Universidad Autónoma de QuerétaroLicenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto

Reporte de Practica #4:

Pruebas Bioquímicas y Medios de cultivo 2

Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos

Profesora:

Erika Beatriz Álvarez Hidalgo

Equipo #9:

Alma Marina Peralta RuizRebeca Alejandra Oloarte Pulido

Juana María López Martínez

16 de octubre del 2013

INTRODUCCIÓN

El metabolismo es toda una serie de reacciones que ocurren en los seres vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como son: la composición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).

En el laboratorio es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos, inoculando en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes esenciales para su crecimiento, y dependiendo del desarrollo de dichos microorganismos se hacen pruebas para observar sus reacciones y así poder identificar el tipo de microorganismos presente en el medio, estas pruebas se conocen como pruebas bioquímicas.

Las pruebas bioquímicas que utilizamos para esta práctica fueron:

Indol

Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en triptófano; después de 24–48 horas de crecimiento se le agrega xilol (un derivado dimetilado del benceno) al tubo con el caldo para poder separar el indol producido, después se agita y se le agrega reactivo de Kovacs (alcohol isoamilico, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado); un resultado positivo mostrará la formación de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondrá de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilización del triptófano por el microorganismo (la molécula de tritófano se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs.

Rojo de metilo

El rojo de metilo es un indicador de pH; actúa entre pH de 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar

la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo de estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc., adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir el cambio del color del medio a rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánicos producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo)

Voges Proskauer

Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis). La acetoína es un producto intermedio de la fermentación butilén-glicólica, que conduce a la formación de 2, 3 butanodiol. Tanto la acetoína como el 2, 3 butanodiol son productos neutros de la fermentación de la glucosa que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6 o más, y un aumento en la producción de dióxido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetoína en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxígeno se oxida a diacetilo; el diacetilo reacciona con compuestos que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo–rosado–violáceo. Se agrega α-naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacterias, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.

Citrato

Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo de estudio en agar citrato. Un resultado positivo es cuando se observa crecimiento bacteriano; si no se observa crecimiento bacteriano entonces el resultado es negativo. Actualmente el medio más utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producirá ácidos orgánicos provenientes de la utilización del citrato, el medio se alcaliniza y el indicador cambia el color del medio a azul, esto será un resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá siendo verde.

Oxidasa

El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de una enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de electrones. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida se pone púrpura.

Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa; el peróxido de hidrógeno se produce cuando la bacteria utiliza el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción

de la enzima catalasa (H2O2 → H2O + 12

O2).

Termonucleasa

Se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa), es una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus, así como de la posible formación de enterotoxina estafilocócica. La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 °C por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus.

Agar TSI

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerogénicas

bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Si la bacteria fermenta la glucosa, acidificará el medio cambiando su color a amarillo mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo; si la bacteria fermenta lactosa o sacarosa, acidifica la superficie del medio volviéndolo color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie permanece roja; si la bacteria produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo (la producción de ácido sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa). Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

SIM (Sulfuro – Indol – Motilidad)

El Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del medio.

El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.

Agar Lisina Hierro (LIA)

El LIA es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, además de la presencia de sales de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.

La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo un cambio del indicador púrpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reacción de fermentación, produciendo acidificación y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reacción de descarboxilacion que ocurre después, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo.

La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La producción de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilización de las sales de hierro.

Ureasa

Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo stuart está estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8; el microorganismo de estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio lo suficiente como para cambiar el indicador (por encima de 8.0). Un cambio de color a rojo/fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa del microorganismo, si no cambia de color entonces la prueba es negativa.

OBJETIVO

Realizar pruebas bioquímicas en medios de cultivo para sustratos específicos que permitirán identificar bacterias así como demostrar actividades metabólicas de las mismas.

