siembra y purificación de cultivos

8/18/2019 Siembra y purificación de cultivos

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Manual de prácticas del laboratorio de

MICROBIOLOGÍA GENERAL

Autores:

Diana Maŕıa Echeverry Arango

Olga Inés Montoya Campuzano

Universidad Nacional de Colombia

Bioloǵıa y Zooctenia

Medellı́n, Colombia

2013


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Índice general

7. TÉCNICAS BÁSICAS DE SIEMBRA Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS 1

7.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

7.2. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

7.3. Clasificación de los medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

7.3.1. Origen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27.3.2. Consistencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

7.3.3. Composición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

7.4. Algunos medios de cultivos selectivos y diferenciales . . . . . . . . . . . . . . 4

7.4.1. Agar BAIRD PARKER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

7.4.2. Agar Manitol Sal común rojo de fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

7.4.3. Agar EMB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

7.4.4. Agar de MacConkey. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

7.4.5. Agar LEIFSON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

7.4.6. Agar XLD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67.4.7. Agar selectivo para Bacillus cereus seg. MOSSEL, . . . . . . . . . . . 6

7.5. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

7.6. Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

7.6.1. Manipulación del tubo y extracción del inóculo . . . . . . . . . . . . 8

7.6.2. Inocular de un medio de cultivo en tubo de ensayo con caldo a otro

tubo de ensayo con caldo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

7.6.3. Siembra del aislado bacteriano en un tubo de ensayo con el medio de

cultivo solido inclinado (pico de flauta) . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

7.6.4. Siembra del inóculo por Picadura en tubo de ensayo con medio de

cultivo semisolido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117.6.5. Siembra y Resiembra en caja de Petri, con medio de cultivo solido . . 12

7.7. Discusión de resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

BIBLIOGRAF́IA 21


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7 TÉCNICAS BÁSICAS DE SIEMBRA

Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS

PUROS

7.1. Introducción

Los aislamientos obtenidos de los ambientes naturales y de la microbiota natural del cuerpo

humano, se encuentran formando consorcios microbianos, los cuales se deben aislar sucesi-

vamente, para obtener cultivos puros y de esta manera poder identificarlos macroscópica,

microscópica, bioqúımica y molecularmente.

Es muy dif́ıcil estudiar las bacterias en forma individual, siendo más práctico trabajar con sus

poblaciones; para lograrlas es necesario disponer de medios de cultivo, que les brinda todos los

requerimientos nutricionales para su desarrollo. Un medio de cultivo, es una preparación con

sustancias nutritivas naturales o artificiales de consistencias sólidas, semiśolidas o liquidas;

que suministran al microorganismo cada una de las fuentes de: carbono, nitr ógeno, energı́a

y las condiciones ambientales adecuadas para la śıntesis y mantenimiento de su protoplasma.

Los componentes de un medio de cultivo son esencialmente agua, infusiones, extractos, pep-

tonas, carbohidratos, entre otros. Los extractos como el de la levadura proporcionan la fuente

de vitamina B y de los aminoácidos; las peptonas contienen el nitrógeno orgánico y también

pueden ser fuente de carbono, los azúcares son la fuente de enerǵıa y de carbono inmediata;las sales minerales regulan la presión osmótica o son útiles como solución buffer.

Algunos medios de cultivo contienen indicadores de pH para observar las reacciones bioqúımi-

cas como la fermentación de carbohidratos, o como descarboxilan o desaminan aminoácidos,

también, indicadores redox para la identificación de reacciones de óxido-reducción, agentes

selectivos, suplementos como los factores de crecimiento, aminoácidos, pirimidina; agentes so-

lidificantes, agentes reductores para asegurar anaerobiosis y agentes quelantes que garantiza

la no formación de compuestos insolubles de los metales con los fosfatos.


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7.3 Clasificación de los medios de cultivo 3

Medios de cultivo semisólidos: se preparan a partir de los medios ĺıquidos, agregando a

éstos el agar en una concentración entre 0.2 y 0.3 % p/v de agar. Uno de sus usos es

la observación de la movilidad de las bacterias.

7.3.3. Composicíon

Son aquellos que presentan una serie de sustancias que los hacen simples o espećıficos.

Medio de cultivo básico: incluyen una formula nutritiva simple como son: extracto de car-

ne, extracto de levadura, peptona, carbohidratos y trazas de sales para permitir el

crecimiento de microorganismos poco exigentes. A partir de estos componentes se pue-

den preparar los otros tipos de medios de cultivo, por la adición de los colorantes, las

protéınas, los antibióticos, los aminoácidos, entre otros. De acuerdo al uso de cada uno.

