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Protozoos susceptibles de ser transmitidos
por el agua regenerada
José Luis Alonso Molina
Responsable del Grupo de Química y Microbiología del Agua, Instituto de
Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, UPV
ESAMUR XIV Jornadas Técnicas de Saneamiento y Depuración Regeneración de aguas: Generando Confianza Lorca 21-22 Noviembre 2018
Índice
• Protozoos transmitidos por el agua
• Epidemiología
• Técnicas de estudio y métodos de referencia
• Supervivencia en aguas
• Concentraciones en aguas
• Niveles de reducción en las concentraciones de protozoos por diferentes tipos de tratamiento en EDAR
• Legislación UE sobre reutilización: protozoos e indicadores
• Protozoos transmitidos por el agua
-Phylum Amoebozoa
Acanthamoeba castellanii (FLA)
Entamoeba histolytica
Vermamoeba vermiformis
-Phylum Ciliophora
Balantidium coli
-Phylum Apicomplexa
Cryptosporidium hominis, C. Parvum,
Toxoplasma gondii, Cyclospora cayetanensis
-Phylum Metamonada
Giardia intestinalis genotypes A and B
-Phylum Heterokontophita
Blastocystis sp.
-Phylum Excavata
Naegleria fowleri (FLA)
Protozoos patógenos
Origen fecal y no fecal de protozoos
patógenos
Fletcher M, Strak D, Harkness J, Ellis J (2012) Enteric protozoa in the developed world. A public health perspective.
Clin. Microbiol. Reviews 25(3):420-449
Especies de Cryptosporidium Feng et al. 2018. Trends in Parasitology in Press
ciclo de vida de Cryptosporidium
fuente: http://phil.cdc.gov/phil/home.asp
• La transmisión del parásito se produce por vía fecal-oral, ya sea por ingestión de agua o alimentos contaminados, o por transmisión de humano a humano o de animal a humano (Xiao, 2010).
Rutas de transmisión de Cryptosporidium Fayer (2008) General Biology. En: Crypotosporidium and Cryptosporidiosis, p. 1-42. (ed.
Fayer and Xiao). CRC Press
Cryptosporidium: dosis infectiva http://waterbornepathogens.susana.org/menuprotozoa/crypto
-La dosis infectiva en voluntarios humanos sanos está entre
10 y 1.000 ooquistes de Cryptosporidium parvum. La DI50,
depende de una serie de factores como: infectividad de los
ooquistes, virulencia de la cepa y factores relacionados con el
huésped
-El tiempo entre la adquisición de la infección y la aparición de
los síntomas puede ser de 5 a 28 días.
ciclo de vida de Giardia
fuente: http://phil.cdc.gov/phil/home.asp
Giardia especies
Seis especies descritas de Giardia. Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, syn.
G. intestinalis) puede infectar a los humanos.
Giardia duodenalis genotipos
Importancia relativa de las diferentes rutas
ambientales de transmisión de Giardia
Agua de
bebida
Más
importante Menos
importante
Agua de
uso
recreativo:
piscinas
Semillas a
germinar:
brotes de
soja
Verduras de hoja
verde: lechuga. Col.
Espinacas.
Ensaladas de 4ª
gama
Frutas sin piel:
fresas
Marisco:
ostras,
mejillones
Arena
parques
infantiles
Robertson y Lim (2011) Waterborne and environmentally-borne Giardiasis. En: Giardia a
model organism (eds. Luján HD y Svärd S) p. 29-62. Springer –Verlag/Wien
Giardia dosis infectiva
Schaefer et al. (1991) Determination of Giardia lamblia cyst infective dose for the
mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). AEM 57:2408-2409.
