UNIVERSIDAD DE IXTLAHUACA CUI

Incorporada a la

Universidad Autónoma del Estado de México

“Comparación cualitativa mediante CCF de Ginkgo biloba

vs EGb 761 para el tratamiento del

Alzheimer”Integrantes de equipo:

Christian Isaí Balderas López

Josué Arturo Fernández Porcayo

Daladier Orozco Morales

Víctor Hugo Sánchez de Paz

Abril Trujillo Ayala

Asesores:

M. en C Q B. Gabriel Martínez Gonzales

Quim. José Fernando Fuentes Gutiérrez

Protocolo de Investigación

17 de Noviembre de 2013

Comparación cualitativa mediante CCF de Ginkgo biloba vs EGb 761 para el tratamiento del Alzheimer

Objetivo General

Extracción con metanol, acetato de etilo y hexano de metabolitos secundarios de las hojas del Ginkgo biloba y comparación en CCF.

Objetivos Especificos

• Identificar cualitativamente mediante CCF los metabolitos secundarios del Ginkgo biloba.

• Identificar cualitativamente mediante CCF los metabolitos secundarios del EGb 761

• Comparación de las de los metabolitos del Ginkgo biloba con el EGb 761.

Pregunta de Investigación

¿Los metabolitos secundarios de Ginkgo biloba serán similares a los del Egb 761?

Justificación

La problemática de todo el tiempo ha sido la búsqueda por nuevas alternativas que ayuden al avance de la medicina para el mejoramiento de nuevas formas para la trata de enfermedades crónicas puesto que se basaban solamente en el estudio de fármacos para combatir estos problemas; ahora en día la utilización de la herbolaria en el tratamiento de algunas enfermedades va cobrando más importancia ya que el hecho de que año tras año incrementa el número de personas mayores que sufren demencia senil, y por ende necesitan cuidados y un tratamiento efectivo.

Así como también la falta de un tratamiento alternativo y los pocos avances existentes en el tratamiento del Alzheimer y los vagos conocimiento que se tienen de este; de tal suerte que el plan de estudios considera en la asignatura metodología de la investigación que se cursa en el quinto semestre, la posibilidad de incursionar en estas líneas de investigación mismas que posibilitan la generación y conformación del perfil de egreso de la licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo.

La realización de este proyecto permitirá la revisión teórica y metodológica, en la construcción de un estado de arte que permita dilucidar científicamente la posibilidad de un tratamiento alternativo.

Hipótesis

Basados en la literatura de los componentes de EGb 761 se propone el uso del Ginkgo biloba como alternativa para el tratamiento del Alzheimer.

Introducción

El extracto de Ginkgo biloba EGb761 se utiliza comúnmente en la prevención y terapia de los trastornos vasculares y cerebrales, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD) [1]. AD, un trastorno neurodegenerativo progresivo, se caracteriza por placas extracelulares β-amiloideas y la pérdida neuronal masiva en la corteza del hipocampo . EGb761 es un extracto de las hojas del árbol Ginkgo biloba y es característico por sus principales fracciones, los flavonoides (principalmente isorramnetol, canferol y quercetina :22-27%) y terpenolactonas (5-7%).

Estas dos fracciones se cree que son, al menos en parte, responsables de propiedades neuroprotectoras potenciales de EGb761. Varios estudios de intervención en humanos reportan efectos benéficos de Ginkgo biloba en la prevención y terapia de enfermedades neurodegenerativas.

Se ha demostrado en estudios en células cultivadas, así como en animales de laboratorio que el EGb 761 presenta propiedades antioxidantes y una actividad anti-inflamatoria.

Marco teórico

Demencia

La demencia puede ser definida como un síndrome caracterizado por la presencia de deterioro cognitivo persistente que interfiere con la capacidad del individuo para llevar a cabo sus actividades profesionales o sociales, es independiente de la presencia de cambios en el nivel de conciencia (es decir, no ocurre debido a un estado confesional agudo o delirio) y es causada por una enfermedad que afecta al sistema nervioso central. La demencia es una enfermedad adquirida como el término deterioro deja en claro. Es un síndrome que puede ser causado por muchas enfermedades y aunque a menudo tenga evolución lenta, progresiva e irreversible, puede instalarse de manera aguda o subaguda y ser reversible con el tratamiento específico de la enfermedad que la causa, cuando este es disponible y administrado precozmente.

