pruebas diagnosticas en endocrinologia

PRUEBAS DIAGNSTICASEN ENDOCRINOLOGA

Pruebas diagnsticasen endocrinologa

Dra. Patricia Leonor Prez Snchez

Especialista en Endocrinologa y Nutricin.Maestra en Ciencias Mdicas

ExCoordinadora Delegacional de Investigacin IMSSExPresidenta del Consejo Mexicano de Endocrinologa

Presidenta de la Sociedad Mexicana de Nutricin y Endocrinologa

Dra. Mara Elena Medrano Ortz de Zrate

Jefe del Servicio de Endocrinologa OncolgicaUMAE Oncologa CMN Siglo XXI, IMSSMaestra en Investigacin Clnica, UAEM

Dr. Aldredo A. Reza Albarrn

Mdico Internista, Endocrinlogo y especialista en Metabolismo Mineral.Certificado y recertificado por el Consejo Mexicano de Endocrinologa.

Departamento de Endocrinologa y MetabolismoJefe de la Clnica de Paratiroides y Hueso

Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn

Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Todos los derechos reservados por: 2010 Sociedad Mexicana de Nutricin y EndocrinologaOhio No. 27, Col. El Rosedal, Del. Coyoacn04330 Mxico, D. F.Tels./Fax: 53362216, 53369072, 53369182 email: [email protected]

Editorial Alfil, S. A. de C. V.Insurgentes Centro 51A, Col. San Rafael06470 Mxico, D. F.Tels. 55 66 96 76 / 57 05 48 45 / 55 46 93 57email: [email protected]

ISBN 9786077504627

Direccin editorial:Jos Paiz Tejada

Diseo de portada:Arturo Delgado

Dibujos:Alejandro Rentera

Impreso por:Solar, Servicios Editoriales, S. A. de C. V.Calle 2 No. 21, Col. San Pedro de los Pinos03800 Mxico, D. F.Enero de 2010

Esta obra no puede ser reproducida total o parcialmente sin autorizacin por escrito de los editores

Colaboradores

Dr. Carlos Alberto Aguilar SalinasMdico Internista y Endocrinlogo. Subjefe del Departamento de Endocrinolo-ga y Metabolismo. Instituto Nacional de Ciencias Mdica y Nutricin. Investi-gador en Ciencias Mdicas F por los Institutos Nacionales de Salud. Investiga-dor nivel II por el Sistema Nacional de Investigadores.Captulo 17

Dra. Nelly Altamirano BustamanteEndocrinlogo Peditrico. Mdico Adscrito al Servicio de Endocrinologa delInstituto Nacional de Pediatra.Captulo 33, 34, 35

Dra. Ma. del Rosario Arechavaleta GranellMdico Internista y Endocrinloga. Certificada y recertificada por el ConsejoMexicano de Endocrinologa. Centro Mdico Nacional de Occidente, IMSS,Guadalajara, Jalisco, Mxico.Captulo 10

Dra. Sara Arellano MontaoMdico Internista y Endocrinloga. Jefe del Servicio de Endocrinologa del Hos-pital General de Mxico, SSA. Investigadora Asociada A. Profesor Titular de la

V

VI (Colaboradores)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Especialidad de Endocrinologa, UNAM. Certificada y recertificada por el Con-sejo Mexicano de Endocrinologa.Captulo 7

Dra. Consuelo Barrn UribeEndocrinloga Pediatra. Hospital de Pediatra, Centro Mdico Nacional SigloXXI, IMSS, Mxico, D. F.Captulo 32

Dra. Paulina Bezaury RivasEspecialista en Ultrasonido y Tomografa. Mdico Adscrito B al Depto. de Radio-loga del Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulo 39

Dr. Ral Calzada LenEndocrinlogo Pediatra. Jefe del Servicio de Endocrinologa del Instituto Nacio-nal de Pediatra.Captulos 33, 34, 35

Dr. Hctor Manuel Crdenas TiradoJefe del Departamento de Endocrinologa de la Unidad Mdica de Alta Especiali-dad, H. Gral. Dr. Gaudencio Gonzlez Garza, Centro Mdico Nacional LaRaza, IMSS. Profesor Titular del curso de Endocrinologa Peditrica, H. Gral.Dr. Gaudencio Gonzlez Garza, Centro Mdico Nacional La Raza, IMSS.Socio Titular de la Sociedad Mexicana de Nutricin y Endocrinologa. SocioFundador de la Sociedad Mexicana de Endocrinologa Peditrica.Captulo 37

Dr. Yulino Castillo NezMdico Internista y Endocrinlogo. Coordinador del Postgrado Nacional de En-docrinologa y Nutricin, Hospital Dr. Salvador B. Gautier, Instituto Domini-cano de Seguros Sociales. Coordinador de Medicina Interna, Instituto Tecnolgicode Santo Domingo (INTEC). Profesor de Endocrinologa, Universidad Autno-ma de Santo Domingo (UASD). Santo Domingo, Repblica Dominicana.Captulo 12

Dra. Ma. del Carmen Cravioto GalindoMdico Internista, subespecialista en Endocrinologa Reproductiva. Investiga-dora en Ciencias Mdicas y Coordinadora de la Clnica de Salud Reproductiva.Departamento de Biologa de la Reproduccin, Instituto Nacional de CienciasMdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulo 23

VIIColaboradores

Dr. Miguel Escalante PulidoMdico Internista y Endocrinlogo, certificado y recertificado por el Consejo Me-xicano de Endocrinologa. Jefe del Servicio de Endocrinologa de la Unidad M-dica de Alta Especialidad, Centro Mdico Nacional de Occidente, IMSS. Guada-lajara, Jal.Captulo 20

Dra. Ana Laura Espinosa de los Monteros SnchezMdico Endocrinloga. Investigadora Asociada C. Servicio de Endocrinolo-ga del Hospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS,Mxico, D. F.Captulo 5

Dr. Eduardo Garca GarcaMdico Internista y Endocrinlogo. Coordinador de la Clnica de Obesidad y Tras-tornos de la Conducta Alimentaria, Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nu-tricin Salvador Zubirn. Profesor Titular del curso de Postgrado en Obesidad,UNAM.Captulo 18

Dr. Rafael Garca OrtizMdico en Medicina Nuclear. Jefe de la Seccin de Medicina Nuclear en Image-nologa del Hospital ABC, Mxico, D. F.Captulo 38

Dr. Francisco Javier Gmez PrezMdico Internista y Endocrinlogo. Jefe del Depto. de Endocrinologa y Metabo-lismo. Profesor Adjunto de la Especialidad en Endocrinologa, UNAM. InstitutoNacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulo 16

Dr. Baldomero Gonzlez VirlaMdico Endocrinlogo, Subespecialidad en Biologa de la Reproduccin. Maes-tra en Ciencias Mdicas, UNAM. Adscrito al Servicio de Endocrinologa delHospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS, Mxi-co, D. F.Captulo 4

Dra. Irma Hernndez GarcaMdico Endocrinloga. Investigadora Asociada B. Servicio de Endocrinolo-ga, Hospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 28

VIII (Colaboradores)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Dr. Sergio Hernndez JimnezMdico Internista, Endocrinlogo y especialista en Diabetes. Certificado y recer-tificado por el Consejo Mexicano de Endocrinologa. Adscrito al Depto. de En-docrinologa y Metabolismo del Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutri-cin Salvador Zubirn.Captulo 31

Dr. Alex Francisco Hernndez MartnezMdico Internista y Endocrinlogo. Adscrito al Servicio de Endocrinologa delHospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 9

Dr. Fernando Larrea GalloMdico Cirujano, egresado de la Facultad de Medicina de la UNAM. Postgradoen Biologa de la Reproduccin Humana en el Instituto Nacional de Ciencias M-dicas y Nutricin Salvador Zubirn. Jefe del Depto. de Biologa de la Repro-duccin, Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubi-rn. Miembro del Sistema Nacional de Investigadores Nivel 3. Miembro de laAcademia Nacional de Medicina y Profesor Titular del Curso de Subespecializa-cin en Biologa de la Reproduccin Humana, Divisin de Estudios de Investiga-cin, Facultad de Medicina, UNAM.Captulo 3

Dr. Israel Lerman GarbeMdico Internista y Endocrinlogo. Departamento de Endocrinologa y Metabo-lismo. Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn,Mxico, D. F.Captulo 15

Dra. Ma. Elena Medrano Ortiz de ZrateJefe del Servicio de Endocrinologa Oncolgica, UMAE Oncologa, Centro M-dico Nacional Siglo XXI, IMSS, Mxico, D. F. Maestra en Investigacin Cl-nica, UAEM.Captulo 14

Dra. Victoria Mendoza ZubietaMdico Internista y Endocrinlogo. Maestra en Ciencias Mdicas. Profesor Ad-junto de la especialidad en Endocrinologa, UNAM. Investigador asociado B.Departamento de Endocrinologa, Hospital de Especialidades, Centro MdicoNacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 25

IXColaboradores

Dra. Marta Menjvar IrahetaProfesor Titular C. Coordinadora del Postgrado en Bioqumica Clnica, Facultadde Qumica, UNAM.Captulo 1

Dr. Moiss Mercado AtriMdico Internista y Endocrinlogo. Profesor Titular de la Especialidad de Endo-crinologa, UNAM. Investigador Titular. Jefe del Servicio de Endocrinologa yde la Unidad de Investigacin Mdica en Endocrinologa Experimental. Hospitalde Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 4

Dra. Elisa Nishimura MeguroMdico Endocrinloga. Jefe del Servicio de Endocrinologa Peditrica, Hospitalde Pediatra, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS. Profesor Titular dela Especialidad en Endocrinologa Peditrica, UNAM.Captulo 36

Dr. Carlos Ortega GonzlezMdico Internista y Endocrinlogo. Expresidente del Consejo Mexicano de En-docrinologa. Mdico especialista C Adscrito al Servicio de Endocrinologadel Instituto Nacional de Perinatologa Isidro Espinosa de los Reyes, SSA. Pro-fesor Asociado de los cursos de especialidad en Ginecologa y Obstetricia y desubespecialidad en Biologa de la Reproduccin Humana y de Medicina Maternofetal en el Instituto Nacional de Perinatologa Isidro Espinosa de los Reyes, SSA,Mxico, D. F.Captulo 21

Dra. Claudia Ramrez RentaraMdico Endocrinloga, adscrita al Servicio de Endocrinologa del Hospital deEspecialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI.Captulo 6

Dra. Alejandra Ramos GuifarroCaptulo 16

Dr. Ricardo Reynoso MendozaMdico Internista, Endocrinlogo. Alumno del curso para mdicos especialistasen Obesidad, Clnica de Obesidad y Trastornos de la Alimentacin, Instituto Na-cional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulo 18

