protocolo e informes de validaciÓn de mÉtodos …
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PROTOCOLO E
INFORMES DE
VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
ANALÍTICOS Lic. David Pineda
¿QUE ES VALIDAR?
REFERENCIA DEFINICION DE VALIDACION
(Norma ISO 9000:2008)
Confirmación, mediante la aportación de evidencia objetiva, que se han cumplido los requisitos para un uso o
aplicación especifico previo.
ISO/IEC 17025:2005 Confirmación, a través del examen y aportación de evidencias objetivas, que se cumplen los requisitos
particulares para un uso especifico previsto.
VIM Verificación, donde los requisitos especificados son
adecuados para un uso previsto.
VALIDAR ES BASICAMENTE: EL PROCESO PARA DEFINIR UN REQUISITO ANALITICO Y LA CONFIRMACION DE QUE CUENTA CON CAPACIDADES CONSISTENTES CON LAS APLICACIONES REQUERIDAS.
QUE ES VERIFICAR…
EURACHEM VM 2016
La Norma ISO 9000 define verificación como “Confirmación, a través de la aplicación de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos especificados”,
METODOS NORMALIZADOS
¿QUE ES VALIDACION DE
METODO?
VALIDACION DE UN METODO
Es el proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un método y la identificación de las influencias que pueden modificar esas características y hasta que punto. (Guia Eurachem 2016).
DNM
RTCA 11.03.39: 06 PRODUCTOS FARMACÉUTICOS. VALIDACIÓN DE
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS
MEDICAMENTOS
RTCA 11.03.39: 06 PRODUCTOS FARMACÉUTICOS. VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ANALÍTICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS
ESTRUCTURA
1- Objeto
2- Ámbito de Aplicación
3-Definiciones
4- Procedimientos Analíticos que son objeto de Validación
5-De la documentación que debe presentarse para la revisión de los métodos analíticos validados.
6- Rechazo de la Documentación presentada
7- Bibliografía
8- Vigilancia y Verificación
OBJETO
Este reglamento técnico tiene por objeto establecer las directrices para la validación de métodos analíticos fisicoquímicos y microbiológicos utilizados en el control de calidad de medicamentos.
AMBITO DE APLICACIÓN
Las directrices del presente reglamento técnico deben ser aplicadas a todos los métodos analíticos no oficiales y oficiales utilizados para el control de calidad de medicamentos con el objetivo de cumplir las normativas vigentes de buenas prácticas de manufactura y buenas prácticas de laboratorio. Los laboratorios de control de calidad que utilizan métodos analíticos oficiales deben únicamente comprobar la linealidad y precisión del sistema.
DEFINICIONES
PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS QUE SON
OBJETO DE
VALIDACIÓN Categoría I: pruebas cuantitativas del contenido del (los) principio(s)
activo(s), constituyen procedimientos químicos o microbiológicos que miden el (los) analito(s) presente(s) en una muestra determinada.
Categoría II: pruebas para la determinación del contenido de impurezas o de valores límites para el control de impurezas. Pueden ser pruebas cuantitativas o una prueba cualitativa para determinar si la impureza está presente en la muestra por encima o por debajo de un valor límite especificado. Cualquiera de los dos pretende reflejar con exactitud las características de pureza de la muestra. Los parámetros de validación requeridos por una prueba cuantitativa son diferentes a los de una prueba cualitativa de cumplimiento de límite.
PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS QUE SON
OBJETO DE
VALIDACIÓN Categoría III: pruebas físico químicas de desempeño. Constituyen
procedimientos de ensayo que miden características propias del desempeño del medicamento, por ejemplo la prueba de disolución. Las características de la validación son diferentes a las de las otras pruebas, aunque las pueden incluir
Categoría IV: pruebas de identificación. Aquellas que se realizan para asegurar la identidad de un analito en una muestra. Esto normalmente se realiza por comparación de una propiedad de la muestra, contra la de un estándar de referencia, por ejemplo espectros, comportamiento cromatográfico, reactividad química y pruebas microcristalinas.
Pruebas microbiológicas: aquellas que se realizan para asegurar la calidad microbiana del medicamento.
