (exp B) y 0.50 mg.(exp. C) deproteina disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 7.7 en presencia de
F.NADP®.12 my y 012Mg 0.015 M (exp. AI, B1, y cl) o C12Ca 0.015 M(exp. 32 y 02).lsaa adiciones en la concentración indicada y acetaldehido 0.15 myagregadoaal final. Actividad del testigo (Á
E340 x lOB/hin); exp.A 128, exp.B, 64; exp.B 68; exp. Cl, 174y exp.C2, 187.
2)
Adiciones Inhibición enzimática
Exp.A Ema} Exp.%ExpClExp.02
l,lO-Fenantrolina 1.0 mg 55 - 85 —_ __1,10-Fenantrolina 0,5 mM - 72 72 56 631,10-Fenantrolina 0,1 mE - 78 75 65 651,10-Eenantrolina 0.05 mE - —- -- 70 58
l,lO-Fenantrolina_0.01 mg —- - -— 39 _34j,g‘-Dipiridiio 1,0 mm 28 —— 26 -_ ‘33
d\i'—Dipiridilo 0.5 mE —— 22 —— 21 21
gli —Dipiridilo 0.1 mg —— —— —_ 13 _;
Tiourea 1.0 mM_ o -_ _- __ _.
ázida sódica 1.0 mid O. -- —- -- ——
Cupferrón 1.o my 84.0 -— :‘t —- —_
Cupferrón 0.5 my -- 31 38 -— ——
Cuyferrón 0.1 my . - O O -— -—
Dietilditiocarbamato 1,0 my 63 - 91 —- —Dietilditiocarbamato 0.5 my - 83 87 -- -Dietilditiocarbamato 0,1 mg —_ 62 64 ‘46 39Dietilditiocarbamato 0,05 my - m- —— 30 28
¡Dietilditiccarbamato 0.01 mE —- m— -" 31 32—8-Hidroxiquinolina 1,0 my m— —— 7 —— 6
Béïidroxiquinolina 0,5 my —— -é -38 —— _17
8-Hidroxiquinolina 0.1 mg -— -— -27 -- #4
Tabla 6
Acción de agentes eggplejantes de metales sobre la actividad de laNADaldehido Qgghidrogenasa de hígado.
0;16 mg de proteína disuelta en 3 m1 de pirofosfato 0.1 MpH 9.3
en presencia de NAD0.45 my, las adiciones en las concentracionesindicadas y acetaldehido 3.5 mmagregado al fina}:
Actividad enzimática Inhiíïción
Adiciones (A E340 x 103 'x' 7‘....__ , L'mln ’
u ——-«._.. .45 -_
8-Hidroxiquinolina 1 mm 12 73
1,10-Fenantrolina 1 my 24 47¿qïïnipiridilo 1 mE 4o 11Dietilditiocarbamato l QE lO 78anferrón 1 mE 6 87Azida sódica l mM 41 9
Tiourea 1 111M 37 18
quimicos o espectroscópicos, se puede sugerir que las aldehidodeshidrogenasas coaetienen ese metal. Esta hipótesis estaría corroborada por el análisis espectrográfioo cualitativo realizadosobre una muestra que presenta un sólo componente durante la ultracentrifugación cuyo resultado se informó en el capitulo anterior.
Si bien la presencia de metales en las deshidrogenasas especificas para las nicotinamida adenina dinucleótidos parece extenderse de acuerdo con los resultados obtenidos. ello no constituyeuna regla general pues no se ha podido demostrar la presencia decinc en la láctico deshidrogenasa de corazón de cerdo, de músculode conejo (18), ni de corazón de rata (29); éstas enzimas no soninhibidas por los complejantes de metales.
En el caso de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura elcomplejante puede además activar la enzima. siempre que no se encuentre presente otro activador comola cisteina. Esta enzima necesita cisteina para su actividad, en ausencia de la mismala actividad es escasa o nula. Stoppani y Milstein (8) señalaron lanecesidad de un activador orgánico y encontraron que la cisteinapuede ser reemplazada por el glutatión y el BAL: el EDTAen concentración 0.06 mMtambién activa la enzima con igual eficienciaque los reactivos de tioles.
En base a esos resultados, a pesar de que no pudieron postular un mecanismode acción para explicar la activación de la enzima por cisteina y otros agentes que combinan metales pesados sugirieron que la misma se debia a la remoción de metales pesadosque disminuyen la actividad de la enzima.
Según se observó con la NADaldehido deshidrogenasa de levadura, aquellos complejantes de metales que actúan como inhibidores de la actividad en presencia de un actiVador de la enzima,enausencia de la mismala activan. Por otra parte la adición de cisteina a una preparación_parcialmente activada con 1.10-fenantrolina, sólo aumenta ligeramente la actividad. la que no alcanzael Valor de cuando es activada por la cisteina solamente. Estehecho unido a que la l,lO-fenantrolina con ausencia de cisteínaes activadora hasta una concentración de l mMy que por encina deesa concentración actúa inhibiendo indica que la cisteina y lafenantrolina actúan sobre el mismocentro de la enzima y que esecentro sería el metal presente en la misma, favoreciendo de esamanera la asociación de la coenzima con el metal. La existencia de quelatos cinc-cisteina (30) contribuyen a sostener esta
sun-m..." “ . . ..
hipótesis:v Chnclusionee
'.‘ F ‘f'.ï:tI.'.".'-Il"‘;:\'r a¿una "‘ '*‘
1° Las tres aldehido deshidrogenasas estudiadas son inhibidas ponios complejantes de metales. s
é° La NADaldehido defihidrogenasa de hígado es la más sensible y?
1a enzima de levadura la menos sensible. É3° La NADaldehido deshidrogenasa de levadura es inhibida prefe-Erentemente pyr 1,10 fenantrolina, 8-hidroxiquinolina y dietil-di;miocarbamato. La deshidrogenasa de levadura especifica para el a?flADPes afectada preferentemente por la 1,10-fenantrolina, el die»kil-ditiocarbamato y el cupferrón. La enzima de hígado es más sen
Ésible al cupferrón, dietil-ditiocarbamato y 8-hidroxiquinolina.Ï4° En ausencia de cisteína la NADaldehido deshidrogenasa de 1evadura es activada por 1,10 fenantrolina, 8 hidroxiquinolina y ‘idietil ditiocarbamato.¿5°La l,10-fenantrolina en ausencia de cisteina, activa a la enzima de levadura especifica para el NAD,en concentración por deban
Ïjo de lmM,a concentraciones mayores actúa inhibiendo la actividad;en7.imática .
CAPITULO V
INACTIVACION IRREVERSLÉ;É_DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGBNA
ME LEVADUIQ}.
En algunas deshidrogenasas especificas para la nicotinamidaadenina dinucleótido (33. 32) se pueden distinguir dos tipos deinteracción entre el Zn enzimático y la l,lO-fenantrolina, ambasconducena inactivaciones caracteristicas. El primer tipo esuna combinación instantánea y reversible entre cada átomo decinc de la enzima y una molécula de fenantrolina cuando se leagrega directamente a la mezcla reaccionante.
E43; + 0P:—“ E — Zn —‘0P
Si se preincuba la enzima con el complejante antes de medirla actividad, durante distintos periodos de tiempo, se produceuna inactivación progresiva, irreversible. En el caso de la alcohol deshidrogenasa de levadura (34) la cinCtica de esta inhibición progresiva es consistente con la unión de una segunda molécula de fenantrolina a cada átomo de cinc del complejo inacti-'vo E-Zn-OP
E-Zh + OP-————>E-Zn-(OP)2Probablemente para que el cinc pueda combinarse con otra
molécula de complejante, la proteina debe sufrir cambios irrevcrssibles. Esto ya ha sido demostrado para la alcohol deshidrogenasa de levadura (34) y la glutámico deshidrogenasa de higado (37).No todas las deshidrogenasas sensibles a la fenantrolina son inhibidas irreversiblemunte por ésta, comofuera demostrado parala alcohol deshidrogenasa de higado (37). ’
En el capítulo anterior se vió que la NADaldehido deshidrogenasa de leVadura es inhibida instantáneamente y en forma reversible por la fenantrolina y otros complejantes similares demetales. En eSte capitulo se describe la acción de los mismoscomglejgntes cuando se los preincuba, con la enzima.
ResultadosCuandose preincuba la enzima, en las condiciones descrip
tas en el capitulo de métodos, con OP, se observa una pérdidaprogresiva de la actividad enzimática. Comose ve en la figural, la inactiVación en las condiciones indicadas es total al ca—bo de 57 minutos. No se observa lo mismo con OHQ, ni con zin
cón. Con DDC0.3 mMse llega a una inactiVación total a los 60minutos; si se aumenta la concentración del inhibidor a 5 mH,
FIGURA l
70m\ 50
% 50
%} 30
ESI
Tie/77,00 (mi/7.)
Efecto del tiempo de incubación sobre la inactivación de laNADaldehido deshidragenasa de levadura por la OP,la OHqyel zincóno 0,7 mg. de enzima se incuba a 209G en Tri: 0.1 MpH 8.0 en presencia de ClK 0.05 M e inhibidor en COnCentración0.3 mM.LíneaA.OP¡línea B.zincón y línea C.OHQ.Laactividadenzimática se mide en 0.02 m1 de la mezcla de preincubación,en los tiempos indicados.El testigo (Linea D) se incuba de lamismamanera pero sin el agregado de iphibiuor.
a los 21 minutos 1a enzima ya ha perdido completamente su actividad (figura 2).
La acción de la OP depende de una serie de factores.Seobservó que preparaciones enzimáticas de distinta actividadespecifica son inhibidas en distinto grado en las mismascondiciones de incubación. Haciendo la correlación entre la inactivación y la pureza de la preparación se ve que están en razón directa: a mayor actividad especifica corresponde una mayor inactivación (Tabla l). Esto probablemente se deba a que las proteinas inactivas presentes en mayor cantidad en las preparacionesmenos puras actúen como protectores de la enzima. Efectivamente, cuando se agregi a la mezcla de incubación enzima desnaturalizada por calentamiento, la acción de la OPdisminuye casiun 50%(Tabla l). En segundo lugar, la acción de la OPvariacon la temperatura de incubación (Figura 3). Asi para obtenerel 50%de inactivación cuando se preincuba a 30°C, la enzimatiene que estar en contacto con la OPdurante 3l minutos, a 20o'Cdurante 41 minutos, a 10°C durante 132 minutos y a O°C durante 200 minutos.
Acción de los componentes del sistema enzimático de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura sobre la inactivación porQB. A fin de dilucidar el mecanismo de la inhibición de la OPse han hecho una serie de ensayos del comportamiento de esteinhibidor en presencia de los sustratos y activadores que constituyen el sistema enzimático: NAD,NADH,acetaldehido, ión potasio y cisteina; el acetato se omitió en razón de que forma uncompuesto sumamente disociado con la enzima.
Los resultados obtenidos se describen en la tabla 2. Seobserva que solamente la cisteina actúa comoun protector totalde la enzima frente al complejante. El acetaldehido aumenta ligeramente el efecto inhibidor de la OP, el NADen concentraciónmMtambién aumenta en forma significativa el grado de inhibicióndel complejante; a concentraciones más bajas de NADeste efectodisminuye. El ión potasio es ligeramente protector, en los tubos de incubación a los cuales no se les ha agregado potasio,ademasdc la notable disminución de la estabilidad de la enzima se observa un ligero aumento de la inhibición por OP.
En vista del fuerte efecto protector de la cisteina enpresencia de OP por una parte, y a su acción activadora de la
FIGURA 2
¡u Q
B
A5340x107mm
¡a 23 30 110 50 ¿o
Tiempo (min)Efecto del tiempo de incubación sobre la inactivacíón de laNADaldehido deshidrogenaua de levadura por el dietil ditioucarbamatoo 0.5 mg de proteína ae incuba a 2090 en Tris 0.1 MpH8.0 en presencia de ClK 0.05 Me inhibidor.Línea Aztestigo sin inhibidor;línea BzDDC0.3 mM;línea CzDDC5 mm.Lavacti—vidad enzimática se mide en 0.02 ml de la mezcla de preincubación,en los tiempos indicados y
U!
TABLA 1
Efecto de la act1v1_d_at_!capecifig de la enzima sobre la inhibi»
ci‘n- de ¿a NA)aldegdo deshidrogenasa de levadura yor la 0P.
Incupación a 2009, durante 120 minutos en 0.5 m1 de Tria 0.1 IgpH 8.0 con 61K0.05 y y las adiciones indicadas. Enzima calentada a lOO°Cdurante S pinutos. Se mide la aQtividad en 0.02 m1
g, unidad enzimática: 0.001 AE34./min.
Efnzima Actividad Adiciones Activlid.enz. l Inhibición
(mgr) específica AE340.103/min. %( u/mg).
IT,60 5083 Ningpna 117 -
0‘. 60 5083 0.10.3 mig . 3 97_0.60 5083 0.05 1311de enz.
. calentada . 126 —0.60 5083 0.05 m; de eng.
j. cale‘ntn OP 0.3 111MÉS 480.88 1734 ningun 65 -*0.88 1734 0P - 48 - _
A¿“oxÍÜ3/¡77/77.
200
100
50
5‘?
FIGURA 3
I l . J J I L
14D1
60 80 100 120
Tiempo (mín)Efecto de la temperatura sobre la inhibición de la actividad de la RADaldehido deshidrogenasa de levadura por laOP. 0.17 mg de enzima se incuba en Tris 0,1 M pH 8,0 enpresencia de ClK 0005 M y OP 0.3 mMa OQC (línea A').IOQC(B‘),209C (CV) y 309G (D')oLíneas A.B.C y D.testigos sin0P.La actividad enzimática se mide sobre 0,02 ml de la mezcla de preincnbación en los tiempos indicadoso
U.)
TABLA 2
¿ccign ¿rreversible de ¿a 0P en presencia de sugtrüoa z acumdores de la NAD99535150 desmdrgsegasa de levggura, \
C
8.6 pg de angina Bo 1110111339 230 durgnte 76 min l(exp. A) 6 67 min
(exp. B)en 1.0 de Tris 0.1 _l_d_pm 8.0 con FELK0.95 ¿llly las adiciones indicadas. La actividad se mide en 0.02 ml.
Exp. Adiciones Activ.enzimá- Inhibi- Protectioa3 ción ción
(AENOJO /1nin) fi 7‘
A -— ¡ 55 ... .._A op 0.3 mg lO 85
A Cisteína m! l 72 -..— ....
A Cisteina mayor!0.3 mg 72 a 190
A Acetaldehído 1,.7xlo'4g l 68 -- .A Acetaldehído 1,7x10’41g + 020.31% 6 91 -7A Acetaldehidc 8,4 x 10'"4 g l 63 -- -—
A Acetaldeh‘ído 8.4x10p4y30P 0.3 m! 3 94 -1.'L
A. Sin 01K 0,05 g l 30 -- -A Sin ClK 0.05 La+ 0P 0.3 mg 3 90 --—
B“ ... ‘ 69 - ...B 0P 0.3 mg 35 50 .-_
n NAD my. , 57 -—- -
n NADmig+ or 0.3 m! 5 91 -82
Bs NADHmy; l 59 .... ...
B NADHmg + OP 0.3 m! 29 52 —2
aldehido deshidrogenasa por otra, se buscó relacionar cuantitativamente amboshechos. Los resultados se describen en la ta
bla 3. se ve que hasta concentraciones de 0.01 mMde cisteinase obtiene protección. Hasta 0.05 mMde cisteina existe unarelación cuantitativa entre el poder protector frente al complejante y la acción actiVadora de la enzima. Por debajo de esaconcentración el poder protector disminuye más rápidamente queel efecto activador.
Acción de Varios complejantes de metales sobre la inacti
vación por OP. Comoevidentemente existe una relación entre laacción activadora de la enzimay el efecto protector frente a lainhibición por OPen el caso de la cisteina, y comoen el capi»tulo anterior se ha demostrado que también el DDCy la OHQac
tivan a la enzima en ausencia de cisteina, se quiere ver qué efecto tienen estas sustancias frente a 1a inhibición irreversible por OP. De acuerdo con los datos de la tabla 4 se ve que tanto el DDCcomo la OHQen concentración l mMprevienen completa
mente la acción de la OP 0.3 mM.Por el contrario, la azida sódica, la tiourea, el d¡°¿—dipiridilo y el cupferrón, que no inhiben la acción enzimática o sólo lo hacen en grado menor y queno activan a la enzima en ausencia de cisteína, no solamente noprotegen a la enzima sino que aumentan el efecto inhibidor de laOP.
Stoppani y Milstein (8) encontraron que también el cianuro,el BAL,el glutatión, el EDTAen concentraciones por debajo del mMy la histidina, son activadores de la enzima en ausencia decisteina.'En la tabla 5 se comparael efecto activador de estassustancias con su poder de protección. Se observa que el cianuroy el EDTAl mMtienen una acción protectora similar al de la cisteína. El glutatión, la histidina y la glicina son ligeramenteprotectores, la glicina sin embargono es activadora. La glicilglicina y la diglicil-glicina que no son activadores no modifican la acción de la OP. El BALque es un actiVador tan eficaz
comola cisteina, presenta un comportamiento_singular, produceuna inhibición irreversible de la enzima,siendo la inactivaciónmenor en el tubo que contiene 0P, comosi ésta protegiera la enzima de la acción del BAL.
De estos resultados se puede concluir que los activadoresson los únicos complejantes de metales que se comportan como
TABLA 3
Ccnparacign de la acción prgtoctora de la ciateina respecto a 1aOB¿Ícon4}aügggiónde la cisteina agbro 1a actividad de la enziuz_n_a_.
Ex arde pgotección210.36 mgr de proteina se incuba durante 72 nun:en 0.5 m1 de Tris 0.1 g_puzp.o con ClK 0.05 y, OP 0.3 pg y cisteina, o cisteina solamente. La actividad se mide en 0.02 m1 de
meacla. Actividad del testigo sin cisteína ni CP (¿3E340.lO3/min):53. La inhibición por 0P sa calcula respecto al taatigo con lamismacantidad de cisteína. Expt de activación: 0.;4 mgr de protpina disuelta en 3 ml de Tria 0.1 y pH 8.0; Cl; 0.05 M, NAD0.45 mgy cisteina en 1a concentración indicada. Acetaldehido seagrega al final en concentiación 17 x lohsnActividad con cistein
na m! (A E34O.lO3/min), 44.T ï
I . .
