programa de doctorado en ciencias y tecnologÍa …

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍA ANALÍTICA

FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

ANALÍTICA

TÍTULO

DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALITICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN

DE COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR EN BIO-OIL Y SU APLICACIÓN EN

LA OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN Y FRACCIONAMIENTO

CATHERINE VALESKA TESSINI ORTIZ

Profesor Tutor Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Profesor Co-Tutor Dra. Claudia Mardones Peña

Departamento de Análisis Instrumental

Facultad de Farmacia

Universidad de Concepción

Concepción-Chile

2011

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ii

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización de compuestos de bajo peso

molecular en bio-oil y su aplicación en la optimización del proceso de producción y fraccionamiento

Comisión Evaluadora

Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Profesor Tutor


Dra. Claudia Mardones Peña Profesor Co-Tutor


Dr. Alex Berg Gebert


Dr. Edward Fuentes Pérez

Universidad de Chile

Director de Postgrado

Dr. Carlos Peña Farfal Universidad de Concepción

Decano Facultad de Farmacia

Dr. Carlos Calvo Monfil


Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el Departamento de Análisis Instrumental de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Concepción, bajo la dirección de los profesores

Dr. Dietrich von Baer y la Dra. Claudia Mardones a quienes deseo expresar mi agradecimiento

por su aportación científico y principalmente por el apoyo personal. Con ellos también, agradecer al Dr. Carlos Bruhn, quien me recibió en el programa de doctorado.

La investigación desarrollada se ha financiado a través de los proyectos PFB-27/PCS 003,

FONDEF D07-I-1137. Además de la beca doctoral proporcionada por CONICYT en el año 2010, y

las becas y beneficios otorgados por el Departamento de análisis Instrumental y la Dirección de Postgrado de la Universidad de Concepción.

Quiero también expresar mi gratitud al Dr. Dietrich Meier, por su recibimiento y apoyo en la estadía realizada en el vTI, Institute of Wood Technology and Wood Biology-Alemania.

Mis más sincero agradecimientos a mis compañeros y docentes del departamento de Análisis

Instrumental quienes colaboraron al desarrollo de mi trabajo de tesis.

Y finalmente, pero no menos importante, deseo agradecer a mi familia y en especial a mis amigos

que me recibieron en esta ciudad, me animaron a seguir adelante y me arrancaron una sonrisa en

los momentos difíciles.

Gracias

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

A mis padres

A mi abuelito José.

ÍNDICE GENERAL

Índice………………………………………………………………………………………………..iii

Abreviaturas………………………………………………………………………………..………..vi

Índice de Tablas……………………………………………………………………………………viii

Índice de Figuras……….……………………………………………………………………………ix

Resumen…………………………………………………………………………………………….xii

Abstract..……………………………………………………………………………………………xiv

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ii

ÍNDICE

CAPITULO 1 Introducción ................................................................................................................1

1.1 Introducción General ............................................................................................................... 1

1.2 Tipos y utilización de biomasa como fuente de energía ........................................................... 1

1.3 Conversiones térmicas de biomasa .......................................................................................... 2

1.3.1 Gasificación de biomasa .................................................................................................... 2

1.3.2 Pirólisis de biomasa ........................................................................................................... 3

1.4 Propiedades físico-químicas del bio-oil................................................................................ 5

1.5 Reactividad del bio-oil ............................................................................................................. 7

1.5.1 Compuestos inorgánicos en el bio-oil................................................................................ 7

1.5.2 Compuestos orgánicos en el bio-oil ................................................................................... 8

1.6 Productos de interés nacional del bio-oil ................................................................................. 9

1.7 Analítica del bio-oil ............................................................................................................... 12

1.7.1 Parámetros físicas del bio-oil .......................................................................................... 12

1.7.2 Análisis del bio-oil por método químicos ........................................................................ 13

1.7.3 Análisis del bio-oil por métodos instrumentales .............................................................. 14

1.8 Bibliografía ............................................................................................................................ 23

CAPÍTULO 2 Hipótesis y objetivos.................................................................................................26

2.1 Hipótesis General................................................................................................................... 26

2.1.2 Hipótesis derivadas ......................................................................................................... 27

2.2 Objetivos Generales ............................................................................................................... 27

