proteasas para la coagulacion

8/13/2019 PROTEASAS PARA LA COAGULACION

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RESUMENUna proteasa de serina, streblin, fue purificada 4,6 veces con 75% de recuperacin a

partir del ltex de una planta, Streblus asper. Este es el primer informe de identificacin ypurificacin de una proteasa de serina del gnero Streblus de la familiaMoraceae.Streblin, tiene una masa molecular de 64 kDa y el coeficiente deextincin() es 5,29.Streblin es una protena bsica con un valor pI de 9,2 que actade manera ptima a pH 9,0; tal actividad ptima a pH alto no ha sido reportado para la

mayora de las serina proteasas aisladas de plantas y la enzima es estable en un amplio

intervalo de pH (3,0 a 12,5 ).La enzima tambin estermoestable, retener la actividadcompleta en 15-85 C y acta de manera ptima a 65 C. Adems, es altamente estableen la presencia de diversos desnaturalizantes en el que la resistencia de SDS es la

propiedad ms llamativa de la enzima purificada.Streblin fuertemente coagulada la lechedesnatada.La fcil disponibilidad de ltex, los procedimientos de purificacin simples, altaestabilidad de streblin frente al pH, o la autodigestin, y en diversas condiciones de hacer

la enzima un buen sistema para explorar la qumica biofsica de proteasas. Adems de sualta capacidad de coagulacin de leche, que podra ser utilizado en la industria del queso,

as como otras industrias de alimentos y biotecnolgicas.

INTRODUCCINLas enzimas proteolticas representan aproximadamente el 60% de todas las ventas de laenzima, debido a sus especificidades de sustrato y actividades generales ms de una

amplia gama de pH y la temperatura.Adems, han sido ampliamente utilizados enproductos farmacuticos, medicinales, alimenticios, de detergentes, de cuero y

biotecnolgicos industrias (Nallamestty,Kundu, y Jagannadham,2003).Como cardosins son probablemente las proteasas de plantas que se han encontrado con

ms xito en la fabricacin de queso,Macedo, Malcata, yOliveira(1993) revisaronexhaustivamente fundamental y los aspectos de la fabricacin dequeso de la Serra aplicado.En la industria alimentaria, las proteasas se utilizan para lacoagulacin de la leche en la industria del queso, as como para la mejora de las

propiedades funcionales y nutricionales de protenas, hidrlisis de gelatina, protena de

soja, casena y protena de suero de leche(Sumantha, Larroche, y Pandey,2006).Tambin se utilizan en la elaboracin de la cerveza, elaboracin de queso, y pande fabricacin (Pande,Dubey, Yadav, y Jagannadham, 2006).Del mismo modo, extractosdeCentaurea calcitrapadegradan las casenas de la leche de diferentes especies, lo que


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sugiere que tales extractos de plantas se pueden utilizar como una alternativa a los cuajos

animales comerciales, especialmente en la fabricacin de caprina y ovina quesos de

leche(Tavariaet al., 1997).El extracto de la fruta de laOpuntia ficus-indicaes al parecerun buen sustituto para el cuajo animal, ya que exhibe tanto la coagulacin y las

actividades caseinolticas(Pintado et al., 2001).Las enzimas proteolticas de origenvegetal son muy adecuadas para las industrias farmacutica y de los alimentos, ya que

son activos en un amplio rango de temperatura y pH, y poseen una amplia especificidad

de sustrato y alta estabilidad en condiciones extremas(Patel, Singh, yJagannadham, 2007).Aparentemente, la mayora de las proteasas de plantas aisladas ycaracterizadas han sido clasificados como proteasas de cistena, que se utilizan

ampliamente en varios procesos en la industria alimentaria(Uchikoba, Yonezawa,YKaneda, 1998).El principal inconveniente en el uso de proteasas de cistena es que suactividad se reduce fcilmente por los iones de oxidacin del aire y de metal.Por lo tanto,la aplicacin de estas enzimas requiere reductores y agentes quelantes y, por lo tanto, no

son econmicos o conveniente(Tomar, Kumar, y Jagannadham, 2008).Por el contrario,las proteasas de serina planta son a la vez estable y activa bajo condiciones duras de

temperaturas elevadas y pH elevado, as como en la presencia de surfactantes o agentes

oxidantes.Por lo tanto, es ms til y econmico para aplicacionesindustriales(Sharma, Kumari, y Jagannadham,2009).Por lo tanto, la bsqueda de nuevospotenciales proteasas de serina planta todava contina, a fin de que stos susceptible de

aplicacin industrial y econmica, as como para entender su papel fisiolgico en las

plantas.Tiol proteasas de ltex de la planta, tales como bromelina, calotropins, ficina y papana, se

utilizan comnmente en varios procesos en las industrias de alimentos y productos

lcteos, pero su actividad proteoltica se inhibe por iones de oxidacin de aire o de

metal.Por lo tanto, estas proteasas requieren agentes reductores y quelantes para suactividad, lo que restringe su aplicacin comercial. Por el contrario, diferentes proteasasde serina proteasas, incluyendo plantas, no necesitan este tipo de co-factores (Singh,