MATERIALES

Agua peptonada (AP) Agar triple azúcar hierro (TSI) Rojo de metiloCaldo rojo de metilo – Voges Proskauer (RM–VP)

Medio SIM Asa de nicromo

Agar citrato (AC) Phenil n–diamina Reactivo de Kovacs3 Cepas Gram – Peróxido de hidrógeno Matraces Erlenmeyer3 Cepas Gram + Agitador magnetico Plato calienteBalanza analítica Gradillas ProbetaMedidor de pH 24 Tubos de ensaye Autoclave

METODOLOGÍA

1. Preparar los medios de cultivo2. Activar bacterias gram + y gram –3. Inocular los medios de cultivo4. Realizar pruebas bioquímicas5. Analizar resultados

Pasos para preparar los medios líquidos, sólidos y semisólidos:

1.1)Suspender la cantidad necesaria de polvo para preparar el agar específico en la cantidad de agua que se desee; en el caso del medio Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP) por cada litro de agua se le agregan 7g de polipeptona, 5g de dextrosa (glucosa), y 5g de fosfato de potasio K2HPO4 (buffer)

1.2)Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en el rango permitido

1.3)Calentar con agitación frecuente

1.4)Hervir durante un minuto hasta disolución completa

1.5)Vaciar de 3 a 5 ml del medio de cultivo en tubos con tapa de rosca con ayuda de una micropipeta

1.6)Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos, reservar para su uso futuro en el caso de los medios sólidos; solidificar inclinado para formar un pico en el caso de los medios sólidos.

PASOS PARA REALIZAR LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:

INDOL

Inocular el agua peptonada, incubar a 37 °C por 48 horas; añadir unas gotas de reactivo de Kovacs, agitar bien y dejar reposar el cultivo. El HCl proporciona el pH ácido que requiere la reacción; el alcohol amílico es insoluble en agua y menos denso. Observar un anillo rosa–rojizo en la superficie

ROJO DE METILO

Se inocula el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48 horas, luego de terminado el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del reactivo de rojo de metilo sin agitar.

VOGES PROSKAUER

Se inocular el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48 horas, luego se añaden unas gotas de alfa–naftol (0.6ml), se agita y se le añade KOH (0.2ml) se agita nueva menta y se deja reposar. Observar coloración roja.

CITRATO

Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola estría en la superficie, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas y se realiza la lectura de la prueba.

OXIDASA

Poner un trozo de papel filtro sobre una de las tapaderas de una caja de Petri, añadir una gota del reactivo de oxidasa; depositar sobre el reactivo masa bacteriana de forma rápida con ayuda de un palillo estéril o un asa de

platino nueva. Detectar un color azul – violeta intenso antes de 10 segundos.

CATALASA

Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur, inocular y detectar la formación de burbujas.

TERMONUCLEASA

Se inoculan los tubos de caldo BHI (infusión cerebro corazón) y se incuban a 37 °C por 24 horas, después se toman 5 µl de caldo inoculado y se llenan los orificios respectivos de una lámina cubierta con medio TDA (contiene: 0.3g ADN, 10g Agar, 1 ml de solución de cloruro de calcio, 10g cloruro de sodio, 3ml solución azul de toluidina y 1L de buffer tris), se incuba a 37 °C por 1 a 4 horas. Un resultado positivo para termonucleasa se da por un halo rosa alrededor de los orificios donde se puso el caldo BHI

TSI

Se inoculan los tubos de TSI con asa recta, se introduce el asa hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo, luego de retirar el asa del fondo, se estría el pico con un movimiento en zigzag, de un lado a otro; se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas. Observar: amarillo = acidez (lactosa en superficie, glucosa en el fondo), rosa = alcalinidad, negro = SH2, fractura o desplazamiento del medio = gases

SIM

Los tubos con medio SIM se inoculan por picadura (asa recta), se incuban a 35 – 37 °C durante 24 horas. Se observa turbidez o en su defecto crecimiento bacteriano sólo en el área en donde se inoculó

UREASA

Se siembra el microorganismo en un caldo urea o agar urea de Christensen, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas.