AlzheimerEl Alzheimer es el tipo más común de demencia. La demencia es un término general que describe una variedad de enfermedades y afecciones que se desarrollan cuando las células nerviosas en el cerebro (neuronas) mueren o dejan de funcionar normalmente. La muerte o mal funcionamiento de las neuronas provoca cambios en la memoria de uno, el comportamiento, y la capacidad de pensar con claridad. En el Alzheimer, estos cambios cerebrales con el tiempo afectan la capacidad de una persona para llevar a cabo tales funciones corporales básicas como caminar y tragar.AD, es un trastorno neurodegenerativo progresivo, que se caracteriza por placas celulares β-amiloideas adicionales, ovillos neurofibrilares intracelulares y la pérdida masiva neuronal en la corteza y el hipocampo.

Edad: suele afectar a los mayores de 60-65 años, pero también se han dado casos entre menores de 40. La edad media de diagnóstico se sitúa en los 80, puesto que se considera que el mal de Alzheimer es una enfermedad favorecida por la edad.

Sexo: las mujeres lo padecen con más frecuencia, probablemente, porque viven más tiempo.

Razas: afecta por igual a todas las razas. Herencia familiar : la enfermedad de Alzheimer familiar, una

variante de la patología que se transmite genéticamente, supone el 1 por ciento de todos los casos. No obstante, se estima que un 40 por ciento de los pacientes con EA presentan antecedentes familiares.

Factor genético: varias mutaciones en el gen de la proteína precursora de amiloide (APP), o en el de las presenilinas 1 y 2. También podría asociarse con mutaciones en el gen de la apolipoproteína E (ApoE). Esta proteína está implicada en el transporte y eliminación del colesterol. estas investigaciones, la nicastrina activaría la producción del amiloide beta.

Factores medioambientales: El tabaco se ha mostrado como un claro factor de riesgo de la patología, al igual que las dietas grasas. Por otra parte, pertenecer a una familia numerosa también parece influir en el riesgo de Alzheimer.

Ginkgo biloba

El Ginkgo Biloba es un árbol muy antiguo y muy resistente a los factores climáticos adversos. Es una planta originaria de China, Corea y Japón, pero se adapta a los más variados terrenos y climas.

Sus hojas son propietarias de múltiples acciones terapéuticas y por ello, éstas fueron usadas en la antigüedad como moneda de intercambio entre comerciantes.

En su composición podemos hallar múltiples beneficios debido a la variedad de compuestos situados en la hoja del Ginkgo Biloba.Entre otras sustancias, posee gran cantidad de flavonoides, biflavonas, terpenos, sustancias orgánicas con función ácida, glicósidos cianogenéticos, y demás.Su amplia y variada composición le confieren al Ginkgo Biloba propiedades terapéuticas que giran en torno a la circulación sanguínea, la agregación plaquetaria y los procesos oxidativos.

En especial los flavonoides y los biflavonas, actúan como antioxidantes disminuyendo los efectos negativos de los radicales libres del oxígeno sobre el organismo.Los terpenos inhiben el factor activador de plaquetas actuando así, como antiagregante plaquetario que reduce los procesos inflamatorios y previenen la erosión de las membranas vasculares.

Su influencia en la síntesis de glucocorticoides podría relacionarse con un efecto antiestresante y neuroprotector que permiten la utilización del extracto de Ginkgo Biloba en afecciones cerebrales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, u otras.Asimismo, los extractos de Ginkgo Biloba han demostrado mejorar unas cuantas condiciones relacionadas con la insuficiencia cerebral como alteraciones de la visión, tiempos de reacción, depresión, memoria, como así también, favorece el rendimiento y reduce los mareos.Fuera del sistema nervioso, la plata contribuye al tratamiento de síntomas del síndrome premenstrual,  revierte algunas complicaciones asociadas a la diabetes, como es el caso de la impotencia sexual, previene el vértigo y otros desórdenes del equilibrio, y además, mejora notablemente el dolor, calambres y parestesias debido a su influencia vascular periférica.Su utilización ha crecido mucho en el mundo del estético, ya que se aplica en tratamientos demás o terapia para mejorar la circulación sanguínea y aliviar el estrés. El ginkgo biloba ayuda a mejorar la habilidad para recibir señales de los neuro-transmisores, sobre todo de la serotonina, que se va perdiendo con la edad, con lo que se consigue mejorar la transmisión nerviosa. Al mejorar la transmisión nerviosa se favorece también la respuesta muscular.

Composición estructural

.

Genistein 4-O-

methylpyridoxine.

6-hydroxykynurenic acid.