X (Colaboradores)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Dr. Alfredo A. Reza Albarrn

Mdico Internista, Endocrinlogo y especialista en Metabolismo Mineral. Certi-ficado y recertificado por el Consejo Mexicano de Endocrinologa. Departamen-to de Endocrinologa y Metabolismo. Jefe de la Clnica de Paratiroides y Hueso,Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulos 12, 24, 26 y 29Dra. Aleida Rivera Hernndez

Mdico Endocrinloga, adscrita al servicio de Endocrinologa Peditrica delHospital de Pediatra del Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 36Dr. Ral Rivera Moscoso

Egresado de la Facultad de Medicina de la UNAM. Endocrinlogo e Internistaegresado del Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubi-rn. Adscrito a la Clnica de Tiroides del Instituto Nacional de Ciencias Mdicasy Nutricin Salvador Zubirn. Jefe del Depto. de Educacin Mdica del Insti-tuto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn.Captulo 13Dra. Sandra Rodrguez Carranza

Mdico Internista y Endocrinloga, adscrita al Departamento de Endocrinologay Metabolismo del Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin SalvadorZubirn.Captulo 27Dra. Mara de la Luz Ruiz Reyes

Endocrinlogo Peditrico. Mdico Adscrito al Servicio de Endocrinologa delInstituto Nacional de Pediatra.Captulo 33, 34, 35Dr. Valentn Snchez Pedraza

Mdico Endocrinlogo. Adscrito al Servicio de Endocrinologa del Hospital Ge-neral de Mxico, SSA. Profesor Adjunto de la Especialidad de Endocrinologa,UNAM. Certificado y recertificado por el Consejo Mexicano de EndocrinologaCaptulo 7Dr. Antonio Segovia Palomo

Residente del cuarto ao del Curso de Especializacin en Endocrinologa,UMAE, Hospital de Especialidades Dr. Antonio Fraga Mouret, Centro MdicoNacional La Raza.Captulo 30

XIColaboradores

Ernesto Sosa ErozaEndocrinlogo. Maestro en Ciencias Mdicas. Hospital de Especialidades, CMNSiglo XXI, IMSS.Captulo 6

Dr. Oded Stempa BlumenfeldMdico Endocrinlogo, Hospital ABC, Mxico, D. F.Captulo 15

Dra. Rosario Tapia SerranoDirectora Mdica del Instituto de Medicina Reproductiva y Androloga, Mxico,D. F.Captulo 22

Dra. Mara Teresa Tusi LunaInvestigador Titular C y Jefe de la Unidad de Biologa Molecular y MedicinaGenmica del Instituto de Investigaciones Biomdicas de la UNAM y del Insti-tuto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubirn. Miembro dela Academia Mexicana de Ciencias y de la Academia Nacional de Medicina.Miembro del Sistema Nacional de Investigadores Nivel II.Captulo 2

Dr. Jorge Alselmo Valdivia LpezMdico Endocrinlogo, adscrito al Hospital de Especialidades Miguel Hidal-go, Aguascalientes, Aguascalientes.Captulo 8

Dra. Guadalupe Vargas OrtegaMdico Endocrinloga, Subespecialidad en Biologa de la Reproduccin. Ads-crita al Hospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, IMSS.Captulo 3

Dra. Alma Vergara LpezMdico Internista y Endocrinloga. Recertificada por el Consejo Mexicano deEndocrinologa. Mdico Adscrito al Servicio de Endocrinologa del Centro Mdi-co Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE. Profesora Adjunta en el curso de espe-cializacin en Endocrinologa en el Centro Mdico Nacional 20 de Noviembre.Captulo 11

Dra. Maricela Vidrio VelzquezEndocrinloga del HGR No. 110 del IMSS, Guadalajara, Jalisco. Maestra enCiencias, Orientacin en Medicina, por la U de G.Captulo 19

XII (Colaboradores)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Contenido

Prefacio XVII. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Patricia L. Prez Snchez, Victoria Mendoza Zubieta,

Ma. Elena Medrano Ortiz de Zrate,Alfredo Reza Albarrn

1. Mtodos para cuantificaciones hormonales 1. . . . . . . . . . . . . . Marta Menjvar Iraheta

2. Pruebas diagnsticas en endocrinologa 11. . . . . . . . . . . . . . . . . Mara Teresa Tusi Luna

3. Hiperprolactinemia 29. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Guadalupe Vargas Ortega, Fernando Larrea Gallo

4. Pruebas diagnsticas en endocrinologa: acromegalia 39. . . . . Moiss Mercado Atri, Baldomero Gonzlez Virla

5. Diagnstico en el sndrome de Cushing 49. . . . . . . . . . . . . . . . . . Ana Laura Espinosa de los Monteros Snchez

6. Secrecin inadecuada de tirotropina 59. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Claudia Ramrez Rentera, Ernesto Sosa Eroza

7. Hipopituitarismo 67. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sara Arellano Montao, Valentn Snchez Pedraza

8. Vasopresina y diabetes inspida 75. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Jorge Anselmo Valdivia Lpez

9. Pruebas de funcin tiroidea 83. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alex Francisco Hernndez Martnez

XIII

XIV (Contenido)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

10. Pruebas diagnsticas para hipertiroidismo 93. . . . . . . . . . . . . . Ma. del Rosario Arechavaleta Granell

11. Pruebas diagnsticas para hipotiroidismo 105. . . . . . . . . . . . . . . Alma Vergara Lpez

12. Abordaje diagnstico de las tiroiditis 117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Yulino Castillo Nez, Alfredo A. Reza Albarrn

13. Biopsia por aspiracin con aguja delgada de tiroides 137. . . . . . Ral Rivera Moscoso

14. Cncer de tiroides 147. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mara Elena Medrano Ortiz de Zrate

15. Pruebas diagnsticas en el paciente con diabetes 155. . . . . . . . . . Israel Lerman Garbe, Oded Stempa Blumenfeld

16. Estudio del paciente con hipoglucemia.Pruebas diagnsticas 167. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Francisco Javier Gmez Prez, Alejandra Ramos Guifarro

17. Pruebas diagnsticas para el estudio de las dislipidemias 177. . . Carlos Alberto Aguilar Salinas

18. Pruebas diagnsticas en el paciente obeso 195. . . . . . . . . . . . . . . Eduardo Garca Garca, Ricardo Reynoso Mendoza

19. Pruebas diagnsticas: mdula suprarrenal.Feocromocitoma y paraganglioma 211. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Maricela Vidrio Velzquez

20. Trastornos de la corteza suprarrenal. Alteraciones en laconcentracin de aldosterona 215. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Miguel Escalante Pulido

21. Pruebas diagnsticas en el sndrome de ovariospoliqusticos 229. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Carlos Ortega Gonzlez

22. Infertilidad masculina. Pruebas diagnsticas 235. . . . . . . . . . . . . Rosario Tapia Serrano

23. Pruebas diagnsticas en endocrinologa. Infertilidadfemenina 245. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ma. del Carmen Cravioto Galindo

24. Osteoporosis: abordaje diagnstico 251. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alfredo A. Reza Albarrn

25. Hiperparatiroidismo primario 259. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Victoria Mendoza Zubieta

26. Estudio diagnstico de la urolitiasis 269. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alfredo A. Reza Albarrn

XVContenido

27. Oncologa endocrinolgica: tumores ectpicos 273. . . . . . . . . . . Sandra Rodrguez Carranza

28. Abordaje diagnstico de hipercalcemia asociadaa malignidad 287. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Irma Hernndez Garca

29. Osteomalacia oncognica 295. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alfredo A. Reza Albarrn

30. Pruebas diagnsticas en cncer de prstata 299. . . . . . . . . . . . . . Antonio Segovia Palomo

31. Hipoglucemia por enfermedad oncolgica 319. . . . . . . . . . . . . . . Sergio Hernndez Jimnez

32. Hiperplasia suprarrenal congnita 325. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Consuelo Barrn Uribe

33. Estudios de laboratorio no hormonales en el pacientecon talla baja 333. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ral Calzada Len, Mara de la Luz Ruiz Reyes,

Nelly Altamirano Bustamante34. Estudios de laboratorio hormonales en el paciente

con talla baja 353. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ral Calzada Len, Nelly Altamirano Bustamante,

Mara de la Luz Ruiz Reyes35. Edad sea 389. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ral Calzada Len, Mara de la Luz Ruiz Reyes,Nelly Altamirano Bustamante

36. Pubertad 401. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Elisa Nishimura Meguro, Aleida Rivera Hernndez

37. Hipoglucemia en nios 413. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hctor Manuel Crdenas Tirado

38. Medicina nuclear en enfermedades endocrinas 421. . . . . . . . . . . Rafael Garca Ortiz

39. Estudios de imagen en endocrinologa 455. . . . . . . . . . . . . . . . . . Paulina Bezaury Rivasndice alfabtico 485. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XVI (Contenido)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Prefacio

La Sociedad Mexicana de Nutricin y Endocrinologa ha avalado y editado obrasde diferentes integrantes de nuestra Sociedad, que han sido de utilidad a nuestrossocios y a personas que han necesitado de su informacin. Las obras Historia dela Endocrinologa y Decisiones en Endocrinologa (Anlisis de Casos Clnicos)fueron las ltimas editadas por la anterior mesa directiva.

Este libro es el resultado final del esfuerzo y trabajo realizado por miembrosde nuestra Sociedad y de algunos invitados que trabajan en instituciones educati-vas y/o hospitalarias, expertos en sus temas; tiene como objetivo proporcionaruna herramienta al especialista en Endocrinologa para el mejor diagnstico y,como consecuencia, un tratamiento oportuno.

Son tpicas de nuestra especialidad las caractersticas clnicas de algunos pa-decimientos, las cuales son evidentes y se podra pensar en intentar un tratamien-to de primera intencin; sin embargo, no es tan simple, ya que la corroboracinde la localizacin de una enfermedad, o alguna pequea diferencia en los nivelesbioqumicos, pueden modificar el abordaje teraputico, el pronstico y la evolu-cin.

En medicina el tratar enfermedades es un arte y, sobre todo, una gran responsa-bilidad, por lo que es necesario contar con todos los elementos disponibles; consi-deramos que esta obra representa un apoyo importante.

Este libro se caracteriza por lo siguiente:Est escrito por distinguidos profesionales expertos en el tema asignado, que

transmiten sus conocimientos con las experiencias de nuestra poblacin.

XVII

XVIII (Prefacio)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Est ordenado por captulos en relacin a los diferentes sistemas glandularesy/o padecimientos, lo que facilita su consulta.