Kumar, Rao, y Jagannadham, 2010).Las proteasas de serina son uno de los mayores grupos de enzimas proteolticas que

participan en numerosos procesos de regulacin.En las plantas, se encuentranampliamente distribuidos entre los diferentes grupos taxonmicos y se encuentran para

estar involucrado en un nmero de procesos fisiolgicos, tales como la degradacin de la

protena y el procesamiento, la microesporognesis, simbiosis, la respuesta hipersensible,

la transduccin de seales y la diferenciacin, y la senescencia (Antao y Malcata, 2005). Apesar de ser la clase ms grande de proteasas en las plantas, las funciones y papeles


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reguladores de serina proteasas de plantas, son poco conocidos, probablemente debido a

la falta de identificacin de sus sustratos fisiolgicos.Una vez que cree que es pocofrecuente en las plantas, en los ltimos aos, varias proteasas de serina se han aislado y

purificado a partir de diferentes partes de las plantas de varias especies de plantas,

incluidas las semillas, ltex y frutas (Mohamed Ahmed, Morishima, Babiker, y Mori, 2009).Los estudios en esta direccin se llevan a cabo en el presente documento, la utilizacin

de una nueva proteasa, streblin, a partir del ltex de Streblus asper, una planta medicinal

importante.S. asper Lour (Familia: Moraceae) es un rbol pequeo. Varias partes de estaplanta se utilizan en Ayurveda y otras medicinas populares para el tratamiento de

diferentes enfermedades, como la filariasis, lepra, dolor de muelas, la diarrea, la

disentera y el cncer.La investigacin llevada a cabo utilizando diferentes in vitro e invivo de las tcnicas de apoyo a la evaluacin biolgica mayora de estas reclamaciones

(Rastogi, Dinesh, Kulshreshtha, y Rawat, 2006).2.Materiales y mtodos2.1.MaterialesLtex se recogi en 0,01 M de tampn de Tris-HCl, pH 8,0, por incisiones superficiales en

los tallos deS.asperencuentra en Varanasi, India, y se congel a-20C durante 24 h.Elltex se descongel y se centrifug a 20.000 gdurante 40 min para eliminar la goma yotros materiales insolubles.El sobrenadante se someti a cromatografa de intercambio aninico, para el que una

columna de DEAE se adquiri de Pharmacia.BSA, lisozima de huevo de gallina,azocasena, azoalbumin, hemoglobina, DTNB, TDT, GuHCl, urea,o-fenantrolina, EDTA,EGTA, SBTI, HgCl2, PCMB, NEM, PMSF, acrilamida,N, N-bisacrilamidade metileno yCBB R 250, se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (Estados Unidos).CBB T 250 fue de

Eastman Kodak.TFA se obtuvo de Applied Biosystems.Anfolitos portadores Ampholineeran de LKB.Todos los dems productos qumicos eran de la mayor pureza disponible. 2.2.Seguridad

La acrilamida es una potente neurotoxina y cancergeno, y itwas manejarse con guantesde seguridad.El manejo de fenol y TCA se hace con cuidado, debido a su naturalezaaltamente corrosiva para la piel. El resto de los experimentos se llevaron a cabo con la

mxima precaucin y cuidado.


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2.3.La purificacin de la proteasa, streblin

La cromatografa se realiz a temperatura ambiente.El sobrenadante, obtenido en el pasoanterior, se someti a cromatografa de intercambio aninico en una columna de flujo

rpido de DEAE-Sepharose pre-equilibrada con 0,01 M de tampn Tris, pH 8,0.Lacolumna se lav con el mismo tampn hasta que no se detect protena en el

eluyente.Las protenas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,8 M en elmismo tampn a una velocidad de flujo de 2,5 ml / min, y se recogieron fracciones de 2,5-

3 ml.Las absorbancias a 280 nm, as como la actividad caseinoltica de las protenas entodas las fracciones, se determinaron.Las protenas unidas se eluyeron en dos picos conactividad caseinoltica.Las fracciones activas y homogneos de pico uno se combinaron,se concentraron y se almacenaron a 4C para experimentos adicionales.La enzima puroas obtenido se denomin como streblin y ensay el contenido de protenas, as como la

actividad de la proteasa (Fig. 1).

2.4.La concentracin de protenasLa concentracin de protena, en diferentes etapas de purificacin, se determin

espectrofotomtricamente la absorbancia a 280 nm, as como por el mtodo

deBradford (1976),usando BSA como estndar.2.5.Ensayo para la actividad de la proteasaLa actividad hidrolizante de la proteasa se determin utilizando sustratos naturales

desnaturalizados tales como la casena y azoalbumin (sustrato cromognico).Enzima, auna concentracin de 15lg en un volumen total de 0,5 ml de tampn Tris-HCl 0,05 M, pH7,5, se incub a 37C durante 10 min.Un volumen igual de solucin de casena al 1% (w/ v), preparado en el mismo pH, se aadi a la solucin de enzima, haciendo que el

volumen final de 1 ml, y la mezcla de reaccin se incub adicionalmente durante 30 min a