Entamoeba histolytica
Entamoeba histolytica es reconocida como una
ameba patógena, asociada con infecciones
intestinales y extraintestinales. Infecta a 50
millones de personas en el mundo y produce
100.000 muertes por año (India, Bangladesh,
Brasil, México China, Sudeste de Asia, países
del África Tropical) (Saidin et al. 2018)
Recientemente, E. histolytica ha sido
reclasificada en diferentes especies, E.
histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, siendo
las dos últimas especies no patógenas (Plutzer y
Karanis, 2016). Las otras especies son
importantes porque pueden confundirse con E.
histolytica en las pruebas de diagnóstico.
www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html
Cyst of E. histolytica/E. dispari n an unstained concentrated wet mount of
stool. www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html
Saidin et al. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis
(2018).
https://doi.org/10.1007/s
10096-018-3379-3
Amebas de vida libre (FLA)
FLA, Acanthamoeba, Naegleria, Vermamoeba or Balamuthia, Son
protozoos ubicuos que se encuentran comúnmente en el agua.
(Sheehan et al., 2003; Magnet et al., 2012; Retana-Moreira et al.,
2014; Niyyati et al., 2015; Sente et al., 2016). Tienen dos etapas del
ciclo de vida: el trofozoíto, metabólicamente activa, y el quiste, una
forma de resistencia.
FLA actúan como reservorio de bacterias/protozoos patógenos
(FLA-ARB).
Acanthamoeba spp. Naegleria spp.
Moreno-Mesonero et al. (2017)
Vermamoeba vermiformis
Fouque et al. (2014)
Bacterias patógenas en Amebas de vida libre (FLA)
Tesis doctoral Laura Moreno (2018)
• EPIDEMIOLOGÍA
Waterborne protozoa outbreaks 1919-2004
Karanis P., Kourenti C., Smith H. (2007) Waterborne transmission of protozoan parasites: A worldwide review of
outbreaks and lessons learnt. J. Water Health 5(1):1-38
325 water-associated outbreaks of parasitic protozoan disease have been reported
Waterborne Giardia and Cryptosporidium outbreaks and cases reported in the literature, 1954-2014
Efstratiou A., Ongerth J.E., Karanis P. (2017) Waterborne transmission of protozoan parasites: Review of
worldwide outbreaks- An update 2011-2016. Water Res. https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.01.036
1993, Cryptosporidiosis: Brote
de Milwaukee. 403.000 casos,
4.400 hospitalizados, 54
muertos (85% con SIDA)
Confirmed cryptosporidiosis cases: seasonal distribution
Confirmed giardiasis cases: seasonal distribution
Cryptosporidiosis en Valencia
Infecciones gastrointestinales (Cryptosporidiosis,
Giardiasis) en la Comunidad Valenciana en 2012
Casos notificados al Sistema de Información Microbiológica de los
microorganismos (Cryptosporidium) más relevantes causantes de infecciones
gastrointestinales. España 1989-2013
Fuente: Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica
Elaboración: Sistema de Información Microbiológica. Centro Nacional de Epidemiología.
Boletín Epidemiológico Semanal.Vol. 22, Num 13.
http://revista.isciii.es/index.php/bes/article/view/897/1083.
Confirmed cryptosporidiosis cases: rate per 100000
population EU/EEA, 2010-2014
Confirmed giardiasis cases: rate per 100000 population
EU/EEA, 2010-2014
• Técnicas de estudio y métodos de
referencia
Métodos Analíticos de
Referencia
• ISO 15553:2006 Water quality- Isolation and
identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia
cysts from water
• ISO 18744:2016 Microbiology of food and animal feed -
detection and enumeration of Cryptosporidium and
Giardia in fresh leafy green vegetables and berry fruits
• EPA Method 1623.1:2012 Cryptosporidium and Giardia
in Water by Filtration/IMS/FA
Filtration methods for Cryptosporidium oocysts from water
(Web Report 4178 WRF, 2008, AWWA)
ISO 15553: Water quality- isolation and identification of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water
DetectionWaterborne Pathogenic Protozoa
-Method 1622-1623 (Gold standard method for detecting environmental
protozoa): its has been applied widely and extensive data indicates that its
performance is effective with recovery efficiency from fresh water over a
range of quality typically for:
-Cryptosporidium from 30-50%
-Giardia from 40-60%
-These methods consist of three main parts:
1-Filtration of at least 10L of water
2-(Oo)cyst concentration using antibody based immunomagnetic
separation procedure
3-Detection component using immunofluorescence and diferential
interference contrast microscopy to enumerate total (oo)cysts
from the water sample
Extracción ADN-qPCR
METAGENÓMICA DIRIGIDA
WORKFLOW FOR 18S rRNA Moreno et al. (2018) Multiple identification of most important waterborne
protozoa in surface water used for irrigation purposes by 18S rRNA
amplicon-based metagenomics. Int. J. Hyg. Environ. Health. 221:102-111
P
• Supervivencia en aguas
Supervivencia en agua
Fuente: Kumar et al. (2012) Analyst. 143:359-375, adaptado de OMS (2011) Guidelines for
Drinking-water Quality
Efecto de la temperatura en la supervivencia de
ooquistes de Cryptosporidium y quistes de
Giardia
WHO (2006) Guidelines for the safe use of wastewater and excreta in agriculture.