PARÁMETROS DE MERITO POR CATEGORÍA
PARÁMETROS DE MERITO POR CATEGORÍA
DE LA DOCUMENTACIÓN QUE DEBE
PRESENTARSE PARA LA REVISIÓN DE LOS
MÉTODOS ANALÍTICOS VALIDADOS Para la revisión por parte de la Autoridad Reguladora de los métodos validados, el informe del estudio de validación debe contener la siguiente documentación:
a. Descripción detallada del procedimiento analítico.
b. Descripción de los parámetros de desempeño evaluados según las tablas 1 y 2.
c. Evaluación y cálculos estadísticos para la verificación de los parámetros de desempeño.
d. Resumen de los resultados instrumentales obtenidos (áreas o absorbancias impresas).
e. Resumen de los resultados de la validación obligatoriamente en idioma español/castellano o debidamente traducido.
f. Conclusiones deben ser obligatoriamente entregadas en idioma español/castellano o debidamente traducidas.
PROCEDIMIENTO
Pasos para la validación.
Cada validación de un procedimiento consiste en tres pasos:
Establecimiento del protocolo de validación,
Realización de la validación,
Elaboración del informe.
ESTABLECER UN PROTOCOLO DE
VALIDACION El protocolo deber ser fechado y firmado por los responsables de la
validación o persona designada por el laboratorio y debe incluir como mínimo lo siguiente:
A- IDENTIFICACION.
Se deberá de identificar de acuerdo al control interno de documentos definido por el laboratorio.
B- OBJETIVO.
Definir la finalidad del protocolo de validación. (Ej. Definir los parámetros a validar, las actividades necesarias para la realización de la validación del método XXX-YY-ZZ para la evaluación del analito EE por la técnica CFG).
ESTABLECER UN PROTOCOLO DE
VALIDACION C- ALCANCE.
Delimitación de tipo de muestra, matriz, analito, rango de concentración, técnica analítica.
D. RESPONSABLES
Equipo de validación: Definir e identificar con Nombre los analistas que realizan la validación, persona(s) que revisa(n) el informe de validación, persona(s) que autorizan el informe de validación.
E. PARAMETROS A ESTUDIAR Y LOS CORRESPONDIENTES CRITERIOS DE ACEPTACIÒN
Establecer los parámetros a validar y su criterio de aceptación de acuerdo al tipo de referencia utilizada.
F. MUESTRAS (MATRICES).
Se definirán los tipos de muestra, identificación.
ESTABLECER UN PROTOCOLO DE
VALIDACION G. EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES DE REFERENCIA
INVOLUCRADOS EN LA VALIDACION
Detallar los equipos involucrados en la validación así como la codificación interna que se ha asignado a cada uno. En cuanto a los reactivos y materiales de referencia utilizados, detallar lote, fecha de vencimiento y proveedor del mismo.
REFERENCIA DEL METODO ANALITICO A VALIDAR
Detallar el nombre, versión, edición, año y cualquier otra información pertinente de las referencias utilizadas, que permita identificar el método a validar.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÒN DE LOS PARAMETROS A EVALUAR
Detallar claramente los parámetros que se han definido para realizar la validación así como un detalle del procedimiento a seguir para la estimación de cada uno, en el cual incluyan como mínimo detalle de las pesadas a realizar, diluciones, análisis estadístico a aplicar y detalle del proceso a seguir para su determinación y los criterios de aceptación.
REALIZACIÓN DE LA VALIDACIÓN.
Una vez se ha aprobado el protocolo se procede a hacer la validación de acuerdo a lo planificado.
Aquí se incluye el proceso de cálculo estadístico de los distintos parámetros evaluados.
El laboratorio deberá demostrar la validación correspondiente de su alcance según lo detallado en las tablas 1 y 2 del reglamento.
7.1.2 REALIZACIÓN DE LA VALIDACIÓN.
Se detalla a continuación, los parámetros estadísticos que pueden realizarse en una validación.
a) Selectividad / Especificidad.
b) Linealidad
c) Exactitud
d) Precisión.
e) Límite de Detección
f) Límite de Cuantificación
g) Intervalo
h) Incertidumbre
a) SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
DEFINICIÓN
Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.
Procedimiento de determinación de la selectividad.