37C.La reaccin se detuvo mediante la adicin de 0,5 ml de TCA al 10% y la mezcla sedej reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Pptidos solubles se separaron porcentrifugacin durante 10 min, utilizando una centrfuga de mesa.La absorbancia de lospptidos solubles en TCA en el sobrenadante se midi a 280 nm.En el caso deazoalbumin (0,6%, w / v) como sustrato, 0,5 ml de sobrenadante, despus de

precipitacin con TCA, se mezcl con un volumen igual de 0,5 M de NaOH y se incubaron

durante 15 min.El desarrollo del color se midi espectrofotomtricamente la absorbanciaa 440 nm.Con la hemoglobina (1% w / v) como sustrato, la actividad se determina de la


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molecular de registro frente a la movilidad electrofortica de los marcadores de peso

molecular.2.7.ZymographyUn zimograma se realiz para visualizar la actividad proteoltica (en ejecucin).Parazimografa, 1,2% de casena se incluy en 12,5% en gel de poliacrilamida. El gel se hizofuncionar a 200 V durante 1 h y empapado en 2,5% de Triton X-100 para el

desplazamiento de la SDS.Los geles se incubaron a continuacin en tampn de reaccin(50 mM de tampn Tris, pH 8.0, 1 mM de CaCl2) por 15 h a 37 C y despus se tieroncon CBB R-250.Los geles se destieron durante la noche con 40% de metanol y cidoactico al 10% hasta que las bandas claras aparecieron contra un fondo azul. La reginsin teirde gel se refleja la actividad proteoltica de las proteasas. 2.8.Punto isoelctricoEl punto de la enzima purificada isoelctrico se determin mediante enfoque isoelctrico

en geles de tubo, como se describe para procerain (DubeyYJagannadham, 2003).Anfolinas, en el intervalo de pH de 9.0-11.0, se han utilizado paragenerar el gradiente de pH.Un gel de poliacrilamida al 5% que contiene 2% anfolinadeseada fue echado en geles de tubo.Andico y tampones cmara catdica fueron 0.01M cidos-iminodiactico y 0.01 M de etilendiamina, respectivamente.Los tampones sevacan con gas nitrgeno antes de la electroforesis.El gel se someti a un pre-carrera auna corriente constante de 1 mA por varilla durante 2 h a desarrollar el gradiente de

pH.Una muestra de protena (100g), que contiene 10% (v / v) anfolina y 25% de glicerol,se carg en el gel y electroforesis a una corriente constante de 2 mA por varilla durante 4

h.Las bandas de protenas se tieron con 0,04% (w / v) de CBB G-250 disuelto en 6% (w/ v) de cido perclrico.

2.9.El contenido de carbohidratosRestos de carbohidratos unidos a la superficie de la protena son una herramienta

importante para regular su estabilidad(Van Teeffelen, Broersen, yJongh, 2005).Elcontenido de carbohidratos de streblin se determin por el mtodo del cido sulfrico

fenol(Hounsell, Davies, y Smith,1997).El contenido de carbohidratos de streblin fueextrapolada de la curva de calibracin generada en condiciones similares, con galactosa

como estndar.


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2.10.Coeficiente de extincinEl coeficiente de extincin de streblin se determin por un mtodo

espectrofotomtrico (Yadav, Pande, y Jagannadham,2006).El coeficiente de extincin sedetermin utilizando la frmula,

= 10 (5,690Nw + 1,280Ny + 120Nc)/ M, dondenW,ny,nc son el nmero de triptfano, tirosina, y residuos de cistena en laprotena;Mes la masa molecular de la protena y 5,690, 1,280, 120 son los respectivoscoeficientes de extincin de triptfano, tirosina y cistena residuos. Los nmeros totales detriptfano, tirosina y cistena residuos en la protena se determinaron como se describe a

continuacin.

2.11.El triptfano y la tirosina contenidosLos nmeros totales de residuos de triptfano y tirosina en la protena purificada se

determinaron(Yadav et al., 2006).Un espectro de absorbancia de la enzima purificada en0,1 M de NaOH se registr desde 300 hasta 220 nm, utilizando un espectrofotmetro

Beckman DU 640B.Valores de absorbancia a 280 y 294,4 nm se obtuvieron a partir de los espectros. Para losclculos, la frmula,W= (A 280-xy)/ (w - y),se utiliz en donde,wes el contenido detriptfano estimado en moles por litro;Un280es la absorbancia a 280 nm de la Losespectros de la protena;wyYson coeficientes de extincin molar de triptfano ytirosina en 0,1 M de NaOH a 280 nm (= 5225 Wyy = 1,576), respectivamente.Latirosina total y contenido de triptfano en la protena, xse calcul utilizando294,4=2375.El nmero de un residuo de aminocido particular por molcula de la protena secalcul a partir de la relacin de las concentraciones molares de los residuos de

aminocidos a la de la protena total.2.12.Medicin del contenido de cistena libre y total

Libres y totales de residuos de cistena de streblin se determinaron mediante el mtodo

DTNB.Para la determinacin del contenido de cistena libre, la enzima se activ con 0,05M B-MEen 0,05 M de Tris-HCl, pH 8,0 a 37C durante 30 min y se dializextensivamente durante 24 h contra 500 ml de cido actico 0,1 M, con cuatro cambios en

el dializado.Despus de la dilisis, 50lde la muestra de enzima dializada se tomaron en700l de 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,3, y la muestra se dej en reposo durante 10 min para