2.2.1 Objetivos específicos....................................................................................................... 27

CAPÍTULO 3 Estrategia analítica y material de estudio ..................................................................28

3.1 Obtención del bio-oil ............................................................................................................. 28

3.2 Procesos de fraccionamiento del bio-oil para la obtención de grupos de compuesto de interés

a nivel industrial .......................................................................................................................... 29

3.2.1 Extracción de compuestos volátiles del bio-oil................................................................ 30

3.2.2 Extracción de ácidos y aldehídos por extracción con solvente ........................................ 30

3.2.3 Extracción con solventes ................................................................................................. 31

3.2.4 Separación de la lignina pirolítica del bio-oil .................................................................. 32

3.3 Métodos analíticos de tratamientos de muestras .................................................................... 32

3.3.1 Extracción líquido‐líquido ............................................................................................... 33

3.3.2 Extracción en fase sólida ................................................................................................. 33

3.3.3 Microextracción en fase sólida ........................................................................................ 34

3.4 Métodos de derivatización ..................................................................................................... 38

3.5 Métodos quimiométricos ....................................................................................................... 38

3.6 Propuesta de la estrategia analítica......................................................................................... 39

3.7 Bibliografía ............................................................................................................................ 40

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

CAPÍTULO 4 Caracterización de bio-oil por inyección directa en GC/MS .....................................41

4.1 Resumen ................................................................................................................................ 41

4.2 Introducción ........................................................................................................................... 41

4.3 Materiales y métodos ............................................................................................................. 42

4.3.1 Reactivos ......................................................................................................................... 42

4.3.2 Instrumentación ............................................................................................................... 42

4.3.3 Condiciones cromatográficas .......................................................................................... 42

4.3.4 Preparación de muestras de bio-oil crudo y fracciones .................................................... 43

4.3.5 Identificación y cuantificación ........................................................................................ 43

4.3.6 Muestras y fracciones ...................................................................................................... 43

4.4 Resultados y discusión ........................................................................................................... 45

4.4.1 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS/FID .................................. 45

4.4.2 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS ......................................... 51

4.5 Conclusiones ......................................................................................................................... 58

4.6 Bibliografía ............................................................................................................................ 59

CAPÍTULO 5 Desarrollo de metodología analítica para la determinación de azúcares en bio-oil por

HPTLC .............................................................................................................................................60

5.1 Abstract.................................................................................................................................. 61

5.2 Introduction ........................................................................................................................... 61

5.3 Materials and methods ........................................................................................................... 63

5.4 Standard solutions and bio-oil samples .................................................................................. 63

5.5 HPTLC quantification of main sugars ................................................................................... 64

5.7 Conclusions ........................................................................................................................... 70

5.8 References ............................................................................................................................. 71

CAPÍTULO 6 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil por HPLC-UV y su determinación

simultámea con azúcares por GC/MS ..............................................................................................73

6.1 Resumen ................................................................................................................................ 73

6.2 Introducción ........................................................................................................................... 73

6.3 Materiales y métodos ............................................................................................................. 75

6.3.1 Reactivos ......................................................................................................................... 75

6.3.2 Materiales ........................................................................................................................ 75

6.3.3 Instrumentación ............................................................................................................... 75

6.3.4 Condiciones cromatográficas .......................................................................................... 75

6.3.5 Preparación de estándares y muestras.............................................................................. 76

6.4 Resultados y Discusiones ....................................................................................................... 77

6.4.1 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y sus fracciones mediante HPLC-UV ..... 77

6.4.2 Determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares por GC/MS previa

derivatización con BSTFA .......................................................................................................87

6.6 Conclusiones .......................................................................................................................... 96

6.7 Bibliografía ............................................................................................................................ 98

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

CAPÍTULO 7 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular en bio-oil por HPLC-UV y por

GC/MS, previa derivatización/extracción simultánea por HS-SPME ............................................. 100

7.1 Resumen .............................................................................................................................. 100

7.2 Introducción ......................................................................................................................... 100

7.3 Materiales y métodos ........................................................................................................... 106

7.3.1 Reactivos ....................................................................................................................... 106

7.3.2 Materiales ...................................................................................................................... 106