Medios de cultivos enriquecidos: son aquellos elaborados a partir de leche, sangre, huevo,

o ĺıquidos corporales y extractos proteicos y permite el cultivo de bacterias exigentes.

Este tipo de medio se clasifican según su función en:

Medios de cultivo de enriquecimiento: son medios ĺıquidos que incorporan una se-

rie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes,

incapaces de sintetizar aminoácidos, vitaminas u otros elementos necesarios para

su metabolismo. Su fin es recuperar aquellos microorganismos estresados o que se

encuentran en muy poca cantidad. Como ejemplo se tiene Caldo cerebro corazón(BHI), peptona buferada, caldo tetrationato.

Medios de cultivo selectivos: son medios sólidos que de manera parecida a los ante-

riores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo

de otros, cuando se le añade alguna sustancia o compuestos qúımicos selectivos

del microorganismo de interés o inhibidores de aquellos que alteran el estudio.

Estas sustancias pueden ser antibióticos, sales biliares; entre otros.

Medios de cultivo diferenciales: permiten demostrar caracteŕısticas metabólicas de

un determinado grupo de microorganismos. Como es la fermentación de carbohi-dratos, la asimilación de aminoácido, la producción de un metabolito en especial.

La clave es incluir en la fórmula, el sustrato adecuado para la caracteŕıstica me-

tabólica que desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variación de

color u otro fenómeno perceptible, los cambios que hayan tenido lugar. 1

Medios de cultivo de transporte: se utilizan para transportar frotis o muestras de

microorganismos conservándose su viabilidad y las caracterı́sticas bioqúımicas y

1No son medios de cultivo especiales estos no tienen inhibidores, solo sustratos que lo degradan aquellos

microorganismos que presentan las enzimas para hacerlo.


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4 7 TÉCNICAS BÁSICAS DE SIEMBRA Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

fisiológicas. Se ha observado que la carencia de una fuente de nitrógeno impide

considerablemente la multiplicación de estos microorganismos.2

7.4. Algunos medios de cultivos selectivos y diferenciales

7.4.1. Agar BAIRD PARKER

(Agar selectivo para Staphylococcus ). Se utiliza para el aislamiento y la diferenciación de

Staphylococcus , en alimentos y materiales farmacéuticos, según BAIRD PARKER (1962).[2]

Composición (g/litro): peptona de caseı́na 10,0; extracto de carne 5,0; extracto de levadura

1,0; piruvato sódico 10,0; glicina 12,0; cloruro de litio 5,0 y agar - agar 15,0.

Aditivos: emulsión yema de huevo telurito 50ml; eventualmente, Sulfametacina 0,05g.

Forma de actuación: el cloruro de litio y el telurito, inhiben la flora acompañante. El mi-

croorganismo reduce el telurito a telurato formando una colonia negra pequeña. En

tanto que el piruvato y la glicocola actúa favoreciendo selectivamente el crecimiento

de estafilococos. La presencia de la yema de huevo le da una opacidad sobre el medio

de cultivo, algunas colonias de Staphylococcus producen lecitinasas que actúan sobre

la yema de huevo formando un halo y anillos alrededor de la colonia.

7.4.2. Agar Manitol Sal común rojo de fenolAgar selectivo y diferencial, para observar el crecimiento de Staphylococcus patógeno y dife-

renciarlos de otros Staphylococcus según CHAPMAN (1945), modificado [2]

Composición(g/litro): cloruro sódico 75,0; D(-)Manitol 10,0; extracto de carne 1,0; mezcla

de peptonas 10,0; rojo de fenol 0,025 y agar-agar 12,0.

Forma de actuación: debido a la concentración extremadamente alta de cloruro de sodio,

permite solamente el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los que

se encuentran, los del género Staphylococcus . La degradación del manitol, con forma-

ción de ácido que ocasiona el viraje del rojo de fenol al amarillo. Está notablemente

correlacionada con la patogenicidad del germen en cuestión y sirve, por lo tanto, como

indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus , que dan como resultado manitol-

positivos; sus colonias crecen con un halo amarillo luminoso con crecimiento intenso

y Staphylococcus epidermidis , que dan como resultado manitol- negativos; sus colonias

no cambian de color y su crecimiento es débil, casi siempre.