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alcanzar el pH.Posteriormente, 50l de 5 mM de solucin de DTNB se aadi y lamezcla de reaccin se mezcl a fondo. El anin TNB liberado, despus de la reaccin delgrupo sulfhidrilo con DTNB, se monitoriz espectrofotomtricamente.El nmero deresiduos de cistena libres se evaluaron utilizandoel coeficiente de extincin de TNB de14150 M-1cm-1a 412 nm.Para la estimacin del nmero total de residuos de cistena, laenzima se desnaturaliz en 6 M de GuHCl y se reduce con 0,05 M de DTT en 0,05 M de

Tris-HCl, pH 8,0.El exceso de DTT en la mezcla de reaccin se elimin por dilisis frentea 500 ml de 0,1 M de cido actico con cuatro cambios de la dializado (Riddles, Blakeley,y Zerner, 1983).Se estimaron los grupos tiol liberados como se describe en el caso de la estimacin de

cistena libre.Los nmeros de enlaces disulfuro en la protena se dedujeron porcomparacin del nmero de residuos de cistena libre y total. Para validar las mediciones,tambin se determinaron los contenidos similares de la papana, ribonucleasa A, y la

lisozima.

2.13.pH y la temperatura ptimosLa actividad proteoltica de streblin se examin en el intervalo de pH 0,5 a 13 para

determinar el pH ptimo.Los tampones utilizados fueron 0,05 M de KCl-HCl (pH 1.0-1.5),0,05 M de glicina-HCl (pH 2.0-3.5), acetato de sodio 0,05 M (pH 4,0-5,5), fosfato de sodio

0,05 M (pH 6,0-7,5), 0,05 M de Tris-HCl (pH 8,0-10,0), y 0,05 M de glicina-NaOH (pH10,5-13).Debido a la insolubilidad de la casena por debajo de pH 4,0, ensayos de laenzima a pH ms bajo se llevaron a cabo usando hemoglobina como sustrato. Unasolucin de sustrato de azoalbumin (0,6% w / v) o la hemoglobina (1% w / v) se prepar

en los respectivos tampones de pH, y la actividad fue tomada en el mismo pH que en el

mtodo descrito anteriormente a 37C.Del mismo modo, tambin se estudi el efecto de la temperatura sobre la actividad, para

determinar la temperatura ptima de la enzima streblin.La casena se utiliz comosustrato.La enzima se incub en el rango de temperatura de 15-100C, durante 15 minen 0,05 M de tampn de Tris-HCl, pH 9,0, y una alcuota se utiliz para la medicin de la

actividad a la misma temperatura.A cada temperatura, un ensayo de control se llev acabo sin enzima.


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2.14.EstabilidadEstabilidad de una enzima dicta su utilidad y aplicabilidad comercial. La estabilidad destreblin se evalu en un amplio intervalo de pH y temperatura y en presencia de

desnaturalizantes qumicos.Streblin se incub durante 24 h en tampones dadas en elintervalo de pH de 0,5 a 13 y se ensay para actividad residual. Los diferentes tamponesutilizados ya fueron mencionados en la seccin anterior.Del mismo modo, la enzima seincub a varias concentraciones de los desnaturalizantes, urea y de GuHCl, durante 24 h

y se ensay para actividad residual; la enzima se incub a diferentes temperaturas en el

rango de 15-100C, durante diversos perodos de tiempo, y una parte alcuota se utilizpara determinar la actividad residual.Aunque la enzima se incub en un rango detemperaturas, las mediciones de la actividad se llevaron a cabo a pH 9 y 37 C.En todoslos casos anteriores el residuoactividades de las muestras pretratadas se midieron por elensayo de proteasa estndar descrito anteriormente.2.15.Ensayo para la actividad amidoltica hacia sustratos sintticosLa hidrlisis enzimtica de diferentessustratosde p-nitroanilidade peptidilo sintticosporla proteasa purificada fue estudiado por un mtodo espectrofotomtrico. Los sustratosutilizados en este estudio fueronN- -benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPA), L-Ala-

Ala-p-nitroanilida, N-succinil-Phe-p-nitroanilida, L-Glu-p-nitroanilida , L-Alap- nitroanilida,y L-Leu-p-nitroanilida.En todos los casos, una accin 1 - solucin 12 mM del sustratosinttico se prepar en DMSO disolviendo la cantidad requerida de sustrato en el volumen

mnimo y se complet hasta el volumen requerido con tampn Tris-HCl 0,01 pH 8,0 a

30C.La mezcla de reaccin contena aproximadamente 15-20g de enzima en 0,5 mlde tampn Tris-HCl,pH 8.0, y 0,5 ml de peptidil p-NA. Despus de 60 min de incubacin a37C, la reaccin se termin por adicin de 0,2 ml de 30% de cido actico y laliberacinde p-NAse determin por absorbancia a 410 nm, usando el coeficiente deextincin de 8800 M-1cm-1parap-nitroanilida como una medida de la hidrlisis.2.16.Efecto de los inhibidores sobre la actividad de streblinSe estudi Efecto de inhibidores de la proteasa en la actividad proteoltica de la

enzima.Los inhibidores utilizados fueron STT, IAA, PMSF, EDTA, EGTA, PCMB, o-fenantrolina, NEM, HgCl2y SBTI.Un ensayo de control de la actividad de la enzima sehizo sin inhibidores y la actividad resultante se tom como 100%.La enzima se incub


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con un inhibidor durante 30 minutos a temperatura ambiente y una alcuota se utiliz para

la medicin de la actividad.El ensayo se realiz como se describi anteriormente.