En el estudio de la selectividad, como norma general se comparan los resultados del análisis de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos de degradación, sustancias relacionadas, excipientes (matriz o placebo), y dependiendo del tipo de muestra, tipo de técnica analítica, instrumento de medición.
a) SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
La selectividad de un procedimiento debe ser establecida para:
• Métodos desarrollados internamente en el laboratorio,
• Métodos adaptados de la literatura científica y
• Métodos publicados por organismos de estandarización utilizados fuera del alcance especificado en el método estándar
EJEMPLOS GUIA
En el caso de métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos que utilizan sistemas de medición volumétricas, gravimétricos, entre otros; la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada con los resultados de exactitud y linealidad del método cumplidos los criterios de aceptación.
LOS ELEMENTOS A CONSIDERAR PARA
LA REALIZACIÓN DEL PARÁMETRO DE
SELECTIVIDAD
b) LINEALIDAD DEFINICION
Define la habilidad del método para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito.
La linealidad se evaluará con la determinación de Intervalo lineal ó Intervalo de trabajo.
b) LINEALIDAD
El ‘intervalo lineal’. Es el intervalo en el cual el método proporciona resultados con una incertidumbre aceptable. El extremo inferior del intervalo de trabajo está determinado por el límite de cuantificación, LOQ. El extremo superior del intervalo de trabajo está definido por las concentraciones a las cuales se observan anomalías significativas en la sensibilidad analítica.
Un ejemplo de esto es el efecto meseta a altos valores de absorbancia en la espectroscopia UV/VIS.
El intervalo lineal,
Es la capacidad de un método analítico para dar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un intervalo dado.
b) LINEALIDAD
Se definen a continuación los elementos a considerar para la realización de los parámetros de Intervalo de trabajo e intervalo lineal.
Muestra Repeticiones Calcular/determinar
Medir un blanco más
Estándar de referencia esparcidos uniformemente
en el rango de interés.
Ó
Medir, de acuerdo con el método documentado, un
blanco más material de referencia o blancos de
muestra adicionados esparcidos uniformemente
en el rango de interés.
Se trabajarán 5 niveles como
mínimo por triplicado, distribuidos uniformemente
en el rango de interés.
● ● ● ● ● x 3
Graficar la respuesta (eje y) en función de la concentración (eje x). Calcular las estadísticas de regresión apropiadas,
calcular y graficar los residuales (diferencia entre el valor observado de
“y” y el valor calculado de “y” pronosticado por la línea recta, para
cada valor de “x”).
La distribución aleatoria de residuales en torno a cero confirma la linealidad. Las tendencias sistemáticas indican la
no linealidad.
b) LINEALIDAD
Calcular/determinar
Graficar la respuesta (eje y) en función de la concentración (eje x). Calcular las estadísticas de regresión apropiadas, calcular y graficar los residuales (diferencia entre el valor observado de “y” y el valor calculado de “y” pronosticado por la línea recta, para cada valor de “x”).
La distribución aleatoria de residuales en torno a cero confirma la linealidad. Las tendencias sistemáticas indican la no linealidad.
b) LINEALIDAD – CRITERIOS DE
ACEPTACION Criterios de aceptación Intervalo lineal
Comportamiento lineal en la gráfica de concentración vs respuesta analítica.
Datos aleatorios en el gráfico de residuales.
El intervalo de confianza del intercepto debe incluir el cero, cuando se incluyan concentraciones bajas en la curva.
Criterios de aceptación Intervalo de trabajo
r ≥ 0.98
El intervalo de confianza de la pendiente debe incluir la unidad
Nota: Si la referencia del método establece la forma de evaluación de éste parámetro de desempeño y sus criterios de aceptación, el laboratorio deberá de cumplir lo indicado en dicha referencia
c) EXACTITUD
DEFINICION
Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado.
c) EXACTITUD
La evaluación práctica de la Exactitud (veracidad) se fundamenta en la comparación de la media de los resultados de un método con relación a valores conocidos, es
decir, la veracidad se determina contra un valor de referencia.
Para verificar la Exactitud (veracidad) utilizando un material de referencia, se determina la media y la desviación estándar de una serie de réplicas de una prueba y se compara contra el valor caracterizado del material de referencia.
c) EXACTITUD
Para el cálculo del parámetro de Exactitud utilizando Material de Referencia, se deberá tomar en cuenta las siguientes formulas
c) EXACTITUD
c) EXACTITUD
c) EXACTITUD
d) PRECISION DEFINICION
Es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas. (Guía EURACHEM).