Exp. de protecciég Eag¿_de agjixaciónCisteína Inhibición Protección Actividad en relación
GnM) Con oia- Con OPy por ciatei- al testigo cpn cieteina pin ciatei-t na respecto teina my (%).0P (%). na (76). a OP (7€).
p - 79 - 0JIKKY 2} 4 95 100
100 6 20 75 75
50 —2 35 56 61
10 -9 63 21 41
5 -13 80 —l 23
l —6 77 3 5
TABLA 4
Acción de la OPsobre la aldehido deshidrogcnasa de levadura en
presencia de otros cqulejantes degggtales.l I
0.68 ag de enzima se incuba a 22fC durante 90 min. en 0.5 ml deTris 0.1 Mpn;presencia de ClK0.050 y, y las adiciones indicasdas, a pH 8.0. Actividad se mide en 0.02 ml. Lap inhibicionesse calculan respecto al testigo correspondiente.
Adiciones Activ.enz‘ at. l Inhibición Protección¿13340 x lO /min. (%) respecto a
0P (%).
-— l 282 —— .—_
OP 0.} mg 99 65 -a
DDC 1,5 my; I 215 24 - -_—
DDC 1,5 my + 01310.3 mn_II 224 -4 106
OHQ11.5 -_ ,. 234 17 -
OHQ1.5 mM+OP0.3 m?! 245 -5 101
Tiourea 1,5 my l 221 22 __
Tiourea 1.5 meOP 0.3 m! 26 88 —35
Azida sódica 1,5 mM l 234 17 -—
Azida sódica 1.5 EMÏOP0.3 m! 3 99 -52
¡x,m'-Dipiridilo 1,5 mM_ í 164 42 -—
Nfli‘-Dipiridilo 1.5 meOP 0.3 m! 12 92 -42Cupferrón 1,5 mM 314 -11 -—I
Cupferrón 1.5 mMjOP0.3 mM 94 70 -8
TABLA 5
Comparaciónde la acción protectora de cogglejantea de metales,reapecto a la OP, coa su accigg sobre la ¿gtividgg de la enzima.Exp, de protección: 0.50 mgr (exp. A) ó 0.92 per. (exp. B) deproteina se incuba a 19°C durante 66 min (exp. A) 6 55 mip.(exp.B) en 0.5 ml de Tria 0.1 oa ppesencia de ClK 0.05 H, 0P 0.3 m!y la adición indicada; pH 8.0. La actividad enzimática se mideen 0.02 ml de mezcla. Actividad del testigo sin complejante
(¿:E34O.lO3/nin): 58 (exp. A) y 55 (exp. B). La inhibición por0P se calcula respecto al teatigo tratado cpn la mismacantidaddel aegundp complejante. Ezp. de ¿gtiVación. 52,ng (e;p.A) ó32/ug (exp. B) de proteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 M_pH8.0.Acetaldehido se agrega al final en concentración 17 x 10-5M. Actividad del testigo tratado con ciateina mg: 45 (exp. A) y 42 (exp.B)¿
E __¿
Ex rotección Exp.activaciónInhibicign Protección'l Actividad res ec
Exp. Adición Con adi, Con 0P por el comp p . _ to al testigoclón Sin Y adi’ Pleaante res con cisteina mM0P fi ción ! pecto a OP í
A Ninguna -: 69 -- 18A Cisteina mg 16 O 109 190
A Histidina mg 5. 58 16 62
A Glicina mg —2 57 18 15
A Glicilglicina mg-7 82 -17 9
B Ninguna -— 190 -r T“
B BAL m! 85 67 —- 8}
m Glutatión mg 31 89 lo 16B; Cianuro m! -7 -6 106 3m.
B EDTAmy -g -o 108 on Diglicilglicina m! 16 100 o 7
protectores eficaces, si bien sólo con la cisteína se encuentrauna relación cuantitativa entre ambosefectos. De las tablas
4 y 5 surge que el BAL)CÉdeipiridilo, glutatión, DDC,tiourea,OHQy azida sódica en concentración del orden mMproducen una
inactiVación irreversible de la enzima, comola OP, pero en mucho menorgrado. En cambiola histidina, glicina, glicil-glicina y cupferrón no afectan la estabilidad de la enzima.
Acción del NADy sustancias deriVadgg sobre la inactivaciónpor OP. Se estudió el efecto que tienen los componentes del NADsobre la inhibición de la enzima por la OP, a fin de dilucidarcual es el responsable del aumento de inactivación de la OP enpresencia del NAD.Este efecto disminuye al disminuir la concentración del NAD,llegando a ser ligeramente protector en concentración 0.1 mM.
En la tabla 6 se ve que los nucleótidos de la adenina ANP,ADPy ATPtienen un efecto similar en concentración l mMal delNADen la misma concentración, es decir, potenciar la acción
de la OP sobre la enzima, siendo notablementemayor el efectodel ADP(del mismo orden que el NAD)y menos apreciable el del
ATP. El NADBproduce un aumento de la acción de la OP del mis
mo orden que el del NAD,lo que sugiere que el tercer grupo fosfato no influye en la inactivación por 0P.
La adenina que es un inhibidor competitivo del NAD,nomodifica la inhibición por OP, mientras que la nicotinamida la aumenta ligeramente. El único componente del NADque tiene unaacción ligeramente protectora frente a la 0P es el pirofosfato,que en concentración mMprotege un 21%.
También en relación al NAD se ha estudiado la influencia
de los análogos del mismosobre la inactivación por OP.Los análogos son sustancias que resultan de sustituir el
grupo oarboxamida de la piridina del NADpor un acetilo (APAD)o aldehido (PyAlAD)o de la desaminación de la adenina delNAD (deamNAD) o sus derivados (APdeamAD), (PyAldeamAD).
Comose verá más adelante, todos estos compuestos se combinan con la enzima, si bien los aldehidos no son reducidos ypor lo tanto no hay reacoión enzimática con ellos. Los resultados obtenidos se consignan en la tabla 7. Tanto el PyAlnDcomoel PyAldeamADque son inhibidores competitivos del NnDpero
que no son reducidos por la enzima protegen a la misma de la
TABLA E
Acción de la 0P sggxe la ENDaldehido deshidgggenaaa de levadura
an presengda de cogponentee del NAD l ‘ l
0.6 mg (exp.A), 2,2 mg (exp.B), 0.2 mg (exp.C), 0.8 mg (exp.D) ‘de enzima ae inpuban a 82°C durante 54 m}n.(exp.A), 63 pin (exp.Q), 25 min (exp.C) y 70 mdn (exp.D) en 0.5 ml de Trie 0.1 M pH
8.0 en presencia de le 0.05 g 0P 0.3 mgy la adicdón indicada 6solo con esta última. Actiyidad se mide en 0.92 m1. Actividad
del teatigo sin 0P (LxE340.103/min): 163 (exp.A); 65 (B); 28 (C)61 (D). La inhibición por 0P se calouda respecto al testigo tratado con la mismacantidad de adición.
l Protección
Exp. Adición Inhibición 32:13:63:;Con adición Gan 0P y a- to a OP (%)sin 0P (%) dlción (%)
A Ninguna -— 68 _.
A AMP 3 EM -5 94 -38
A ADP 3 mE 13 99 -46
A ATP 3 my; -4 82 -_2o
B Ninguna - 52 -_
15 AMP mg -12 64 —23
E ADPmy -13 93 -79
B: ATP mg -11 60 -15
C Ninguna - 93 Adenina 7 mg O 93 O
Nicotinamida 20 mg 11 100 -7
D Ninguna -- 57 ._
D Pirofosfato my -11 47 21D Pirofosfato 0,5 m! -10 48 19D Pirofosfato 0.1 mg -2 56 2
TABÏA 7
Acción de la OP sobre la NADqigenido_ggggifirogenqsgu g iexeqnggen presencia de análogos del NAD.0,31 mg. de proteina se incuba duranto 66min. (exp. A), 75 min,(exp.B y D) y 73 min. (exp. C) en 0.5 ml de Tris 0.1 N pH 8‘0 enpresencia de ClK 0.05 M, OP0.3mMy la adición indicada ó la adición solamente.Actividad se mide en 0.02 ml.Actividad del testigosin adición ni OP(¿1FBo.10 /min ): 102 (exp. A); 69 (exp. B); 115(exp. C) y 60 (exp. Í. La inhibición por OP se calcula respectoal testigo tratado con la mismacantidad de dinucleótido.
" nhibic ón .. C n 1 u- Ü n i u- Prote001ónExp. Adiciones gggó%%?%) gggó%%%%) (%)
A Nin _- 31 ___,vm_,_.i.A PyAlAD 0.6 mm —1o 18 58A APAD 0.6 mM O 62 -lOO
B' Ninguna —_ 71 __B NAD? 0.6 mM 4 86 —2lB PyAldeamAD 0.6 mg ll 13 82
C Ninguna -- 36 -—C NAD 0.6 mM 3 58 —61C PyAlAD 0.6 mM 3 18 50C APAD 0.6 mM 19 100 -202C DeamAD 0.6 mM 9 59 _64
D Ninguna —— 55 __D APdeamAD 0.6 mM 7 52 6
acción inactivadora de la OP, mientras que el APADy el deamNuD
la eXageran; la APdeamADla modifica escasamente.Acción de varios cationes monoy divalentes sobre la inac
tivación por 0P. La NADaldehido deshidrogenasa de levadura requiere cationes para su actividad, actúa con K+y con Rb+,'y con
NH4+en menor grado. El Na+, Li+, Ca+, Mg++yBa++ son inhibidores de la misma.
Se ensayó la acción de varios cationes monoy divalentespara ver si tienen acción en la inhibición irreversible por OP.Los resultados se resumen en la tabla 8. Se ve que el único ca —tión que protege totalmente la enzima de la acción de la OP esel Zn++ puesto que forma ocn la OP instantáneamente un complejo
estable Zn(OP)3 (K = 1 x 10’17 a 25°C) (31) impidiendo de estamanera que se combine con la enzima. E12K+, Rb+y Sr++ son algo
protectores, mientras que el Cs+, Ba++, NH4+y Na+contribuyena aumentar la inestabilidad de la misma.
Discusión
La NADaldehido deshidrogenasa es inhibida por agentes quelantes de metales ya sea cuando se agregan directamente a lamezda en que se mide la actividad enzimática como cuando se preincuban con la enzima antes de medir la actividad.
ste efecto se observa con OP, DDC, OHQ,EDTA, cianuro,
Uuok'-dipiridilo y tiourea. Comparandola inactivación de laNADaldehido deshidrogenasa de levadura con la de la glutámicodeshidrogenasa (34) se ve que la acción relativa de los complejantes Varia según la enzima. Estas diferencias se deben a la nnturaleza de los grupos funcionales vecinos del metal (15).
Como la acción de la OP es mucho más marcada que la de
los otros complejantes, se hizo un estudio más completo con lamisma. La incubación con OPproduce una inactivación irreversible de la NADaldehido deshidrogenasa que depende del tiempoque dura la incubación, de la temperatura a la que se efectúala mismay de la pureza de la preparación enzimática. La irreversibilidad de la reacción queda demostrada porque al diluir150 veces la mezcla de incubación la inhibición subsiste)noobstante disminuir la concentración de OPa un nivel incapaz deinhibir directamente la enzima comolo demuestran los testigosincubados durante tiempos muybreves o a muybaja temperatura.Esta irreversibilidad sugiere una alteración permanenteen el
TABLA 8
Acción de la OP sobrg_;a NADaldghido dehidrgggnasa de leyggg:_——————__.r— ——._——
gg en presencia de cationgg_mono x divalentgg. 0.64 mg de proteina disuelta en 0.5 ml de Tris 0.1 MpH 8.0 in
cubados-durante 18 minutos ( exp. A)y 0.71 mg de proteina disueltta en 0.5 ml deTris 0.1 MpH 8.0 incubados durante 21 minutos(exp.B)en presencia de OPy cationes en las condiciones indicadasTemperatura de incubación 21°. Actividad se mide en 0.02 m1 de lamezcla de incubación.
Actividad enzim. Inhib. Protec.Exp. Ad1c10nes AE x10 /min (%) (%)34o
a ——- so -_ _A' 0P 0.3 mM 57 29 -—A ClK 50 mM 112 -4o ——A ClK 50 mM + OP 0.3mM 84 22 2oA ClNa 50 mM 94 -17 __A ClNa 50 mM+ 0P 0.3 mM 61 35 -2lA Cle 50 mM . 84 -5 -A Cle 50 mM+ 0P 0.3 mM 64 24 17A ClLi 50 mM . 71 11 -—A ClLi 50 mM+ OP 0.3 mM 52 27 7A Cle 50 mM 72 lO -—A C105 50 mM + 0P 0.3 mM 7 90 -2oo
A (NO )28r 50 mM 84 -5 -_A (NO ) Sr 50 mM + 0P 0.3mM 68 19 34A c1 a 50 mM - 124 -55 -A Cl Ba 50 mM + OP 0.3 mM 54 56 -48A Cl Ca 50 mM 76 5 -A Cl Ca 50 mM + OP 0.3 mM 54 29 -A olfiH 50 mM . 105 —31 ——
A C1NH4 50 mM + 0P 0.3 mM 60 43 -40
B -—- 186 -- __
B °P_°'3 “M 122 34 -B c1 Zn 0.1 mM . 124 33 -
B C12Zn 0.1 mM+ 0P 0.3 mm 129 3 91
centro activo comoconsecuencia de la unión del agente quelante
al átomo de Zn de la enzima. Efectos similares se observaroncon la alcohol deshidrogenasa de levadura y la glutámico deshidrogenasa de higado (33, 32).
Al estudiar el comportamientode distintos cationes metálicos frente a la acción inhibidora de la OP, se observa que solamente el Zn++ impide que la enzima sea inhibida. Esto se debea que el ión agregado compite con el Zn enzimático por la OP impidiendo de esa manera que ésta inhiba a la enzima. La neutralización de la inhibición de la enzima por la 0P a través de la
formación del complejo Zn (OP)3 confirma la hipótesis de quela inhibición de la enzima por agentes complejantes de metalesse debe a la capacidad de los mismos de formar complejos con
átomos de metal que son enzimáticamente activos.Se vió en el capitulo anterior que la NADaldehido deshidro
genasa de levadura requiere cisteina u otro complejante de metales para alcanzar su máximaactividad. De estos, la cisteina, elDDC, HOQ,EDTAy el cianuro son los más eficaces tinto en su ac
ción uctivzdora, comoprotegiendo a la enzima completamente contra la inhibición irreversible por la OP.En el capitulo anterior se habia encontrado una correlación entre la inhibición queejercen estos complejantes sobre la actividad de la enzima cuando se los agrega directamente al sistema enzimático y su poderactivador. De las observaciones efectuadas se sugirió que el mecanismo de activación y el de inhibición se efectúa sobre un mismo centro activaLa OP activa a la enzima (en incubación cortaen ausencia de cisteina) promoviendo la asociación del NADa la
proteina, domose verá más adelante es posible que los activadores ejercen su acción a través del mismomecanismo.
Otro componente del sistema enzimático que modifica la acción de la OPes el NAD.Esta sustancia tiene una acción diferente según la inhibición por OPsea instantánea o dependientedel tiempo. En el primer caso compite con el inhibidor y disminuye su efecto, en el segundo exagera la acción de la OP. Si lainactivación por 0P se debiera comoen el caso de la alcohol deshidrogenasa de levadura (34) primero a la formación de un complejo reversible En-Zn-OPy luego por una exposición más prolongada
se formaría un segundo complejo En-Zn(0P)n (n) 2), el NADinterferia en la formación del primer complejo, pero favoreceria la
del compuestoEnz-(OP)nque al ir desnaturalizándose irreversiblemente, desplaza lentamente el equilibrio en el sentido de laenzima inactiva.
A1 estudiar la acción de los compuestos del NADse encon
tró que los nucleótidos adenilicos AMP,ADPy ATPejercen lamisma acción potenciadora sobre la OP que el NADen iguales concentraciones a pesar de que el pirofosfato es ligeramente protector. Igual efecto tienen el deamNADy el APAD,análogos delNADque son reducidos por la enzima. En cambio el PyAlADy el
PyAldeamADque no obstante reaccionar con la proteina, como lodemuestra su acción inhibidora respecto al NAD,no son reducidospor la enzima, la protegen de la acción de inhibidor, el NADPy el APdeamADno la modifican sensiblemente.Existe por lo tantouna relación entre el comportxmientoen el sistema enzimáticapor una parte y sobre la inactivación por 0P, por la otra.
Esta diferencia en el comportamiento del NADy análogosfrente a 1a acción de la fenantrolina es probable que se deba ala influencia del sustituyente piridinico y del grupo aminodela adenina sobre elpirofosfato de la molécula que, consider;ndoque de los componentes del NADes el único que ejerce acciónprotectora frente a la inhibición por OP, se puede suponersea uno de los centros de unión del NADcon el Zn de la enzima.
Asi por ejemplo, el grupo carboxamida del NADforma con elpirofosfato un puente de hidrógeno (35) y disminuye su afinidadpor el Zn. Además, de acuerdo con el esquema de Van Eys y col.
(36) que sugiere que el centro activo de la alcohol deshidrogenasa de leVadura contiene dos grupos sulfhidrilos no reactivos,probablemente unidos al Zn, al combinarse la coenzima se romperian las uniones S-Zn quedandolibres los dos grupos sulfhidrilos para unirse, uno con el grupo amino de 1a adenina y el otroal N de la nicotinamida y el Zn tendria libres Valencias adicionales que permitirían su unión con otra molécula de OP;
Por otra parte, en el NADHy en los análogos aldehidicos,al no tener lugar el puente de hidrógeno con el grupo sustituyente de la piridina no se modifica la carga del pirofosfato,por lo tanto hay una mayor afinidad del pirofosfato por el Zn,este efecto contrarrestaria la rotura del puente de sulfuro.
En cuanto al comportamiento del ADPse puede explicar sugiriendo que el grupo amino de la adenina neutralizaria la ac
ción protectora del pirofosfato.Conclusiones
1) La 0P, DDC, OHQ,EDTA,cianuro, ok,o<'-dipiridilo y tiourea inhiben a la NADaldehido deshidrogenasa en forma irreversible cuando se los incuba con la enzima durante distintos periodos de tiempo. Esta inhibición depende del tiempo que durala incubación, de la temperatura a la que se efectúa y de la pureza de la preparación enzimática.
2) Aquellos complejantes de metales ¿ue activan a la enzimaen ausencia de cisteina y la inhiben instantáneamente cuando seagregan directamente al sistema enzimático, actúan Comoprotectores de la misma, frente a la acción de la OP.