2.17.La autodigestinLas proteasas, en general, son propensos a la autodigestin, y el grado de autolisis

depende de la concentracin de enzima, el pH y la temperatura. Diferentesconcentraciones de streblin, que van de 0,01 a 0,1 mg / ml se incubaron con 0,05 M de

Tris-HCl, pH 8,0 a temperatura ambiente.Una parte alcuota que contena 5g de enzimase utiliz para la determinacin de la actividad de la proteasa despus de 1, 7 y 14 das

de incubacin, como se describi anteriormente con casena como sustrato.Actividadde la enzima despus de la primera 10 min de activacin se tom como 100% para el

clculo de las actividades residuales.2.18.Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccinSe estudi el efecto de aumentar la concentracin de sustrato sobre la velocidad de

reaccin de la hidrlisis enzimtica, usando casena como sustrato a pH 9,0 y 37 C.Seutilizaron diez microgramos de la enzima, y la concentracin de casena era en el rango

de 1-500M.Los ensayos se realizaron como ya se ha descrito en las mediciones de laactividad proteoltica.Un espacio en blanco se utiliz en las concentraciones de sustratoespecficas sin la enzima.Se obtuvo una representacin de Lineweaver-Burk y se calculel valor de la constante de Michaelis-Menten (Km).2.19.Pptido masiva de huellas dactilaresPara la huella dactilar de masa de pptido, la banda de protena diana se escindi del gel

y se someti a en-gel de digestin con tripsina.La espectrometra de masas se llev acabo por el Instituto Jalma de la lepra y otras enfermedades microbianas, Agra, en un

espectrmetro de masas MALDI / TOF-TOF.Las listas de los picos obtenidos sesometieron a los resultados de bsqueda de la

mascota(http://www.matrixscience.com) programador para la identificacin de protenas.


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2.20.Ensayo para la actividad de coagulacin de la lecheLa actividad de coagulacin de la leche-se determin de acuerdo con los mtodos

descritos porOtani, Matsumori, y Hosono (1991)con una ligera modificacin.El sustrato(10% de leche desnatada en 0,01 M de CaCl2) se prepar y el pH se ajust a 6,5. Elsustrato (2,0 ml) se pre-incubaron durante 5 min a 37 C, y se aadi 0,2 ml de extractode enzima, y se observ la formacin de la cuajada, mientras que manualmente girando el

tubo de ensayo de vez en cuando.El punto final se registr cuando partculas discretaseran perceptibles.Una unidad milkclotting se defini como la cantidad de enzima quecoagula 10 ml de sustrato en 30 min.Actividad de coagulacin de la leche se defini comoMCA (unidades) = 2400 /TxS/ET= tiempo necesario para la formacin de cuajada fragmento (s) S= volumen de solucin de sustrato (2,0 ml)E= volumen de solucin de enzima (0,2 ml)

3.Resultados y discusin3.1.La purificacin de la enzimaUna nueva proteasa de serina se purific a partir del ltex de S.asperhasta lahomogeneidad, usando la cromatografa de intercambio aninico.Las protenas unidas ala columna dieron como resultado un perfil de elucin que consta de dos picos con la

mayor parte de la actividad que aparecen en pico I (fig. 1).Protena en la mayora de lasfracciones de primer pico era homognea en SDS-PAGE.Estas fracciones homogneasse combinaron (70 - 140) y se concentraron para su uso posterior. El rendimiento de laprotena purificada fue de 75% con actividad especfica 6,92 U / mg y 4,6 veces la

purificacin.La protena purificada fue nombrado streblin, de acuerdo con la nomenclatura de las

proteasas.La actividad proteoltica observado en slo un pico sugiere la existencia de una

sola proteasa en el ltex deS.asper.Esa sola proteasa es una caracterstica poco comn,como el ltex planta consta de varias proteasas, por ejemplo, Euphorbia

dupifera(LynnyClevette-Radford, 1988),Euphorbia milli(Moroet al, 2008;. Yadavet

al.,2006)y otros.A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe de

identificacin y purificacin de una proteasa serina del gneroStreblusde la familia

Moraceae.El simple purificacin deS.asper, junto con la fcil disponibilidad de una gran


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cantidad de ltex, hace que la produccin a gran escala de enzima posible, y permite as

la exploracin de industrial, as como aplicaciones biotecnolgicas.