Este libro est actualizado, sin embargo, con el avance de la ciencia en cuantoa recursos tecnolgicos y a difusin de la informacin; el conocimiento se modi-fica en forma rpida y constante con el tiempo, por lo que habr que consideraren un futuro no lejano realizar una continuacin del mismo.

Agradecemos a todos los colaboradores de esta obra, y esperamos que sea debeneficio en la prctica diaria de todos los que nos dedicamos a la Endocrinolo-ga.

Dra. Patricia L. Prez SnchezDra. Victoria Mendoza Zubieta

Dra. Ma. Elena Medrano Ortiz de ZrateDr. Alfredo Reza Albarrn

Edito

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1Mtodos para cuantificaciones

hormonalesMarta Menjvar Iraheta

ANTECEDENTES HISTRICOSUno de los avances tecnolgicos ms importantes que dieron por resultado unaexplosin del conocimiento en el rea de la endocrinologa fue el desarrollo delradioinmunoanlisis (RIA), que supli los laboriosos y poco exactos bioensayosin vivo. Fueron Solomon Berson y Rosalin S. Yalow quienes realizaron en 1959el primer inmunoanlisis, que se denomin RIA por incluir un marcador radiacti-vo.1 El diseo de la tcnica se bas en dos puntos importantes:

1. La presencia de anticuerpos antiinsulina en pacientes tratados con insulinaanimal.

2. La disponibilidad de radioistopos como el yodo radiactivo (131I).As, para determinar por primera vez la concentracin de insulina en sangre, losresiduos de tirosina de insulina se marcaron con 131I, la cual compiti con la insu-lina no marcada presente en la muestra por una cantidad limitada de anticuerpopurificado a partir de la muestra de los pacientes tratados con insulina animal.Finalmente, mediante la separacin de las fracciones libre y unida, se realiz elconteo de la radiactividad y el clculo del resultado (figura 11). La decisin deBerson y Yalow de no patentar su tecnologa permiti el rpido desarrollo de in-munoensayos para cientos de compuestos tanto de inters clnico como de inves-tigacin, especialmente en el rea de endocrinologa.

La primera variante del inmunoanlisis radiactivo la realizaron Miles y Halesen 1968;2 ellos desarrollaron la tcnica radioinmunomtrica o IRMA (immuno-

1

2 (Captulo 1)Pruebas diagnsticas en endocrinologa

Ag + Ag* + Ac AgAc + Ag* Ac + Ag* + Ag

AgAc + Ag* AcFigura 11. Esquema general del radioinmunoanlisis. Ag* = antgeno marcado.

radiometric assay) para insulina humana; en sta se marcaba radiactivamente elanticuerpo en lugar del antgeno. Este procedimiento increment la sensibilidadya ofrecida por el RIA.

Luego, en las dcadas de 1960 y 1970 se trabaj fundamentalmente en el desa-rrollo y mejoramiento de las tcnicas de marcaje, mtodos de separacin y pro-duccin de anticuerpos. En 1975, Kohler y Milstein3 describieron la fusin de c-lulas de mieloma capaces de producir anticuerpos con linfocitos B del bazo deun ratn inmunizado con un antgeno, dando lugar al desarrollo de los anticuer-pos monoclonales. Este avance contribuy enormemente al desarrollo de inmu-noanlisis ms sensibles y especficos.

A pesar de la incuestionable ventaja del RIA, desde sus inicios se realizaronmuchos esfuerzos dirigidos al empleo de inmunoensayos no radioisotpicos. Ba-sados en los principios del RIA, Engval y Perlmann,4 al igual que Weemen ySchuurs,5 introdujeron en 1971 el uso de enzimas como otra categora de inmuno-anlisis, acuando el trmino ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Esteavance dio como resultado una metodologa equiparable al RIA en sensibilidad yespecificidad, que adems se incorpor fcilmente a los sistemas automatizados.

Otro de los esfuerzos en el desarrollo de inmunoanlisis no radiactivos implicel uso de sustancias quimioluminiscentes. En 1976, Shoeder y col.6 desarrollaronel primer inmunoanlisis empleando isoluminol. Desde entonces se han desarro-llado numerosos compuestos luminiscentes, y actualmente la mayora de los equi-pos automatizados para inmunoensayos emplean quimioluminiscencia porqueofrece un fcil manejo y sobre todo alta sensibilidad.

Los inmunoanlisis fluoromtricos que emplean compuestos fluorescentes con-vencionales fueron explorados en las dcadas de 1960 y 1970 sin lograr la sensi-bilidad ya ofrecida por los ligandos radiactivos. Fue hasta la dcada de 1980cuando se resolvieron los problemas producidos por las interferencias de otroscompuestos fluorescentes presentes en las muestras biolgicas, llegndose porlas investigaciones de Siitari y col. (1983),7 Hemmila y col. (1984),8 entre otros,al desarrollo del fluoroinmunoanlisis de resolucin temporal (TRFIA), el cualutiliza quelatos de lantnidos como marcas fluorescentes de vida media larga.Esta metodologa ha sido patentada como DELFIA (dissociation enhancementlanthanide fluoroimmunoassay) y tiene actualmente muchas aplicaciones en en-docrinologa.9,10

3Mtodos para cuantificaciones hormonalesEd

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.

TIPOS DE INMUNOANLISIS

Los inmunoanlisis se clasifican tomando en cuenta las siguientes caractersticasbsicas:

a. Diseo y disponibilidad de reactivos.b. Tipo de marca.c. Mtodos de separacin.d. Equipos.

Diseo y disponibilidad de reactivos

En cuanto al diseo y disponibilidad de reactivos, los inmunoensayos se clasifi-can en competitivos y no competitivos. Los anlisis competitivos se basan en lacompetencia entre dos antgenos, uno marcado y otro denominado fro, que co-rresponde al metabolito que se quiere medir, por una cantidad limitada de anti-cuerpo. A este tipo de anlisis tambin se les denomina de reactivo limitado; unejemplo de ellos es el RIA. Por otro lado, en los anlisis no competitivos slo in-tervienen en la reaccin el antgeno fro y uno o ms anticuerpos (uno de ellosmarcado) presentes en concentracin no limitada, por lo que se denomina ensayode reactivo en exceso, y adquieren la terminacin de mtricos, p. ej. radioinmu-nomtrico o IRMA.

Tipo de marca

Desde sus inicios, los inmunoanlisis han utilizado compuestos capaces de emitiro producir una seal susceptible de ser medida y a la cual se la denomina marca.Entre los diferentes tipos de marcas estn las radiactivas, las enzimticas, las qui-mioluminiscentes y las fluorescentes.

Los compuestos radiactivos se aplicaron en los primeros inmunoensayos o sis-temas de primera generacin. Inicialmente se emple el 131I, que emite radiacingamma con una vida media corta de ocho das, por lo que se cambi por el usodel 125I, cuya vida media es de 60 das. Otro compuesto radiactivo ampliamenteutilizado es el tritio (3H), que emite radiacin beta y tiene una vida media de 12.5aos. Comnmente las marcas yodadas han sido empleadas para la cuantifica-cin de la mayor parte de molculas, principalmente aquellas de estructura pro-teica. Por otro lado, tanto en el servicio clnico como en la investigacin el tritioha sido utilizado casi exclusivamente para la cuantificacin de molculas de es-


tructura esteroidal, como vitamina D, esteroides gonadales y adrenales, y anti-conceptivos. La cuantificacin de diversos metabolitos por RIA ofrece medicio-nes con gran sensibilidad, dado que las emisiones radiactivas se detectaneficazmente. Sin embargo, el manejo de radioistopos requiere licencias de ma-nejo de materiales radiactivos, disposicin especializada para los desechos, ascomo personal capacitado y certificado por la autoridad responsable.

Los inmunoensayos con marcas enzimticas o enzimoinmunoanlisis (EIA)constituyen los sistemas de segunda generacin. Entre las ventajas fundamenta-les del empleo de enzimas en los EIA estn evitar los compuestos radiactivos yen cierta medida ser ms sensibles que el RIA. La seal derivada de la marca enzi-mtica depende de su actividad cataltica y por lo tanto de su capacidad de generarla aparicin de un producto o la desaparicin de un sustrato. Las enzimas ms uti-lizadas son: peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa 6fosfato deshidrogenasa ybetagalactosidasa. Los EIA ms utilizados son los que utilizan dos primeros an-ticuerpos en ensayos tipo sandwich o ELISA. La desventaja del empleo de enzi-mas como marcadores estriba en el corto tiempo de anaquel y las diferencias entrelos lotes de las enzimas, as como en el limitado margen de lectura de la seal entrminos de densidad ptica.

Los sistemas de tercera generacin de inmunoanlisis se basan en el empleode marcas quimioluminiscentes o fluorescentes. Los quimioinmunoanlisis (QIA)utilizan marcas quimioluminiscentes que involucran molculas orgnicas queemiten luz como resultado de una reaccin de oxidacin; el compuesto ms co-mnmente usado en los QIA es el luminol. Por otro lado, respecto de los fluoroin-munoanlisis (FIA), en las marcas fluorescentes tambin existe emisin de luz,pero sta ocurre a consecuencia de la absorcin previa de luz que produce excita-cin de los electrones desde sus estados basales. Por el amplio rango de emisin,as como porque ambas marcas son excitadas en la celda de lectura dando unaseal de 100%, tanto la quimioluminiscencia como la fluorescencia ofrecen unalto rango de sensibilidad, el cual supera en algunos casos en dos o ms rdenesde magnitud el alcanzado por el RIA y el EIA.11

Mtodos de separacin

Con base en los sistemas de separacin de las fracciones unida o libre de los com-ponentes de los inmunoanlisis, stos se clasifican en homogneos y heterog-neos. Los ensayos homogneos son aquellos que no requieren una separacin f-sica de elementos para tener la seal especfica del metabolito por medir; paraello se requiere que la marca manifieste un cambio en la forma unida distinguiblede la forma libre. El primer enzimoinmunoanlisis homogneo, conocido comoEMIT (enzyme multiplied immunoassay), fue desarrollado para la morfina por


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Rubinstein y col. en 1972,12 y desde entonces esta metodologa se utiliza para ladeterminacin de drogas de abuso y monitoreo de frmacos.

Los inmunoanlisis heterogneos son los ms comunes, porque mediante sis-temas de separacin de las fracciones unida y libre se eliminan interferencias yaumentan la especificidad y sensibilidad de las cuantificaciones. Entre los mto-dos de separacin estn la adsorcin a soportes slidos, el uso de dos primerosanticuerpos en formato sandwich, el empleo de segundos anticuerpos que facili-ten la precipitacin por centrifugacin o que permitan la adsorcin a un soporteslido, el empleo de partculas magnticas y el sistema biotinaavidina, entreotros.