3) El Zn++ que forma con la OP un complejo muy poco diso
ciado, protege a la enzima de la inhibición por OP.4) El NADaumenta el poder inhibidor de la OP sobre la NAD
aldehido deshidrogenasa de levadura. De los componentes del NAD,el ADPes el único que ejerce igual acción que este, el AMP,elATPy la nicotinamida aumentan sólo ligeramente el poder inhibidor de la OP. El pirofosfato en cambio es algo protector. ElNADHno ejerce ninguna acción, el NADPse comporta igual queel NAD.
5) Aquellos análogos del NAD, PyAlAD y PyAlaeqmgm que sibien son inhibidores comgetitivos del NADno son reducidos porla enzima, protegen a la mismade la acción inactivadora de la0P. En cambio el APADy el deamNADque son reducidos por la en
zima la exageran
. CAPITULO VI
ACCION DE LOS COMPLEJANTES DE METALES SOBRE LOS COMPUES
TOS ENZIMAFSUSTRÁTOS DE LA NAD-ALDEHIDO DESHIDROGEHASA DE LE
Laala. 'La velocidad de las reacciones enztnáticas depende de la
formación de un compuesto activo enzimamsustrato y tanto laactiVación comola inhibición de las mismas se puede explicarpor la acción del activador (inhibidor) sobre el compuestoactivo.
Se vió en capitulos anteriores que la NADaldehido deshidrogenasa.de levadura requiere un activador (2, 8), cisteína uotros complejantes de metales, para desarrollar su actividaden forma completa. Estos mismos complejantes de metales actúansobre la enzima de dos maneráidistintas: a) la inhiben instantáneamente en forma reversible en concentraciones altas y b)la inhiben irreversiblemente después de un contacto suficientemente prolongado con la enzima.
Una visión interna de la forma de interacción se puede obtener a través de estudios cinéticos de inhibición que indicansi la reacción es reversible o si se puede prevenir y si existecompetición entre el agente quelante, el sustrato y/o la acenzima por el centro activo.
En el caso de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura,se analizó 1a formación del compuesto activo (39, 40) pero nose pudo demostrar la manera de actuar de los activadores sobreel mismo (8). El haber encontrado que la OP en concentracionesbajas y en ausencia de cisteina tiene la mismaacción que ésta,permite establecer una relación entre la acción de los activadores y la formación del compuesto activo enzima-sustrato.
RESULTADOS
l) Necesidad de activadorgpara la reacción enzimática. Enel capitulo IV se vió que algunos complejantes de metales actúan comoactivadores de la enzima en ausencia de cisteina cuando
el aceptador de hidrógeno es el NAD.Se estudió el comportamiento de los mismos complejantes cuando se cambia el aceptador dehidrógeno por análogos del NAD; deamNAD,APdeamAD.D0 los re
sultados que se resumen en la tabla 1 se Pueden sacar variasconclusiones; a) La Velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador depende de la coenzima presente en el sistema
TABLA l
ActivacióndelaNADaldehidodeshidrogenasadelevaduraporcqulejantesdeggtales
1704ug(exp.A)y50,ug(exp.B)deproteínadisueltaen3mldeTris0.1MpH8.0enpresencigdeClK
b.05M,coenzimas0.45mMyadicionesenlaconcentraciónquese3indican.Acetaldehido17xlOMseagrega
alfinal.Lasactividadesenzimáticasseexpresancomo(QE34Ox10/hin.)
Expo“mms¿33HMDcIÍSÉEÏï'12823%“¿552233¿33??3233¿BÉHZAPADEÏÉÉÉÏÉSfi
ANinguna9141836x9¿100.0ACisteinamM65100501008810024100ACianuromM385861267761875ACianuromM+CisteinamM88135-—----AEDTAmM7111428-—-—--AEDTAmM+CisteinamM67103--—---—AEDTA035mM4975-----AEDTA0.5mM+cisteínamM70108-----AEDTA0,25mM—--27549711027112AEDTA0105mM5991-._—_...__-AEDTA0.05mM+cisteínamM78120----——AHistidinamM5686387675851875ABALmM77118511009110328117ASNa2mM5686428479902083AOPmM5584408045511354AOHQmM5483367277871667BNinguna1814-—----BCisteínamM125100-----BDDC5mM4o32-—-_-_..._..:6Adenina9mM32-—-—----—
enzimático, así con APADla reacción no se produce; con NADy
APdeamADla velocidad de la reacción enzimática es 9 y con
deamNADes de 18. b) Los complejantes no tienen el mismo efec
to activador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemasenzimáticos a los cuales se agregan tienen distintas coenzimas.Por ej. el cianuro mMproduce las siguientes activaciones (%):58 (NAD), 12 (deamNAD), 76 (APdeamAD) y 75 (APAD), mientras que
con la OHQse obtiene: 83 (NAD). 72 (deamNAD),87 (APdeanaD) y
67 (APAD). c) En el caso del EDTAque en concentración altaproduce inhibición (efecto activador aumentaal disminuir laconcentración de l mMa 0.05 mM), el agregado de cisteina contrarresta la inhibición. d) Si se agrega al sistema enzimáticosimultáneamente dos complejantes que producen activación significativa, la velocidad de la reacción es mayor que si se agregara cada uno por separado, pero menor que la suma aritmética delas acciones individuales. e) De los complejantes ensayados conNADcomo aceptor de hidrógeno, el EDTA(0.25-0.05 mM)y el BAL
mMson tan eficaces comola cisteina, la histidina, OP, OHQyel sulfuro activan algo menos mientras que el cianuro y el DDCson muchomenos activadores. La adenina no obstante complejaral cinc, carece de acción activadora.
El hecho de que la cisteina pueda ser reemplazada por otrocomplejante de metales en su acción activadora, que pueda con
trarrestar el efecto inhibidor a concentraciones altas de EDTAy que no se sumenlos efectos activadores individuales de cisteina y otro complejante activador cuando se agregan simultáneamente el sistema enzimático)indica un mecanismo comúndeacción.
2) Acción de los complejantes sobre el complejo enzimaggggglgg. La cinética de la NADaldehido deshidrogenasa se puede analizar en forma simplificada manteniendo constante laconcentración de los componentes del sistema excepto uno (39,40). La velocidad de la reacción es entonces función de la concentración del sustrato variable y la representación de la recíproca de la velocidad en función de la recíproca de la concentración (Método de Lineweaver-Burk (41)) permite calcular cnbase a la ecuación de Hichaelis-Menten (44);
l/v = 1/vm + ¡{NAD/vm (NAD) (1)
el valor de K aparente correspondiente al componenteestudiado;suponiendo que ¿Ste sea el NAD,la ecuación (l) permite el
cálculo de KNADy Vm, es decir, la constante de Michaelis delcomplejo enzima-NADy de la velocidad máxima aparente (Vm) de
la reacción enzimática respecto al NAD.KNADse calcula por larelación entre la pendiente (Km/Vm)y la ordenada al origen(l/Vm) de las rectas respectivas y Vmse obtienen directamentepor el valor de la ordenada al origen.
Acción de la OP en ausencia de cisteina. Comoya se vióen el capitulo IV, concentraciones bajas, O.33-l.3 mm,de 0Paumentanla velocidad de la reacción enzimática; en la figura lse ve que disminuye l/v, si bien todas las rectas se cortan enel mismoValor de la ordenada o sea que todas las reacciones
tienen la mismavelocidad máximaaparente)lo que significa quela OP no actúa sobre la velocidad de descomposición del complejo
ternario activo en productos de reacción. KÑADdisminuye de 13a 2.8 x 10'4ma a la enzima.
M indicando un aumento de asociación de la coenzi
Si se aumenta la concentración de OP, se pone en manifiesto el poder inhibidor del mismocomose ve en la figura 2. Seobtienen rectas convergentes en el mismovalor de la ordenadao sea que la OP no modifica la velocidad de descomposición delcomplejo; l/v aumenta a medida que aumenta la concentración de0P lo que indica inhibición de la actividad enzimática por elcomplejante y las pendientes de las rectas aumentan, lo que determina un aumento de las constantes de Michaelis; la OP influye sobre la formación del complejo enzima-coenzima. dismhmdyerr
do su concentración. Los Valores de KNADvarían de 4 a 19 x 10-4M cuando la concentración de OP aumenta de 1.3 a 10.5 mM.
Acción de la OP en nresencia de cisteína Cuando se trabaja enpresencia de cisteina se obtienen resultados similares, es de
cir, los KNADaumentan, los valores que se obtienen son 7.4,12.5 y 29 x 10'4
0, 5.2 y 10.5 mM(Figura 3); la Vmpermanece invariable.
M que corresponden a concentraciones de OP de
Si se representan los datos de la figura 3 comoinversasde velocidad en función de la concentración de OP, se obtienenrectas (figura 4) para las distintas concentraciones de coenzima¿que se cortan en un punto correspondiente a V_l= 0.15 x lOy (0P) = -4.2 x 3.0"3 M. La linealidad de los datos de las in
2
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[NADJ" (M'x 103)OP la actividad ehzlmátiga u varias
n de Cirteínz. Bgflg dcpresencia de C]\
habreNAD en
lacoycentrqciones
deinfluenciade 'ÜUIJQINÍL
I ‘ . - , . » _ . ‘prPLean :1319Lïw en irls 0.1 ¿ ¡d 8.( anC.O5 R y LABen las concentraciones que Ke jmvihaaw. “cgïildCHLHO17 X 10-9m se agrega al final. 0P (TF): (,;) (Íínea h), G.6? (B) y 1.3 (U).
¿19985.3
I I l l I l .
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10 15 20 25 30
[NAD/‘x/M‘}1o3)Influencia de OPsobre la actividad enzimática a varias con
mh
centraciones de NAD,en ausencia de ciqteína. Condiciones ex;
como en 13 figura I OF;(MM); 10.5 (línea A),Í . ' y,"\B) VJ).
perimeñtalcs5.2
1/"x10-2
Mi l l l
10 20 ¡o
[NA0]" (M1109¿ufïuenciz de 1a “P sobrc la activ1fiafl enzimítica a varias
cancentraciones de NAD.ïyégzde proteína disuelta en í mlda Iris 0.1 h pd 9.0, en presencla de cisteínu mn, 31k 0.05y “¿y en las conCentruciones que se 1nolc2n. n0at.gden4do17 x 10- m se agrega al final 0P: 10.5 (línea «). 5.0 (B) y0 LJ).
versas de la Velocidad cuando se representan en función de laprimera potencia de la concentración de 0P indica que una molécula de inhibidor (0P) se combina con cada uno de los centros
activos de la enzima (42). El valor de KoP = 4.2 x 10’3 Mdeterminado por el método gráfico de Dixon (43) coincide con el ha
llado a partir de la fórmula Ki = i (KP=Kmen presenciade inhibidor) _ 1
a”La?“
3 M para una concentración de inhibidor de 8 mMigual a 4.2 x 10'y de 3.3 x 10’3mM.
Mcuando la concentración de inhibidor es de 1.5
Si se procede de la misma manera con los datos de la figura 2, se otienen rectas (figura 5) para las concentraciones altas de sustratos qie se cortzn en un punto que corresponde av“l = 0.25 x 10"2 y (0P) = -2.3 x io"3K = 2.3 x 10-3M. Para las concentraciones bajas de sustratoOP
y de inhibidor la representación correSponde a una recta, pero
M, lo que equivale a
cuando se aumenta la concentración de 0P se tiene una curva con
la concavidad hacia la abscisa o sea velocidades menores que lasque corresponden a un comportamiento linea1,como si al disminuir la concentración de coenzima aumentara la inhibición por OP.Es decir,que cuando se tiene una concentración de sustrato entre 0.5 y 0.12 mM,en ausencia de cisteina, deja de cumplirsela relación estequiométrica de mol de inhibidor por mol de centro activo.
Cuandose representan los datos de las inversas de velocidad de la figura l, en los cuales la 0P en concentraciones bajas y en ausencia de cisteina actúa comoactiVador, en funciónde la inversa de la concentración de activador (Figura 6) paravarios valores fijos de sustrato, se tiene para concentracionesaltas de NAD,1 y 0.5 mM,rectas que se cortan en un punto cuya
abscisa es igual a --l/KA (42). En cambio para concentracionesbajas de sustrato, 0.25 y 0,12 mM,la linealidad sólo se cumplepara las concentraciones más altas de actiVador; 1.3 y 0.67 mM,mientras que para concentraciones más bajas de OP la Velocidades muchomenor que la correspondiente a un comportamiento lineal, comosi disminuyese la asociación entre la enzima y la coenzima.
En la figura 7 se ve los resultados obtenidos con OHQen
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(método de Dixon). Cnnüicinnes exporimanï1iov cmwwen la figura 1.
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[NAD] " (M"x 107Influencia del OHQsobre la ac11vid2d enzimática avarias cnnpentrqciones de WÜU.VR/ág de prnteíra disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 F ph 8.0 en prQSania de31K 0.05 M, C‘steína mmy NADvn las chncentrqvlcnes
. . .. , ")‘. que se 1nd1can. Acetaldenldo 1/ x 10 M :e a¿raga al
final. OHQwfibfi(línea n), l (B) y O ai).
presencia de cisteina, las rectas que se obtienen a distintasconcentraciones de inhibidor tienen el mismoValor de la orde
nada en el origen mientras que KNADanuenta significativamente;1.5 x 10’4M en ausencia de OHQ; 2.2 x 10’4M (OHQ1 mM) y 4.o x
10‘4M (OHQ 2.5 mM).
Con DDCen presencia de cisteina, el gráfico de LineweavereBurk que se obtiene, corresponde también al de una inhibición
competitiva respecto al NAD(Figura 8). KNADpasa de 3.6 x 10'4M(sin DDC) a 4.3 x 10’4M (DDC 3.o mM) y 5.8 x 10'4M (DDC 626 mM).
Se ha intentado analizar en la forma descripta el efectoactivador de la cisteina pero se ha tropezado con la dificultadde que si bien a concentraciones bajas de cisteina hay activa-u'ción, la actividad decae tan rápidamente que imposibilita elanálisis cinético de la acción de la misma. Con concentraciones
altas (16 mM)no se observa inhibición inmediata de la reacciónenzimática.
3) Acción de los complejgptes de metales qnhrm e] complejo engima-acetaldehido. Si en el análisis cinético se mantiene constante la concentración de NADvariando la del acetaldehido y serepresentan los valores obtenidos de acuerdo al método de Line"
weaver- urk (41%se tienen rectas para concentraciones no demasiado altas de sustrato (40) cuyas ordenadas a1 origen dan la inmversa de la velocidad máximade la reacción respecto al acetaldehido y la relación entre la pendiente y la ordenada al orígen
da el KacetaldehidoLa adición de OP (Figura 9) o de DDC(Figura lO) da como
aparente.
resultado rectas que presentan un aumento mayor de la pendiente que de la ordenada al origen; las rectas que se obtienen condistinta concentración de inhibidor se cortan en un punto porencimade la abscisa negativa; El inhibidor afecta tanto a lavelocidad máximaaparente o sea la disociación del complejo activo, comola formación del complejo enzima-sustrato.
5Los valores de Kac obtenidos son de 1.84 x 10- M (sin
OP) y 2.14 x 10-5M (OP ÉÏ6 mM) y de 1.84 x 10-5M (sin DDC),
3.39 x 10'5M (DDC 3.0 mM) y 3.32 x 10"5 M (DDC 8 mM).
'Ée han realizado experimentos similares con concentraciones bajas (0.3-l.3 mM)de OP, sin cisteina. Las rectas correspondientes dan intersecciones distintas en la ordenada o sea
comoen la inhibición, la OPmodifica Vmrespecto al acetalde
Ylfiufinwf
l l l l L
A4 e e 1o 42
[NAD]"/M"x 703/TN)’
«Infïueaciu de DDCsobre la actividad enzimática a varias,
concentraciones de NAD.ISI/kg de proteína disuelta en3 ml dp Tris 0.1 M pH 800 en presencia de 81K 0.05 M,cisteína mmy NADen las concentrficiones que se indian.Acetalflehido 17 x 10 "5 H se agrega al final. DDC(mm):6.6 (MMM). 3 (B) y 0 (c).
v"x10"
EJNÉAÉ
3 ..
2.3-
16" q
14- “22.- B _ “
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aal- . l l l l lha 50 v
[Ace ta/ dehíc/o] Ï/M 710")Acción de la OP sobre la actividad enzimátlca 2 vnrlas concen
30
traciones de acetaldehido. 82/Qg de proteína Riquelta en 3 m1de Tris 0.1 H pH 8.0, en presencia de 01K 0.05 M, NAD0.45 mm,Cisteína mMy acetaldehido agregado al final en Las concentraciones que se indican.
10"
-I
VX
1.8
2.6
l l l
40 20 30 40 50
[34cefalc/eh/c/OJ'Í/M'ÏíO‘lDDC
deInfluencia ¿al
aceta en 3 m1 de Tris 0.1
, NAD O.%5
con cc nt m ci “¿7‘35?
concentraciones
cisteíwñ WMen las
(a)y (a).
sobre la activifiiá enzimática a eriasde Urotuína iisuel
CLK 0.05tu ‘1. ni o Ja1 Ag
M pH “.0, en QFBSGÚCha M,(18
‘É finalmE y wget» dehifim a regado a‘ _‘ _. A; , , - v .1 g,que a4ï_u1}¿c4p. ¡Luj (ma). O (-1nea A),
hide.4)Efecto de los complejgptes sobre la reactividad de los tiolesggzimáticos.'En un trabajo anterior, Stoppani y Milstein (8) de”mostraron que la enzima tiene grupos tioles necesarios para laactividad enzimática por cuanto es inhibida por reactivos que sesabe actúan sobre esos grupos y que probablemente el tiol intervenga en la unión con la coenzima ya que ésta los protege contralos inhibidores especificos.
Se estudió el comportamiento de los complejantes de metales frente a la acción del o-iodosobenzoato y del óxido de me;larsen; los resultados se resumen en la tabla 2; se ve que tanto la 0P como la OHQaumentan la sensibilidad de la enzima hacia
estos reactivos, comosi liberaran grupos tioles haciéndolos más
accesibles, ya sea a la coenzima (fenómenode activación) ya seaa otras sustancias capaces de reaccionar con ellas,como son losreactivos de tioles.
DISCUSION
Experimentalmente se pueden distinguir Varios tipos de inhibición por acción de una concentración fija de inhibidor, sobrelas pendientes e intersecciones con la abscisa)de gráficos develocidad inicial de acuerdo almétodo de Lineweaver-Burk (41).