Microbial Risk Assessment Section)
• Concentraciones de protozoos en
aguas
Frecuencia de detección y concentración de ooquistes de
Cryptosporidium y quistes de Giardia en aguas residuales
Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water Environments. Journal of
environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023
Concentraciones de ooquistes de Cryptosporidium y
quistes de Giardia en aguas residuales Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water
Environments. Journal of environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023
Concentraciones de ooquistes de Cryptosporidium y
quistes de Giardia en aguas residuales
Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water Environments. Journal of
environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023
Concentraciones de microorganismos
patógenos en aguas residuales
Cryptosporidium spp. y Giardia en EDAR de Galicia,
Castro-Hermida et al. (2008) Contribution of treated wastewater to the contamination of recreational river areas
with Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis. Water Res 42:3528-3538.
Especies de Cryptosporidium y genotipos de Giardia
duodenalis en EDAR de Galicia
Castro-Hermida et al. (2008) Contribution of treated wastewater to the contamination of recreational river areas
with Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis. Water Res 42:3528-3538.
El caso de los brotes de E. coli que afectaron a dieciséis países de Europa
y América del Norte en 2011, con más de 4 000 casos detectados y 53
muertes en Alemania, es un ejemplo de tal situación. Se culpó del brote a
los pepinos regados con aguas residuales tratadas importados de
España, y varios Estados miembros, entre ellos Austria, Bélgica, Chequia,
Dinamarca, Alemania y el Reino Unido, bloquearon o restringieron la
importación de productos españoles ante el temor de que pudieran haberse
contaminado durante el riego.
Después se demostró que la fuente del E. coli no habían sido los
pepinos, sino más bien las semillas germinadas procedentes de una
granja alemana, y las semillas de alholva implicadas que procedían de
Egipto. Se estima que este acontecimiento costó 200 millones de euros
semanales a España en concepto de pedidos cancelados y contribuyó a
reducir la renta agrícola de la región de Murcia en un 11,3 % durante la
campaña de 2010-2011. Este hecho ha disuadido la inversión en la
transformación de productos alimenticios regados con agua reutilizada.
Fuente: Propuesta de REGLAMENTO DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL
CONSEJO relativo a los requisitos mínimos para la reutilización del agua
Water JPI Call “Emerging contaminants” METAWATER project
Partners in the project: Spain: Rosina Girones (Universitat de Barcelona), Maria José Figueras (Universitat Rovira i Virgili, Reus), José Luis Alonso (Universitat Politècnica de València) Denmark: Anna Charlotte Schultz (Technical University of Denmark) Cyprus: Georgios T. Papageorgiou (State General Laboratory) Germany: Christiane Höller (Bavarian Health and Food Safety Authority) and Michael Seidel (Technische Universität München).
Stakeholder involment:
METAWATER
New metagenomics and
molecular based tools for
european scal
identification and control of
emerging microbial
contaminants in irrigation
water
UPV Research Team:
Coordinator
José L. Alonso, PhD, Microbiology.
Participants
Inmaculada Amorós, PhD, Microbiology.