Equipos

El desarrollo de equipos especializados ha contribuido enormemente al avancetecnolgico de los inmunoensayos. Hoy en da existen numerosos instrumentospara inmunoanlisis, algunos de ellos exclusivamente dedicados a una metodolo-ga en particular de la cual toman su nombre, como los fluormetros ARCUS paraDELFIA. Se han construido contadores de radiactividad multipozo, espectrofo-tmetros de zipper, luminmetros altamente sensibles, as como instrumentos ca-paces de medir una seal fluorescente especfica en tiempos de nanosegundos.La innovacin tecnolgica en este campo ha contribuido enormemente a elevarlos lmites de deteccin y a disear sistemas incorporados a autoanalizadoresmulticanal. El cuadro 11 muestra los equipos utilizados para realizar las medi-ciones de acuerdo con la seal propia de cada marca y metodologa seleccionada.

Con objeto de incrementar la sensibilidad de los inmunoensayos se han desa-rrollado tambin metodologas con reacciones acopladas; p. ej., como reaccin

Cuadro 11. Tcnicas y equipos empleados en los inmunoanlisisTcnicas Marca Seal Unidades Equipo Nombre

comercial

Radiactiva 125I Emisin ra-diactiva

CPM Contadorgamma

RIA

3H Contador beta RIAEspectrofo-

tomtricaFosfatasa alcalina UVvisible DO Espectrofot-

metroELISA

PeroxidasaLuminiscente Isoluminol Luminiscencia CPS Luminmetro QIA

DioxetanoFluorescente Europio Fluorescencia CPS Fluormetro DELFIA

Samario, terbio

CPM = cuentas por minuto; DO = densidad ptica; CPS = cuentas por segundo.


indicadora o seal de los enzimoinmunoanlisis se han usado compuestos qui-mioluminiscentes. Para la fosfatasa alcalina se han utilizado como sustrato com-puestos derivados del dioxetano, que producen intermediarios fenxidos queemiten luz a 470 nm y cuyo lmite de sensibilidad es de zeptomoles (1021 mol)aun en sistemas automticos.13 Estos mtodos acoplados son ms sensibles quelos clsicos mtodos enzimticos o los fluoromtricos.

SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y REACCIN CRUZADA

Los tres componentes esenciales en los inmunoensayos son la sensibilidad, la es-pecificidad y la reaccin cruzada. Por ser la sensibilidad la mnima dosis detecta-ble diferente de cero, depende del tipo de marca usada y de la disponibilidad dereactivos. Entre los mtodos disponibles en el mercado, los inmunoanlisis mssensibles son los heterogneos de tercera generacin. El aumento en los lmitesde sensibilidad ha sido importante para ciertas patologas endocrinas; p. ej., noes posible realizar un diagnstico de hipotiroidismo mediante el empleo de mto-dos de primera generacin para cuantificar TSH cuya sensibilidad sea de 0.05mU/L, y en este caso debern usarse ensayos de tercera generacin con sensibili-dad de 0.01 mU/L, o de cuarta generacin, que ofrecen sensibilidad de 0.0001mU/L.14 De igual forma, gracias a los mtodos de tercera generacin es posiblerealizar de manera adecuada el diagnstico diferencial entre retraso en la puber-tad o hipogonadismo hipogonadotrpico.15

Dado que los inmunoensayos se basan en la reaccin antgenoanticuerpo, elreconocimiento especfico del anticuerpo por el antgeno o especificidad es unacaracterstica fundamental para lograr determinaciones confiables y tiles. Debeevitarse la posibilidad de reconocimiento errneo del anticuerpo por antgenosde estructuras semejantes y, en casos en que no se pueda eliminar la reaccin cru-zada, como para algunos esteroides, esto deber documentarse.

Una manera sencilla de integrar las caractersticas y componentes de los inmu-noensayos se ilustra en las figuras 12 y 13. Como puede observarse en la figura12, en los sistemas heterogneos competitivos la diferencia la establece bsica-mente el tipo de marca utilizada, de la cual toma su nombre cada mtodo. En cadacaso se detecta una seal dependiente del tipo de marca, lo cual permite construiruna curva estndar en la que se interpola la concentracin de la muestra descono-cida (M). Las curvas estndar de los inmunoanlisis competitivos se grafican conbase en la seal de la marca en trminos de CPM, DO o CPS, la cual es inversa-mente proporcional a la concentracin del metabolito evaluado.

La figura 13 muestra las caractersticas y componentes de los inmunoensayosheterogneos no competitivos. Como en el caso de los ensayos competitivos, to-


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Figura 12. Tipos de inmunoensayos competitivos.

AnticuerpoConcentracin

constante

Antgeno froMuestra estndar

Control

Antgeno marcadoConcentracin

constante

Separacin

Fraccinunida

Fraccinlibre

Seal(fraccinunida)

MInter-

polacin

Tipo de marcaMtodo

Concentracin

125I/3H = RIAEnzima = EIALuminol = QIA

Lantnidos = FIA

dos los mtodos comparten un diseo bsico y se diferencian esencialmente conbase en la marca empleada, de la cual toman su nombre. As, se generan los ensa-yos radioinmunomtrico (IRMA), enzimoinmunomtrico (EIMA), quimioin-

Figura 13. Tipos de inmunoensayos no competitivos.

AnticuerpoConcentracin

constante

Antgeno froMuestra estndar

Control

Antgeno marcadoConcentracin

constante

Separacin Seal

M

Inter-polacin

Tipo de marcaMtodo

Concentracin

125I = IRMAEnzima = EIMALuminol = QIMA

Lantnidos = FIMA

Fase slida


munomtrico (QIMA) y fluoroinmunomtrico (FIMA). Todos estos mtodos seplantean como anlisis tipo sandwich en sistemas heterogneos no competitivos.En cada caso, segn la seal emitida se genera una curva estndar cuya respuestaen trminos de CPM, DO o CPS es directamente proporcional a la concentracindel analito evaluado. En la curva estndar generada se realiza el proceso de inter-polacin de la seal de la muestra desconocida (M) para determinar su concentra-cin.

Es importante considerar que el incremento en la sensibilidad y especificidadque ofrecen los mtodos de segunda y tercera generacin obliga a cada laborato-rio a establecer valores de referencia propios de cada metodologa.

PERSPECTIVAS

El futuro de los inmunoensayos estar en la aplicacin de nuevos tipos de marcasque incrementen an ms la sensibilidad de los ensayos actuales. El empleo demarcaje con DNA en sistemas de inmunoPCR, considerado como de cuarta ge-neracin, ofrece ya para algunos metabolitos, como el antgeno tumoral MG7,una sensibilidad de 1022 mol, superior en cinco rdenes de magnitud a la sensibi-lidad de las mediciones por ELISA.12

Otro de los desarrollos recientes que an tienen limitada aplicacin pero unagran perspectiva es el anlisis multiplex, el cual, adems de incrementar la sensi-bilidad a niveles atomolar (1018 mol) o yoctomolar (1024 mol), permite medirsimultneamente ms de un metabolito. El sistema multiplex incluye diversidadde microesferas (coloreadas), marcas fluorescentes, en ensayos heterogneostipo sandwich adosados a citmetro de flujo. Los ensayos multiplex ya estn dis-ponibles para la evaluacin de citocinas y alergenos en el sistema comercial Lu-minex FlowMetrix; sin embargo, an no se tienen aplicaciones para el rea en-docrinolgica.13

Es predecible que el desarrollo de inmunoanlisis que empleen enzimas, fluo-rescencia, quimioluminiscencia, metales y DNA, entre otros, para la medicintanto de protenas como de haptenos, continuar ofreciendo ventajas y exploran-do sus limitaciones. La eleccin del tipo de anlisis o tipo de marcador depender,entre otros factores, de la sensibilidad requerida, de la evaluacin costobenefi-cio, as como de los prejuicios de los consumidores. Es probable tambin quenuevos reactivos sean producidos por manipulaciones genticas y que la intro-duccin de tecnologa alternativa, incluidos los microarreglos, ser un procesogradual en los diferentes laboratorios de acuerdo con sus necesidades, recursoseconmicos y expectativas, al igual que su aplicacin en otros campos, como laveterinaria, la agricultura y la industria alimentaria, entre otros.


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Edito

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2Pruebas diagnsticas

en endocrinologaMara Teresa Tusi Luna

El diagnstico clnico se fundamenta o se confirma con los resultados de distintosanlisis clnicos, como la determinacin de glucosa, colesterol o triglicridos ensangre, la determinacin de actividades enzimticas como las transaminasas o dedistintos anticuerpos dirigidos contra diversos agentes patgenos.

Ms recientemente, y derivada del conocimiento de la secuencia de nucleti-dos del genoma humano y de mltiples organismos patgenos, aunada a la posi-bilidad de analizar esta informacin en muestras muy pequeas de sangre, tejidoo fluidos corporales, se abre la posibilidad de incorporar el anlisis gentico aldiagnstico clnico. Hoy en da el estudio del material gentico es uno ms de loselementos que permiten un diagnstico de certeza para algunas entidades dondese requiere el diagnstico diferencial, como es el caso de la hiperplasia suprarre-nal congnita, o la posibilidad de un diagnstico presintomtico en el caso de fa-miliares de pacientes con cncer medular de tiroides.

Para enfermedades en donde participa un conjunto de genes con un efecto pe-queo pero aditivo en su desarrollo, como el caso de la diabetes, la hipertensinarterial y la enfermedad cardiovascular, el anlisis molecular no puede ser aplica-do todava al diagnstico clnico. Esto se debe a que las distintas variantes genti-cas que promueven el riesgo de distintas enfermedades tienen una contribucin pe-quea (entre 0.1 y 5% cada una), de tal manera que para que esta informacinpueda aplicarse al diagnstico tendra que identificarse la mayor parte de los genesque contribuyen. Esto no es factible, ya que hasta la fecha, en el caso de la mayorade las enfermedades genticas complejas como la diabetes, la hipertensin arterialy la obesidad, no se conoce gran parte de los genes que contribuyen a su desarrollo.

11


Por lo tanto, el diagnstico molecular es til para identificar mutaciones endonde el cambio gentico determina en mayor medida la presentacin de la sinto-matologa en los individuos portadores de este cambio. Tal es el caso de las enfer-medades monognicas mendelianas y de algunos tipos de cncer, donde se cono-ce la participacin de distintos genes con alta penetrancia.