2Un gran número de medios de cultivo tienen funciones mixtas; puede ser Enriquecido porque lleva sangre

y Selectivo porque incluye algún antibiótico. Puede ser selectivo porque incluye inhibidores y diferencial

porque pone en evidencia propiedades metabólicas.


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7.4 Algunos medios de cultivos selectivos y diferenciales 5

7.4.3. Agar EMB

(Agar- Eosina- Azul de metileno- lactosa- sacarosa). Es un agar selectivo y diferencial, para

el estudio de las bacterias de la familia de las Enterobacteriaceae , según HOLT-HARRIS y

TEAGUE (1916).[2]

Composición (g/litro): peptona 10,0; hidrogenofosfato dipotásico 2,0; lactosa 5,0; sacarosa

5,0; eosina amarillenta 0,4; azul de metileno 0,07 y agar-agar 13,5.

Forma de actuación: la diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o

sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina

y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram po-

sitivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp, presentan un caracterı́stico

brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia

azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. En este medio se

obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

7.4.4. Agar de MacConkey.

Agar selectivo y diferencial, para el aislamiento de Salmonellas, Shigellas y bacterias colifor-

mes, a partir de heces, orina, alimentos, aguas residuales, entre otros. Según McCONKEY

(1905).[2]

Composición(g/litro): peptona de caséına 17,0;peptona de carne 3,0; lactosa 10,0; mezcla

de sales biliares 1,5; rojo neutro 0,03; cloruro sódico 5,0; cristal violeta 0,001; Agar-

agar 13,5.

Forma de actuación: por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe

el crecimiento de las bacterias Gram-positiva. Las bacterias capaces de fermentar la

lactosa acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias

rojas o rosadas, presentan un halo turbio debido al descenso del pH provocado por las

sales biliares; en cambio las bacterias lactosa-negativas como la Salmonella producen

colonias incoloras.

7.4.5. Agar LEIFSON

(Agar- desoxicolato-citrato), se utiliza para el aislamiento y diferenciación de Salmonellas y

Shigellas según LEIFSON (1953), modificado por HYNES (1942).[2]

Composición(g/litro): citrato de amonio e hierro(III)1,0; extracto de carne 5,0; lactosa

10,0; rojo neutro 0,02; citrato sódico 6,0; desoxicolato de sodio 2,5; tiosulfato sódico

5,4 y agar- agar 12,0.


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Forma de actuación: este medio de cultivo contiene concentraciones tan altas de desoxico-

lato y citrato, que la flora gram-positiva queda totalmente reprimida e inhibidos más

o menos intensamente los coliformes. Las salmonellas crecen sin obstáculo; algunasshigellas son ligeramente inhibidas, como la Shigella shigae. La degradación de la lac-

tosa da lugar a una acidificación en los alrededores de las correspondientes colonias

y produce un viraje al rojo del indicador de pH rojo neutro. Estas colonias están ca-

si siempre rodeadas de un halo turbio de ácido desoxicólico precipitado. Las colonias

lactosa-negativas son incoloras. La reducción del tiosulfato a tiosulfuro se demuestra

en forma de sulfuro de hierro negro que reacciona con las sales de citrato de amonio e

hierro (III).

7.4.6. Agar XLD(Agar- Xilosa- Lisina- Desoxicolato), se utiliza para el aislamiento y diferenciación de en-

terobacterias patógenas, especialmente de especies de Shigella y Salmonella , según Taylor

(1965), TAYLOR y HARRYS (1965, 1967) y TAYLOR y SCHELHART (1967).[2]

Composición(g/litro): citrato de amonio e hierro(III) 0,8; extracto de levadura 3,0; Lactosa

7,5; l-lisina 5,0; rojo de fenol 0,08; sacarosa 7,5; cloruro de sodio 5,0; desoxicolato de

sodio 2,5; tiosulfato sódico 6,8; D(+)-Xilosa 3,5 y agar- agar 13,5.

Forma de actuación: la degradación de la xilosa, lactosa y sacarosa acidifica el medio pro-

duciendo un viraje amarillo del rojo de Fenol. El tiosulfato y las sales de hierro (III),revelan la formación de ácido sulfhı́drico por la precipitación de sulfuro de hierro negro

en las colonias. O la descarboxilación de la lisina produce cadaverina y se reconocen por

la presencia de un color rojo-purpúreo, alrededor de sus colonias, debido al aumento del

pH. Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente y sucesivamente,

lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, o a un viraje de

amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más prolongada. El efecto inhibidor

de este medio de cultivo es débil.