Se pueden interpretar teóricamente incluyend01en el esquema dereacción propuesto por Michaelis-Menten (44) par; una reacción
de un sólo sustrato l/v = l/Vm + KNAD/Vm . (NAD) los compues
tos EI y ESI,con constantes de disociación KEI y KESI respectivamente (45). La relación general toma la forma
l/vo = (1 + i/KESI) / v + (l + i/KEI) Km/V.s
Cuando el agregado de un inhibidor resulta en un aumentode la pendiente pero con una intersección con la ordenada invae
riable, indica una inhibición competitiva (KESI:00), la inhibición disminuye a1 aumentar la concentración de sustrato.Pendientes invariables con aumento de ordenada al origen, esdecir gráficos paralelos corresponden a una inhibición incompe
titiva (KEI=uc.-).La explicación habitual de este tipo de inhibición es que el inhibidor se combina solamente con el complejoES (46). Cuando por el agmgadode un inibidor, en el gráfico deLineweaver-Burk se observa que la pendiente comola ordenada alorigen aumentan en 1a misma proporción se tiene una inhibición
TABLA 2
Acción de los complejantes de metales sobre la inhibición de laNADaldgpido dgehidroggnasa de levadura por reactivos de tioles.
0.60 mg ( exp.A y B ), y 0.80 mg (exp.C) de proteína disueltaen 0,5 m1 de Tris 0.1 MpH 8,0 se incuban con las adiciones indicadas durante treinta segundos. La actividad se mide en 0.02 mlde la mezcla de incubación.
Actividad enzim. Inhib.Exp. Adiciones AE 34ox10 /min. (%)
A Ninguna 63 -A o-iodosobenzoato 0.12 DM 6 90A HOQ 5 DM 60 -—A HOQ 5 EM + O-iodosobenzoato 0.12 DM O 100A OP 5 UM 57 -A 0P 5 BM + O-iodosobenzoato 0.12 UM O 100
B Ninguna 89 -B 0-iodosobenzoato 0.03nM 50 44B HOQ 5 UM 72 -B HOQ5 nM+O-iodosobenzoato 0.03 2M 23 68B 0P 5 DM 72 -B OP 5 DM+ o-iodosobenzoato 0.03 nM 32 55
C Ninguna 63 -C Melarsen 0.01 EM 23 63C HOQ 5 UM 58 -—C HOQ 5 mM+ nelarsen 0.01 uM 18 69C 0P 5 nM 51 -C 0P 5 DM+ nelarsen 0.01 UM 9 82
no competitiva__(KEI = RESI), el efecto de un inhibidor no competitivo no disminuye por aumentode la concentración de sustrato;
esto podria deberse a una combinación del inhibidor a un centrode la enzima de manera que no influye sobre la unión del sustra
to a la misma, Kminvariable, pero si sobre la velocidad de descomposicion del complejo activo.
Existen también tipos mixtos de inhibición; aquellos en quese observa proporcionalmente un aumento mayor de 1a pendiente
sque de la ordenada al origen corresponden,al tipo competitivo-no
competitivo (KEI<KESI),el inhibidor afecta tanto la velocidadmáxima como la formación del complejo enzima-sustrato (42). En
cambio cuando el aumento de la ordenada al origen es mayor que
el correspondiente a la pendiente,(KÉi>KESI) se tiene una inhibición del tipo no competitivo-incompetitivo (45).
La NADaldehido deshidrogenasa necesita un activador para
alcanzar su máximaactividad enzimática (2,8), Tanto la cisteina comootras sustancias que se conoce son capaces de complejar
metales,actúan comoactivadores de la enzima. Se tiene evidenciade que la cisteína actúa sobre el mismomecanismo que los otroscomplejantes de metales por el hecho de que ésta puede anularel efecto inhibidor producido por concentraciones altas de-EDTA.de que se comporta comoprotector frente a la inhibición irreversible de la enzima por la OP, de que no se suman los efectosactiVadores individuales cuando se agrega simultáneamente cisteina y otro activador al sistema enzimático.
La activación de las enzimas por complejantes puede debersea dos causas (8); a la eliminación de metales pesados que contaminan e inhiben a la enzima, o a la formación de un complejo activo complejante-enzima. Todas las preparaciones enzimáticas están contaminadas por metales pesados, su completa eliminación esmuydificultosa (47) dependiendo del grado de afinidad que tenga la enzima por el metal contaminante, por lo que no se puedeafirmar que la preparación enzimática estudiada no se encuentreincluido en este caso. Sin embargo, el que la 0P en concentraciones bajas y en ausencia de cisteina, es decir en las condicionesen que actúa comoactivador. influye sobre la formación del com
plejo enzima-coenzima disminuyendo el valor del KNADaparente osea favoreciendo la asociación de la coenzima a la enzima, sibien no excluye una posible remoción de metales pesados,indica
que el mecanismode activación implica una acción directa de la
OP sobre la formación del compuesto activo. La variación de KNADdiferencia netamente el efecto activador de los complejantes
del de los iones metálicos (40% que no modifican KNADy si au
mentan Vm.
Los datos de las figuras 3,7 y 8 indican que la coenzimacompite con la OP, DDCy OHQ,por un centro activo que proba
blemtne involucra un metal. Además, el hecho de que se obtenganrectas al representar inversas de velocidad en función de laconcentración del inhibidor para distintas concentraciones decoenzima (figura 4),indica que por cada centro enzimático secombina una molécula de inhibidor (42). Resultados similares seobtuvieron con la alcohol deshidrogenasa de higado de caballo(48) y de levadura (34) los que fueron confirmados por medidasespectrofotométricas (49).
Las figuras 9 y lO muestran gráficos de Lineweaver-Burkcuando se varia la concentración de aldehido, los datos que seobtienen, rectas que no se cortan sobre un punto de la ordenadasino que presentan un aumento mayor de la gendiente que de laordenada al origen, de acuerdo con la discusión anterior corresponde a una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo(45).
Resultados semejantes; inhibición competitiva de OP, DDCyOHQrespecto a la NAD,se observaron con 0P y deshidrogenasasque contienen Zn (50, 48, 51). Si se asocia ese efecto a la in»activación irreversible de la enzima por OPtambién similar ala observada con Zn deshidrogenasas (34) y a la inhibición mixta competitiVa no competitiVa respecto del acetaldehido descripto también para la alcohol deshidrogenasa respecto del etanol(45)>se puede postular de que el Zn juega el mismo papel en laaldehido deshidrogenasa. Sobre esa base se puede aplicar a laaldehido deshidrogenasa los modelos propuestos para la alcoholdeshidrogenasa. Basándose en una hipótesis de trabajo propuestopor TheoreIl y Chance en 1951 (53) se tienen las siguientes ecuaciones;
E + (NADH);‘—==":> - NADH
E - NADH+ CHBCHO+ ¡{É-mes - NAD + C2H50HE - NAD¿;====E + NAD
E+OP\=————-‘— —0P
Este mecanismono excluye la existencia de complejos binarios E-alc. y E-ald. o de los complejos ternarios E-NADH-aldyE-NAD-alc. que se asocian e intercomvierten lo suficientementerápido comopara no influenciar la velocidad máxima. Se postularon una serie de mecanismos de acción a partir de datos experimentales obtenidos estudiando la cinética de la reacción en presencia y ausencia de inhibidores.
Vallée y ool. (49,50) deducen de los datos obtenidos,quela coenzima se une a la enzima a través del Zn, inhibición competitiva entre OPy coenzimas, mientras que el sustrato al no presentar un comportamiento estrictamente competitivo no puedeestar unido al Zn en complejos ternarios, pero si en sitios cercanos al mismo, ya sea sobre la enzima (52) o la coenzima (29).
Theorell (54, 55, 56) basándose en un mecanismo de orden
casual,explica la ausencia de una competición estricta entre lossustratos y la 0P de la siguiente manera; el cinc octahódrico seencuentra unido rigidamente a la proteina por tres uniones coordinadas de manera que las tres Valencias libros del metal estándirigidas de una manera constante y no son necesariamente equivalentes. Los ligantes bidentados comola 0P, OHQy‘XfÏ -dipiri—dilo son estrictamente competitivos con el NADcomo es de esperarse si hay solamente tres valencias libres y la adenina dela coenzima forma también una unión bidentada a través del gru
po amino del 06 y del N en posición 7. Al no ser las valenciaslibres equiValentes postula que los ligantes bidentados sólo pueden usar los mismos dos centros de coordinación que la coenzimapor lo tanto no compiten con el sustrato por el tercer centrode coordinación. El comportamiento parcialmente competitivo deletanol lo atribuye a un efecto estabilizante mutuo del NAD+ydel alcohol (N+—alc-- Zn) en el equilibrio:
I , ——— .
/ ! 0;? / i NAD [5- /5.: ¡Zn _._.___..'; ,Z,n\\.___i l.
/// ¡A <——“‘—‘ ' \\ Í - - n-\..__¿\¿/\\ alc \ c 2H5oM_\ Aun aumentode la concentración de alcohol desplaza el equilibrio hacia la derecha simulando de esa manera un cierto gradode competencia entre el alcohol y la 0P.
Una representación esquemática del complejo ternario de la
alcohol %%shfigrogenasaseria el siguiente:
Dalziel (45) demuestra sobre la base de un mecanismo de ordencompulsivo en el cual la coenzima se une primero a 1a enzima,que un inhibidor que compite con la coenzima en general exhibediferentes tipos de comportamientocon relación al sustrato.El esquema de Dalziel se transforma en z
E + I ¿tilï EIE + C (“‘73 EC
EC + S e_——¿ ECS +==zi EC‘S' Q———4ÏEC' + S'
EC';———4\E + C'
La ecuación de la velocidad inicial en el estado estacionario, incluya o no a los complejos ternarios ECSy EC‘S' toma la forma:
e/vo =‘Ïo + WI (1 + i/KEI)/b +‘92/s +‘P12(1 + i/KEI)/c.sSi se mantienen constantes las concentraciones de sustrato
y de inhibidor y se varia la de la coenzima¡
e/vo = (‘90 + k{Je/s) + (“Pl 4412/8) (1 + i/KEIVCel efecto del inhibidor va a ser aumentar la pendiente por el
factor (1 + i/KEI) mientras que la intersección con la ordenada permanece inVariable. o sea un comportamiento competitivo.
Si se mantienen constantes las concentraciones de inhib‘dor y de coenzima, variando la del sustrato:
e/vo = («yo + V1 (1 + 1/KEI)/c] + [x92 Alza + 1/KEI)/c]/sel efecto del inhibidor va a ser aumentar tanto la pendiente cmmo el valor de la ordenada al origen, pero no necesariamenteen la mismaproporción. El tipo de comportamiento del inhibidorhacia el sustrato va a depender de los Valores relativos de
Kml(constantes de Michaelis aparente para la coenzima) y deKEC(constante del compuesto enzima-coenzima).Si km1: KECaumenta tanto la pendiente comola ordenada al origen en 1a misma proporción,indicando una inhibición no competitiva. Si
Kml(;KÉCla inhibición va a ser competitiva-no competitivao si la desigualdad es muygrande casi puramente competitiva.
O
Si Kml>KECla inhibición va a ser incompetitiva/ho competiti
va-incompetitiva. Se ha demostrado para una serie de deshidrogenasas que usan como coenzima nicominamida adenina dinucleótidoincluyendo láctico deshidrogenasa (57), alcohol deshidrogenasade levadura (58) y de higado (59, 605 y málico deshidrogenasa
(61) que para NAD+, Km1< KBC mientras que para la NADHKml) KEC.Se llega a la misma conclusión partiendo del mecanismo de
Theorell-Chance en el caso especial en que los complejos ternarios no sean cinéticamente significativos.
El mecanismo de orden compulsivo provee una explicaciónsimple de los datos experimentales: si el metal fuera el centrode un complejo tornario octahédrico con tres uniones a la proteina y dos a la coenzima bidentada no puede haber competiciónentre la OPbidentada y el sustrato monodentadopor el centrode coordinación remanente del complejo enzima-coenzima.
Puede concluirse que la cinética de inhibición con OP provee una evidencia válida de que la coenzima está unida al Zn enel complejo-enzima-coenzima de la NaDaldehido deshidrogenasa deleVadura y es consistente, pero no pureba la unión del sustratoal Zn.
El Zn está unido por tres valencias a la proteina, debidoa que la unión entre el Zn y la enzima es muy fuerte (54) probablemente una o dos de estas uniones sean del tipo zn-sulfuro(36); lo cual se ajusta a las observaciones reseñadas pues loscomplejantes, al liberar los tioles del compuestode coordinacióncon el Zn los harian más sensibles a los reactivos correspondientes.
Conclusiones
l) La velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador,depende de la coenzima presente en el sistema enzimático. Loscomplejantes no tienen el mismoefecto activador (comparado conla cisteina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales seagregan tienen distintas coenzimas.2) Los efectos activadores individuales de cisteina y otro complejante activador no se suman cuando se agregan simultáneamente al sistema enzimático.3) La cisteina y los complejantes de metales tienen un mecanismo común de acción cuando actúan como actiVadores. El mecanismo
de activación inplica una acción directa de la OP (activador)sobre la formación del compuesto.
4) 0P, DDC, y OHQcompiten con NADpor un centro activo; por
comparacióncon resultados similares obtenidos con otras deshidrogenasas que contienen Zn, se puede postular que el Zn es uncentro activo de la enzima por el cual compiten el NADy loscomplejantes de metales.5) OPy DDCpresentan hacia el acetaldehido una inhibición mixta del tipo 00m5itivo-no competitivo, este resultado es consistente con la unión del sustrato al Zn, pero no lo prueba¿6) Tanto la OP como la OHQaumentan la sensibilidad de la enzi
ma hacia los reactivos de tioles, o-iodosobenzoato y óxido demelarsen.
CAPITULO VII
REACCION DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE LEVADURA CON SUS
SUSTRATOS: NAD, ANALOGOS DEL MISMO Y ALDEHIDOS.
Kaplan y col. (62, 63) han preparado una serie de sustancias a partir del NADya sea sustituyendo el grupo carboxamidaen el núcleo piridinico por un acetilo ( 3-acetilpiridina ¡AD)o un aldehido (piridina-3-aldehidoAD), o bien el grupo amino dela adenina por un hidroxilo (desamino NAD,3acetilpiridina_dosa—minoAD,piridina-3-aldehido desamAD).Estas sustancias resultanmuyútiles en el estudio del mecanismode unión de la enzima conla coenzimaya que la unión implica la interacción de ¿nipos reactivos característicos de la enzimay del nucleótido respectivamente. Así comomediante el uso de reactivos específicos del grupo tiol y de complejantes de metales se vió que tanto la presencia en la enzima de SHcomoun metal son esenciales para la actividad enzimática; con la introducción de los análogos se puede verificar el papel de grupos claves del dinucleótido en launión con la proteina catalítica para formar el compuestoactivo del cual depende la velocidad de la reacción enzimática.
RESULTADOS
La reducción de las coenzimas se midió a 340 mp. Comoeldeam NAD,el APADy el PyAlADtienen absorciones específicas li
geramente distintas al NADen 340 mu, las velocidades iniciales(v) obtenidas en las reacciones respectivas se han corregidomultiplicando por los siguientes factores: deamNADy APdeamAD,1.07, APAD,1.14. Estos factores se han calculado en base a datos espectrofotométricos de Siegel y col. (64).
En la figura l y tabla l se ven las velocidades de reacción de varios análogos del NADen comparación con la correspondiente al NAD.De los resultados obtenidos se ve que no todoslos análogos utilizados son reducidos por la enzima. Entre loscompuestos que actúan en la reacción enzimática, NADP,deamNAD,APADy APdeamAD,el deamNADes el más activo. A concentraciones
bajas de nucleótido la velocidad de la reacción es más alta conel deamNADque con el NAD, a medida que se va aumentando la con
centración se invierte la relación (figura 3) ya que el deamNADalcanza antes la concentración de saturación. Para una'concen
Tabla 1
Acción de aqálqgos del NADsobre la actividad de la NAD-aldehigg deshidrogenasa de levadura.
53¡ug de enzima disuelta en 3 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0 en presencia de 01K 0.05 M, cisteína l mM,acetaldehido 0.17 mmy lasadiciones que se indican.
. ADAM? ¿222;1 C10ne S “(A)” (%>NAD 0.45 mM 334 _“ _
NADP 0.45 mN 112 33 __
DeamNAD0.45 mg 266 79 __
APdeamAD 0.45 mMV 61 18 -
APAD 0.45 mM, 35 lO -_
PyAlAD 0.45 mM 3 A _
PyAldeamAD 0.45 mM o o __
NAD 0.45 mM + APAD 0.45 mm 299 9o lO
NAD 0.45 mm.+ NADP 0.45 mM 254 76 24
NAD 0.45 mm L PyAlAD 0.45 mM 88 26 74
NAD 0.45 mM L PyAldeamAD 0.45 mM 78 23 76
FIGURA 1
30/m¡n
390
AEX7
10 20 50 40 ï‘ 60 70 80
Tiempo (seg)Acción de análogos del Nau sobre la actividad delaNnDaldehido deshidrogenasa de levadura. 0.1? mg deproteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 8.0, enpresencia de 81K 0.05 M, cisteína 1 mm, aCetaldehi—do 17 x 10’5 m y dinucleótidos 0.45 mm. NAD(línea a), deamNAD (B), NnuP (C), APdeamAD (D) y APAD(E). ‘
360
320
280
240
x103/mín
Acción de análogos del NADsobre la actividad dela NADaldehido deshidrogenaáa dé levadura. 0.12mg de proteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 M¡B 8.0, en preSencia de ClK 0.05 M, cisteína1 min, acetllráe‘nido 17 x 10'5 ru, NAD 0.45 mmydlnucleótloos 0.45 mm. Línea A (sin adición), B
FIGURA 2
L
lO 20 30 40 50 60 70
Tiempo (seg).
(wm), s (¿.ADP)y D (PynlhD).
FIGURA 3
52OP _
480-
Q 4140-
úoo- C 360- B ...\ ,
(:> 320r. _‘Vx
x 240- —
Lu 200%- _Q160-
120- ,4
80 _
4o
l l l l l l l l l l0.4 0.2 0.3 0.4 05 06 0.7 a: a! 1
[Nucle‘otic/o] M x 10”Influencia de 14 conoentrwción de nucleótido sobre laactividad de la NADaldehido deshldrogenasn ña IQVQflu1m, C.12 mg de rrnteínq disuelta en 3 ml de Tú.s 0.1 MpH SGU, en presenqia de ClK 0,05 M9 cisteína l'mE,ncet—aldehiqo 17 x lO"5 M, APdeamAD (línea A)9 deam NAD (B).y NAD(G) en las concentrqcinnes que se indicnnb
tración de nucleótido de 0.45 mMla velocidad de reacción deldeamNADes del 88 por ciento respecto a la del testigo con NAD.
