“Efecto adyuvante de vacunas de las saponinas de Sapindus saponaria L. en músculo estriado de Rattus rattus var

albinus”

PROYECTO DE TESIS DE

DOCTORADO

CIENCIAS BIOMEDICAS

AUTOR

M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva

ASESOR

Dr. Ramón Piminchumo Carranza

Escuela de PostGrado/UNT

TRUJILLO – 2007

Sapindus saponaria L.

Sapogenina (L-Hederina)

ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION DEL TRABAJO

Se ha investigado científicamente las sustancias presentes tanto en plantas (Fitoquímica) como animales (Zooquímica)1. Las saponinas, se han utilizado por sus propiedades detergentes2. Las saponinas de saponaria o jabonera, son agentes limpiadores de la contaminación por vertidos tóxicos y poseen virtudes hemostáticas3. De Sapindus saponaria se ha aislado la Saponina L-Hederina4.

ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION DEL TRABAJO

En Perú, de Sapindus

saponaria L., desde

épocas precolombinas se

ha utilizado el pericarpio

del fruto maduro por su

alto contenido de

saponinas5.

ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION DEL TRABAJO

La Asociación Argentina de Químicos Cosméticos6 reporta la actividad antihialuronidasa de las saponinas de Sapindus saponaria L. y la eficacia en el tratamiento cosmético de la lipoesclerosis. En Colombia; se ha reportado que saponinas de Ruscus, estimularían el metabolismo celular, la multiplicación celular y micro circulación cutánea7.

ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION DEL TRABAJO

En Santiago de Cuba, reportan la utilidad de las saponinas como adyuvantes inmunológicos en el campo de la salud veterinaria8. En La Habana, han reportado la actividad in vitro frente a L. infantum de las saponinas hederacolchisida A y α y β-Hederina, y que Yuccasaponina MC3, inhibe al 100% el crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana amazonensis9.

ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION DEL TRABAJO

En Chile, se ha anunciado la creación de una industria para la extracción y comercialización de saponinas, para refinación del cobre10. El Tratado de Libre Comercio (TLC) Perú-USA11, incluiría saponinas con arancel base 4 y canasta 4. El TPD Colombia-USA12, también incluye saponinas.

INVESTIGACIONES PREVIAS DEL AUTOR EN EL TEMA

En 2005, con el proyecto "Saponinas de Sapindus saponaria L.: Extracción por fraccionamiento de espuma y secado por radiación infrarroja". Concluimos que 1) La velocidad de burbujeo no influye en la pureza de las saponinas, 2) La altura de columna de fraccionamiento influye en la pureza de las saponinas, y 3) No fue posible secar la espuma con radiación infrarroja en las condiciones experimentales.

INVESTIGACIONES PREVIAS DEL AUTOR EN EL TEMA

En 2006, con el proyecto "Efecto del grado de vacío en la operación de evaporación a 40 °C para concentrar el producto del fraccionamiento de espuma de las saponinas de Sapindus saponaria", concluimos que 1) Es posible concentrar los extractos de saponinas de Sapindus saponaria L. “Choloque” mediante evaporación al vacío, y 2) Por cada 180 mm de Hg de reducción de presión se puede obtener concentrados estadísticamente diferenciados con un 95% de seguridad.

JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En nuestros laboratorios se ha utilizado la cáscara del fruto maduro, para desarrollar una tecnología de obtención de un extracto concentrado de saponinas, para aplicaciones científico-tecnológicas que a futuro demanden la producción industrial y la industrialización del producto.

JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Continuando las investigaciones del Centro de Investigaciones de Energía Solar en Santiago de Cuba, sobre ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS8 y su búsqueda de nuevas sustancias con actividad adyuvante/inmunopotenciadora en el marco de la investigación inmunológica actual y con la finalidad de proponer como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L. ”Choloque” es necesario explicar científicamente el mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirán un mejor enfoque científico, tecnológico y ecológico de promoción de su cultivo.

JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Adyuvante es una sustancia distinta de un antígeno que potencia la activación de los linfocitos T al favorecer la acumulación y activación de otros leucocitos, denominados células accesorias, en el lugar de exposición al antígeno. En las células accesorias, los adyuvantes aumentan la expresión de coestimulantes y citocinas que activan a los linfocitos T y pueden prolongar también la expresión de complejos péptido-CPH en la superficie de las CPA13.

Problema científico

¿Cuál es el Efecto de las

saponinas de Sapindus

saponaria L. en músculo

estriado de Rattus rattus var

albinus?

HIPOTESIS DEL TRABAJO

“Las saponinas de Sapindus

saponaria L. actuando como

adyuvantes en el tejido estriado

de Rattus rattus var albinus,

favorecen la acumulación y

activación de células accesorias

en la zona de depósito”.

Objetivo general

Determinar el efecto

adyuvante de las

saponinas de Sapindus

saponaria L. en tejido

estriado de Rattus rattus

var albinus.

Objetivos específicos

Ensayar la respuesta coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. a tres concentraciones diferentes en solución salina fisiológica en músculo estriado de Rattus rattus var albinus.

Realizar el análisis histoquímico, es decir cuantificar los IL y CD.

Determinar estadísticamente la significancia de los resultados obtenidos.

Relevancia técnica y socioeconómica del tema

propuesto En la preparación del extracto se aplica una tecnología desarrollada en nuestros laboratorios, adecuada a nuestra realidad y por tanto fácil de aplicar a nivel de planta piloto con un mínimo de inversión.

Sapindus saponaria L. puede convertirse en una planta agroindustrial y de reforestación de nuestros valles costeños, incluidas las zonas urbanas, por su follaje perenne y abundante; sus frutos y semillas pueden tener aplicación industrial, incluida la química farmacéutica. Existen otras líneas de investigación potencial, aún por iniciar.

Diseño de investigación

Material de estudio

Concentrado de saponinas de Sapindus saponaria L. preparado en el laboratorio de Análisis Instrumental; solución salina fisiológica; Rattus rattus var albinus, tres grupos testigo y tres grupos ensayo. Cada grupo estará constituido por 10 especimenes cada uno.

Diseño experimental: Diseño clásico

Dos grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimental, serán inyectados con solución salina fisiológica y solución de saponinas (tres concentraciones diferentes) en solución salina fisiológica, respectivamente. Se realizarán las observaciones antes y después de la inyección.

Extracción y concentración de saponinas

Se preparará un extracto

acuoso concentrado de

saponinas de la cáscara

del fruto seco de

Sapindus saponaria L.

Muestra para extracción

Fraccionamiento y concentración

Ensayo inflamatorio

1. Inyección intramuscular Se depilará el área de inyección de cada

espécimen.

Se inyectará a cada espécimen la

solución experimental correspondiente

(según grupo y dosis) y se observará la

aparición de signos en el área:

inflamación, color, calor.

Se documentará esta etapa mediante

fotografías. Para esto se colocará junto

al animal una regla para llevar la cuenta

de la dimensión del área.

Zona depilada para inyectar

Ensayo inflamatorio

2. Biopsia del tejido de la zona de depósito

Se tomará una muestra de tejido y se

observará en una lámina la infiltración (si

la hubiera).

Se hará un conteo de células,

especialmente neutrófilos. Se comparará

con una muestra patrón (con inyección

de solución salina fisiológica).

Si el animal es sacrificado, se observará

la zona de depósito.

Ensayo inflamatorio

3. Pruebas histoquímicas Se tomará una muestra y se observará

las respuestas histoquímicas, se cuantificará los IL y CD.

4. Comparación con un coadyuvante patrón Se inyectará coadyuvantes patrones13, 14:

Hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato cálcico, BCG.

Se documentará todas las evidencias que permitan realizar la comparación.

Si se no se dan los signos del paso 1 se continuará directamente con el 3.