En este captulo se revisarn las caractersticas generales del polmero del ci-do desoxirribonucleico (DNA) y del cido ribonucleico (RNA), as como de lastcnicas que se emplean con mayor frecuencia en el diagnstico molecular.

ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL MATERIAL GENTICO

Estructura del DNA

El DNA de todos los seres vivos est constituido por desoxirribonucletidos, for-mados por un fosfato, una 2desoxirribosa y 1 de 4 diferentes bases nitrogenadas:dos purinas (adenina o guanina) y dos pirimidinas (citidina o timidina). El fosfatoest unido al hidroxilo del carbono 5 de la ribosa por medio de un enlace fosfoster,mientras que las bases nitrogenadas se encuentran unidas al carbono 1 de la ribosapor medio de un enlace glucosdico. La molcula del DNA est formada por dospolmeros complementarios de desoxirribonucletidos. Cada polmero tiene unacadena de fosfatos y ribosas en donde los fosfatos estn expuestos hacia el exteriory las bases nitrogenadas se encuentran orientadas hacia el centro de la estructura.

La capacidad de almacenamiento de informacin del DNA radica en la posibi-lidad de unin de las bases nitrogenadas. La complementariedad entre adeninay timidina, o entre guanina y citosina, permite que la informacin se copie de ma-nera fiel durante la replicacin del DNA. Durante el paso del DNA a mRNA(transcripcin), slo una de las dos cadenas sirve como molde, por lo que a stase la denomina cadena templada y a la otra cadena codificante.

Estructura de un gen

Los genes humanos, como los de la mayora de los eucariotas superiores, tienenen promedio 10 000 pb, aunque se han identificado genes mucho ms pequeosy mucho ms grandes. La expresin del gen depende de la actividad de una reginlocalizada en el extremo 5 del gen, denominada regin de control o promotor,que normalmente tiene cerca de 1 000 pb. En esta regin se localizan secuenciasque pueden unir factores de transcripcin, esto es, protenas que activan o repri-men la transcripcin del gen (figura 21 B). La secuencia que codifica para los

13Pruebas diagnsticas en endocrinologaEd

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Figura 21. Fundamento de la secuenciacin con didesoxirribonucletidos. A. Reac-cin de adicin de desoxicitosina marcada con 32P en posicin . B. Reaccin de adicincon didesoxiguanosina en presencia de otros tres desoxinucletidos. C. Reaccin deadicin de didesoxiadenosina en presencia de los otros tres desoxinucletidos. D.Reaccin de adicin de didesoxitimidina en presencia de los otros tres desoxinucleti-dos. E. Reaccin de adicin de didesoxicitidina en presencia de los otros tres desoxinu-cletidos. F. Separacin de los productos de adicin en un gel de poliacrilamida con ureacomo agente desnaturalizante.

productos gnicos se encuentra fragmentada en secciones denominadas exones,separadas por regiones del DNA que no codifican para el producto gnico, deno-minadas intrones. El conjunto de exones e intrones representa la regin estructu-ral o codificante del gen (figura 21 B). Es importante mencionar que en muchasocasiones se han identificado regiones que colaboran en el control de la expresindel gen, pero que fsicamente estn dentro de los primeros exones, intrones o am-bos. Tambin se han identificado regiones que participan en el control de la ex-presin del gen y que se encuentran muy distantes de ste.

Estructura del RNA

El RNA es tambin un polmero, pero est constituido por ribonucletidos quedifieren del DNA en que presentan un grupo hidroxilo en la posicin 2 de la ribo-


sa. El RNA siempre est constituido por una sola cadena de ribonucletidos. Laotra diferencia importante radica en que el RNA tiene uracilo en lugar de timidi-na. Este cambio en el uso de la pirimidina, complementaria a la adenina, originaque una secuencia codificante del DNA como 5ATGGAATTC3 se traduzcaa un RNA con la secuencia 5AUGGAAUG 3. Existen tres principales tiposde RNA: el RNA ribosomal (rRNA), que forma parte funcional de los ribosomas;el RNA de transferencia, que forma parte del sistema de traduccin (tRNA), y elRNA mensajero (mRNA), que se origina de la transcripcin del DNA codifican-te, mismo que sirve como molde para la sntesis de protenas. Adems, existenotros RNA pequeos que forman parte de diversas partculas riboprotenicas delncleo. La mayora de las alteraciones genticas que pueden ser detectadas en elRNA se encuentran en los mRNA.

En una clula humana, el mRNA slo representa menos de 2% del RNA total(rRNA+ tRNA + mRNA), lo cual ocasiona su relativa inestabilidad en compara-cin con el DNA. Por su baja abundancia e inestabilidad, el uso del mRNA enel diagnstico molecular es imprctico. Este problema se ha resuelto traduciendoel mRNA a DNA con el empleo de una enzima denominada transcriptasa reversa,que emplea RNA como molde en lugar del DNA. Esto ha permitido copiar la se-cuencia de los diferentes mRNA a DNA, al que se denomina DNA complementa-rio (cDNA) para distinguirlo del DNA codificante o genmico.

Dogma central de la biologa molecularPor mucho tiempo se propuso que la informacin flua exclusivamente en unasola direccin: del DNA al mRNA y de all a las protenas. Asimismo, se conside-raba que la herencia se deba a la replicacin del DNA, que transmita la informa-cin de una generacin a otra. A este postulado se le denominaba el dogma centralde la biologa molecular, e implicaba varias restricciones importantes al flujo deinformacin. Por una parte, no se prevea el flujo de informacin del RNA alDNA; sin embargo, el estudio del virus cuyo genoma consiste en RNA (como elvirus de la poliomielitis) llev al descubrimiento de la transcriptasa reversa, quesirve como molde para la sntesis de DNA. Actualmente, el dogma central de labiologa molecular ha incorporado nuevos conceptos que explican que el flujode informacin puede ir del DNA al RNA y de regreso. La biotecnologa ha hechouso de estos procesos para manipular al DNA y al RNA y desarrollar los princi-pios en que se basan las tcnicas de diagnstico molecular.

DIAGNSTICO MOLECULARLa biologa molecular estudia la estructura y la funcin del DNA y del RNA (oambas); por lo tanto, el diagnstico molecular consiste en determinar las altera-


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ciones en la estructura o secuencia de los cidos nucleicos del DNA, del RNA ode ambos, asociadas con una enfermedad particular. Este objetivo se logra en laprctica buscando diferencias en la secuencia de bases del DNA o del RNA, supo-niendo que estas variantes de la secuencia del DNA produzcan una protena defuncin alterada. Es importante recordar que cada aminocido est codificadopor un codn (una secuencia de tres desoxirribonucletidos) y que el cdigo gen-tico que correlaciona los codones con los aminocidos es degenerado. Esto quie-re decir que, mientras que algunos codones slo codifican un aminocido, comop. ej. el codn AUG, que corresponde siempre al codn de inicio y codifica parala metionina, tambin hay tres codones de trmino (stop): UUA, UAG y UGA.Un ejemplo de esta degeneracin son los dos codones que codifican a la isoleuci-na: AUU y AUC. Una mutacin se presenta cuando, p. ej., en el codn de inicioAUG se produce un cambio de G por U en la tercera posicin, convirtiendo aAUG en AUU, que codifica para isoleucina. Este cambio tiene un efecto profun-do sobre la expresin de la protena, ya que se pierde la seal de inicio de la tra-duccin (AUG) y, por lo tanto, si bien se tiene un mRNA, ste nunca se traducea la protena correspondiente. En este caso se trata de una mutacin con prdidade funcin en la cual, en este caso particular, el cambio de G por U produce laprdida del codn, que sirve como seal del inicio de la traduccin (AUG) y, porlo tanto, a pesar de que s hay mRNA, no hay protena y por esto existe ausenciatotal del producto gnico. La degeneracin de codones tambin puede ocasionarcambios de secuencia que codifican para el mismo aminocido. P. ej., el codnUUC codifica para fenilalanina; un cambio de la C de la tercera posicin por unaU genera el codn UUU, que tambin codifica para fenilalanina. En este caso,el cambio de secuencia es un polimorfismo que no tiene ningn efecto sobre lafuncin de la protena.

Dado que la secuencia de desoxirribonucletidos se encuentra en el centro deldiagnstico molecular, la tcnica de secuenciacin tiene ms peso que todas lasdems metodologas de anlisis del DNA y representa el estndar contra el quese comparan las dems tcnicas. Si bien esta tarea parece sencilla y directa, secomplica en el momento de considerar la muestra de tejido a partir de la cual seobtendr el material gentico por analizar.

Las dificultades comienzan por el simple hecho de que, fuera de los gametoscon genoma haploide (vulo y espermatozoide), todas las clulas somticas pre-sentan dos alelos de un mismo gen: uno de origen paterno y otro de origen mater-no (genoma diploide). La naturaleza diploide del material gentico humano im-plica que un cambio en la secuencia presente en un alelo no necesariamente estarpresente en el otro. Las dificultades pueden aumentar si se considera que el cam-bio de base en un alelo pudo originarse a travs del desarrollo del individuo, porlo que no estar presente en todas sus clulas (condicin conocida como mosai-cismo). Por lo tanto, en casos de mosaicismo, al aislar el material gentico de un


tejido, slo 1 de los 2 alelos de algunas clulas presentar el cambio en secuencia.Este problema es comn en oncologa, ya que la mayora de las mutaciones pre-sentes en tumores no ocurren en el tejido normal que los circunda.

CAMBIO DE SECUENCIA FUERA DELA REGIN CODIFICANTE DE UN GEN

Es importante recordar que la informacin codificada en la secuencia de un genes relevante tanto en la regin de control o regin promotora como en las regionesestructurales de un gen que codifican informacin para la sntesis de un mRNAy, en ltima instancia, de una protena. Con base en el cdigo gentico es posiblepredecir si el cambio en secuencia tendr un efecto en la estructura o en la funcinde la protena. Sin embargo, es mucho ms difcil definir el efecto de un cambiode secuencia en los intrones o en la regin promotora. La facilidad de predecirel efecto de un cambio de secuencia en la regin codificante y la dificultad paraasignar la importancia funcional a un cambio en la regin promotora o en un in-trn han sesgado el conocimiento sobre las mutaciones en la regin codificantede los genes, dejando de lado la identificacin de mutaciones en intrones y lasregiones de promotores. Por esta razn es importante mencionar que la ausenciade mutaciones en la regin estructural de un gen no significa que no puedan exis-tir mutaciones con efectos tanto o ms importantes en los intrones o en las regio-nes de control.