El APADy APdeamADsi bien son reducidos por la enzima, la velocidad de reacción sólo alcanza a lO y 18 por ciento respectivamente de la correspondiente al testigo; el NADPreacciona conun 33 por ciento de la velocidad de reducción del NAD.Los derivados aldehidicos no son reducidos por la NADaldehido deshidragenasa de levadura. Estos análogos son reducidos quimicamente(62)o por acción de otras deshidrogenasas comola alcohol deshidrogenasa de higado de caballo y de levadura, la láctico deshidrogenasa de corazón de vacuno y de músculo esquelético de conejoy la glutámico deshidrogenasa (65), aunque en la mayoria de loscasos reacciona muchomás lentamente que los otros análogos. Quelos análogos con función aldehido no sean reducidos por la enzima no implica que no reaccionen con la misma; en la figura 2 ytabla l se ve que estas sustancias son fuertes inhibidores de lareducción del NAD. Tanto el PyAlADcomo el PyAldeamADinhiben
alrededor del 70 por ciento la velocidad enzimática cuando suconcentración es igual a la del NAD,loque indica que estas sustancias forman con la enzima un compuesto inactivo combinándose
a los mismos centros ocupados por el NAD,yaque la inhibiciónque se obtiene es competitiva con el mismo (Figuras 6 y 7).
El APADy el NADPa pesar de ser reducidos por la enzima
son también inhibidores de la reacción con el NADdado que loscompuestos que forman con la enzima son reducidos más lentamente que el compuesto del NAD.
Comoen el capitulo anterior, se puede tratar la cinéticade la reacción en forma simplificada, manteniendo constante laconcentración de uno de los sustratos del sistema enzimático yvariando la concentración del otro. Este tratamiento permitecalcular los parámetros de la ecuación de velocidad respecto alNADo al análogo; representando la recíproca de la velocidadinicial de la reacción en función de la recíproca de la concentración del sustrato variable (nucleótido); se deben obtener rectas a partir de las cuales de acuerdo con el método de Lineweaver-Burk (41) se puede calcular la velocidad máximade reducciónde la coenzima en el compuesto activo ternario cuando la misma
satura la enzima y la constante de Michaelis aparente del complejo enzima-NAD.
1'0 1
FLGURA 4
- . c -¡ . J[D/nuc/eot/c/OHMX 70)Oxidación enzimática del acetaldehido con NAD.deamNAuyAPdaamAu0.12 mg de proteína disuélta en 3 m1 de Tris 0.1MlpH8.0, en presencia de 01K 0.05 M, cistefna L mm, acet—'aldchldo 17 x 10"5que se indlcun. ¿PdeamAD (línea n), NAD(B) y deamNAD(C).
M, y bucleótido en las concentraciones
FIGURA 5V
40
_v“‘x70"z
L, l l l l
1o 30 J 5;)xíO/[0' Ïo r'c/J'fiOxidación enzimática del acataldehido_con NAD.NAQBy‘APAD.Gendiciones experimentales iguales que en ‘figura 4, 0,24 mg deuproteína «(ïíneas B.C) y 0.8“ ":
(líneas A,D); NAD( lineas Byüj, NADP(C) y “IAB {A,.Línea A, ordenada derecha; líneas 8,0 y D ordenada izqui«‘r.a'
3.0"
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1.31GURA S
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5 1o 15 20 25 30
[NA 0/ 7M)? 103/Acción del PyAlAD sobre 1% úotividad de la NADaldehidñ ieshidroq351ïn ¿e Íuvwíwéñ. 0.1% üg ¿e proteína flinweltn en 3 mific Tris 0.1M pH 9.0, en DTQSCÜCÍHde ClK 0.05 M,‘ci:teínq Ï mm,¿hetnïdehido 17 x lO"D My NnDen las cancentracinqes que meindican v kwnlau (my) 0.25 (línea A), 0.05 (B) y O (C).
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w...J...l{ma A), 0.05 (B), 0.03 Ko) y o (u).
Las figuras 4 y 5 muestran los resultados que se obtienen cor
dos preparaciones enzimáticas distintas. Los valores de Kmpara elNADvarían ligeramente y los valores de Kmde cada análogo debencompararse con el Ki del NADen el experimento respectivo. De la figura 4 se obtienen los siguientes Km (x 10- M) NAD2.1, deamNADO.E
y APdeamAD1.98. Los valores relativos de Vmconsiderando 100 al N1son deamNAD53 y APdeamAD16; es decir los análogos tienen mayor
afinidad por la enzima que el NADlo que explica porqué el deamNADalcanza antes la concentración de saturación.
De la figura 5 se calculan los siguientes valores, Km(x10-4NNAD, 4.7-4.8; NADP1.1 y APAD5.3 Vm (considerando 100 el NAD) NADI50 y APAD. 6.1.
Comoel PyAlADreacciona sumamente despacio-y el PyAldeamAD
\‘no es reducido por el sistema enzimático no se puede calcular directamente las constantes de sus complejos. Dado que estas sustanciasson inhibidores competitivos del NADse puede calcular su constante
de inhibición (K1), que es la constante de disociación del complejcenzima-inhibidor. La determinación de Ki involucra mediciones de velocidades iniciales con distintas concentraciones de inhibidor ysustrato; su valor se puede determinar de varias maneras: a) Si serepresentan los resultados de dos series de medidas en-las que sevaría la concentración de sustrato, una en ausencia de inhibidor yotra en presencia de una concentración constante del mismo, se vana obtener lineas rectas (figura 6) por el método de Lineweaver-Burk
(41). a partir de las cuales se puede calcular Kmy Kp (constantede Michaelis aparente del complejo enzima-sustrato en presencia de
inhibidor) que se define como K5 = Km ( l - i ) ; K se puede ca]icular a partir de la expresión Ki==Ï-¿-- .1 b) Mediante el meto"
.2 — 1Km
do gráfico de Dixon (43) que da Ki directamente. Si se determinanlas velocidades a distintas concentraciones de inhibidor manteniendo constante la concentración de sustrato, se obtiene una línea recta cuando se representan las inversas de 1a velocidad (ordenadas)en función de la concentración de inhibidor (abcisa). En el caso deinhibición competitiva se determina una segunda serie de valorespara otra concentración de sustrato, cuya representación corresponde a otra recta que corta la primera comose ve en la figura 8. El
r‘IGURA 8'
z -n.25 0 0.25 0.5
[PyA/AD]x(Mx10 JDetermingción de la constante de inhibicióndel comblejofenzimañPyAlAD (método de Dixon).Condiciones experimentales iguales que en lafigura 6.
punto de intersección corresponde directamente a - Ki. Medianteeste método el Ki calculado para el PyAlADes de 2.7 x 10-4M (fibgura 8). valor que coincide con el obtenido por el método anali
tico (KÑAD= 3.5 x 10-4M). Procediendo«1e la misma manera con el
PyAldeamADse tiene Ki = 0.9 x 10-4M.A fin de establecer cuales componentes del NADson los res
ponsables de la unión con_1aproteina catalitica se ha estudiadola acción que tienen sobre la;actividad enzimática los distintoscomponentes: AMP,ADP, ATP, NMN,nicotinamida y pirofosfato. En
la tabla 2 se resumen los resultados obtenidos; se ve que lostres mononucleótidos son inhibidores aunque en grado diferente;el más eficaz es el AMP.“Tambiénla adenina es un inhibidor de
1a reacción enzimática. Llamala atención que si bien la nicotinamida actúa como inhibidor la NMNno lo es. En cambio dos basespiridinicas, la picolina y la piridina tambiéninhiben pero enmenor grado que la nicotinamida. No son inhibidores el pirofosfate y el fosfato.
El estudio cinético de 1a acción de estos inhibidores indica que los nucleótidos de la adenina son inhibidores competitivos del NAD;rectas convergentes sobre un punto de la ordenadao sea velocidad máximainvariable, aumento de pendiente lo que
Conduce a un aumento de Km(figuras 9, 10 y ll). A partir de losdatos de las figuras correspondientes se pueden hallar los K1respectivos de acuerdo al método gráfico de Dixon (43). Estos valores son ( x 10-4M), 16 (AMP), 19 (ADP) y 20 (ATP), valores pró
ximos entre si pero mayores que los correspondientes al NAD(3.1, 5.0 y 6.6 en los respectivos experimentos). Las dos basesconstituyentes del NAD,adenina y nicotinamida también inhibenla reacción en forma competitiva respecto del NAD(figuras 12 y
13) siendo los K1 para la adenina (50 x 10-4M) y para la nicotinamida (43 x lO’éM). Tambiénla piridina es un inhibidor competitivo del sistema enzimático (figura 13).
Efecto de la constitución de la coenzimgsobre la reacciónde la enzimg con el acetaldehigg. Manteniendo constante la con-icentración de coenzimay variando la concentración de acetaldehido si se representan las actividades en función de la concentración del sustrato se obtienen curvas que en el caso del NADy del deamNAD(figura 14) presentan un máximo; con los otrosanálogos, APADy APdeamAD,no se encuentran máximos. A los da
Tabla 2
Influencia de los cquonentes del NADsobre la actividgg de laNADaldehido deshidrogenasa de levadura.
Proteina disuelta en Tris 0.1 MpH 8.0 en presencia de ClK0.050M cisteína mm,NAD0.45 mm, adiciones en las concentraciones indicadas y acetaldehido 17 x lOMSMagregado al final.
Exp. Enzima Adición Actividad Inhi
(ug) ¿3B34ox103 bi;iónmin.
A 72 -- 344 -
A 72 AMP 2.3 mg 188 45
A 72 AMP 5.o mM 163 51
A 72 -- 280 -- |
A 72 ADP 1.8 mg 215 23
A 72 ADP 3.7 mE 174 38
A 72 ATP 1.3 mM 202 28
A 72 ATP 3.1 mM 186 34
B 52 -— 408 ——
B 52 Adenina 20 mM 94 77
B 52 Picolina 20 mm 325 20
B 52 Nicotinnmida 2o mm 293 28
B 52 Piridinu 20 mm 352 14
C 27 -- 234 __
C 27 NMN 5 mM 246 -6
D 46 —— 12o ——
D 46 Pirofcsfatc 10 BM 130 -8
E 20 -- 330 -—
20 Pirofosfato 50 mg 330 O
E 2o Fosfato 50 mM 33o o
1 0 9
315 o
3c>__ .__
A
2¿5L_ ..
B
l5__ ._
IO___ C _
0. _ o __5 4¡¡' I
4: 1 l l l l l l l I l l l l
5 1o
-{ _¡[NAD] fo 10’}
Influencia del AMPsobre la actividad de la BADaldehido deshi-«drogenasa de levadufao 0°14 mg de proteína disueltaáeñ 3 m1 deTris 0.1 M pH 8.0, en presencia de CIK 0.05 M. cisteíná 1 mH..HaDen las concentraciones indicadas, acataldehido 17 x lo"5 Iy AMP(mm): 500 (línea A) 2.3 (B) y o (C).
0.5
110
I I I l Ï' T Í I Í I I I T
A "B- -4
. I
A
- I/’Il l l l l I l l l l J l l
5 d q lo[NA D](Mx10)
actividad de ïv Nhfi widcwiininfluencia del «DPsobre la:xpvr1.xdoshidrogenasa de levadura. iguales C0flïïx1”fl””
tales que la figur; 9. “DP (mb) z 3.7 ilínzu A), 1.‘(B) y 0 (C).
GH
¿Ágüfigwll
10"
5 4 1o[NAD] (M'x103/
Influencid del ATPsobre la actividad de la NADa;qehido deshidrogenasa de levadura. Genciciones experimentales igualesque en la figur¿ 9. ATP (mm); 3.11 (línna A), 1.33 (B) y O (G).
'10"
-{
VX
3.0- , -—
— -—
P _
L- -—
lllllllllllll125145678! lo-4 3
[NAD] ./'/O .M /qdeninu sobre la actividau de ía NADalInfluencia de la
levadura. Condicinnos experimen(mN); O (línea A).
áehido deshidragennsa detales imuales que en la fiqua 9. ¿dañina5 {B} y 10 (C).
SEGURA 1':
V'IX10"
40 20 30 ha 50 60
[NAD]"/M'x íO’ÍLuiLuencia de la nicotinamida y la piridina sobre la actividad de la NADaldehido deshidrngenasa de levadura. Condiciones experimentales iguales que en la figura 9. Proteína7O/Á5. Testigo (línea A); piridina 50 mm(B) y nicótinqmiáa50 mm (C).
tos obtenidos se les puede aplicar el tratamiento de MichaelisMenten (44) si bien con altas concentraciones de aeetaldehido haydesviaciones que requieren un tratamiento particular (40,66). Las
rectas correspondientes permiten calcular el Kacet y la Nmde lareacción. Los resultados que se obtienen en la figura 15 indicanque las constantes de disociación de los complejos enzima-acetal
dehido varían significativamente según el nucleótido. Los Kacetson (x 10‘5M) NAD, 1.1; deamNA'D, 1.4; APA'D, 6.3 y APdeamAD, 8.o.
Las velocidades máximasaparentes de la reacción también variansegún el nucleótido asi para NADconsiderado lOO corresponde 13.3(deamNAD), 10.3 (APdeamAD) y 10.5 (APAD).
Comportamiento del NLD, análogos y componentes del mismofrente a la acción de los reactivos de tioles.
Stoppani y Milstein (8) demostraron que el NADes un protector de la aldehido deshidrogenasa de levadura frente a la acción inhibidora de los reactivos de tioles. Se quiere ver quefracción de la coenzima es la responsable de la protección. Paraello se ensaya el comportamiento de los distintos análogos y mononucleótidos del NADfrente a la acción del o-iodosobenzoato ydel óxido de melarsen. Los resultados se resumen en las tablas
3 y 4. Actúan como protectores el NAD,NADPy aquellos análogos
que no son reducidos por el sistema enzimático, PyAlADy PyAldeamAD, siendo el segundo mucho más eficaz. El deamNLDprotege, pero
en menor grado frente al O-iodosobenzoato; con el óxido de melar
sen se comporta igual que el NAD. En cambio el ¿PAD y APdeamAD,
que son reducidos por el sistema enzimático, no sólo no protegena la enzima sino que aumentan la inhibición por los reactivos detioles utilizados. Los mononuoleótidos adenílicos actúan comoprotectores, el piridínieo es muchomenoseficaz.
Acción de la hidroxilamina sobre la actividad de la NADaldehido deshidrogenasa.
Kaplan y Ciotti (67) estudiando el mecanismode la alcoholdeshidrogenasa de levadura observaron que la hidroxilamina es unfuerte inhibidor de la enzima. Se ensayo la acción de la hidroxilamina sobre la NADaldehido deshidrogenasa y se obtuvo unainhibición relativamente baja, alrededor del 15%, cuando la coenzima_del sistema es el-NAD o el deamNAD,en cambio si se los
reemplaza por APADo APdeamAD,la inhibición observada es del 90%,
para una misma concentración de hidroxilamina (lO mM)(Tabla 5).
v‘IGURrLlí
Í l l l l l l I
>)0r- ¡q .
200- __C
g 180- 8 —
S2 140- _
>< 120“ _O
¡JNEKlOO '
<1 80 _
60 _
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2 A ,0 __J l l l l l
[Aceta/c/eh/c/OJX 10'77
lnfïuonciq GCla COnCQntraciónde ncetaldehido sobre laactividad de La NADxldehidn deshidrogenasa. 46/4g deïrntefna disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 8.0, en presencia de 31K 0.05 M, cisteína l mM,dinucleótidos 0.45m? : NAD {línea A), daamNAD (B), aneamAD (U), y ABAJ(J). acotaquhido en la concentracián indicada.
1.5
2.2
¿.0
1.8
1.6
1.4
12
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
70"
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FIGURA 15
o . g/ C_ A 0 ¿q
1'1 n í l l 111o zo 30 ¿40 so ¿o 70
[Aceta/c/eh/do]"4x 703)
80
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acetiAÍCÑlJO. Jondiuionks oxpera u.;urw. ,. _¡ ,‘IV‘ w ly‘v L ‘_".¡ . .1!"l: 11¿:'=íï‘.i; . Lunes mu); ..¿ ¿3, -.»;\¡..A.\!,\JJ;lg ;\. l n .,' . , . A ,- . ‘ . ,3 .NAD; 1.151641 4.), :‘xI‘J'Ïinih al). Luxmeus n J 4.1 AI. ,12 112“! :3 l
‘ r l ‘ _ . ‘ . ‘V ‘ . ' m ,wï,recna, LlULiS u y B OFdUUJuJ n ¿4 31QAlcauu.
116
leí NnDsobre el complsgo enzima-h.‘- jI:.¡Ïe‘aI: ¿zw Ir;
. TABLA 3
¿gpión del NAD.ggálogos y componentes 931 mismo. sobre la inhig¿ción de la NADaldehido deshidrogquga de levadura por o-iodo
sobennggg0.6 mg (exp. Ay B), 1.7 mg (exp. C) y .8 mg (exp. D) de proteína disuelta en 0.5 ml de Tris 0.1 MpH .0, se incuban con lasadiciones indicadas durante 30 segundos. La actividad se mide en 0.00.02 ml de la mezcla de incubación.
. Activ. e z. Inh. Prot.Exp. Ad101ones AE} ¡lo min (%) (%)40.
A Ninguna 76 -— -—A o-iodosobenzoato 0.12 mM 32 58 -A NAD 1.3 mM . 76 —- -A o-iodosobenzoato O.12mM+NAD1.3mM 54 29 50A APAD 1.3 mM 75 —- -A o-iodosobenzoato O.12mM+APAD1.3ÜM 26 65 —A APdeamAD 1.3 mM 93 -- -A o-iodosobenzoato o.12mM+APdeamAD1.3mM 36 61 -B Ninguna 80 __ __B o-iodosobenzoato 0.12 mM 33 59 -B PyAldeamAD 2.6 nM 90 —- -B o-iodosobenzoato 0.12mM+PyA1deamAD2.6mM102 —- -B PyAlAD 1. 3 mM 93 ._ -_B o-iodosobenzoato 0.12mM+PyAlAD1.3mM 60 35 40C Ninguna 115 -- —C ' 'o-Ioúoaobonzoato 0.12 mM 64 44 —C NAD1.3 mM 120 -- -Co- o-iodosobenzoato 0.12mM+ NAD1.3 mM 102 15 66C NADP0.7 mM 110 -- -C o-iodosobenzoato 0.12mM+ NADP0.7mM 96 13 70C' deamNAD0.4 mM 119 -- -C o-iodosobenzoato 0.12mM+deamNAD0.4mM 78 35 20C AMP 1.3 mM 102 -- -—C' o-iodosobenzoato O.l2mM+ AMP1.3 mM 66 35 20C ADP 1.3 mM 108 -- -C o-iodosobenzoato 0.12mM+ ADP 1.3 mM 78 28 36C ATP 1.3 mM 102 —- -
o- iodosobenzoato 0.12mM+ ATP 1.3 mM 78 24 455 Ninguna 130 -- -D o-iodosobenzoato 0.12 mM 33 75 -D NMN 5 mM 136 -- -D o-iodosobenzoato 0.12 mM+ NMNSmM 55 60 20
TABLA 4
Acción del NAD,análogos y componentes del mismo, sobre la inhibición de la NADaldehido deggidrqgenasa de levadura por oxido demelarsen.