Análisis estadístico

Se realizará el ANOVA15 con las

prueba de MSD y Dunnett para

determinar si existe o no diferencia

significativa entre las respuestas

grupo experimental y testigo,

mediante el software16 SPSS v 10.

Resultados esperados

El análisis de datos

permitirá concluir si las

saponinas de Sapindus

saponaria L. tienen efecto

coadyuvante de vacunas en

músculo estriado de Rattus

rattus var albinus .

Impacto o beneficios esperados

Ante la resistencia al uso de

coadyuvantes como el mercurio,

hay una gran potencialidad

aplicativa del extracto concentrado

de saponinas de Sapindus

saponaria L.; todo esto enmarcado

en una alternativa de desarrollo de

una tecnología propia que permita

explotar nuestros recursos

naturales respetando el medio

ambiente.

Infraestructura y medios físicos a utilizar

Laboratorios: Laboratorio de Química Física y

Laboratorio de Análisis Instrumental de la Sección de Química e Instrumentación, Departamento de Bioquímica

Laboratorio de Toxicología, Departamento de Farmacología.

Equipos de laboratorio: Columna de fraccionamiento de espuma

Equipo de destilación al vacío

Espectrofotómetro UV/Vis HP 8452A

Microscopio óptico binocular

Tipo de investigación

De acuerdo al fin que se

persigue: Aplicada

De acuerdo al diseño de

investigación: Explicativa

Localización

Localidad: Trujillo

Institución: Universidad

Nacional de Trujillo

Referencias bibliográficas

1. Martínez, A. Manual de Farmacognosia y Fotoquímica. Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia) 1997. [En línea]. <http://huitoto.udea.edu.co/~farmacogfit>.

2. Evans, W. Trease-Evans, Farmacognosis. 13ª ed. Ed. Nueva Editorial Interamericana, S.A. de C.V. México D.F. (México). 1989. pp 519-520.

3. [En línea]. <http://www.revik.com/cosmetologia/enciclopedia.htm>

4. [En línea]. <http://fbio.uh.cu/webfv/articulos/metabolismo%20secundario.doc>

5. Almenara, O. Físico-Químca. Ed. Empresa Editorial Humbolt, S.A. Lima (Perú). 1984. pp. 192-194.

6. [En línea].

<http://www.abc-cosmetologia.org.br/biblioteca/descr_

revistas.php?id=942>

Referencias bibliográficas

7. [Em línea]. http://www.sic.gov.co/propiedad/Estudios/vigilancia/Vigilancia_Cremas.php

8. Morris, H. J.; Martínez, Cl, Abdala, R. T.; Campos, D. Adyuvantes inmunológicos. [En línea]. <http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03001999000200010

&script=sci_arttext>

9. [En línea]. http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol36_s_02/F%20Producciones%20Plantas%20y%20Prod.%20Natya.pdf

10. [En línea]. http://www.puc.cl/autoridades/rector/discurso02.PDF

11. [En línea]. http://www.tlcperuusa.com/uploads/Oferta%20de%20Peru%20a%20EEUU%20con%20formato%205.pdf

12. [En línea] <http://www.sice.oas.org/TPD/AND_USA/COL_USA/Draft_text_050806_s/Lista%20de%20Desgravacion%20de%20Colombia%20(industria%20y%20textiles)%20con%20Categorias.pdf>

Referencias bibliográficas

13. Abbas A; Andrew H. Lichtman. Inmunología celular y molecular. 5ª ed. Ed. Elsevier España S.A. Madrid: 2004. 363-365, 477.

14. [En línea] . http://www.aeped.es/vacunas/pav/modulo1/PDFs/Vacunas2.pdf

15. Walpole, RE., Raymond H. Myers y Sharon L. Myers. Probabilidad y Estadística para Ingenieros. Ed. Prentice - Hall Hispanoamericana, S.A. México: 1999. 483.

16. Pérez, C. Técnicas Estadísticas con SPSS. Ed. Pearson Educación, S.A. Madrid: 2001. 370 – 372.

Por una tecnología propia y ecológica

A ustedes

Muchas gracias