M. Antonia Ferrús, PhD, full professor, Microbiology.
Yolanda Moreno, PhD, Microbiology.
Eva Doménech, PhD, assistant professor, Food Technology.
José Morillo, PhD, contracted researcher, Microbiology.
Isabel Escriche, PhD, full professor, Food Technology.
PhD Students (MSc):Laura Moreno Mesonero
THE METAWATER PROJECT: Lessons learned for improving the safety of irrigation water in Europe
One year surveillance of different types of irrigation water
•Distribution water (UB)
•Irrigation water channels (UPV)
•River water (UB)
•Reservoir water (UB)
•Groundwater (UB and DTU)
•Urban raw sewage (UB, UPV and DTU)
•Secondary treated effluents (UB, UPV and DTU)
•Tertiary treated effluents (UB, DTU)
•Hospital raw sewage (DTU)
Characterization of viral/bacterial/protozoa communities/pathogens in
critical points of source water and distribution networks, including antibiotic-
resistant bacteria and cyanobacterial toxins (METAWATER PROJECT)
Parameters analysed:
•Viruses: HAdV, JCPyV, MCPyV, NoV GI, NoV GII, EV, HEV
•Bacteria: E. coli, E. fecalis, Legionella spp, Aeromonas spp., Arcobacter
spp. Helicobacter pylori, Salmonella spp. and Campylobacter spp.
•Protozoa: Acanthamoeba spp. Giardia spp. and
Cryptosporidium spp.
•Cyanobacterial toxines
•Antibiotic Resistant Bacteria
EDAR2
Datos de la EDAR Caudal (m3/día): 35.384 Población servida (he): 199.550
EDAR2
Sampling Date
Giardia
spp.
cysts/10L
G. intestinalis
genotype A
G. intestinalis
genotype B
Cryptosporidium
spp. cysts/10 L C. hominis C. parvum
Acanthamoeba
spp
ISO 1553 qPCR qPCR ISO 1553 qPCR qPCR qPCR
11th March 2015 after
secondary 45 - - 32 + (WGA) -
9th June 2015 after
secondary 93 + - 1 - - +
7th October 2015 after
secondary 6 - - 2 - -
9th December 2015 after
secondary 20 + - 12 - - +
23rd February 2016 after
secondary 86 + - 5 - - +
23rd February 2016 after
tertiary 80 - - 4 - -
+ 16th July 2016 after
secondary 59 + - 4 - -
17th May 2017 after
secondary 230 + - 6 - - +
17th May 2017 after
tertiary 142 + - 2 - - +
24th May 2017 after
secondary 80 + - 0 - - -
24th May 2017 after
tertiary 20 + - 0 - - +
31st May 2017 after
secondary 82 + - 8 - - +
31st May 2017 after
tertiary 45 + - 6 - - +
Waterborne protozoa identified (Relative abundance%)
Sampling date Secondary effluent (%) Tertiary effluent (%)
11 June 2015
Entamoeba histolytica 0.31
Blastocystis sp. 0.11
Cryptosporidium sp. 0.01
Vermamoeba vermiformis 0.01
---
23 February16 Blastocystis sp. 1.58 Entamoeba sp. 0.04
Blastocystis sp. 1.31
16 July 2016 Blastocystis sp. 3.96
Cryptosporidium sp. 0.02
---
17 May 2017
Entamoeba sp. 0.001
Entamoeba coli 0.006
Entamoeba dispar 0.065
Blastocystis sp. 15.575
Entamoeba coli 0.005
Entamoeba dispar 0.062
Entamoeba hartmanni 0.003
Blastocystis sp. 10.985
24 May 2017 Entamoeba dispar 0.029
Blastocystis sp. 9.294
Entamoeba dispar 0.003
Blastocystis sp. 5.983
31 May 2017 Entamoeba coli 0.003
Entamoeba dispar 0.015
Blastocystis sp. 8.819
Entamoeba coli 0.010
Entamoeba dispar 0.035
Entamoeba hartmanni 0.008
Blastocystis sp. 4.518
Multiple identification of most important
waterborne protozoa in EDAR2 samples by 18S
rRNA amplicon-based metagenomics
730 muestras afluente entrada EDAR, 25 EDAR Australia
Muestras positivas: 83/730 (11,4%).