Metabolitos Secundarios

TerpenolactonasGlucósidos de flavonolIsoflavonoidesBiflavonas

EfectosCuales sirven para el alzheimer:Quercetina, el kaempferoly el isorhamnetiny la cianidina son los compuestos más útiles en el tratamiento del alzheimer El metabolito del ginko biloba en el que nos vamos a enfocar es la cianidina

EGb-761

El Ginkgo biloba de uso terapéutico farmacológico debe ser estandarizado para poder cumplir con las normas mundiales y se le ha designado el número o nombre  EGb-761 como indicador de calidad farmacéutica definida.

El extracto de Ginkgo biloba se utiliza en pacientes con insuficiencia circulatoria cerebral, cuando se detecta vértigo, problemas de carácter. También está indicado en secuelas de accidentes cerebrovasculares y traumatismos del encéfalo y cráneo.

Se ha demostrado en estudios en células cultivadas, así como en animales de laboratorio que el EGb 761 presenta propiedades antioxidantes [16-18] y una actividad anti-inflamatoria [19]. En disminución de la memoria y del estado de alerta y atención. No obstante varios estudios científicos contradicen la eficacia del mismo en la prevención de la enfermedad de Alzheimer y la demencia, así como en la mejoría de la memoria.

Investigaciones han demostrado que la estructura del EGb-761 contiene doce compuestos, esencialmente por flavonoides (principalmente isorramnetol, canferol y quercetina :22-27%) y terpenolactonas (5-7%).

Efectos Secundarios del EGb 761

Como todos los medicamentos, EGb 761 puede tener efectos adversos. No hay datos verificados sobre la frecuencia de los efectos indeseables observados durante el tratamiento con preparados que contienen Ginkgo biloba, ya que estos efectos se conocen sólo a través de informes individuales de los pacientes, médicos o farmacéuticos. De acuerdo con estos informes, los siguientes efectos secundarios pueden ocurrir durante el tratamiento con EGb 761:

Puede ocurrir sangrado de órganos individuales, en particular en caso de medicación concomitante con medicamentos inhibidores de la coagulación como fenprocoumon, ácido acetil salicílico u otros antireumáticos no esteroideos .En personas con hipersensibilidad puede ocurrir shock alérgico o reacciones alérgicas de la piel (rojez, hinchazón, picor). Además pueden ocurrir trastornos gastrointestinales leves, cefaleas, vértigo o agravación del vértigo ya existente.

Métodos y materiales

Planta: Gingko biloba y pastillas de EGb761

Disolventes polares: metanol,acetato de etilo,hexano, acetona

Se utilizo el rotabapor el cual es un tubo de refrigeración de serpentin, una bomba, una cubetapara un baño maria y una brazo el cuan se introducirá en el baño con la muestra concentrada; la cual consiste en la concentración de la muestra extraida con algún disolvente en este caso con acetona y hexano.

A las 16:20 horas que comenzó a rotaboporar con una temperatuba de 34 grados con 300 revoluciones por minutos (r.p.m) con un tiempo de 8 minutos, en el caso del hexano , miestras que la maceración con acetona la temperatura fue de : -------- con 300 revoliciones por minuto (r.p.m) con un tiempo de 5 minutos ya que al exponer la acetona al medio ambiente esta es muy volátil puesto que es considerado un compuesto organico volátil.

Cromatografía

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil. Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido ( fase vapor ). Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

Rf

Rf: es el registro, es una relación de distancias, y se define como:

P1=(a)distanciaque recorrelamuestra desdeel puntode aplicación(b)distancia querecorre el disolvente hasta el frente deleluyente .

Solventes

El principal disolvente que arrastraría los metabolitos secundarios seria el metanol (MeOH). Este disolvente es polar y los metabolitos del ginkgo biloba como los flavonoides son polares, con lo que estos serán arrastrados.

Identificación y revelación

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante:

a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número que aparece como subíndice nos indica Ia longitud de onda de excitación del indicador utilizado"

b) La introducción de la placa en vapores de yodo

c) El rocío con una solución de agua-H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero. Hasta carbonizar los compuestos.

Ensayo Shinoda

Para este tipo de ensayo los flavonoides con el núcleo benzopirona producen las coloraciones rojas cuando se les adiciona magnesio en presencia de HCl concentrado.

El ensayo de Shinoda, permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto vegetal. El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo, intensos en todos los casos.

Extracción de flavonoides

Muestra de hoja: trituración o maceración Etanol-agua a un pH de 8 Muestra flavonoide en bruto: 70°C en microondas Resultado de flavonoides de 92.2% de eficiencia Purificación: glucoflavonoides (20% de glicósido de flavonoides) y

aglicona (20%)

Cromatografía de capa fina de alto rendimiento para la cuantificación de flavonoides

Fase estacionaria: placas de sílica gel de 20x20 cm x 2mm Fase móvil: 5% de ácido fórmico en metanol-agua (70:30)

Protocolo de Investigación

Este se realizará en una prueba in-vitro con el uso de ratones transgénicos los cuales se someterán a pruebas con base al tratamiento del EGb 76.