7.4.7. Agar selectivo para Bacillus cereus seg. MOSSEL,para la enumeración de gérmenes, demostración y aislamiento de Bacillus cereus en alimen-

tos, según MOSSEL y col. (1967).[2]

Composición(g/litro): peptona de carne 10,0; extracto de carne 1,0; D(-)manitol 10,0; clo-

ruro sódico 10,0; rojo de fenol 0,025 y agar- agar 12,0.

Aditivos: emulsión de yema de huevo 100 ml; polimixina B sulfato 0,01 a 0,1 g.

Forma de actuación: la degradación del manitol posibilita la separación de la flora acom-

pañante que es manitol- positiva y se caracteriza por un viraje al amarillo del rojo de


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7.5 Materiales 7

fenol indicador de pH. El Bacillus cereus , no degrada el manitol formando una colonia

rosada algodonosa, pero si asimila la lecitina presente en la yema de huevo que se

acumula alrededor de las colonias, formando un precipitado blanco. La polomixina queinhibe la flora acompañante pero no al Bacillus cereus .

7.5. Materiales

Mecheros de alcohol

Asas de inoculación en aro y en aguja

Cinta de enmascarar

Gradillas

Marcadores permanente

Cajas de Petri

Tubos de ensayo

Incubadora

Cepas Gram positivas y Gram negativas

Medios de cultivos sólidos en cajas de petri: agar nutritivo, agar XLD, agar manitol

sal, agar EMB, agar Leifson, agar McConkey, agar MOSSEL, agar Baird Parker,

Tubos con caldo nutritivo, con agar nutritivo en bisel y en agar semisolido.

7.6. Procedimiento

Antes de comenzar el procedimiento marcar las cajas de petri o los tubos de ensayos con el

nombre del estudiante, el d́ıa, la hora y el medio de cultivo.

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo derecipiente que los contiene, utilizando varios métodos.


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7.6.1. Manipulacíon del tubo y extracción del inóculo

Figura 7-1: Forma de manipular el tubo de ensayo

Quitar las tapas o tapones a los tubos de ensayo con el medio de cultivo.

Coger con la mano izquierda el tubo de ensayo con la muestra bacteriana y con el

dedo meñique de la mano derecha coger la tapa y girar el tubo con la mano izquierda.

(Figura a) 7-1)

Flamear la boca del tubo y esterilizar el asa al rojo vivo.

Introducir el asa después de enfriarla en las paredes del tubo. (Figura b) 7-1)

Tomar el inoculo dentro del tubo con cultivo bacteriano 3

Flamee la boca del tubo antes de taparlo.

Colocar el tubo en la gradilla.

3Si la muestra proviene de un medio lı́quido, se toma el inoculo agitando el asa suavemente dentro del tubo.

Si el medio es sólido, tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra.


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7.6 Procedimiento 9

7.6.2. Inocular de un medio de cultivo en tubo de ensayo con caldo a

otro tubo de ensayo con caldo

Figura 7-2: Inoculación en caldo

En esta siembra, se procede de la siguiente manera:

Coger el tubo de ensayo con el caldo a inocular con la mano izquierda y con el dedomeñique de la mano derecha coger la tapa y girar el tubo con la mano izquierda; o

quitar el tapón de algodón.

Introducir y sumergir el asa con el inóculo agitándolo dentro del tubo con el caldo del

cultivo estéril (Figura 7-2).

Sacar el asa y pasarla por las paredes internas del tubo para eliminar cualquier exceso

de inóculo.

Flamear nuevamente la boca del tubo, colocándole el tapón o la respectiva tapa.

Flamear el asa antes de colocarla en la superficie del mesón.

Incubar a una temperatura de 37◦C , por 24 a 48 horas.

Observar los resultados.


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7.6.3. Siembra del aislado bacteriano en un tubo de ensayo con el

medio de cultivo solido inclinado (pico de flauta)

Figura 7-3: Inoculación a)Picadura y b)En zigzag

Este método se realiza de la siguiente manera:

Coger el tubo de ensayo con el agar inclinado, de manera que el bisel o pico de flauta

quede de frente.

Destapar el tubo de la forma anteriormente explicada.

Tomar el inoculo con el asa de aguja previamente esterilizada y enfriada.

Inocular con el asa atravesando el agar por picadura a una distancia de 2 o 3 mm del

fondo del tubo. 4 (Figura a) 7-3)

Retirar el asa del agar suavemente y seguir sobre la superficie del medio de cultivo enforma de zig-zag (Figura b) 7-3).