Datos Bibliografía EDAR (6,4%- 100%)
Concentración qPCR: 70-18.055 ooquistes/L,media 3.426/L
Estacionalidad de Cryptosporidium y Giardia en aguas
Como se observó en varios estudios, la estacionalidad de Cryptosporidium y
Giardia en aguas residuales presenta diferentes patrones dependiendo de las
características especiales del país como el clima, las temperaturas del agua
relacionadas con la situación epidemiológica.
108 muestras de 3 EDAR de Valencia
(Domenech et al. (2018) Cryptosporidium and Giardia safety margin increase in leafy green
vegetables irrigated with treated wastewater. Int J Hyg Environ Health 221:112-119
Nasser et al. (2016) Seasonality
of Cryptosporidium prevalence
in Wastewater, J Water Health
14:1-13
Afluente (oo)quistes/L Efluente (oo)quistes/L
Prevalencia estacional de protozoos en ensaladas de
4ª gama (648 muestras de 6 fabricantes) en Italia
Caradonna et al (2017) Detection and prevalence of protozoan parasites in ready-
yo-eat packaged salads on sale in Italy. Food Microbiology 67:67-75
• FLA isolation and ARB associated to FLA-
PROTOCOLS ESTABLISHED
DNA isolation
Membrane 3 μm
Non-Nutrient Agar Page
28 ºC, 3-12d
Water sample
sodium hypochlorite
100 ppm
16S rRNA
Metagenomics
Illumina Miseq
DNA extraction (SOPs)
16S rRNA amplification
Amplicon sequencing IIlumina MiSeq
PCR purification, attach indexes and sequencing
adapters to libraries by PCR
Pool libraries
Amplicon viewer in BaseSpace (Data)
Normalize DNA concentration to 5 ng/µL
Sequencences quality control
Bioinformatics analysis
WORKFLOW
FOR 16S rRNA
METAGENOMICS
SEQUENCING Amplicon-based metagenomics was carried out with 2 × 300 bp
paired-end reads on a MiSeq platform (Illumina) at Life Sequencing
S.L. (Valencia, Spain). The amplicon sequencing protocol targets the
V3-V4 regions of the 16S rRNA gene and strictly followed the
Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation guide
(https://support.illumina.com/content/dam/illumina-
support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16
s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf). Illumina data
were analysed using Qiime 1.9.1 (Caporaso et al., 2010) applying
additional scripts available in MicrobiomeHelper virtual box (Comeau
et al., 2017). OTUs were defined at the 97% genetic similarity cut-off.
16S SILVA 128 version was used as the reference database.
Number and percentage of analysed
samples contaminated with FLA
Wastewater treatment plants of
Valencia
A total of 31 FLA were purified using a micromanipulator from wastewater
Moreno-Mesonero et al. (2017) Detection of viable Helicobacter pylori inside free-living amoebae in
wastewater and drinking water samples from Eastern Spain. Environmental Microbiology. 19:4103-4112.
Identification of isolated FLA in wastewater
of Valencia by means of multiplex PCR or
conventional PCR plus sequencing
In wastewater samples, Acanthamoeba spp., A. castellanii, A. tubiashi, A.
polyphaga, Naegleria spp., Vannellidae spp. and Cercozoa spp. were identified.
A total of 31 FLA were purified using a micromanipulator from wastewater
Bacteria associated to FLA
(Acanthamoeba- ARB)
Different pathogens such as Legionella, Mycobacterium, Aeromonas, Listeria, Arcobacter or
Campylobacter have been isolated from inside FLA in co-culture assays. Inside them, these bacteria
survive and are more resistant to harsh environmental conditions that would normally kill them,
such as chlorination or presence of biocides Therefore, FLA act as “Trojan horses” for these ARB
(Amoeba resistant bacteria)
6 wastewater samples
have been analyzed to
identify the different FLA
present and the bacteria
associated to them.