3.2.La homogeneidad y propiedades fsicas de la proteasaElectroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostr que la enzima, en condiciones

reductoras y no reductoras, se altamente purificado como una nica banda, lo que sugiere

la naturaleza monomrica de la enzima (Fig. 2a).La masa molecular de la enzimapurificada se calcul como 64 kDa por SDS-PAGE, utilizando la trama de la movilidad

relativa frente masa molecular (fig. 3),el cual casi coincida con la banda de albmina de

suero bovino (BSA).El coeficiente de extincin de la enzima se promedi a un valor de5,29 por mtodos espectrofotomtricos y se utiliza para todas las dems aplicaciones

prcticas.La masa molecular de la enzima era similar a la de la cucumisina serinaproteasa planta conocida (Yamagata,Ueno, y Iwasaki, 1989),y con otras proteasas deserina-cucumisina como(Asif-Ullah, Kim, y Yu, 2006; Rudenskaya et al, 1998.; Uchikobaet al., 1998).La masa molecular de la enzima purificada fue tambin similar a las de lasendoproteasas-subtilisina como de la planta de tomate(Messdaghi y Dietz, 2000; Tornero,Conejero, y Vera,1996).Las masas moleculares de las serina proteasas de plantas, hastaahora conocidos, varan desde 19 hasta 110 kDa, sin embargo, la mayora se encuentran

entre 60 y 80 kDa (Antao y Malcata, 2005).Como se muestra enla figura.2b, zimogramaactividad tincin en 12,5% de SDS y no reductoras en gel de poliacrilamida, usando

casena como sustrato, estableci que se obtuvo una banda bien resueltas en SDS-

PAGE, correspondiente a la actividad de la proteasa. Aunque el gel zimograma contena0,1% de SDS y la muestra se trat con 1% de SDS, la enzima an se muestra la

actividad, lo que indica que era resistente a SDS desnaturalizante.Resistencia a DSS esla propiedad ms llamativa de las enzimas purificadas entre todas las proteasas de serina

planta reportados excepto para cucumisina(Yamagata et al., 1989).

Como se muestra enla figura.2c, la enzima purificada fue aparentemente resuelve comouna nica banda en el enfoque isoelctrico con un punto isoelctrico (pI) de 9,2, lo que

indica que es una protena bsica.Noda,Koyanagi y Kamyia (1994)encontr resultadossimilares para una serina proteasa planta deCucumis meloL.con un punto isoelctricobsico (pI) de 9,5.En contraste, la mayora de las serina proteasas aisladasrecientemente de plantas tienen puntos isoelctricos en el intervalo de 4,0-7,0


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(Singh et al., 2010).Una sola banda obtenido en SDS-PAGE, y la actividad de zimogramaelectroforetogramas IEF demostr su alta pureza.3.3.Deteccin de carbohidratosStreblin contiene alrededor de 9-10% de hidratos de carbono, determinado por el mtodo

del cido sulfrico fenol(Hounsell et al., 1997)por extrapolacin de la curva de calibracingenerada en condiciones similares con galactosa como el estndar. Adems, la presenciade un resto de carbohidrato se confirm mediante tincin de la protena con el reactivo de

Schiff, que apareci como un color magenta(Fig. 2d).El resultado demostr que laenzima purificada era una glicoprotena.El resto glycocarbohydrate puede ser parte de laarquitectura funcional de la enzima purificada, y podra ser responsable de su estabilidad

trmica.Se necesita ms trabajo para dilucidar la naturaleza de la unin entre elcarbohidrato (s) y protena en la enzima purificada y su funcin.Muchas proteasas deplantas son glicoprotenas aunque la ventaja biolgica de tales glicosilacin todava no

est claro.Sharma et al.(2009)concluyeron, despus del tratamiento TFMS, que laglicosilacin es esencial para la actividad proteoltica de la protena.3.4.Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de streblinLa actividad hidrolizante de streblin se control a diferentes temperaturas en el rango de

15-100C y pH 0,5 a 13.La temperatura y el pH ptimo para la actividad de streblinfueron 65C y pH 9,0, respectivamente(Fig. 4A y B).La actividad de la enzima aumenta medida que la temperatura aument de 15 a 75C.Sin embargo, la actividad disminuyde manera constante como la temperatura subi por encima de 85C.Haba 100% y 80%la actividad retenciones despus de 15 min de incubacin a 75 y 85C,respectivamente. La termoestabilidad de la enzima se encontr que era de hasta90C(Fig. 4A).El perfil de temperatura de la enzima purificada fue similar a las de lasubtilisina / serina proteasas de plantas-cucumisina como (Tabla 1).La enzima purificada fue estable en un amplio rango de pH (3,0 a 12,5) condiciones y

retuvo toda su actividad dentro del mismo intervalo de pH cuando se incubaron durante 1

h(Fig. 4B).Por otra parte, en el pH 3,0-12,5 gama, ms de 55% de la actividad seconserv despus de 15 min de incubacin a 37C.La proteasa purificada actu demanera ptima a un pH de 9,0.Tal actividad ptima a pH alto no ha sido reportado para lamayora aislados serina proteasas de la planta.La estabilidad de las protenas y lasenzimas es por lo general un factor que limita su utilidad en muchas aplicaciones.La


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estabilidad de streblin en lo que respecta a su pH es ms comparable al de otras

proteasas de serina-cucumisina como (Tabla 1).A este respecto, la enzima aislada esnico, y por lo tanto podra ser adecuado para usos en la industria bajo condiciones

alcalinas.Estas caractersticas son importantes, porque la mayora de las enzimas soncatalticamente inestable a valores de pH alcalinos, lo que limita su utilidad en la industria

alimentaria, especialmente el queso de decisiones coagulantes(Lamas, Barros, Balcao, yMalcata, 2001).Una excepcin a esta regla general es representado por el extractoacuoso y asprtico proteasas de la flor deCynara cardunculus,que se han empleado conxito para la fabricacin de quesos tradicionales de ovino y caprino de leche(Sousa yMalcata, 2002).