TCNICAS APLICADAS AL ESTUDIO DEL DNA

Secuenciacin

Esta tcnica requiere cadenas sencillas del DNA (DNA desnaturalizado), que ge-neralmente en el diagnstico molecular es un fragmento de gen humano generadopor PCR a partir del DNA genmico obtenido del paciente. Muchas veces esteDNA se inserta dentro de un DNA circular (denominado vectores de clonacin)que puede propagarse fcilmente en bacterias. Una vez desnaturalizado, el DNAes apareado con un oligonucletido sinttico complementario (iniciador), quesirve como punto de anclaje e iniciador de la sntesis del DNA. Esta reaccin escatalizada por la enzima DNA polimerasa que, en presencia de desoxirribonu-cletidos trifosforilados (dNTP), emplea 1 de las 2 cadenas del DNA como moldepara copiar la secuencia, generando una cadena con una secuencia comple-


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mentaria y antiparalela a la cadena que sirve como molde. El principio de la reac-cin de secuencia consiste en interrumpir de manera aleatoria la sntesis del DNAen cada uno de los pasos de polimerizacin. Esto se logra mediante cuatro reac-ciones de polimerizacin que se realizan de manera simultnea en cuatro tubosindependientes; a cada uno de stos se le aade una pequea proporcin de unode los cuatro didesoxirribonucletidos (ddNTP) que carecen del grupo hidroxiloen la posicin 3 de la ribosa y una muy pequea proporcin de un desoxirribonu-cletido trifosforilado marcado con 32P en la posicin , generalmente 32PdCTP. El resultado es que al incorporar uno de los ddNTP se termina la polimeri-zacin, ya que el polmero naciente carece de un hidroxilo 3 en su extremo. As,p. ej., en un tubo en el que se hubiera puesto una pequea porcin de ddCTP ca-rente de un hidroxilo en la posicin 3, en presencia de un exceso de dCTP nor-mal, se genera toda una familia de productos de polimerizacin interrumpidos,esto siempre que haya una citidina en la secuencia. Los productos de esta reaccinse separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida, para extender esto al m-ximo a las cadenas del DNA de diferentes longitudes y separarlas por tamao. Encada uno de los cuatro carriles se separan las familias de productos de elongacinque terminan con un ddGTP, ddATP, ddTTP o ddCTP. La secuencia se lee si-guiendo el orden en el que aparecen los distintos productos de elongacin en cadauno de los cuatro carriles del gel (figura 22). Estos productos pueden visualizar-se por dos mtodos independientes que emplean didesoxirribonucletidos mar-cados con istopos radioactivos, o bien con compuestos fluorescentes (fluorfo-ros). En el primer caso, las cuatro reacciones se hacen en presencia de undesoxirribonucletido marcado con istopos radiactivos en posicin (el fsfo-ro ms cercano a la ribosa); los istopos empleados comnmente son el azufre35S, el fsforo 32P y el fsforo 33P. Actualmente las reacciones de polimerizacinse realizan slo en presencia de desoxicitidina, marcada en posicin (32PdCTP). Dado que durante la elongacin de un oligonucletido se incorporan va-rias citidinas marcadas, todos los productos de elongacin tienen incorporadosvarios istopos radiactivos. Los productos se separan en un gel desnaturalizantede poliacrilamida, que al trmino de unas horas de electroforesis se fija y se seca.La posicin de cada producto de elongacin se evidencia en una pelcula fotogr-fica como una banda negra despus de una exposicin de varias horas. Este siste-ma es el que se aplica en los sistemas denominados de secuenciacin manualpor el hecho de que la lectura de la secuencia se realiza manualmente leyendoel orden de las bandas negras en la pelcula. La segunda alternativa emplea lafluorescencia para identificar los diferentes productos de elongacin del DNA.En este caso, el proceso de marcaje se realiza en un solo tubo, en donde las reac-ciones de elongacin del DNA se hacen en presencia de cuatro desoxirribonu-cletidos trifosforilados (dNTP) y una pequea proporcin de los cuatro diferen-tes ddNTP, acoplados a fluorforos (usualmente derivados de rodamina, que se


Figura 22. Mecanismo de accin de la PCR. En la parte superior se presentan los cam-bios de temperatura que permiten la desnaturalizacin del DNA, la formacin del hbridoentre el DNA templado y los oligonucletidos que sirven como cebadores, y la polimeri-zacin a partir del oligonucletido, empleando la enzima TaqPol. En la parte inferior semuestran las dos cadenas antiparalelas del DNA (barras gruesas) y los oligonucletidos(flechas) durante los primeros dos ciclos de amplificacin. Las barras de grosor interme-dio representan los productos de la PCR.

Desnaturalizacin Hibridacin Extensin tiempo (seg)

excitan a una sola longitud de onda y que emiten a cuatro diferentes longitudesde onda). Los productos de elongacin se separan en geles desnaturalizantes depoliacrilamida o en un sistema capilar y se someten a electroforesis. Una unidadde lectura que se encuentra fija en el punto ptimo de resolucin del sistema deelectroforesis revela las cuatro seales fluorescentes por medio de un rayo lserque excita a los cuatro fluorforos. Cuatro fotodetectores con filtros especficosacoplados a la unidad de lectura captan la luz emitida por cada fluorforo, lo quepermite comunicar el orden en el cual aparecen los diferentes productos de poli-merizacin (usualmente los fluorforos empleados emiten luz verde, roja, azulo amarilla).

Ya que la electroforesis mueve las cadenas del DNA a lo largo del gel, la se-cuencia de fragmentos de elongacin pasa continuamente frente a la unidad delectura.


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En este caso se generan histogramas de cuatro colores; cada color representauna base diferente, y el orden en que aparecen los picos corresponde a la secuen-cia de bases. ste es el sistema de lectura que se aplica en los secuenciadores auto-mticos.

PCR y PCR en tiempo real

Una de las principales limitaciones de la secuenciacin es que requiere cantida-des significativas del DNA molde (100 ng). Este problema se resolvi con el de-sarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (del ingls polymerase chainreaction, PCR), en la cual se duplica el DNA molde de doble cadena con cadaciclo de reaccin. En una reaccin tpica de 30 ciclos de amplificacin se produ-cen ms de un billn de copias del molde original (230 ciclos = 109) de molculasamplificadas. Este mtodo requiere el conocimiento de dos secuencias que fun-cionan como cebadores o indicadores y que se encuentran en los extremos de lasecuencia que se desea amplificar. Con base en estas secuencias se sintetizan dosoligonucletidos con una longitud de 17 a 35 desoxirribonucletidos. Por lo ge-neral, el fragmento del DNA que se amplifica tiene de 200 a 1 000 pares de bases.La reaccin es catalizada por una DNA polimerasa termoestable (Taq Pol) deri-vada de una bacteria termfila. La PCR permite obtener grandes cantidades deun fragmento de DNA especfico a partir de un DNA o RNA molde, en una reac-cin enzimtica in vitro. Esta sntesis de DNA o RNA se realiza en un instrumentoque somete la reaccin a series de diferentes temperaturas por cantidades varia-bles de tiempo, lo que se conoce como ciclos de amplificacin.

Cada ciclo esta constituido por tres fases:

a. Desnaturalizacin (p. ej., de 15 seg a 2 min de 94 a 96 C), donde las doscadenas de DNA se separan por ruptura en los puentes de hidrgeno que lasunen. Se produce as el DNA molde de una sola cadena necesario para lareplicacin por la DNA polimerasa.

b. Alineacin (p. ej., de 15 a 60 seg de 40 a 60 C). Los oligonucletidos pue-den formar una asociacin estable, es decir, alinearse con el DNA moldedesnaturalizado y servir como iniciadores para la DNA polimerasa.

c. Extensin (p. ej., de 1 a 2 min de 70 a 74 C). La sntesis de DNA comienzacuando se alcanza la temperatura de reaccin ptima para la DNA polime-rasa. La velocidad de sntesis de la Taq polimerasa es de 2 000 nt/min.

La tcnica de PCR se utiliza rutinariamente en proyectos de investigacin bsicaen biologa celular y molecular para el anlisis de genes (clonacin, secuencia-cin, expresin, regulacin), en estudios de mapeo gentico, en el diagnstico


clnico de enfermedades hereditarias e infecciosas (virales y bacterianas), ascomo en la identificacin de individuos en medicina forense y para determinarla paternidad.

El PCR en tiempo real es un mtodo que, mediante la reaccin de PCR y detec-cin de fluorescencia, permite cuantificar la cantidad de DNA producido, ya quela emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidadde DNA sintetizado. Es un mtodo especfico y sumamente sensible donde losprocesos de amplificacin y deteccin se llevan a cabo de manera simultnea. LaPCR en tiempo real requiere el uso de aparatos que incorporan un lector de fluo-rescencia y estn diseados para poder medir en cualquier momento la fluores-cencia emitida en cada uno de los viales o pozos donde se realice la amplificacin.

Los sistemas de deteccin de secuencia por fluorescencia se basan en el usode agentes intercalantes, que son fluorocromos que aumentan notablemente laemisin de fluorescencia cuando se unen a DNA de doble cadena. El SYBR greenes el ms empleado. Las sondas Taqman utilizan la actividad 5 exonucleasa dela Taq DNA polimerasa. Tienen un marcador fluorescente (reportero) en el extre-mo 5 y una molcula que absorbe (apagador) la fluorescencia emitida por el mar-cador en el otro extremo. Las principales aplicaciones del PCR en tiempo real sonla cuantificacin semicuantitativa de la expresin gnica (esto es, cambios en losniveles de expresin de mRNA de distintos genes), la cuantificacin de patge-nos y el anlisis de polimorfismos genticos para deteccin de mutaciones, en es-tudios de mapeo gentico y gentica de poblaciones.