1.7 mg (Exp. A y B) y 0.6 mg (Exp. C) de proteina disuelta en0.5 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0, se incuban con las adiciones indicadas durante 30 segundos. La actividad se mide en 0.02 m1 de lamezcla de incubación.
Activádad Inhibi- Protecen21m 10a\ ción ciónExp. Adiciones (Éííláoxlo3) % %mln. A - 118 -— -
A Melarsen 0.015mM 66 45 __
A NAD 1.3mM 120 _— ——
A Melarsen 0.015mM+NAD1.3mM 76 37 18A ABAD1.3mM ‘ 119 -- -
A Melarsen 0.a'015mM+.A.PA.D1.3mM 55 54 ——
A APdeamAD 1-3 mM ' 120 __ __
A Melarsen 0.015mM+APdeamAD1.3mM 30 75 -
A PyAlAD 1.3mM ’ 118 -- -
A Melarsen 0.015mM+PyAlAD 1.3mM 70 40 12
A PyAldeamAD 2.6mM 118 —— —
A Melarsen 0.015mM+PyAldeamAD 2.6mM 88 26 42A DeamNAD 0.4mM _ 120 -— —
A Melarsen 0.015mM+deamNAD0.43 M 90 25 45
B —— ' 122 —— —_
B Melarsen 0.015mM 60 51 -B NAD 1. 3mM 114 __ __
B Melarsen 0.015mM+NAD1.3mM 80 30 41
B DeamNAD 0.4mM , 128 - -—B Melarsen 0.015mM+deamNAD0.umM 93 27 47
B NADP 0.7mM ' 128 —— —
B Melarsen 0.015mM+NADPO.Hflfl 100 22 57
B AMP 1.3mM _ 128 —— ——
B Melarsen 0.015mM+AMP1.3mM 88 31 39B ADP 1.3mM ‘ 132 —- ——
B Melarsen 0.015mM+ADP 1.3mM 78 41 20B ATP 1.3mM - 130 -— —
B Melarsen 0.015mM+ATP 1.3mM 76 41 20
c —— 180 —— ——
C Melarsen 0.015mM 100 45 -C NMN SmM 170 -- ¿0 Melarsen+NMN SmM 100 41 9
Si se hace un estudio cinética de la acción de la hidroxi
lamina viendo que efecto tiene una concentración fija de la misma sobre las pendientes e intersecciones con la ordenada, de graficos de velocidad inicial de acuerdo al método de LineweaverBurk (41) se obtiene, cuando el sustrato Variable es el NAD,deamNADo APAD,pendientes invariables con aumento de ordenada
al origen, es decir gráficos paralelos, lo que corresponde a unainhibición incompetitiva (46), la velocidad máximaaparente disminuye por el mismofactor que la constante de Michaelis aparente (figuras 16, 18 y 20). La eXplicación de este tipo de inhibición es que el inhibidor se combina solamente con el complejo ES.
Si el sustrato variable es el acetaldehido, los gráficos que seobtienen son, para el NADcomo coenzima (figura 17) y para eldeamNAD(figura 19) del tipo de una inhibición mixta competitivano competitiva. casi puramente competitiva, en cambio cuando elsistema enzimática actúa con el APAD(figura 21) la inhibiciónobservada es del tipo competitivo, es decir la hidroxilaminabloquea el centro de unión del acetaldehido.
Acción de los aldehidos sobre la actividad de la NADal_ghido deghidrogenagg de levadura.
Para completar el estudio del comportamiento de la enzimafrente a sus sustratos, se revisó la especificidad de la mismacon distintos aldehidos. Se ensayaron el benzaldehido, glicolaldehido. p-metoxibenzaldehido (anisaldehido). gliceraldehido, salicilaldehido y p-dimetilaminobenzaldehido¡ los resultados seresumen en la tabla 6. Se ve que de los aldehido ensayados seoxidan el benzaldehido, glicolaldehido y anisaldehido. En cambioel slicaraldehido no es oxidado, contrariamente al comportamiento de la aldehidc deshidrogenasa de higado. que lo oxida con unavelocidad doble a la del acetaldehido. Tampocose oxida el salicilaldehido, ni el p-dimetilaminobenzaldehido. La enzima además oxida al prOpionaldehido. butiraldehido y crotonaldehido(2,68). En la tabla 7 se resumen los datos que se obtienen cuando se agregan al sistema enzimático simultáneamente acetaldehido y cada uno de los aldehidos indicados. Se ve que excepto elgliceraldehido, los demásinhiben la reacción enzimática en mayor o menor grado; asi el pédimetilaminobenzaldehido a pesar deno ser oxidado por la enzima. inhibe totalmente la actividad dela misma cuando su concentración en el sistema enzimático es de
Tabla 5
cción de la hidroxilamina sobre la actividad de la NADaldehidoü. _.—-A.——.-—.-.——-oun-..“
deshidrogqugg de levadura.un;0.21 mg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0, enpresencia de ClI 0.05 M. coenzimas 0.45 mm. cisteína l mme hidroxilamina en las concentraciones que se indican. Acetaldehido
517 x 10' M se agrega a1 final. Las actividades enzimáticgs se
expresan como (¿333401103)/hin.
Hidroxil- NAD deamNAD APAD APdeamADamina
¿Ct- 1 AO". I ¿etc I A030 Im“ 0m- 5 ens. 'p' enz. fl enz. 2%
no- 386 .- """ 87 a "‘‘0.05 -- -- -- -- 72 17 97 180.1 o- o- -- - 61 29 92 230.5 -— -- - -- 60 30 86 281.0 -- -- 495 4 49 43 79 34
10.0 340 12 422 18 3 91 15 87
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V"x70"
a"
[Aceta/c/ehic/OJYM'X 10’)1EÍIHG*Ü13 d” la\_ hldr0x1laninñ sobre la actiVide mv; .ÏL‘”n varias concentrqciones de acetaldehido. 0.21 ma denq Aiouoltq bn 3 T1 :3 Iris'0.1 K pH9.0. en presencip.05 fl, cisteína .3, NAD0.í5 mM,aceiqïdehi4n en la. CÓRccntrzcinntn qu; se inA). 0 (B).
{101? e Hidrnxiïwmjnn (mV): ¿0 (línea\
a de ÉL
q
FLGURA 18
lO
[c/eam NAD]“(M"x 70’)InflJencla de L: uidrowllaminu sobre iq actividad enzlmítica a varias concentrac:ones de deamNAD =. “.91mg de prñteína tisueïta en 3 ml de Iris 0.1 MpH 8.0,en vmsgxug. cg. .21 0.05 rn. cisíteína 1 mm, acetaldehido17 x lO JM. deañNau en las concentr1c40nes que se i ii»can e Plirnxilixjna (mm) : lO (línga A), O (B).
IO
V"x10"
¿10mm 12
12
60 80
[Aceta/c/eh/c/OJTM'X 70’)Cia
100 120
Influen de la hLdPOXiÏuminasohre la actlvidad enzlmïvarias conecntracinnes de acañu'dehido.
3 ml de Tri: 0.1l díñí?1ï.'li"vlri.u O . 415 1T?N. ,
se indiCun
0.21 mg de prapH8.0. en presencia
acetaldenidn en10 (¿Í
7' xJim .
CentraC1ones hidrox114mína (mm):() (13) .
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nica1€de1¿31 S ¡.3í" r1
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[AP/¡DJYM'X 10’)Influencia de la hidroxilumina sobre la actividad
1.? 14 16 3m
enzimítica a varias concentrac1nnes de :u'úD. 0.?5mg:de proteína disuelta en 3 ml de Iris 0.1 pH8.0, en mesencia de 01K 0.05 Fw,cisteíaa l mm,acetaldehido 17 y; 10-52%, Aval) en las Cr>ncentrac1o—nes que se indican e hidroxilamina (mïaí): 10 (11'1ea A). O (B).
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17 x 10-5M.El salicilaldehido es también un inhibidor pero enmucho menor grado. Los demás aldehidos si bien actúan como sustratos de la enzima, son inhibidores de 1a reacción enzimáticapor cuanto son oxidados a menor velocidad que el acetaldehido.
E1 estudio cinético del conportamiento de los distintos aldehidos activos, de acuerdo a1 tratamiento de Linaweaver-Burk
(41) de los valores de las KInparará. NADcuando se varia 1aconcentración de la coenzima y se mantiene constante la de losdisitintos aldehidos (figura 22). Estos valores son (x 10-4M)4.34 (acetaldehido), 0.5 (benzaldehido) y 1.14 (glicolaldehido).Las velocidades muximassi se considera 100%el correspondientea1 acetsldehido son: 18%para el glicoldtdehido y 12%para elbenzaldehido.
Si se mantiene constante la concentración de NADy se va
ría la de los distintos aldehidos, se tienen los Kald respectivos (figura 23), que son par; el acetaldehido de 6.6 x 10"5 Mpara el benzaldehido de 7.3 x 10-5My para el glicoluldehidode 4.3 x 10“4
100%para el acetaldehido, 13%para el benznldehido y 10%para
M. Las velocidades máximas están en relación de
el glicolaldehido.Si al sistema enzimático con acetaldehido se le agregan
distintos aldehidos; anisaldehido y benzaldehido que son oxidados por la enzima y p-dimetilaminobenzaldehido que no es oxidada, se obtienen las rectas de la figura 24. El benzaldehido dis
minuye el valor del Kacet de 2.0 x 10-5M (sin benzaldehido) a1.75 x 10’5M (benzaldehido 2.5 x 10‘4M) y 1.94 x 10’5M (benzal
dehido 10 x 10'4M). El anisaldehido aumenta el valor del Kacctque pasa de 2.0 x 10-5M (sin agregados), a 11 x 10'5M (anisaldehido 2.5 x 10’4H) y 7.7 x 10‘5M (anisaldehido 10 x 10’4M). Cuando se agrega p-dimetilaminobenzaldehido tambien aumenta el va
lor del Kacet;tración del inhibidor, asi K
-5 . 1 . “cet . -5 -57.3 x 10 M (p-dimetiiiminobenzaldehido 10 M) y 8 x 10 M (pdimetildminobenzaldehido 5 x 10‘5M).
aumento que se hace mayor para una mayor concen
es de 2 x 10-5M (sin agregado),
DiscusiónTodos los análogos ensayados se combinan con la NADalde
hido deshidrogenasa, es decir la enzima es capaz de formar complejos con sustancias de estructura análoga al NADen la
TABLA 6
Acción de los aldgg;dos sobre la activngd de la NAD-aldehidodeshidrogenqgg de levadura.
32 pg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0 enpresencia de ClK 0.05 M, cisteína l mM,NAD0.45 mMy las adi
ciones que se indican.
Activ.enzimát. Activ.respec¿¿E 4o x 103 to al testi___l________.Adiciones
min. go con acetaldehido
Acetaldehido 17'x 30" M 276 160Benzaldehido 17 x 10-5M- 108 39
Glicolaldehido 17 x 10'5M 72 26
Anisaldehido 17 x 10’5M 3o 11
Gliceraldehido 17 x 10'5M o5Salicilaldehido 17 x 10' M
p-dimetilamino benzaldehido 17 x 10-2M O
TABLA 7
Acción de los aldgpidos sobre la actividgg de la NADaldehido ¿e2_hidrogqusa de levadura.22%g de proteina disuélta en 3 ml de Tris 0.5 MpH 8.0 en presencia de ClK 0.05 M, cisteína l mM,NAD0.45 mMy las adiciones quese indica.
Adiciones Actividad Act.respecto Ienzimátic al testigo %E ,10 con acet.
3É9n
Acetaldehido 17 x 10-5M 272
Acetaldehido 17 x 10-5M + _5gliceraldehido 17 x 10 M 256 94 6Acetaldehido 17 x 10-5M +
gliceraldehido 8.6 x 10 284 —- —
Acetaldehido 17 x 10"5 M + _5glicolaldehido 17 x lO M 276 —-
Acetaldehido 17 x 10—%M+ _glicolaïlehido 8.6 x lO 224 82.4 17.6
Acetaldehido 17 x 10’5M + _5benzaldehido 17 x 10 M 206 76 24
Acetaldehido 17 x 10'5M + _4benzaldehido 6.6 x 10 M 152 56 44
Acetaldehido 17 x 10’5M + _5anisaldehido 17 x 10 M 211 77.6 22.4
Acetaldehido 17 x 10’5M + _4anisaldehido 6.6 x lO M 119 43.6 56:4
Acetaldehido 17 x 10'%M + _5salicilalde: 17 x 10 M 240 88 12
Acetaldehido 17 x lO’áfl + _salicilald.'6.6 x lO 4M 190 70 30
Acetaldehido 17 x lo’am + _5p.dimetilamino benzald. 17 x lO M 0 O 100
Acetaldehido 17 x 10—%M+ _5p.dimetilamino benzald. 8.5 x lO M 20 7.35 92.55
Acetaldehido 17 x 10“%n + _5p.dimetilamino benzald. 4.2 x 10 M 78 29 71
ElGUHA 22
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[NADJ" (M'x 10’)
Acción de los aldehidos sobre la actividad de la NADaldehido deshidrogenaaa de levadura. 32 Lg de proteína disuelta en 3 ml de Iris 0.1M pH 8.0. en presencia de ¿1K 0.05 m, cisteína l mM,NADen las concentraciones que se indican y aldehido 17 x lfi-5M; gli:olaldehido (línea A), benzaldehido (B) y acetalde«ido (C).
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cual los grupos amino en la adenina y carboxamida del anillopiridfnico han sido reemplazados por hidróxilo y acetilo o aldehido respectiVamente. El hecho de que se formen estos complejos no significa que todos los análogos puedan reemplazar alNADen el sistema enzimática; solamente el deamNAD,APADy AP
deamADson reducidos por la enzima. El PyAlADy el PyAldeamAD
son totalmente inactivos. Esto indica que si bien la unión dela coenzima con la proteína no depende fundamentalmente de losgrupos amino y carboxamida, los análogos del NADse combinancon la proteina catalitica en grado aproximadamentesimilar alNAD, es más aún, el deamNAD, el APdeamADy el NADPaparentemen
te forman compuestos más estables que el NAD,en cambio para la
reducción de la coenzima la presencia del grupo carboxamida enel anillo piridinico parece ser importante, pues con la enzimasaturada las velocidades de reacción del APADy del APdeamAD
son 7.7% y 15% respectivamente de la que se obtiene con NADy con los derivados aldehidicos no hay reducción. El grupo amino de la adenina no parece esencial pues con deamNADse obtiene más del 50%de la actividad hallada con NADy con los acetildcrivados da mayor actividad el APdeamAD.
Comparandoestos resultados con los obtenidos con otrasdeshidrogenasas se observa que no todas tienen la mismareactividad con los análogos (65, 69, 70, 71), asi la alcohol deshidrogenasa de levadura reacciona con el APADcon un 10%de lavelocidad correspondiente al NADy el PyAlADreacciona a unavelocidad considerablemente menor, con la enzima de higado decaballo el APADy el PyAlADreaccionan más rápidamente en con
centraciones de saturación que el NAD.La láctico deshidragenasa de corazón de vacuno reduce más rápidamente al PyAlADque al
APADmientras que con la misma enzima de músculo esqueléticode conejo la reacción es más favorable con APAD.La diferenciaen respuesta de los análogos aún a las mismas deshidrogenasasde distinto origen sugiere la posibilidad de que existan pequeñas diferencias en su mecanismode acción o en su estructura.
Con gliceraldehido fosfato deshidrogenasa de músculo y de levadura, enzimas específicas para el grupo aldehido, se tiene queel APADreacciona con ambos, sin embargo el PyAlADno tieneactividad con ninguna de las dos, a pesar de ser un fuerte inhibidor de ambas enzimas. Este comportamiento es análogo al ob
eervado con la NADaldehido deshidrogenasa de levadura. De loanterior se deduce que la falta de reactividad observada conlos análogos aldehidicos no es una propiedad inherente a losmismos (65), más bien podria pensarse que el grupo aldehido dela coenzima se une a un centro de la enzima esencial para lacombinación del grupo aldehido del sustrato (70).
Se puede llegar a la conclusión de que la actividad de laaldehido deshidrogenasa con análogos del NADdepende de la velocidad de reducción de la coenzima más que de la posibilidadde formar el compuesto análogo-enzima, ya que tanto el deamNAD
como el APdeamADy el NADPtienen Km menores que el NKQno obstante lo cual la velocidad de la reacción es considerablemente
menor. También el PyAlAD y el PyAldeamAD, de acuerdo a sus Kirespectivos, muestran una mayor afinidad por la enzima que elNAD,a pesar de lo cual no son reducidos.
El NADestá formado por dos nucleótidos: el ADPy el NMN,
de acuerdo con la acción inhibidora de los mismos y de sus componentes, el adenilico se une más firmemente a la enzima. Elgrupo pirofosfato parece influenciar de alguna manera la unión
de la adenina dado la diferencia entre el Ki de la misma (50 x10.4M), que disminuye notablemente en los nucleótidos (16-20 x10-4M). Tanto la adenina comolos nucleótidos son inhibidorescompetitivos del NAD.El pirofosfato no tiene acción inhibidorafrente al NAD,si bien posiblemente se una a la enzima dado queactúa comoprotector de la mismafrente a la inactivación por1.10-fenantrolina. A pesar de que el nucleótido piridinico notiene acción inhibidora, la piridina y la nicotinamida si latienen, además exageran fuertemente 1a combinación del nucleótido adenilico lo que se pone en evidencia por el menorvalor
del KNADsuponer por lo menos dos puntos de unión entre la coenzima y
respecto al KiAMPo KiADP.Estos resultados permiten
la enzima; los grupos correspondientes a la coenzima serian:la adenina y la nicotinamida. Ya se vió en trabajos anterioresque los probables centros de unión de la proteina involucrangrupos - SH (72) y un metal. .
En base a hechos experimentales similares con la alcoholdeshidrogenasas, distintos autores han.propuesto una serie dehipótesis de trabajo para explicar la unión de 1a mismaa lacoenzima.