LIA (AGAR LISINA HIERRO):

Se cultiva el microorganismo en agar LIA, se inocula en forma de estría y se incuba a 37 °C por 24 horas. Se observa: color azul (hay movilidad), rojo

(no hay movilidad), enegrecimiento (descarboxila ornitina), ruptura de agar (no descarboxila), fondo amarillo y superficie púrpura (descarboxilación de lisina)

Diagrama de flujo para pruebas bioquímicas

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

No

No

No

No

No

No

No

No

No

Fin

Incubar

Poner en los orificios de una lámina de medio TDA

Agregar el microorganismo con ayuda de un asa

Añadir una gota de agua oxigenada en un portaobjetos

Con ayuda de un palillo estéril, inocular el papel

Interpretar resultados

Añadir reactivo de rojo de metilo sin agitar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular Incubar

Inocular

Añadir una gota de reactivo de oxidasa a un papel filtro

Añadir alfa naftol y KOH, dejar reposar

Observar movilidad

Añadir reactivo de Kovacs

Termonucleasa

RM

VP

Catalasa

Oxidasa

Citrato

SIM

LIA

TSI

Indol Incubar

Preparar medios de cultivo

Prueba

Inicio

RESULTADOS

MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIÓN PROCEDIMIENTO RESULTADOS EN PRUEBAS

BIOQUÍMICAS

Agua Peptonada

(AP)

10g Peptona de carne5g Cloruro de sodio

pH final 7.2±0.2

Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en autoclave a

121°C durante 15 minutos.

Positivo: color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el

cultivoNegativo: color amarillo

Caldo Rojo de

Metilo/Voges Proskauer (RM/VP)

7g Polipeptona5g Glucosa

5g Fosfato dipotásicopH final 6.9±0.2

Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente

agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C

durante 15 minutos.

Prueba del rojo de metilo:Positivo: color rojo.

Negativo: color amarillo.Prueba de Voges Proskauer:

Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una

completa agitación del tubo.Negativo: ausencia de color rojo.

Agar Citrato (AC)

2g Citrato de sodio5g Cloruro de sodio

1g Fosfato dipotásico1g Fosfato monoamónico0.2g Sulfato de magnesio0.08g Azul de bromotimol

15g AgarpH final 6.9±0.2

Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de

agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar

calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.

Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a

121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.

Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay

desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Agar Triple azúcar hierro

(TSI)

3g Extracto de carne20g Pluripeptona

5g Cloruro de sodio10g Lactosa

10g Sacarosa1g Glucosa

0.2g Sulfato de hierro y amonio

0.2g Tiosulfato de sodio0.025g Rojo de fenol

13g AgarpH final 7.3±0.2

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera

parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo

solamente fermenta la glucosa.Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el

microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.

Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es

no fermentador de azúcares.La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el

microorganismo produce gas.El ennegrecimiento del medio indica

que el microorganismo produce ácido sulfhídrico

Caldo BHI

200g Infusión de cerebro de ternera

250g Infusión corazón vacuno

10g Peptona5g Cloruro de sodio

2g Glucosa2.5g Fosfato disódico

15g AgarpH final 7.4±0.2

Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta

su disolución total. Esterilizar en autoclave durante 15

minutos a 121°C.

Termonucleasa positivo: color rosa alrededor de los orificios de la lámina

TDATermonucleasa negativo: lamina TDA

color azul sin cambio alguno.