Hibridacin del DNA (Southern)En esta tcnica, el DNA genmico obtenido generalmente de leucocitos de san-gre perifrica es digerido con alguna enzima de restriccin o una mezcla de estasenzimas y separado de acuerdo con el tamao de los fragmentos generados en unsistema de electroforesis horizontal en geles de agarosa. Los fragmentos delDNA se transfieren por capilaridad o por electrotransferencia a una membranade nitrocelulosa, a la cual se unen de manera covalente por exposicin a luz ultra-violeta. Para facilitar la transferencia de fragmentos muy grandes del DNA, el gelse sumerge en una solucin alcalina (generalmente NaOH) para producir hidrli-sis parcial y as reducir el tamao de los fragmentos; despus el gel se sumergeen una solucin de amortiguador concentrado para suspender la hidrlisis. Losfragmentos del DNA unidos a la membrana de nitrocelulosa se sumergen en unamezcla que los desnaturaliza. En este estado extendido y de cadena sencilla, losfragmentos del DNA pueden hibridarse o unirse con un fragmento del DNA,cDNA o el RNA (de secuencia conocida) complementario a la secuencia de inte-rs, al cual se lo denomina sonda. Esta sonda se marca normalmente con istopos


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radiactivos, con compuestos fluorescentes o con dioxigenina. Una vez hibridada,la membrana se lava para eliminar la sonda unida a la membrana de manera ines-pecfica y se expone a una pelcula fotogrfica donde se visualizan el o los sitios(bandas) donde ocurri la hibridacin. Esta tcnica tiene distintas variantes, perola idea de este anlisis consiste en identificar genes o fragmentos gnicos de untamao anormal o ausentes como consecuencia, p. ej., de deleciones. Una varian-te de este ensayo, que se ha empleado en ocasiones en el diagnstico molecular,consiste en usar oligonucletidos de 17 a 30 bases como sonda; este sistema apli-cado al anlisis de productos de PCR puede detectar cambios de una base. A esteensayo se lo denomina hibridacin especfica de alelo. Sin embargo, su aplica-cin es limitada, ya que normalmente un ensayo de hibridacin tipo Southern sehace sobre DNA genmico digerido con enzimas de restriccin. En este caso, unasonda pequea de 30 bases puede seguir reconociendo su secuencia complemen-taria legtima, pero tambin se produce una alta seal inespecfica al estableceruniones parciales con muchas secuencias del genoma.

Esta limitacin se supera amplificando por PCR, en primer lugar, la regin delDNA en la que se encuentran las variantes allicas, y sometiendo los productosde la PCR a un anlisis tipo Southern. El uso de ensayos tipo Southern como unaherramienta cuantitativa ha crecido con el advenimiento de nuevos sistemas dedensitometra y de anlisis de seales radiactivas, as como sistemas de marcadocon fluorforos y con dioxigenina.

Polimorfismos en la longitudde fragmentos de restriccin (RFLP)Una de las herramientas ms sencillas en el diagnstico molecular es la identifi-cacin de cambios de secuencia que afectan el reconocimiento de secuenciasblanco de enzimas de restriccin (endonucleasas que hidrolizan el enlace entrefosfato y desoxirribosa, pero slo dentro de una secuencia especfica). Estas enzi-mas, aisladas originalmente de diferentes especies de bacterias, tienen una granespecificidad para el reconocimiento de las secuencias especficas de 4 a 10 nu-cletidos consecutivos a sus secuencias blanco y tambin se les denomina sitiosde restriccin. Las enzimas de restriccin de mayor uso reconocen secuencias de6 y 8 nucletidos.

En el ensayo de hibridacin tipo Southern las enzimas de restriccin se em-plean para fragmentar el DNA genmico con el propsito de hacerlo manejable,partiendo de que las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccinse encuentran en la mayora de los genes en posiciones aleatorias. En los ensayosde RFLP se busca que los cambios en secuencia que se utilizan como herramien-tas para el diagnstico molecular hayan ocurrido en una regin especfica de un


gen particular, o en regiones muy cercanas o ligadas genticamente al gen encuestin.

Un cambio que afecte la secuencia de reconocimiento de la enzima de restric-cin har que un sitio de restriccin preexistente desaparezca o, alternativamente,que el cambio en secuencia produzca un nuevo sitio de restriccin donde antesno haba ninguno.

En un principio estos ensayos se realizaban combinando el corte con enzimasde restriccin y ensayos de hibridacin tipo Southern, empleando como sondauna secuencia aledaa o que incluso se traslapara con el sitio de restriccin. P. ej.,la desaparicin de una de las bandas que se registran en el Southern se consideracomo evidencia de la desaparicin del sitio de restriccin. Hoy en da esta aproxi-macin sigue siendo til, aunque es ms frecuente que se utilice en combinacincon reacciones de PCR.

En este caso se amplifica la regin en la cual est el sitio de restriccin. Mues-tras del producto de PCR antes y despus de ser sometido al tratamiento con laenzima de restriccin se separan en geles de agarosa, en condiciones no desnatu-ralizantes, y se tien con bromuro de etidio para visualizar los productos de PCRy sus posibles fragmentos en un transiluminador de luz ultravioleta. En estos sis-temas los fragmentos se separan basndose en la longitud del fragmento delDNA, por lo que la ausencia o presencia de un sitio de restriccin se refleja enla posicin de las bandas fluorescentes, y de ah el nombre de la tcnica. Este m-todo de deteccin de cambios de secuencia es tal vez el ms sencillo, dada la acce-sibilidad a un termociclador y a un sistema de electroforesis horizontal, as comoporque no requiere el uso de istopos radiactivos.

Polimorfismos de cadena sencilla del DNA (SSCP)Esta estrategia permite el anlisis preliminar dinmico de posibles diferencias desecuencia en un fragmento determinado del DNA (p. ej., el exn de un gen) enuna gran cantidad de individuos. Consiste en la amplificacin, por medio de PCR,de un fragmento del DNA a partir del DNA genmico total. La reaccin de ampli-ficacin se hace en presencia de un dNTP radiactivo, generalmente dCTP marca-do con 33P o con 32P en la posicin .

Los productos de amplificacin de los distintos individuos por analizar sondesnaturalizados por altas temperaturas y se separan en un gel no desnaturalizan-te de poliacrilamida. Las cadenas sencillas se pliegan sobre s mismas estable-ciendo uniones AT y GC dentro de las cadenas. Si hay cambios de secuencia enla regin analizada se producen alteraciones en la conformacin que toman lascadenas sencillas del DNA, lo que altera la migracin de dos cadenas sencillasdel mismo tamao, pero cuya secuencia difiere.


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Microarreglos del DNA(DNA microchips o DNA microarrays)Los microarreglos son sistemas anlogos a los sistemas de hibridacin tipo Sou-thern, llevados a pequea escala. La principal diferencia consiste en que el DNAque se encuentra sobre las membranas o vidrios empleados como soporte corres-ponde a un solo tipo de secuencia del DNA de secuencia conocida. En el caso demembranas, las dimensiones son de 5 x 7 cm, mientras que en el caso de vidriosse emplean portaobjetos de 2.5 x 7.7 cm. El nombre de microarreglos se refiereal hecho de que las diferentes secuencias estn dispuestas en hileras de pequeospuntos del DNA. La tecnologa requerida para depositar estas secuencias delDNA de manera reproducible y para amplificar las secuencias sobre los soporteses muy similar a la que se emplea para la construccin de microcircuitos electr-nicos, y por esto tambin se les denomina microchips del DNA.

Normalmente el nmero de puntos con secuencias de diferentes genes quepueden depositarse sobre los soportes oscila entre 4 000 y 6 000. Las secuenciasque se depositan sobre estos soportes suelen ser secuencias tipo o de referenciay variantes conocidas que pueden corresponder a mutaciones o polimorfismosparticulares.

Los microarreglos del DNA pueden ser sometidos a un proceso de hibridacincon DNA derivado de la muestra de un paciente y previamente marcado con unistopo radiactivo (como 33P o 32P). Si la hibridacin se realiza en condicionesde alta selectividad (esto es, que requiere una unin perfecta entre los DNA delpaciente que sirven de sondas con las secuencias tipo de los microarreglos), lasparejas slo permanecern unidas con un apareamiento perfecto, que se revelacon sistemas de deteccin de emisiones radiactivas, ya que el arreglo de las cade-nas del DNA que se emplean como estndares en los microarreglos es conocido(secuencias normales, polimorfismos o mutaciones). El auge de esta tecnologase debe en parte al desarrollo de sistemas muy sensibles para la deteccin de emi-siones radiactivas y acoplados a sistemas de emisin y deteccin de luz. Ya queen un solo soporte se pueden depositar miles de secuencias diferentes, en princi-pio se pueden analizar simultneamente el mismo nmero de polimorfismos, mu-taciones o variantes allicas en un solo individuo.

TCNICAS APLICADAS AL ESTUDIO DEL RNA

El RNA es el producto primario de la transcripcin de un gen, con excepcin delRNA ribosomal (rRNA), el RNA de transferencia (tRNA) y los RNA pequeosque participan en la edicin del RNA mensajero. Las molculas de RNA que


codifican informacin que ser traducida a protenas pasan por un proceso de ma-duracin desde el RNA recin transcrito, la eliminacin de intrones y, finalmente,la adicin de seales estabilizadoras como el grupo CAP en su extremo 5 (7metilguanosina unida a dos nucletidos con una metilacin en posicin 2) y unacola de poliadenilacin, en su extremo 3 (secuencia consecutiva de 100 a 200adeninas). En ocasiones, los cambios de secuencia afectan la capacidad de trans-cripcin de un gen, lo que origina una transcripcin deficiente y, por lo tanto, unamenor cantidad de mRNA. En otras ocasiones los cambios de secuencia afectanla vida media del mRNA propiciando una mayor tasa de degradacin, al igual queen el caso anterior; de esta manera el resultado es una menor cantidad del mRNA.En otros casos los cambios de bases en el DNA alteran las secuencias que sirvenpara definir los sitios de corte y empalme durante el proceso de edicin delmRNA (splicing); el resultado es la eliminacin de un intrn junto con uno desus exones adyacentes, lo que origina un mRNA ms corto, que codifica para unaprotena a la que le falta la secuencia de aminocidos codificados por el exn fal-tante. Si bien en la mayor parte de casos estas consecuencias pueden predecirsedesde la secuencia primaria del DNA, en muchas ocasiones es necesario obteneruna confirmacin directa por medio del anlisis del RNA.

La principal limitacin de esta aplicacin en el diagnstico molecular radicaen la dificultad para obtener el mRNA a partir de una biopsia del tejido en el cualse expresa el gen en cuestin. Si el gen se expresa en leucocitos, piel o msculo,no hay una dificultad mayor. Sin embargo, si se sospecha que el gen alterado seexpresa en rganos afectados por la enfermedad, como pueden ser las glndulasendocrinas o el tejido nervioso central o perifrico, la obtencin de las biopsiases difcil y con frecuencia est contraindicada.

Es por estas razones que el anlisis de mRNA registra una aplicacin limitada.