Van Eys y col. (36) presentan un esquema en el cual elcinc está unido a la proteina por dos grupos sulfhidrilos esenciales para 1a actividad enzimática. Por adición de la co
enzima 1a unión Zn - S se disocia,quedando libre cada uno delos componentes para combinarse con el NAD.Dado que se encon
tró que la fracción adenilica (63) y la piridínica (35) afectanla actividad enzimática y ademásse conocia el efecto complejante de metales de los fosfatos y la quelación de fosfatos através del ión metal de la proteina (73), van Eys y col. pos
tularon que uno de los -SH interactúa con el ión piridiniojmientras que el otro puede unirse al grupo amino de la adenina (36);poro el pirofosfato se uniria al Zn:
+2 ‘%\\/H N — P — O — P - N+
¿- ¿— s
\/-'_‘“-¿> \/
La)
zn\\Wallenfels y Sund (51,74)¿;¿ÉSÍ¿á/áápánán áoz‘tioos de u
nión entre la proteína enzimática y los piridín nucleótidos:a) Complejos metálicos entre las enzimas que-contienen metalesy los piridin nucleótidos, pero a diferencia de Van Eys y Kaplan (36) postulan que es la parte adenilica del nucleótido laque está unido al Zn dado que encontraron que compuestos quecontienen esqueletos semejantes a la adenina, como8aminoquinolina actúan comoinhibidores competitivos de la alcohol deshidrogenasa; desechan la posible unión del Zn al pirofosfato delnucleótido en base a la falta de inhibición por pirofosfato(51, 54) y la poca influencia del fosfato en la unión del NADcon la enzima. b) Reacción de grupos - SH de la proteina conlas coenzimas, La transferencia de hidrógeno es directa, tienelugar sin la participación del solvente y es estereoespecificaen relación a la posición 4 de la nicotinamida del NAD(75. 76)lo que significa que se elimina la libre rotación de la porciónnicotinamida por unión de la misma con la coenzima. Es probable que haya un grupo -SH de la enzima involucrado en estaunión (74,77,78). De los posibles tipos de unión que pueden existir entre -SH enzimáticos y la coenzima, los autores considaran más probable la formación de una unión hidrógeno entre
el grupo -SH de la enzima y el N del anillo piridínico. El esquema Propuesta por Wallenfels y Sund es el siguiente:“lcx O\
ü <í;_v’|U dí’N‘\.I/"N
_ N ¡l ,/Of’c-P—0 ‘Iïí' ‘\N
i u | ,4g s2\ Znfl,"‘ ’\ .
, __o- -«
Gr.7 /,\C0NH2 ió t 1' —‘ 0 NfgcoHS-J
' l
HZC 1/ :74
El esquema propuesto por Theorell y McKinley McKee (56)difiere del de Wallenfels (51,74) por el tipo de unión que proponen de la porción piridínica del NAD.Según estos autores elátomo de Zn en la enzima libre está unido por 3 valencias a laenzima, una o dos de las cuales sean probablemente uniones del
tipo S-andado que la unión entre el Zn y la enzima es muyfuerte (54); formando un complejo octahédrico (49), las tres Valencias restantes del Zn estarian unidas a 3 moléculas de agua, unade las cuales a pH alto (86) pierde un protón transformándose
en un grupo - 0H-. En el isómero naturalfBNAD, el anillo piridinico debe también estar cercano al Zn, ejerciéndose una atracciónelectrostática entre el OH.unido al Zn y el N del anillo piridinico cargado positiVamente, de alli la mayorestabilidad delcomplejo enzima —NADque la del complejo enzima - NADHen el,
que ésta unión no existe.Esquemáticamente el complejo se representa de 1a siguiente manera:
Una serie de comunicaciones (36,70,77,81) indican que lacombinación de una deshidrogenasa, NADo un análogo del mismoy un compuesto nucleofílico resulte en un compuesto de adiciónque tiene un espectro de absorción similar al espectro exhibidopor el complejo enzima-coenzima reducida. Estas sustancias nu!
cleofílicas)en todos los casos dan reacciones de adición conlos nucleótidos en ausencia de la enzima dando complejos que ,
tionen espectros de absorción similares al del NADH.Los compleJos de adición enzimática muestran invariablemento-un corrimiento del máximode absorción hacia las longitudes de ondamás cortas.cuando se los compara con los espectros de adiciónno enzimáticos (82). Un hecho interesante es que sólo aquellascoenzimas que pueden sustituir al NADen el sistema enzimáticopromueven la formación del complejo sobre la enzima. Sin embargOola efectividad relatiVa de un dado análogo para reemplazar al NADen la catálisis y en la formación de complejos noes idéntica. Por ejemplo, el PyAlADes generalmente un aceptorpobre de hidrógeno (65), por otro lado es el análogo que invariablemente forma los complejos más favorables. La habilidadde las coenzimas de formar complejos ternarios aparece relacionado con su habilidad de formar complejos de adición no enzimático (62) y a su potencial de óxido —reducción (65). A pesarde que una sustancia nucleofilica puede inhibir la reaccióncuando el sistema actúa con NAD,sin que se observe la formación del complejo correspondiente, se obtiene mayor inhibicióncuando el sistema trabaja con los análogos. La magnitud de lainhibición parece estar relacionada al grado de formación decomplejos (82). Esto explicaría los resultados obtenidos; parauna mismaconcentración de hidroxilamina la inhibición observada cuando el sistema enzimático trabaja con NADo deamNADes
del 15%, en cambio con los análogos APADy APdeamAD,la inhibición aumenta a 90%. Asimismo la cinética que se obtiene conAPADcomo coenzima es mucho más definida que la que se obtiene
con NADy deamNAD,dada la mayor asociación de hidroxilaminacon el análogo. Por la disposición de las rectas de los gráficos correspondientes se concluye que la hidroxilamina es uninhibidor incompetitivo respecto a la coenzima, pero es competitivo con respecto al acetaldehido. Estos resultados son similares a los obtenidos por Kaplan y Ciotti (67) con las alcohol
deshidrogenasas de hágado de caballo y de leVadura. Burton yKaplan (83) sugieren el siguiente mecanismopara explicar lareacción entre piridín nucleótidos e hidroxilamina: l) El derivado piridínico existe en solución comouna estructura en resonancia con una carga positiva distribuida entre las posiciones l, 2,4 y 6. De éstas, la posición 4 es la que parece llevar la mayorcarga positiva, comofuera indicado por Pullman y col. (84) para la reducción enzimática y quimica del NAD.2) El otro reactivo, hidroxilamina, pierde un protón para transformarse en un ióncargado negativamente; 3) El reactivo nucleofilico se combinacon el carbono 4 cargado positivamente, del derivado piridinicoformando e] compuesto reducido. Esta secuencia se puede esquematizar de la siguiente manera:
1)
+
/\.CONH2 . -—CONH2 ¡Í’ (:0an / —CONHs'-———>l'l"wi-s ¡2‘ 'C‘__—. ' ' + ‘__-_. + ; <_"_- 'V \_/ \.,/
r.“ 15 IN" ¡YR R R R
2)
- ___r, _NH2OH -+ OH .._\.__.. NHOH + HOH
ÑHDH 7,35 NH-Qo‘
3)
/H
H \:></f N"\(xf. \,,_CONH CONH‘2
De los resultados obtenidos por Kaplan y Ciotti (67,77,85);inhibición competitiva de alcohol deshidrogenasa por hidroxilamina, preincubación de enzima de higado con NADe hidroxilaminaque resulta en un compuesto inactivo, 1a demostración de que elcompuesto inactivo es un compuesto NAD-hidroxilamina, la somosJunta entre s1 corrimiento espectral del compuestoNAD-hidroxilamina cuando se combina con la enzima con el observado cuando el
NADHse combina con la enzima libre, se deduce que la enzima
combina y activa a 1a hidroxilamina y al NADy que estos reactivos actiVados reaccionan para formar el compuesto inactivo. Demanera similar Burton y Kaplan (83) sugieren la hipótesis de quela enzima une y activa al NADy al etanol y que estas sustanciasactivadas reaccionarian para formar un compuesto intermedio quese podria descomponer en los productos de la rsacción NADHy acetaldehido. Esta hipótesis se puede representar de 1a siguiente manera:
HO\ /,*4
H// \\CH¿
HH/ /° H 0=C
/HH. (D H O-C H -1C H
XH/ \CH3 "un" \CH5 + \CH.6coNH¿ coma camu cosa/2,
n —s I y ——\-I J é u\|\l N
I
R 1k
l
\N/ \NnR
Esta hipótesis está de acuerdo con el esquemade Theorell,Wallenfels y Dalziel (57,36,45) en el cual el Zn combina alNADy al sustrato. La hidroxilamina forma sales con sodio, calcio y cinc (86) lo cual refuerza esta hipótesis. Tambiénconcuerda con el esquema de Dalziel (45) que postula un mecanismode orden compulsivo. La inhibición de tipo incompetitivo haciael NADindica que la hidroxilamina se une al complejo enzima-,NAD.
Estudios cinéticos realizados por Stoppani y Milstein(40,66) tendientes a dilucidar el mecanismode la reacción nopermitieron decidir categóricamente si el sistema se encuentraen flujo estacionario con formación compulsiva del complejoternario en un orden definido o en equilibrio rápido con formación desordenada del complejo, dado que los datos experimentales que obtienen, afectados por un error considerable, satisfacen las ecuaciones correspondientes a cualquiera de los dos mecanismos. Si bien los resultados obtenidos en este capitulo noson concluyentes, tienden a reforzar la suposición de que elsistema se encuentra en estado de flujo estacionario‘ Estos hechos son:
a) El tipo de inhibición que se obtiene con hidroxilamina.b) La variación de los parámetros de los compuestos enzi
ma-acetaldehido con la constitución quimica de la coenzima; siel acetaldehido se uniera independientementea la proteina, el
Kacet seria independiente de la estructura de la coenzima.c) El hecho de que la estructura de los distintos aldehi
dps oxidados por la enzima afectan al KNAD,no es contradictorio con esta hipótesis, por cuanto las mismaspueden afectar
k3, velocidad especifica de descomposición de complejo, constan.te que en el estado de flujo estacionario está incluido en Km
(E+s:]]:_2_3—>EsJL) E+P;Km=—kz;—lk3- ).De las rectas que se obtienen cuando se estudia la ciné
tica de inhibición del acetaldehido en presencia de otros aldehidos, anisaldehido, benzaldehido y p-dimetilamincbenzaldehi-“do, no se puede sacar una conclusión clara de la forma de actuar de las mismas. Al no haber una inhibición competitiva neta,no se puede afirmar que estos aldehidcs actúan sobre el mismocentro catalitico que el acetaldehido,pero tampocose puededeshechar que esto ocurra, unido a una serie de efectos secundarios, por cuanto hay una diferencia estructural y de tamañomuygrande entre los aldehidos ensayados. La naturaleza de losgrupos sustituyentes del benzaldehido en su carácter de aceptores o dadores de electrones puede variar considerablementela asociación del aldehido a la enzimay la transferencia del
ión hidruro al C4 del anillo piridinico del NAD.Existen Variashipótesis sobre mecanismosde acción de aldehido deshidrogenasas (87, 88) que suponen que uno o más grupos nucleofilicos
de la enzima situados en el centro activo, se unen al átomo decarbono del carboniJP del sustrato convenientemente orientado;al mismotiempo el hidrógeno del grupo aldehido ( :H) es repeli«do con una transferencia simultánea, esteraoespecifica del iónhidruro a la posición 4 de la nicotinamida del NAD(89). Porlo tanto grupos sustituyentes del anillo bencénico que "atraigan" electrones van a facilitar la unión con el nucleófilo dela enzima, pero pueden entorpecer la transferencia del ión hidruro lo que se traduce en una inhibición por el sustrato. Porotra parte, los grupos sustituyentes que son dadores de electrones aumentan la velocidad de oxidación. También hay que teneren cuenta la posible existencia de efectos estéricos en la relación de los sustratos a la proteina enzimática.
Si se analiza el comportamiento del NAD,análcgos y nucleótidos componentesdel mismo,frente a la acción inhibidora delos reactivos de tioles, o-iodosobenzoato y óxido de melarsen,el resultado que se obtiene es inesperado, si bien el NAD,NADP,y PyAlADy PyAldeamADprotegen a la enzima de la acción de los
reactivos de tioles, aunque no en la medida informada por StoppanivMilstein (72), el APADy APdeamADque también se unen a
la enzima, no ¿ólo no la protegen sino que aumentan el efectoinhibidor de los mismos. Esto sugiere que los grupos tioles noson esenciales para la unión de la enzima con la coenzima; probablemente la unión de la enzima con la coenzima es el resulta
do de una serie de uniones débiles de diferente grado de fuerza; esto parece necesario dado que uniones fuertes producirianinhibición en vez de activación. Podria ser que el grupo susti
tuyente del 03 de la nicotinamida de la'coenzima condicione lareactividad del resto del anillo piridinico, permitiendo o no,su unión a grupos -SH de la proteinao Asi,suponiendo que en elNADexista una unión entre -SH y un C del anillo piridinico,aunque dicha unión no sea indispensable para la combinación dela enzima con la coenzima, en el APADal variar el grupo susti
tuyente del C3varia la reactividad del anillo, dicha unión notiene lugar y el -SH quedaria libre para reaccionar con el reactivo de tioles, de ahi el aumentode reactividad observado.
Otra posibilidad seria que la coenzima, al estabilizaruna configuración particular de la enzima, que dependeria delgrupo sustituyente de la misma. haga que los tioles se vuelvan
más o menosaccesibles a los reactivos sapecificos. Con los datos de protección de la actividad con los sustratos de la reacción enzimática, sin pruebas experimentales directas, no se puede sacar conclusiones categóricas sobre el papel de los grupos-SH en el mecanismo de la reacción.
MLUSIONES1) Todos los análogos ensayados, deamNAD,APAD,APdeamADy
PyAlAD y PyAldeamAD, se unen a 1a enzima; pero sólo el deamNAD,
APADy APdeamADson reducidos por la misma. Todos ellos son in
hibidores competitivos del sistema enzimática cuando este trabaja con NADcomo coenzima. También son inhibidores competitivos
los mononucleótidos AMP, ADP, ATP y NMNy las bases adenina,
piridina y nicotinamida. _
2) Kacetvarian significativamente con el nucleótido utilizado.
3) NAD, PyAlAD, PyAldeaInAD y deamAD protegen a la. enzima
de la acción de los reactivos de tioles. El APADy APdeamADno
sólo no la protegen sino que aumentan el efecto inhibidor delos mismos.
4) Hidroxilamina inhibe al sistema enzimático; se observamayor inhibición cuando el sistema actúa con APADy APdeamAD.La inhibición es incompetitiva respecto de la coenzima y competitiva respecto del aldehido.
5) Benzaldehido, glicolaldehido y anisaldehido son oxidados por el sistema enzimítioo. Gliceraldehido, salicilaldehidoy p-dimetilaminobenzaldehido no son oxidados.
CAPITULOVIII
DISCUSION GENERAL
Resumiendo las propiedades de la NADaldehido deshidroge
nasa de leVadura encontradas durante su estudio se tiene:1.-Egpecificidgd de sustrato: 1a enzima presenta una espe
cificidad muyamplia hacia sus sustratos; estos pueden ser aldehidos alifáticos o aromáticos. Entre los primeros son oxidados el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y crotonaldehido; entre los segundos el benzaldehido y el anisaldehido(p-metoxibenzaldehido). No se oxidan el gliceraldehido, p-dimetilaminobenzaldehido, ni el salicilaldehido.
Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensayados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima,dado que son inhibidores del sistema enzimático cuando ésteoxida al acetaldehido.
2.-Egpecificidad de coenzima: la aldehido deshidrogenasaademás del NAD reduce al NADP, deamNAD, APADy APdeamAD. El
deamNADes el más activo, la velocidad de la reacción es del
88% respecto a la del testigo con NAD,la del NADPes del 33%,APdeamAD 18% y APAD10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos
por el sistema enzimático si bien pueden ser reducidos quimicamente o por acción de otras deshidrogenasas.
3¡-!ggggidgd de activadores de_la enzima: la NADaldehidodeshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximode suactividad; en ausencia de la misma, la velocidad de la reacciónes sólo del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia decisteina l mM.Si en esas condiciones se agrega al sistema enzimático aquellos complejantes de metales que en presencia decisteína inhiben la acción catalitica (OP, HOQy DDC)se veque en ausencia de la mismala activan. La adición de cisteinal mMa una preparación parcialmente activada por OP aumentaligeramente la actividad, pero no tanto comoCuandoactúa sola. La activación de la enzima en función de la concentraciónde OP llega a un máximo, concentraciones de OP por encima deese valor (1 mM)producen inhibición.
El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación. Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogosdel NAD,se tienen los siguientes resultados: la Velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador depende de la
coenzima presente en el sistema enzimático, asi con APADla reacción no se produce, con NADy APdeamADla velocidad de la
reacción enzimática es 9 y con deamNADes de 18.Los complejan
tes no tienen el mismoefecto activador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales se agregantienen distintas coenzimas asi, con HOQse tienen las siguientesvelocidades: 83 (NAD), 72 (deamNAD),87 (APdeamAD) y 67 (APAD).
El estudio de la cinética de activación indica que la OP
actúa sobre el KNAD,aumentando la asociación de la coenzima ala enzima.
4.-lgfiibidores de la reacción de la NADaldehido deshidroEspasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clasesde compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, análogos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sustrato y III) compuestos estructuralmente no relacionados ni conel sustrato ni con la coenzima, este grupo comprende: a) sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejos conmetales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles.
I) Agálggqs_del H¿D¿_derivados_pigidinicos y ¿denilicoszlos componentes de la molécula del NAD,adenina, nicotinamiday sus derivados, asi como los análogos del NAD(APAD, APdeamAD,
NADP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibi
dores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP,ADP,ATP, PyAlADy PyAldeamAD. NMN,pirofosfato y fosfato no modifican la velocidad de la reacción enzimática.
II) Inhibición por sustrato y sustancias análqggg_al sustrato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (glicolaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores delmismocuando se los agrega junto con acetaldehido. El salicilaldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido que no son oxidadospor la enzima son inhibidores de la misma, especialmente elúltimo de los nombrados que cuando se agrega en concentraciónigual a 1a del acetaldehido inhibe el 100%de la actividad. Encambio el gliceraldehido que no es oxidado tampoco es un inhibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de estosaldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetaldehido, no revela un comportamiento definido.