La figura. 4. (a) Efecto de la temperatura, sobre la actividad ( ) y estabilidad (o) del

streblin. Para la temperatura ptima, 10 g de streblin fueron activados a la temperatura

requerida durante 15 min; se aadieron 0,5 ml de sustrato a la misma y la actividad se

midi a la misma temperatura. Para los experimentos de estabilidad, 15 g de la enzima se

incubaron a la temperatura requerida durante 15 min, y la actividad se midi a 37 C y pH

9,0. (b) Efectos de pH, sobre la actividad ( ) y estabilidad (o) del streblin. Para pH

ptimos, 10 g de enzima activada en 0,5 ml de tampn, de pH requerido, se utilizaron y se

determin la actividad usando los sustratos preparados en correspondientes tampones.

La estabilidad se determina por (durante la noche) incubar 15 LG de la enzima a

temperatura ambiente y la actividad (da siguiente) se determin como se describe en el

texto.


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3.5. Estabilidad

Retencin de la actividad completa en 40% de metanol, 45% de acetonitrilo y 70%

dioxano es un reflejo de la alta estabilidad de streblin en disolventes orgnicos. La

proteasa es estable en 3 M de GuHCl y pierde su actividad lentamente a partir de

entonces. Tambin mantiene su actividad mxima en 6.5-8.0 Murea. La alta estabilidad de

streblin en diversas condiciones duras hace que sea un excelente sistema para estudios

biofsicos para dilucidar la relacin entre su estructura y funcin. Estabilidad de streblin,

bajo diferentes condiciones se presentan en la Tabla 2.

La estabilidad de una enzima en los extremos de condiciones es el factor decisivo para su

utilidad industrial. Streblin mostr una notable estabilidad en condiciones en que la

mayora de las enzimas pierden su actividad. Se conserva la actividad en un amplio

intervalo de temperaturas de hasta 90 C durante 15 min (fig. 4a), as como el pH 3,0 a12,5 (Fig. 4b).

3.6.Efecto de los inhibidoresDiferentes inhibidores, especficos para diferentes clases de proteasas se utilizaron para

determinar la clase de la proteasa purificada (Tabla 2).La inactivacin de la enzimaproducido en presencia de PMSF, cido caproico 6-amino, benzamidin-HCl y, un poco,

con SBTI, mientras que IAA, NEM, E-64, o-fenantrolina, el EDTA y EGTA no tuvieronefecto sobre su actividad.Como la enzima se inhibi exclusivamente por inhibidores de laproteasa de serina, esto indica que es una serina proteasa.PMSF inhibi fuertemente laenzima y la inhibicin de 95,5% se produce a una concentracin de 60M dePMSF.SBTI fue menos eficaz como inhibidor de la inhibicin completa no se logr (slo70% de inhibicin) en el rango de concentracin utilizado de 0,1 mM.Esto indica quepuede que no sea una serina proteasa similar a la tripsina y la determinacin estructural

de residuos del sitio activo puede proporcionar evidencia ms concluyente.La falta deinhibicin de la actividad de los inhibidores proteicos, tales como SBTI, abundante en

alimentos ricos en protenas como la soja, hace que la enzima proteasa potencial para la

industria alimentaria.Inhibidores de metaloproteasa, por ejemplo, o-fenantrolina, EDTA yEGTA, no mostraron efectos significativos sobre la actividad de streblin, descartando la

posible de que sea un metalloprotein.Del mismo modo, los inhibidores de la proteasa decistena, por ejemplo, IAA, STT, NEM y PCMB, tambin mostraron ningn efecto

significativo sobre la actividad proteoltica de la enzima purificada.


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3.7.Especificidad de sustratoStreblin hidroliza sustratos desnaturalizadas naturales, tales como la casena, la

hemoglobina, azoalbumin y azocasesin, con notable actividad.Sin embargo, no muestraninguna actividad significativa para los sustratos sintticos usados en el estudio actual,

por ejemplo, L-Ala-Ala-p-nitroanilida, L-Ala-p-nitroanilida, L-Leu-p-nitroanilida,N-una-benzoil-DL-arginina p-nitroanilida (PABA), N-succinil-Phe-p-nitroanilida y L-Glu

p nitroanilida.Para la serina proteasa planta ms estndar, es decir, cucumisina, lalongitud hexapptido tiene una alta tasa de hidrlisis y se escinde de manera deseable en

el lado C-terminal de residuos de aminocidos carboxilo, tales como cido glutmico y

cistena carboximetilada, y el lado N-terminal de alanina (Yonezawa, Kaizuka, Uchikoba, yArima,2000).Como los sustratos sintticos mencionadas anteriormente no tienen estascaractersticas, esta puede ser la posible razn de la inercia de streblin hacia ellos. 3.8.Residuos de aminocidos especficosEl contenido total de cistena de streblin se encuentra para ser 7 con 1 residuo de cistena

libre (valor medido 0.98), formando as tres puentes disulfuro. Las proteasas de serina,como euphorbian l,yeuphorbian1y euphorbiany3, tienen 7, 9 y 10 residuos de cistena,respectivamente(Lynn y Clevette-Radford, 1988).El nmero total de triptfano y tirosinaresiduos de streblin, tal como se determina por el mtodo de Goodwin y Moore, son 3 y 7,respectivamente. Estos valores son inusualmente y excepcionalmente bajos encomparacin con los valores reportados para otras proteasas de serina.En este punto, ladeterminacin del nmero especfico de estos residuos es necesaria para el clculo del

coeficiente de extincin de la enzima.Sin embargo, estamos en el proceso de generacincompleta de aminocidos de datos de secuencia que se inform de otros lugares.3.9.La autodigestin