Posteriormente después se hará una determinación de flavonoides y una cuantificación de anticuerpos los cuales se harán bajo un análisis estadístico esto es mediante un software.

Animales, dieta y tipo de Alzheimer inducido.

Se usaron ratones de la sepa Transgénicos Tg2576 que expresan la mutación sueca de la APP695 humana (APPK670N/M671L) * refiriéndonos a APP695 humana como Alzheimer

Los ratones transgénicos fueron criados en el apareamiento Tg2576 machos con hembras F1 C57B6/SJL.

A la edad de 4 meses, las hembras Tg2576 se dividieran aleatoriamente en cuatro grupos (n = 10 para el tratamiento a corto plazo de 4 semanas y n = 6 para el tratamiento a largo plazo de 16 meses, el peso corporal 21,5)

Los ratones se someterán a una dieta de control la cual será baja en flavonoides durante 1 semana. Durante la investigación (4 semanas y 16 meses, respectivamente), los ratones serán alimentados con la dieta de EGb761 (300 mg / kg de dieta). Los ratones se alojarán en condiciones estándar (21-23 ° C, 50-60% de humedad, 14-h oscuridad ciclo light/10-h) y los pesos corporales se registrarán semanalmente.

Los procedimientos experimentales se basarán en Reglamentos sobre Protección de los Animales; a la edad de 5 y 20 meses, respectivamente, los ratones se decapitarán y se diseccionarán el cerebro (corteza e hipocampo). Se tomará sangre de todos los animales y las muestras de cada grupo dietético se agruparán.

Determinación del contenido de flavonoides en el plasma.

El plasma obtenido se someterá a el proceso de centrifugación (2000 g durante 10 min, 4 ° C) y se almacenará a 80 ° C hasta el día del análisis. Los flavonoides se analizarán en alícuotas de plasma mediante HPLC (Cromatografía líquida de alta eficacia-).* Todas las muestras de plasma se tratarán con β-glucuronidasa / sulfatasa antes de hacer la extracción de flavonoides.

Resultados

Después de 4 semans de arduo trabajo y las pruebas a las que se sometieron lo xtractos de Ginkgo biloba y de EGb761 podemos dar a conocer los siguientes resultados.

Macerados

Tabla 1 Caracteristicas Genrales

Ginkgo biliba (hojas) EGb 761 (pastillas)

Hexano

23 mil solución

5 gramos

3 días

----------------

Metanol

23 mil solución

5 gramos

3 días

10 pastillas

17 mililitros

3 días

Acetato de Etilo

23 mil solución

5 gramos

3 días

--------------------

Acetona --------------

1 pastilla + 1:1 de NaOH+ 1ml + 1 de

H2O

3 días

Tabla 1: Se muestras en primer instacia los militros de la solución correspondiente (hexano, metanol, acetato de etilo y acetona) posteriormete se observan los gramos utlizados de las hojas de Ginkgo Biloba y de las pastillas y finaliza con los días que se dejaron macerar cada uno.

Figura 1 : secuencias de macerado de hojas de Ginkgo Biloba y EGb761

Ginkgo y Frasco

peso de frascos

Metanol

Cromatografía en capa fina (C.C.F.)

Las cromatoplacas tuvieron una dimeción de 5x2 y de 5x3; posteriormete se prepararón los elyentes las cuales fueron distribuidasde la siguiente manera.

Tabla 2 : Comparación de Cromatoplacas

Ginkgo biliba

(hojas, hexano)

Ginkgo biliba

(hojas, metanol)

Ginkgo biliba (hojas,acetato

de etilo )

EGb 761 (pastillas, metanol)

1:1 diclorometano

-hexano

si no si no

Metanol concentrado

Si Si Si Si

Hexano concentrado

No no Si Si

9:1 diclorometano

7:3 hexano-acetato de

etiloSi Si Si Si

Tabla 2; en ella se puede observar que el mejor eluyente fue 7:3 hexano acetato de etilo puesto que las manchas observadas eran mas fáciles de identificar en la lámpara de UV mientras que en el caso del metanol

sabiedo que es un buen eluyente no se observaba nada en la cromatoplaca sometia a la lámpara de UV .

Análisis Fitoquímico

En etsa prueba no apunte nada*

Conclusiones

Bibliografía

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