Flamear la boca del tubo y taparlo.

Flamear el asa y colocarla en la superficie de la mesa.

Incubar a una temperatura de 37◦C , por 24 a 48 horas


4Si se toca el fondo del tubo puede ingresar aire e invalidar las condiciones anaerobias


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7.6 Procedimiento 11

7.6.4. Siembra del inóculo por Picadura en tubo de ensayo con medio

de cultivo semisolido

Se utiliza para determinar el comportamiento de los microorganismos en presencia de ox́ıgeno,

observar su crecimiento y movilidad para la preservación de los cultivos bacterianos duran-

te más tiempo. Se manipula un tubo de ensayo estéril que contenga un medio de cultivo

semisólido.

Figura 7-4: Inoculación por picadura

En esta siembra, se procede de la siguiente manera:

Con el asa de aguja introducir el inóculo en el tubo, haciendo una punción en el centro

del medio de cultivo, haciendo un giro de 180◦ en el fondo para asegurarse que la

muestra quede en el medio de cultivo. (Figura 7-4)

Retirar el asa de aguja por el mismo sitio en que punzó el medio. 5

Esterilizar el asa antes de colocarla en la superficie del mesón .

Flamear la boca del tubo y taparlo.

Incubar a una temperatura de 37◦C , por 24 a 48 horas.


5Un mal movimiento puede dar como resultado un patr ón de crecimiento a lo largo de la linea de punci ón,

que puede interpretarse en forma errónea como movilidad bacteriana.


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7.6.5. Siembra y Resiembra en caja de Petri, con medio de cultivo

solido

Este procedimiento se puede realizar tanto en superficie como en profundidad, en el caso de

la siembra en superficie, se procede a inocular sobre el medio de cultivo s ólido ya sea por

exposición, estŕıas o diseminación; para el método en profundidad se requiere adicionar el

inoculo en la caja de Petri vaćıa y luego verter el medio de cultivo fundido. En cambio, la

resiembra sólo puede ser por estŕıa y diseminación.

Siembra por Estŕıas en medio de cultivo solido en cajas de Petri

La resiembra por estŕıas, se puede realizar por varios métodos: El Francés, el Clásico o el

Radial.

El Método Francés: es el más utilizado en Microbiologı́a, porque favorece el aislamiento de

las colonias y su purificación, como también la observación de las caracterı́sticas del

cultivo bacteriano. (Figura 7-5)

Figura 7-5: Siembra por el método Francés


Marcar cada una de las cajas de Petri de la forma usual.

Flamear el asa al rojo vivo, enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo estéril;

tomar el inóculo del centro del cultivo microbiano.


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Colocar el inóculo en uno de los extremos de la superficie del medio de cultivo que se

encuentra en la caja de Petri.

Extender el asa con la muestra en forma continua, hasta una cuarta parte de la super-

ficie del medio de cultivo en la caja de Petri.

Flamear de nuevo el asa.

Enfriar el asa en uno de los bordes del medio de cultivo estéril y proceder a hacer 4 ó 5

estŕıas paralelas, formando un ángulo recto desde donde se hizo la primera siembra,

hacer otras 3 ó 4 estŕıas paralelas, siempre formando ángulo recto con el origen.

Repetir esta operación hasta formar una especie de C, sobre todo el área de la caja de

petri. 6

(Figura 7-5).Flamear el asa al rojo vivo, antes de ponerla sobre le superficie del mesón.

Incubar a temperatura de 37◦C, durante 24-48 horas.

Observar los resultados .

Método Cĺasico: se utiliza con el fin de determinar la presencia de los microorganismos en

una muestra dada, en el caso de que se haga muy parejo y continuo se puede lograr un

buen aislamiento y por ende la purificación del aislado (Figura 7-6).

Figura 7-6: Siembra método clásico


6En el procedimiento de las estrı́as se debe esterilizar el asa cada vez que se inicie una nueva serie de estrı́as

o no esterilizar el asa y proceder a hacer las estŕıas separadas de la última inoculación, procurando que

se forme la “C”.


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Flamear el asa al rojo vivo, enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo estéril;tomar la muestra del material que utilizará.

Inócular en uno de los extremos de la caja de petri.

Extender la muestra de un extremo a otro, en zigzag sobre toda el área de la caja de

petri de manera uniforme y seguida, sin quedar muy separada (Figura 7-6).

Flamear el asa al rojo vivo, antes de ponerla sobre le superficie del mesón.