Hibridacin (ensayos tipo Northern)El ensayo de hibridacin tipo Northern es muy similar al ensayo de hibridacinpara DNA (Southern). En este caso se asla todo el RNA de un tejido en el cualse exprese el gen en cuestin; la tcnica de uso comn no distingue entre elmRNA y los rRNA, tRNA o RNA pequeos (aunque por medio de una columnade afinidad con secuencia, consecutiva de timidinas, se puede purificar al mRNAcon relativa facilidad al unirse a las colas de poliadenilacin de los mRNA madu-ros). La mezcla de molculas del RNA se separa por electroforesis en un gel deagarosa en condiciones desnaturalizantes, lo cual genera un ordenamiento deacuerdo con su tamao. Las molculas del RNA se transfieren a una membranade nitrocelulosa a la que se unen en forma covalente por medio de irradiacin conluz ultravioleta y calor. Posteriormente la membrana se hibrida con una secuencia


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del cDNA marcada con un istopo radiactivo o bien con un fluorforo que sirvecomo secuencia de referencia o patrn. Esta sonda servir para identificar la se-cuencia del mRNA de inters de entre varios miles del RNA diferentes que exis-ten en una clula humana. Dado que no todas las clulas expresan todos los genes,es posible encontrar variaciones en el nivel de expresin de un mismo gen en dife-rentes tejidos. La membrana ya hibridada se pone en contacto con una pelculade autorradiografa en la cual aparecen bandas que revelan la posicin delmRNA, que fue reconocida por la sonda del cDNA. La comparacin con elmRNA de un individuo sano permite definir alteraciones. Si los cambios de se-cuencia afectan los sitios de corte y empalme (splicing) o producen delecioneso inserciones en la secuencia codificante, el mensajero es de menor o mayor ta-mao con respecto al mRNA silvestre, y la banda aparecer por debajo o por arri-ba de la banda del mensajero silvestre, respectivamente. Si los cambios de se-cuencia afectan la eficiencia de transcripcin o la estabilidad del mensajero,entonces la banda aparece en el mismo lugar en que se registra la seal del mensa-jero normal, pero difiere en intensidad, ya que la cantidad del mRNA en la mem-brana es directamente proporcional a la intensidad de la banda. Una menor efi-ciencia de transcripcin o una vida media ms corta propician una menorintensidad en la seal, mientras que una mayor eficiencia de la transcripcin o unavida media ms prolongada ocasionan una banda con mayor intensidad. Todo elprocedimiento es muy similar al ensayo de hibridacin tipo Southern, excepto porla presencia de agentes desnaturalizantes, necesarios para mantener a los mRNAen una forma lineal y permitir la formacin de los hbridos RNAcDNA marcado.

Transcripcin reversa de mRNAy PCR del cDNA (RTPCR)Este procedimiento realiza la transcripcin reversa del mRNA al cDNA pormedio de una transcriptasa reversa de origen viral; el cDNA que se origina de lasntesis sirve como molde para una reaccin de amplificacin por PCR. En estecaso es necesario contar con informacin sobre la secuencia del mRNA que sedesea analizar; esta informacin es necesaria para la sntesis de los oligonucleti-dos que sirven como cebadores de la Taq polimerasa.

Al igual que el ensayo de hibridacin tipo Northern, este procedimiento buscaanalizar slo una secuencia del mRNA particular dentro de la mezcla de todoslos diferentes al RNA que se encontraban dentro de la clula en el momento delaislamiento.

Una alternativa muy comn es realizar la transcripcin reversa empleandocomo cebador oligodesoxitimidina (oligodT), que hibrida con las colas de polidesociadenosinas de los mRNA maduros. Por lo general, el producto de PCR ge-


nerado a partir del cDNA de un mensajero especfico tiene una longitud de 300a 1 000 pb y, al igual que en cualquier ensayo de PCR, los productos teidos conbromuro de etidio se visualizan en un transiluminador de luz ultravioleta. Cuandose establece el RTPCR semicuantitativo, las diferencias en la intensidad del pro-ducto de PCR entre una muestra control y una con un cambio en secuencia sugie-ren alteraciones en la eficacia de transcripcin del gen o en la vida media del men-sajero. Sin embargo, al igual que para cualquier reaccin de PCR, se debeconsiderar que el cambio de secuencia no altere la estructura secundaria y tercia-ria del cDNA de tal manera que interfiera con la hibridacin en solucin con eloligonucletido cebador. En este caso, diferencias en la intensidad de la bandareflejan diferentes eficacias de la reaccin de amplificacin. Esta dificultad seelimina por medio de reacciones de PCR semicuantitativas, que se basan en am-plificar dos genes a partir de la misma muestra del cADN, en donde uno corres-ponde al gen cuyo nivel de expresin se cree afectado y el otro a un gen controlcuya expresin no se cree afectada. Como genes control es comn utilizar lasactinas y actinas (protenas estructurales) o la gliceraldehdo 3fosfato-deshidrogenasa (GAPDH, una enzima glucoltica). El anlisis semicuantitativoradica en normalizar la intensidad del producto de PCR del gen de inters con laintensidad del producto de PCR del gen control (actina o GAPDH).

Por otro lado, las inserciones o deleciones en la secuencia del mRNA se mani-fiestan como productos de PCR que difieren en tamao con respecto al productode PCR derivado de un individuo normal. En el caso de deleciones, si la secuenciade los oligonucletidos que sirven como cebadores se encuentra dentro de la se-cuencia faltante, en lugar de una variacin en el tamao del producto de PCR, ladiferencia consiste en la ausencia del producto de PCR. Por lo general es difcilque se presente este caso, aunque se puede encontrar al evaluar la expresin delgen ligado al cromosoma X.

La principal ventaja de la tcnica de transcripcin reversa del mRNA y PCRdel cDNA radica en que requiere una menor cantidad del mRNA que un anlisisde hibridacin tipo Northern (1 g del RNA total para RTPCR contra 20 g delRNA total para una hibridacin tipo Northern). Asimismo, las reacciones detranscripcin reversa y PCR no requieren el uso de istopos radiactivos.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

El diagnstico molecular se basa en la identificacin de la o las variantes de se-cuencia causal(es) de distintas enfermedades mendelianas o de ciertas neoplasiasdonde se conoce un nmero reducido de genes con un efecto mayor sobre la ex-presin de la patologa. La utilizacin del diagnstico molecular para enfermeda-


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des comunes como la diabetes, la hipertensin o la enfermedad cardiovascularse restringe hoy en da a las variantes monognicas de estas entidades. Cuandose identifiquen la mayora de los genes causales en las formas complejas, las va-riantes particulares y la magnitud de cada una sobre el riesgo de manifestar la en-fermedad, es probable que esta informacin sea til en primera instancia para laadecuacin de tratamientos preexistentes, as como para el diseo de nuevos fr-macos. Es posible tambin que su aplicacin como marcadores predictivos seamuy limitada.

REFERENCIASSe recomienda la lectura de algunos captulos de los siguientes libros como textosintroductorios:

1. Alberts B, Lewis J, Raff M et al.: Molecular biology of the cell. Cap. 4: How cells are stu-died. Garland, 1994.

2. Griggith AJF, Miller JH, Susuki DT et al.: An introduction to genetic analysis, 6 ed. Cap.14: Recombinant DNA technology; cap. 15: Applications of recombinant DNA technolo-gies. Nueva York, W. H. Freeman, 1996.

3. Lodis H, Baltimore D, Bek A, Zipursky SL et al.: Molecular cell biology. Cap. 7: Recom-binant DNS technology; cap. 8: Genetics analysis in cell biology; cap. 9: The molecular ana-tomy of genes and chromosomes. Nueva York, Scientific American Books, W. H. Freeman,1995.

4. Watson JD, Gilman M, Witkowski J et al.: Recombinant DNA. 2 ed. Nueva York, Scienti-fic American Books, W. H. Freeman, 1992.

Textos que proveen de protocolos detallados y de fcil acceso en bibliotecas:

5. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al.: Current protocols in molecular biology. Vols.1 y 2. Nueva York, John Wiley and Sons, 1992.

6. Berger SL, Kimmel AR: Guide to molecular cloning techniques. Methods in enzymology.Vol. 152. Nueva York, Academic Press, 1987.

7. Karcher S: Molecular biology: a project approach. Nueva York, Academic Press, 1995.8. Kaufmann PB, Wu W, Kim D, Cseke LJ: Handbook of molecular and cellular methods

in biology and medicine. Boca Ratn, CRC Press, 1995.9. Sambrook J, Russell DW: Molecular cloning: a laboratory manual. 3 ed. Vols. 1, 2 y 3.

Nueva York, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001.

Tambin se han incluido algunos ttulos que revisan las ventajas y dificultadesde las aplicaciones de la biologa molecular a la medicina:

10. Davies KE (ed.): Human genetic diseases: a practical approach. G. B., IRL Press Oxford,1987.

11. Morgan M: A history of molecular biology. Cambridge, Harvard University Press, 1988.

Edito

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3Hiperprolactinemia

Guadalupe Vargas Ortega, Fernando Larrea Gallo

INTRODUCCIN

La prolactina (Prl) es una hormona de naturaleza protenica de origen hipofisariocon efectos importantes sobre la funcin reproductiva. Esta hormona tiene un pa-pel importante durante la produccin de leche por la glndula mamaria comoaporte y sustento nutricional del recin nacido. Por otra parte, la Prl ejerce efectosmoduladores negativos sobre la secrecin de hormonas hipofisarias responsablesde la funcin gonadal, incluyendo la hormona luteinizante (LH) y la foliculoesti-mulante (FSH).

El exceso en la produccin y secrecin de la Prl, situacin conocida como hi-perprolactinemia, representa una condicin clnica a menudo encontrada comocausa de infertilidad o disfuncin del sistema reproductivo en ambos sexos. Elmanejo y el tratamiento de esa condicin dependen sobre todo de la causa y delos efectos que tiene sobre el paciente.

El objetivo primario del tratamiento es la normalizacin de las concentracio-nes circulantes de la Prl, adems de reducir, en casos de tumor, el tamao del ade-noma con la finalidad de prevenir el dao al tejido hipofisario normal o a las es-tructuras paraselares que lo rodean, particularmente el quiasma ptico. En estarevisin se mencionarn los avances sobre la relevancia clnica de la hiperprolac-tinemia, sus mecanismos fisiopatolgicos, diagnstico y estrategias de trata-miento.

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ASPECTOS EPIDEMIOLGICOS

El exceso de Prl circulante se presenta en cerca de 10% de la poblacin. La preva-lencia es an mayor en pacientes con signos atribuibles a hiperprolactinemia,siendo de 9% en mujeres con amenorrea, de 25% con galactorrea y en 75% enmujeres con amenorrea y galactorrea.1

REGULACIN DE LA SECRECIN DE LA PROLACTINA

La glndula hipofisaria es el origen principal de la Prl circulante. Las clulas pro-ductoras de esta hormona, o lactotropos, representan cerca de 25% del total declulas que conforman la adenohipfisis.2 La tasa de produccin y depuracinpla

pruebas diagnosticas en endocrinologia

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