Nota: La precisión no se relaciona con el valor verdadero o valor especificado. La medida de la precisión generalmente se expresa en términos de imprecisión y se calcula como una desviación estándar de los resultados de la prueba. ―
d) PRECISION
La precisión es medida mediante la repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia.
REPETIBILIDAD: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (un mismo analista, mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto.
PRECISION INTERMEDIA: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.
REPRODUCIBILIDAD: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios. Esto aplica en caso de organizaciones con diferentes laboratorios y/o cuando se requiera transferir métodos. Éste parámetro aplica únicamente a laboratorios que tienen cedes con las cuales poder compararse.
d) PRECISION Muestra Repeticiones Calcular
/determinar Comentarios
Se puede utilizar como muestra lo siguiente: • Material de
referencia certificado
• Blanco adicionado • Material de
referencia • Matriz adicionada
• Muestra natural con contenido de analito
dentro del rango a validar.
Al menos tres niveles de concentración (Bajo,
medio y alto) y realizar al menos 6 repeticiones en
cada nivel bajo condiciones de Repetibilidad.
Determinar el coeficiente de variación porcentual de los resultados o del porcentaje de recobro
obtenido.
Determina la Repetibilidad.
Este parámetro deberá realizarse tomando en cuenta todo el proceso
analítico para cada repetición.
Si la referencia tiene otro estadístico de dispersión,
justificar su uso.
d) PRECISION Muestra Repeticiones Calcular
/determinar Comentarios
Se puede utilizar como muestra lo siguiente: • Material de
referencia certificado
• Blanco adicionado • Material de
referencia • Matriz adicionada
• Muestra natural con contenido de analito
dentro del rango a validar.
Al menos tres niveles de concentración (Bajo,
medio y alto dentro del rango a validar) y realizar al menos 12 repeticiones en
cada nivel bajo condiciones de precisión intermedia. 6
repeticiones por cada condición.
Determinar el coeficiente de variación porcentual de los resultados o del porcentaje de recobro
obtenido y determinar el ANOVA de los datos. Ver
anexo 4.
Determina la Precisión intermedia.
Este parámetro deberá realizarse tomando en cuenta todo el proceso
analítico para cada repetición.
Si la referencia tiene otro estadístico de dispersión,
justificar su uso.
d) PRECISION
Muestra Repeticiones Calcular /determinar Comentarios
Se puede utilizar como
muestra lo siguiente: • Material de
referencia certificado • Blanco adicionado
• Material de referencia
• Matriz adicionada • Muestra natural con
contenido de analito dentro del rango a
validar.
Las condiciones del estudio de reproducibilidad
deberán de ser plantadas por el laboratorio y
aprobado por el OSA.
Determinar el coeficiente de variación porcentual de
los resultados o del porcentaje de recobro
obtenido y determinar el ANOVA de los datos de los laboratorios. Ver anexo 4.
Determina la reproducibilidad
ANOVA Analysis Of Variance
El análisis de la varianza permite contrastar la hipótesis nula de que las medias de K poblaciones (K >2) son iguales, frente a la hipótesis alternativa de que por lo menos una de las poblaciones difiere de las demás en cuanto a su valor esperado. Este contraste es fundamental en el análisis de resultados experimentales, en los que interesa comparar los resultados de K 'tratamientos' o 'factores' con respecto a la variable dependiente o de interés.
El Anova requiere el cumplimiento los siguientes supuestos:
Las poblaciones (distribuciones de probabilidad de la variable dependiente correspondiente a cada factor) son normales.
Las K muestras sobre las que se aplican los tratamientos son independientes.
Las poblaciones tienen todas igual varianza (homoscedasticidad).
Criterio de aceptación
- Se debe tomar en cuenta lo establecido en la referencia del método. Otras referencias podrán ser evaluadas.
e)Limite de Detección y Limite de
Cuantificación Cuando las mediciones se realizan a concentraciones bajas, existen tres conceptos generales a considerar.:
Limite de decisión o valor critico
Limite de detección, la concentración mas baja de analito que puede ser detectada
Limite de cuantificación, nivel mas bajo en el cual el desempeño es aceptable para la aplicación del método.