III) ComJuestosestructuralmente_no relacionados_ni conlas coenzimas ni con el sustrato:
a) sustancias complejantes de metales: la inhibición por agentes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos conmetales indica que hay un metal involucrado en la reacción catalizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina,la 8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón,el q,u‘-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ningunaacción. '
Estudios detallados de la influencia de la OPsobre la
reaeción de la NADaldehido deshidrogenasa muestran que estasustancia produce: dos tipos de inhibición, una instantánea yreversible y otra dependiente del tiempo e irreversible. También el dietilditiocarbamato produceuna inhibición irreversible dependiente del tiempo. No se obserVa lo mismo con el zincón.
La inhibición irreversible por OPdepende del tiempo deincubación, del grado de pureza de la preparación enzimática,cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de latemperatura de incubación. Aumenta con la misma.
Estudios de protedción por distintas sustancias de la inhibición irreversible por OPconducena los siguientes resultados; la cisteína, dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolinaprevienen completamente la acción de la OP; cianuro y EDTAsontambién fuertemente protectores. De la coenzima, análogos dela misma y mononucleótidos que la componen sólo el PyAlADyPyAldeamADactúan como protectores, los demás o bien potencian
la acción do la OP como el NAD, NADP, ADP y APADo no ofrecen
ninguna acción,como la adenina. El pirofosfato es ligeramenteprotector. Él único catión que protege totalmente la enzimade la acción de la OP es el Zn++; el K+5 Bb+ y Sr++ son algo
protectores. El acetaldehido aumentaligeramente el efecto inhibidor de la OP.
Estudios cinéticos de 1a acción de la OP, HOQy DDCsobre los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestranque la inhibición instantánea es competitiva con el NADy mixta,del tipo competitivo-no competitivo con el acetaldehido.La cinética es consistente con la suposición de que se formaun complejo entre el metal unido a la enzima y la OP en elque ambos están en relación 1:1.
b).gidroxilaminal la inhibición de la NADaldehido deshidrogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NADactúaa como coenzima del sistema enzimática. es del 90%con el APADo APdeamADpara una concentración de hidroxilamina de 10 mM.
En iguales condiciones con el NADo deamNAD¡lainhibición observada es sólo del 15%.
El estudio cinética indica que la hidroxilamina presentauna inhibición incompetitiVa respecto de las coenzimas mientras
que para el acetaldehidq,si la coenzima es NADo deamNADse observa una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo,casi puramente competitivo. mientras que cuando el sistemaenzimático actúa con APADla inhibición es del tipo competitivo.
o) Reactivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppaniy Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa essensible a los reactiVos de tioles (72). Se estudió el comportamiento de los complejantes de metales frente a la acción delo-iodosobenzoato y del óxido de melarsen; tanto la 0P comolaHOQaumentan la sensibilidad de la enzima hacia los reactivosde tioles.
También se vió qué efecto tienen los análogos y componentes del NADcuando se los incuba en presencia de los mismos;
el NAD. NADP, PyAlAD. PyAldeamAD y deamNADactúan protegiendo
la enzima. El APADy APdeamADsustancias que se sabe que se
combinan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumen
tan la inhibición por los reactivos de tioles utilizados. Losmononucleótidos adenilicos AMP,ADPy ATPson protectores,aunque no tanto comoel dinucleótido; el piridinico es muchomenos eficaz.
DiscusiónA partir de estos resultados se pueden sacar algunas con
clusiones sobre: 1) grupos esenciales de la enzima, 2) gruposesenciales de la coenzima, 3) mecanismopor el cual actúa lacisteína. 4) mecanismo de la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.
l) grupggmgggnciales de la enzima.a) Esta}. La NADaldehido deshidrogenasa de levadura es sensible a la acción de varios complejantes de metales. Con 0P y
DDCse obserVan dos tipos de inhibición, uno instantáneo y reversible; otro dependiente del tiempo e irreversible que puedeprevenirse mediante el agregado de Zn++o de cisteina y otroscomplejantes a los tubos de incubación. Se pueden comparar cswtos resultados con los obtenidos por Vallee y col. (27) con otras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adenina dinu
cleótidosien las que se observan efectos análogos de los complejantes de metales y en las que se ha demostrado la presenciade cinc mediante métodos químicos y espectrográficos. En esasenzimas se ha señalado que la acción inhibidora de los complejantes se debe a que se combinan con el cinc enzimático, necesario para su actividad, por lo que se puede sugerir que la NADaldehido deshidrogenasa también contiene ese metal. Más aún, elhecho de que el Zn++impide la inhibición irreversible por OPindica que el ión agregado posiblemente compita co¿ el cincenzimático por la OP, impidiendo así que ésta actúe sobre la enzima. La neutralización de la inhibición de la enzima por la OP
a través de la formación del complejo Zn (OP)3 confirma la hipótesis de que la inhibición de la enzima por agentes quelantesde metales se debe a 1a capacidad de los mismos de formar complejos con átomos de metal que son enzimáticamente activos.
Esta hipótesis estaría corroborada por el análisis espectrográfico cualitativo realizado sobre una muestra que presentaun sólo componente durante la ultracentrifugación y que da comoresultado cinc comoúnico metal presente en la proteina enZimática y no en los sistemas amortiguadores en los que ésta se encuentra disuelta.
Estudios cinéticos de la acción de los complejantes sobrelos complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato demuestran quela inhibición es competitiva respecto del NADy del tipo competitivo-no competitivo respecto del acetaldehido. En cambioexperimentos de protección de la enzima de la acción inhibidorairreversible muestran que el NAD, NADP,ADPy APADexageran la
acción de la OP. Es decir, el NADtiene una acción diferentesegún la inhibición por OPsea instantánea o dependiente deltiempo. En el primer caso la coenzima compite con el inhibidorpor un centro activo de la enzima que posiblemente involucre alcinc, disminuyendo la acción de la OP; en el segundo caso laexagera, Posiblemente la inhibición instantánea se deba a la
formación reversible de un complejo E-Zn-OP, que por una mayor
exposición a la OP permitiría la combinación de una segunda molécula de OPal cinc lo que traería aparejado una alteración pormanente en el centro activo.
El hecho de que los distintos análogos se comporten enforma diferente cuando se los incuba con la enzima en presencia
de OP’probablementese deba a la influencia del sustituyente del
C3go. En base a los resultados de los ensayos de protección, el
de la piridina sobre el pirofosfato de la molécula de análo
pirofosfato es el'único componente del NADque ejerce algunaprotección, se podría suponer ¿ue el pirofosfato sea uno de loscentros de unión del NADal cinc de la enzima, por lo tanto cuando el sustituyente piridinico es el grupo carboxamida, al formarse un puente de hidrógeno entre éste y el pirofosfato disminuye su afinidad por el cinc, mientras que en los análogos aldehidicos al no existir el puente de hidrógeno, no se modifica lacarga del pirofosfato y la unión al cinc seria más fuerte. Porotra parte, el hecho de que de los componentes del NADel piro_fosfato es el único que no ejerce ninguna acción sobre la velocidad de la reacción enzimática, hace dudar que el pirofosfatosea realmente un centro de unión entre el NADy la enzima.
Resultados similares, inhibición competitiva de OPcon respecto a1 NAD,se observaron en varias deshidrogenasas que contienen cinc (50, 48, 51); si se asocia ese efecto a la inactivaciónirreVersible de la enzima por QBtambién similar a la observadacon Zn-deshidrogenasas (34) y a la inhibición mixta competitiva
no competitiva respecto del acetaldehidg,descripto también parala alcohol deshidrogenasa respecto del etanol (45) se podriapostular de que el cinc jugaría el mismopapel en esta enzimaque en la alcohol deshidrogenasa, es decir, seria el contro deun complejo ternario octahédrico con tres uniones a la proteina,dos a la coenzima bidentada y una al sustrato monodentado.b) grupos tioles. Con los datos de que so dispone, sin pruebasexperimentales directas, no se puede dar una interpretación concluyente del papel de los tioles en el mecanismode la reacciónenzinática.
La NADaldehido deshidrogenasa posee grupos tioles necesarios para su actividad comolo demuestra la inhibición de lareacción enzimática por los reactivos respectivos (72). La pro
tección especifica de las tres aldehido deshidrogenasas estudiadas por Stoppani y Milstein (6), por los piridin nucleótidosque les sirven de coenzimas)muastran una relación estrecha entrela coenzima y el tiol enzimático por lo que en base a estos resultados y a la falta.de protección especifica de los tiolespor compuestosaldehidicos descartan la posibilidad de que eltiol actúe comomediador de electrones entre el sustnato y lacoenzima, y llegan a 1a conclusión de que la hipótesis más factible sea que los tioles actúen comovinculos entre la enzimay la coenzima. Sin embargo estudios de protección con análogosdel NADseñalan que no todos tienen la misma pro,iedad de prote
ger a la enziia frente al o-iodosobenzoato y al óxido de melarsen, as! mientras el NAD, NADP,PyAlAD y PyAldeamADson protec
tores, el APADy APdeamADque se sabe que se unen a la enzima
y que son reducidos por ol sistema enzimático, no sólo no laprotegen sino que potencian el efecto de los inhibidores. Estoindicaria que los grupos tioles no son esenciales para la uniónde la enzima con la coenzima y el hecho de que se observe protección con algunas coenzimas y con otras no se podria deber a que
el grupo sustituyente del C3 de la nicotinamida condicione lareactividad del resto del anillo piridinico, permitiendo o nosu unión a grupos tioles de la proteina, unión que no necesariamente es esencial para la combinación de la enzima con la coenzima. O bien, que 1a coenzima al estabilizar una configuraciónparticular de la enzima, que dependeria del grupo sustituyentede la primera, haga que los tioles se vuelvan más o menos accesibles a los reactivos especificos.
2) grupos esenciales de la cgenzima.' De los resultados obtenidos en el estudio del comportamien
to de los análogos del NADen el sistema enzimática se puedensacar las siguientes conclusiones. Si bien la unión de la coenzima con la proteina no depende fundamentalmente de los grupos
amina y carboxamida ya)que los análogos del N5Dse combinan conla proteina cetalitica, en grado aproximadamentesimilar al NAD.en cambio para la reducción de la coenzima la presencia delgrupo carboxamidaen el anillo piridinico parece ser importante,pues con la enzima saturada las velocidades de reacción del APADy del APdeamADson 7.7% y 15% respectivamente de la que se
obtiene con NADy los deriVados aldehidicos no son reducidos,
probablemente debido a que el grupo aldehido de las mismas bloquea un centro esencial para la unión del aldehido del sustratoa la enzima (70). Por lo tanto parecería comosi la actividadde la aldehido deshidrogenasa con análogos del NADdependierade la velocidad de reducción de la coenzima más que de la posibilidad de formar el compuesto análogo-enzima, ya que tanto el
deamNAD como el APdeamAD y NADP tienen Km menores que el NAD,no obstante lo cual la velocidad.da la reacción es considerable
mente menor. También el PyAlAD y PyAldeamAD de acuerdo a sus Kirespectivos muestran una mayor afinidad por la enzima que elNAD,a pesar de lo cual no son reducidos.
Mediante estudios cinéticos de inhibición de los componen
tes del NADsobre el sistema enzilático’se encuentra que de losdos nucleótidos que forman la cocnziaa, ADPy NMN,el prtmero seune más firmemente a la enzima. Tanto la adenina como los mononu
cleótido son inhibidores competitivos del NAD;el pirofosfato notiene acción inhibidora frente al NAD.La piridina y la nicotinamida son también inhibidores competitivos del NAD,además exageran fuertemente la combinación del nucleótido adenilico dado el
menor valor del KNADrespecto al K1 AMPy Ki ADP.Estos resultados permiten suponer por lo menos dos puntos
de unión entre la coenzima y la enzima, siendo los grupos corres
pondientes a la coenzima, la adenina y la nicotinamida. Esta suposición se ve reforzada por el hecho de que se ha demostradoque la transferencia de hidrógeno del sustrato a la coenzima esdirecta (88) y es estereoespecífica con respecto a la posición 4de la nicotinamida del NAD(89). Esto significa que la libre r0tación de la porción nicotinamida se elimina por su unión con lacoenzima,
3) Mecanismopor el cual actúa la cisteina.La NADaldehido deshidrogenasa necesita un activador para
alcanzar su máximaactividad enzimática (2,8). Tanto la cisteínacomootras sustancias que se conoce son capaces de complejar me
tales, actúan como activadores de la enzima (OP, HOQ,DDC, BAL,EDTA).
Todos los hechos experimentales encontrados: a) cisteinapuede ser reemplazada por otros complejantes de metales, b) enausencia de cisteina, complejantes de metales en concentraciónbaja actiVan; aumentandola concentración inhiben la actividad
enzimática. c) los efectos actiVadores individuales no se suman cuando se agrega simultáneamente cisteina y otro activadoral sistema enzimático, d) cisteina, DDC,HOQ,y EDTA(todosellos activadores) protegen a la enzima totalmente contra laacción inhibidora irreversible de la OP; señalan que el mecanismo de activación y el de inhibición tienen lugar sobre unmismo centro de la enzima, presumiblemtne el metal y de quela cisteina actúa sobre el mismomecanismo que los otros complejantes de metales.
La activación de las enziaas por los comglejantes de metales puede deberse a dos causas (8): a la eliminación de metales pesados que contaminan e inhiben a 1a enzima o a la formación de un complejo activo complejante-enzima. Todas laspreparaciones enzimáticas están contaminadas por metales pesados, su completa eliminación es muydificultosa (47) porlo que no se puede estar seguro de que la preparación enzimática estudiada no se encuentre incluida en ese caso. Sin embargo, el qle la OPen concentraciones bajas y en ausencia decisteina, es decir en las condiciones en que actúa comoactivador, influye sobre la formación del complejo enzima-coenzima,
disminuyendo el valor del KNADaparente o sea favoreciendo laasociación de la coenzima a la enzima, si bien no excluye unaposible remoción de metales pesados indica que el mecanismode activación implica una acción directa de la OPsobre la formación del compuesto activo. La existencia de quelatos cinccisteína (30) corrobora esta hipótesis.
4) Mgggqiggg de la NADaldehido deshidrogenagggge leva9252.
Stoppani y Milstein (40, 66) estudiaron la cinética dela NADaldehido deshidrogenasa respecto al acetaldehido y ala coenzima, los datos experimentales concordaban con la existencia de un complejo teranrio (enzima-NAD-acetaldehido) queno condiciona la velocidad de la oxidación del acetaldehido.La teoria del compuesto ternario da ecuaciones que permitenrepresentar la velocidad inicial en función de la concentración de ambos sustratos, esas ecuaciones varian según se considere el sistema en estado de equilibrio rápido o de flujoestacionario. En el primer Caso se pueden presentar tres posibilidades, a) la enzima debe unirse primero al NADpara formar
el complejo ternario; b) la enzima debe unirse primero al acetaldehido para formar el complejo ternario y c) el NADno afectala unión de enzima-acetaldehido. Los datos que se obtuvieronpermitieron descartar las primeras posibilidades y satisfacena la tercera. Si el sistema se supone en estado de flujo estacionario, solamente una formación ordenada del complejo ternariode ecuaciones donde la recíproca de la velocidad inicial es unafucnión lineal de la recíproca de la concentración de los sustratos; los valores hallados satisfacen esa condición.
Si bien los hechos experimentales reseñados en este trabajono alcanzan para afirmar categóricamente, tienden a reforzarla suposición de que el sistema se encuentra en estado de flujo estacionario.
Estos hechos son:
a) El tipo de inhibición que se obtiene con hidroxilamina. Lacinética de inhibición con hidroxilamina indica que ésta es uninhibidor incompetitivo respecto a la coenzima y competitivo respecto al acetaldehido o sea que el inhibidpr se combina con elcomplejo enzima-coenzima bloqueando el centro de unión del acetaldehido.b) La variación de los parámetros de los compuestos enzima-acetaldehido con la constitución quimica de la coenzima, si el acet
aldehido se uniera independientemente a la proteína, el Kacet.sería independinte de la estructura de la coenzima. Esto estáen desacuerdo con la condición de que el NADno afecta la uniónde enzima con acetaldehido, lo que permitiriia desechar la posibilidad de que el sistema se encuentre en estado de equilibriorápido.
c) La inhibición que se obtiene con OP)que es competitiva respecto de la coenzima y competitiva-no competitiva respecto del
acetaldehido'puede explicarse suponiendo un mecanismode ordencompulsivo. (45).d) El hecho de que la estructura de los distintos aldehidos oxi
dados por la enzhma afectan el KNADno es contradictorio con lasuposición de que el sistema se encuentra en estado de flujoestacionario con formación ordenada del complejo ternario, yaque las mismas pueden afectar la velocidad específica de descomposición del complejo, que en este caso se encuentra incluido
en la constante de Michaelis aparente del sistema.De la discusión anterior se puede bosquejar un esquema que
conduzca a la formación de un complejo ternario cnzima-coenzimaacetaldehido mediante los siguientes pasos.l) Combinación de la coenzima con la enzima, en la que una delas posibles uniones se estableceria entre el metal que se postula se encuentra en la proteína enzimática y la adenina delNAD.El derivado piridinico existe en solución comouna estructura en resonancia con una carga positiva distribuida entre lasposiciones l, 2, 4 y 6; de éstas, la posición 4 es la que parece llevar la mayor carga positiva según Pullman y col. (84).2) El aldehido se combinaría con la enzima posiblemente a tra—'vés del Zn de la misma, activándose, ya que el Zn es capazde aumentar la polaridad del grupo carbonilo (90).3) El reactivo nucleofílico se combinaría con el carbono 4cargado positivamente del derivado piridínico, formando un compuesto intermedio que luego se descompondria en los productosde la reacción.
l
Una forma de esquematizar al complejo ternario seria:H
N<-'—----o :__— N
6.7.8.9.lO.ll.
12.
13.
14.
15.16.17.18.
19.
20.
21.
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CapítuloCapítulo
Capítulo
Capitulo
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Capitulo
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INDICE resinaI Introduecidn 4II Abreviaturas ¡3
Materiales ¡qMétodos ¡5
III Purificación de 1a NADaldehido Aadeshidrogenasa de levadura-—-
Analisis fisicoquimicos de 5 gpureza ' "Análisis de metales_s--—?¿---, 3X
IV Acción de a¿enfes ¿empiejantesde metales sobre las aldehido 3 5deshidrogenasas —-;_-;_.-_---.
V Ihagtivaeióñ:¿ireversibie dé _la NADaldehido deshidrOgenasa _5¿de levadura'--—a-s—-¿-—-—au--—
VI Acción de los complejantes demetales sobre los compuestos en
zima-sustratos de la NADaldehido ,?Ádeshidrogenasa de levadura —.-—. 'VII Reacción de la NADAldehido deshi
drogenasa de levadura con sus
sustratos;NAD, análogos del mismo S 5y aldehidos.VIIIDiscusiópgeneral............ _. .
Bibliografia Í'íq