La autodigestin del streblin se monitoriz a temperatura ambiente en el rango deconcentracin de protena 0,01-0,1 mg / ml a pH 9,0. En cada caso, la prdida deactividad fue inversamente proporcional a la concentracin.La enzima retiene ms del95% de la actividad despus de 1 da de incubacin, incluso a bajas concentraciones

(0,01 mg / ml) y la prdida de actividad aument con el tiempo de incubacin de 1 da a

da 7, mientras que, a mayores concentraciones, la enzima era completamente


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activa.Despus de 14 das de incubacin, se produjo una disminucin general de laactividad residual en cada concentracin en el intervalo elegido.En concentraciones msaltas, la enzima era completamente activa despus de 1 da de incubacin y se mantiene

la tendencia hasta 7 das de incubacin con alguna disminucin en la actividad residual

despus de das 14.Por lo tanto, streblin mostr excepcionalmente alta resistencia a laautodigestin.Esto, a su vez, indica su alta estabilidad, y por tanto su posible aplicacinen las industrias de alimentos, textiles y biotecnolgicas.La mayora de las proteasasaislados estudiados se someten a la autodigestin a bajas concentraciones de protena. 3.10.Efecto de la concentracin de sustratoLa naturaleza de la cintica hiperblica era tpicamente con sustratos naturales (casena)

y, a concentraciones ms altas del sustrato, la actividad de la enzima alcanz la

saturacin.El efecto de aumentar la concentracin de sustrato sobre la velocidad dereaccin de streblin sigui la ecuacin de Michaelis-Menton.El valor deKm, como seestima a partir de la representacin de Lineweaver-Burk, fue de 27 0,5M con lacasena como sustrato.3.11.Anlisis de huellas dactilares MisaLa protena se digiri enzimticamente con tripsina y se resolvi en masas de pptido. Elpptido masa determinada se registraron en contra de las bases de datos relevantes en

los resultados de bsqueda de la mascota.La ausencia de cualquier resultado positivocon el fragmento de cualquiera de los conocidos de la proteasa serina planta confirm la

singularidad de la streblin.3.12.Milk-coagulacinEl streblin enzima fuertemente coagulada la leche desnatada y form una cuajada blanca

y firme.Se determin la relacin entre la actividad coagulante a la actividad proteoltica destreblin.Se encontr que la relacin de la actividad de coagulacin de la leche a laactividad proteoltica de streblin era 2306 U / OD 660 nm. Ms recientemente, una enzimade coagulacin de la leche se extrae de la hoja deS.asperporIshak et al.(2006),enapoyo de esta.La capacidad de esta proteasa para producir leche cuajada podra hacerlotil como un nuevo coagulante de la leche, aunque ms estudios sobre las cualidades de

ambos cuajada de la leche y el queso formado se deben realizar en el futuro para


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confirmar su utilidad en la industria lctea y la industria alimentaria. Sin embargo, el cuajode ternero utilizado para la produccin de queso es una enzima relativamente caro debido

a su limitada disponibilidad y consideraciones ticas asociadas con su uso, por lo tanto, la

bsqueda de nuevas enzimas procedentes de otras fuentes an contina(Tavaria etal,.1997).4.ConclusinPara nuestro conocimiento, este es el primer informe de la purificacin y caracterizacin

de una nueva serina proteasa, llamado streblin, a partir del ltex de una planta medicinal

valiosa,S.asper.En comparacin con otros procedimientos de purificacin llevadas acabo previamente, tuvimos xito en el desarrollo de un procedimiento de purificacin

simple en este estudio.El procedimiento es econmico y, combinado con la disponibilidadde la planta de ltex, posiblemente podra ser utilizado para la produccin a gran escala

de la enzima, lo que permite un amplio estudio de sus diversos aspectos y aplicaciones,

por lo tanto probables, as como estudios sobre la estructura-funcin relacin de la

enzima.Por otra parte, la alta estabilidad de streblin contra la autodigestin en diversascondiciones, la disponibilidad de materias primas y su fuerte capacidad de coagulacin de

la leche, podra allanar el camino para su uso en la industria del queso, as como otras

industrias alimentarias y biotecnolgicas.Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Deepa Bisht y el Sr. Prashant Sharma, Jalma Instituto de la lepra y

otras enfermedades microbianas, Agra, UP, India, por la huella de masas

peptdicas.Tambin agradecemos a CSIR de apoyo financiero en forma de un miembroasociado de Investigacin.Tambin se reconoce la asistencia financiera del ICMR a RituTomar en forma de JRF y SRF.Apndice A. Datos complementariaDatos suplementarios asociados con este artculo se pueden encontrar, en la versin en

lnea, endoi: 10.1016/j.foodchem.2010.09.108.

proteasas para la coagulacion

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