REFERENCIA

AP RM VP CITRATO

E. Coli + + – –

REFERENCIA AP CITRATO TSI UREA LIA

Salmonella – +Glucosa +Lactosa –

H2S +

–DL +H2S +

REFERENCIA TSI OXIDASA

PseudomonasGlucosa –Lactosa –

H2S –

+

REFERENCIA AP RM VP CITRATO TSI SIM COAGULASA CATALASA

S. Aureus S. Aureus+S. epidermidis –

+

REFERENCIA CATALASA

BacillusBacillus +

Clostridium –

DISCUSION DE RESULTADOS

NO. DE COLONIA PROCEDENCIA GRAM AP RM VP CITRATO TSI SIM OXIDASA CATALASA

Rebeca#3

Tierra G– – – + +Glucosa +Lactosa +

H2S –

– +

Rebeca#8

Agua de tortuga G+ – +

Marina#5

Tierra G– + + – –Glucosa +Lactosa +

H2S –

– +

Marina#7

Agua de tortuga G+ – –

Juana#2

Agua de tortuga G– – – – –Glucosa –Lactosa –

H2S –

+ +

Juana#8

Tierra G+ + +

De acuerdo a nuestros resultados se observa que probablemente la colonia #5 de Marina sea E. Coli ya que comparándola con las cepas de referencia, coincide en las 4 pruebas.

Por otro lado el cultivo 2 de Juana coincide con la cepa de referencia para pseudomonas, por este motivo posterior a las pruebas bioquímicas se procedio a cultivar este microorganismo en agar pseudomonas en el cual no presento fluorescencia por lo que nos da a entender que si bien este microorganismo es una pseudomona, no produce fluorescencia, investigando al respecto encontramos la siguiente tabla:

CEPA CRECIMIENTO EN AGAR PSEUDOMONAS

PRODUCCION DE FLUORESCEÍNA

PRODUCCION DE PIOCIANINA

P. aeruginosa Bueno + +

P. fluorescens Bueno + –

P. putida Bueno + –

P. mallei Bueno – –

P. stutzeri Bueno – –

S. maltophilia Bueno – –

B. cepacia Bueno – –

Escherichia coli Bueno – –

Por tanto la cepa de pseudomonas que encontramos no es pseudomonas aeruginosa, fluorescens o putida pero sí puede ser alguna de las otras que no presentan fluorescencia.

Otro resultado interesante que obtuvimos fue de la colonia #7 de Marina la cual mostro un resultado negativo para la prueba de catalasa por lo tanto es probable que se trate de un clostridium.

La colonia #3 de rebeca dio resultado positivo para la prueba de citrato; entre las bacterias que dan citrato positivo están la Klebsiella, Salmonella, Serratia, entre otras, por lo que las bacterias que son citrato negativas quedan descartadas entre ellas la shigella y escherichia.

CONCLUSIÓN

Las pruebas bioquímicas son de gran importancia en la identificación de bacterias ya que los tipos distintos de microorganismos tienen diferentes características en su metabolismo así como en la actividad enzimática que desarrollan.

Es importante activar nuestras cepas previa realización de pruebas bioquímicas para de esta forma tener un cultivo fresco, esto va a reducir las alteraciones posibles que pudiera llegar a tener nuestro cultivo.

Algunas pruebas bioquímicas nos facilitan la identificación bacteriana más que otras, por ejemplo en la prueba de citrato, el agar tiene un colorante que nos permitirá detectar si las bacterias utilizan el citrato como única fuente de energía, por lo que solamente necesitas sembrar tu microorganismo y no requieres de agregar ninguna solución de reacción

Algunas pruebas como la termonucleasa necesitan de una segunda incubación ya que requieren de calor para poder reaccionar

Las especies de pseudomonas son típicamente oxidasa positivas con ausencia de gas a partir de glucosa, son negativas para la prueba de indol, rojo de metilo y Voges Proskauer; también son generalmente móviles gracias a la presencia de 1 o más flagelos polares que poseen. Las pseudomonas pueden ser patógenas para los humanos, un ejemplo de esto es la P. aeruginosa que afecta vías respiratorias.

BIBLIOGRAFÍA

Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial PearsonManual de Medios de Cultivos – Editorial E. MERCK, 1990 Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica – Jean F. Mac Faddin, Irma Lorenzo trad. Editorial Médica Panaméricana