Several pathogenic
bacteria, such as
Legionella, Helicobacter,
Rickettsia or
Pseudomonas have
been found to be
associated to FLA in the
analyzed wastewater
samples.
Average of
1,2 million
reads per
sample
virus potencialemente patógenos para
humanos detectados en agua residual
Fernandez-Cassi et al. (2018) Metagenomics for the study of viruses in urban sewage as a
tool for public health surveillance. Sci Total Environ. 618:870-880
• Niveles de reducción en las
concentraciones de protozoos por
diferentes tipos de tratamiento en
EDAR
Calidad recomendada del agua residual
antes de la desinfección Guidelines for Environmental Management. Disinfection of Treated
Wastewater. (2002) EPA Victoria´s website
Cuando se investigó la inactivación de C.
parvum y G. lamblia con ozono y dióxido de
cloro, bajo las mismas condiciones
experimentales, los ooquistes de C. parvum
fueron 30 veces más resistentes al ozono y 14
veces más resistentes al dióxido de cloro
Cryptosporidium y Giardia: Cloro y Ozono www.cdc.gov./parasites/crypto/index
Eliminación de Cryptosporidium con
dióxido de cloro
US EPA (2005) Technologies and costs document for the Final long Term 2 Enhanced
Surface Water Treatment Rule and Final stage 2 Disinfectants and Disinfection by
Products Rule. EPA-815-R-05-013
Eliminación de Cryptosporidium con ozono
US EPA (2005) Technologies and costs document for the Final long Term 2 Enhanced
Surface Water Treatment Rule and Final stage 2 Disinfectants and Disinfection by
Products Rule. EPA-815-R-05-013
Inactivación de Cryptosporidium
con UV
US EPA (2006) Ultraviolet disinfection guidance manual for the final Long term 2
enhanced surface water treatment rule toolbox guidance manual. EPA 815-R-06-
007
Dimero de timina
https://en.wikipedia.org/wiki/Pyrimidine_dimer
Quistes G. lamblia infectivos en EDAR
Li et al. 2009. Water Res 43:3037-3046
Tecnología de Membranas
Clasificación de las membranas
Tamaño de los virus
Fuente: http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&
view=article&id=573&Itemid=579
Tamaño de los
virus oscila
entre 0,02 µm a
0,3 µm
Características físico-químicas de quistes y
ooquistes (Dumètre et al. AEM, 2012, 78: 905-912)
Reducción de virus, bacterias y
protozoos por ultrafiltración
Reducción concentraciones de protozoos por
los diferentes tipos de tratamientos NRMMC/EPHC/NHMRC (2008) Australian Guidelines for Water Recycling: Managing Health
and Environmental Risks (Phase 2) –Augmentation of Drinking Water Supplies
Tratamiento Cryptosporidium Giardia
Secundario 0,7 1,5
Ozono 1,0 3,0
Ultrafiltración 4,7 7,4
UV (12 mJ/cm2) 2,0-3.5 2,0-3,5
Cloración (800-900 mg-min/L) 1,0
Cloración (12 mg-min/L) 0,5
Soller et al. (2017) Evaluation of microbiological risks associated with direct potable reuse. Microbial Risk
Analysis. 5:3-14.
• Legislación UE sobre reutilización:
protozoos e indicadores
Normativas países UE aguas
regeneradas
Anexo I
Categorías de calidad de las aguas
regeneradas
Control de validación de las aguas
regeneradas
WHO (2006) Guidelines for the safe use of wastewater and excreta in agriculture.
Microbial Risk Assessment Section)
Concentraciones de Esporas de Clostridios
Sulfito-reductores en aguas residuales
Lucena et al. (2004) Reduction of bacterial indicators and bacteriophages infecting bacteria in
primary and secondary wastewater treatments. J. Aool. Microbiol. 97:1069-1076
Gracias por su atención
ESAMUR XIV Jornadas Técnicas de Saneamiento y Depuración Regeneración de aguas: Generando Confianza