Incubar a temperatura de 37◦C, durante 24-48 horas


El Método Radial: se realiza con el mismo propósito del método clásico (Figura 7-7).

Figura 7-7: Siembra por método radial



Flamear el asa al rojo vivo, enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo estéril;

tomar la muestra del material que utilizará.

Inócular en uno de los extremos del medio de cultivo de la caja de petri.

Extender la muestra de un extremo a otro, en zigzag hasta una tercera parte del área

de la caja.


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Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag, del extremo izquierdo

partiendo del inoculo inicial.

Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag de la parte central del

inoculo inicial.

Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag del extremo derecho del

inoculo inicial (Figura 7-7).




El Método en cruz: su uso más frecuente es para observar la presencia de enzimas extra-

celulares producidas por algunos microorganismos, como son las bacterias del género

Bacillus , este método de siembra se practicará en la realización de las pruebas bio-

quı́micas (Figura 7-8).

Figura 7-8: Siembra método en cruz y desarrollo de su colonia



Flamear el asa de aguja y enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo y tomar

el inóculo.

Proceder a extender el inóculo en forma recta desde el centro hacia los extremos for-

mando una cruz (Figura 7-8).




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Siembra por el método de diseminación: se emplea para homogeneizar la muestra pre-sente en la superficie del medio de cultivo utilizando un asa de vidrio previamente

esterilizada, que permite obtener las colonias aisladas de tal manera que se puedan

contar o hacer un estudio de sus caracteŕısticas morfológicas y bioqúımicas.

Figura 7-9: Siembra por el método de diseminación



Tomar un inoculo de 0.1 a 0.2 mL de la muestra previamente homogeneizada y depo-

sitarlo sobre el respectivo medio de cultivo presente en la caja de petri.

Esterilizar y enfriar la espátula de vidrio, introduciéndola en alcohol y luego pasarla

por la llama.

Enfriar la espátula pasándola por la parte interna de la tapa de la caja de petri.

Pasar suavemente la espátula fŕıa sobre la muestra.

Observar que la muestra quede completamente absorbida sobre la superficie del medio

de cultivo (Figura 7-9).

Flamear de nuevo la espátula y descartarla.




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Siembra por el método en Profundidad: se utiliza para aislar microorganismos proceden-

tes de una muestra compleja que puede ser del suelo, de los alimentos, del agua entre

otros; el aislamiento se puede hacer directamente de la muestra o por medio de lasdiluciones (Figura 7-10).

Figura 7-10: Siembra por método profundidad



Tomar 1 mL de la muestra, previamente preparada.

Adicionar a una caja de petri vaćıa, debidamente marcada.

Mezclar 20 mL del medio de cultivo fundido a 50◦C.

Hacer movimientos circulares en contra y a favor del sentido de las agujas del reloj y

en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio de cultivo impregne la caja,

hasta que se solidifique (Figura 7-10).

Incubar con las condiciones indicadas para el microorganismo.


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7.7. Discusión de resultados

1. ¿Cuál es la composición qúımica de los medios de cultivo utilizados? ¿Cuáles sonlos componentes o propiedades responsables de su función cómo medios selectivos o

diferenciales (forma de actuación)?

2. ¿Se presentó la misma morfologı́a de la colonia en los diferentes medios de cultivo?, si

hubo variaciones explique.

3. ¿Qué indica el viraje del indicador de pH en los medios de cultivo empleados?

4. ¿Por qué es importante conocer la morfoloǵıa de las colonias creciendo en los diferentes

medios de cultivo?

5. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?

¿Proponga algunas sustancias que se le agregaŕıan para hacerlo selectivo para bacterias

Gram negativas?

6. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos en tubos

con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?


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7.7 Discusión de resultados 19

Tabla 7-1: FORMATO DE REPORTE No 5 (Obtención de cultivos puros)

REACCIÓN DE LA CEPA EN CADA UNO DE LOS MEDIOS SEMBRADOS

Reacción de la bacteria en el medio Medio de cultivo...




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CULTIVO SOLIDO DE AGAR NUTRITIVO EN BISEL

Cepa bacteriana... Desarrollo de las colonias...

Observaciones:

CULTIVO SEMISOLIDO DE AGAR NUTRITIVO

Cepa bacteriana... Movilidad...

Observaciones:

CULTIVO EN TUBO DE CALDO NUTRITIVO

Cepa bacteriana... Desarrollo de las colonias ...

Observaciones:


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BIBLIOGRAFIA

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siembra y purificación de cultivos

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