En Validación de métodos, comúnmente se determinan el LOD y el LOQ,
Es importante conocer el límite de detección en las condiciones del método; de lo contrario se puede incurrir en un falso positivo.
Numéricamente es mayor el límite de Cuantificación y representa la menor cantidad de analito que puede analizarse con un % de Coeficiente de Variación y de Recuperación aceptables. Concentraciones menores pueden detectarse pero no cuantificarse.
e)Limite de Detección y Limite de
Cuantificación Nota: Si el rango validado por el laboratorio es superior al rango lineal de la referencia
bibliográfica, se deberá de determinar los parámetros de precisión y exactitud a la concentración más baja del rango validado.
e)Limite de Detección y Limite de
Cuantificación
Nota: Si la referencia del
método establece la forma de
evaluación de éste parámetro de desempeño y sus
criterios de aceptación, el
laboratorio deberá de cumplir
lo indicado en dicha referencia.
g) INCERTIDUMBRE DEFINICION
El concepto de incertidumbre La guía ISO 3534-1 [ISO 1993], define incertidumbre como “una estimación unida al resultado de un ensayo que caracteriza el intervalo de valores dentro de los cuales se afirma que está el valor verdadero”.
VIM [BIPM, 1993], define la incertidumbre como “un parámetro, asociado al resultado de una medida, que caracteriza el intervalo de valores que puede ser razonablemente atribuidos al mensurando”. En esta definición el mensurando indica: “la propiedad sujeta a medida” [BIPM 1993]. El contenido de zinc en un acero o el índice de octano en gasolina son dos ejemplos de mensurandos en análisis químicos.
g) INCERTIDUMBRE
5.4.6. Estimación de la incertidumbre de la medición
5.4.6.2 Los laboratorios de ensayo deben tener y aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de la medición.
En algunos casos, la naturaleza del método de ensayo, puede excluir un calculo riguroso metrológicamente y estadísticamente valido de la Incertidumbre.
En este caso el Laboratorio debe , por lo menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable y debe asegurarse de que la forma de informar el resultado, no de una impresión equivocada de la incertidumbre.
Una estimación razonable se debe basar en un conocimiento del desempeño del método y en el alcance de la medición y debe hacer uso , por ejemplo, de la experiencia adquirida y de los datos de validación anteriores.
g) INCERTIDUMBRE Se describen varios enfoques para obtener una estimación de la incertidumbre de los
resultados de las mediciones químicas. Estos tienen en cuenta:
la precisión a largo plazo global del método (es decir, la precisión intermedia o la reproducibilidad);
El sesgo y su incertidumbre, incluyendo la incertidumbre estadística que corresponde a las medidas de sesgo, y la incertidumbre en el valor de referencia;
La calibración de equipos. Las incertidumbres asociadas con la calibración de equipos tales como balanzas, termómetros, pipetas y frascos son a menudo insignificantemente pequeña en comparación con la precisión global.
Cualquier efecto significativo que opera además de lo anterior. Por ejemplo, los intervalos de temperatura o el tiempo permitidos por el método no pueden ejecutarse plenamente en los estudios de Validacion, y sus efectos pueden necesitar ser añadidos.
g) INCERTIDUMBRE
ELABORACION DEL INFORME El informe de validación contendrá la información suficiente para poder concluir acerca de la validación
que se ha desarrollado.
Debe incluir:
• Referencia al protocolo utilizado
• Parámetros validados y criterios de aceptación
• Resultados Analíticos
• Resultados Estadísticos
• Interpretación de resultados y/o conclusiones
• Cuadro resumen de los resultados obtenidos (parámetro, criterio, resultado y conclusión)
• Declaración de Aptitud del Método
• Datos crudos de la validación
• Fechas de realización de la validación
Además será autorizado por o las personas asignadas por el laboratorio.
RECHAZO DE LA DOCUMENTACIÓN
PRESENTADA
La documentación presentada será rechazada si se detectan incongruencias técnicas o científicas, inadecuado soporte estadístico de las conclusiones o fallas en el diseño experimental o en la realización de la validación. Una vez comunicado por la Autoridad Reguladora el rechazo de una documentación de validación, el interesado cuenta con el tiempo establecido por la legislación propia de cada país de la Región Centroamericana para resolver la inconformidad.