7.3.3 Instrumentación y condiciones cromatográficas ............................................................ 106

7.3.4 Preparación de estándares y tratamiento de muestras de bio-oil .................................... 107

7.3.5 Optimización de metodologías D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS ................... 108

7.4 Resultados y discusión ......................................................................................................... 108

7.4.1 Determinación de aldehídos por HPLC previa derivatización con 2,4-DNPH .............. 108

7.4.2 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS previa derivatización

con PFBHA. Comparación de procedimientos de derivatización en solución y derivatización

en fibra (D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS respectivamente) .................................... 111

7.5 Conclusiones ........................................................................................................................ 126

7.6 Bibliografía .......................................................................................................................... 128

Conclusión General………………………………………………………………………………..129

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

ABREVIATURAS

Å Ångstrom

amu Unidad de masa atómica

ANOVA Análisis de la varianza

ASTM American Society for Testing Materials

ATD Análisis térmico diferencial

ATG Análisis termogravimétrico

BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamida

CAR Carboxen

cp CentiPoises, medida de viscosidad

cSt CentiStokes, medida de viscosidad

CW Carbowax

DNPH 2,4-Dinitrofenilhidrazina

DSC Calorimetría diferencial de barrido

DTG Termogravimetría diferencial

DVB Divinilbenceno

FID Detector de ionización de llama

FT-IR Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier

GC Cromatografía de gases

GC x GC Cromatografía de gases bi-dimensional

GPC Cromatografía de permeación por gel

HAA Hidroxiacetaldehído

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución

HPTLC Cromatografía de capa fina de alta resolución

HS Espacio de cabeza o “Headspace”

ICP Plasma de acoplamiento inductivo

IR Infrarrojo

LC Limite de cuantificación

LD Limite de detección

LDI Desorción/ionización laser

LLE Extracción líquido-líquido

MALDI Desorción/ionización láser asistida por matriz

MS Detector selectivo de masas

MTBE Metil terbutileter

OFD Derivatización “on-fiber”

PA Poliacrilato

PDMS Polidimetilsiloxano

PFBHA O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobencil) hidroxilamina clorhidrato

Py Pirolizador

R Resolución cromatográfica

RMN Resonancia magnética nuclear

RSD Desviación típica relativa

SAX Intercambio aniónico fuerte

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vi

SCAN Barrido completo de masas

SIM Monitoreo de ion selectivo

SPE Extracción en fase sólida

SPME Microextracción en fase sólida

TAN Acidez total

THF Tetrahidrofurano

TLC Cromatografía de capa fina

TMS Trimetilsilil derivados

TMSI Trimetilsililimidazol

TOF Tiempo de vuelo

XRF Espectrometría de fluorescencia de rayos X

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis……….3

Tabla 1.2 Propiedades típicas y características del bio-oil obtenido de biomasa forestal…………..5

Tabla 1.3 Algunas Propiedades físicas del bio-oil…………………………………………………..6

Tabla 1.4 Principales compuestos presentes en el bio-oil…………………………………………...7

Tabla 3.1 Principales propiedades de las fibras de SPME…………………………………………37

Tabla 4.1 Concentraciones de compuestos de interés identificados en bio-oil y sus fracciones…..49

Tabla 4.2 Resultados obtenidos para el bio-oil L y las diferentes fracciones. Los resultados están

expresados en % p/p húmedo…………………………………………………………………….....55

Table 5.1 Physico-chemical properties of analyzed bio-oil samples obtained by pyrolysis at

500°C………………………………………………………………………………………………..63

Table 5.2 Analytical parameters for HPTLC sugar determination in bio-oil………………………65

Table 5.3 Sugar concentrations in fresh bio-oil samples and extracts……………………………..68

Tabla 6.1 Parámetros analíticos obtenidos de la curva de calibración instrumental, para los

principales ácidos orgánicos presentes en el bio-oil………………………………………………..78

Tabla 6.2 Repetibilidad y error en la determinación de ácidos orgánicos en fracciones de destilado

al vacío de bio-oil mediante HPLC-UV……………………………………………………………79

Tabla 6.3 Concentración de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil. Comparación de los métodos

TAN y HPLC-UV………………………………………………………………………………….79

Tabla 6.4 Repetibilidad y recuperación de ácidos orgánicos desde fracciones orgánicas (MTBE) del

bio-oil, (n=9)………………………………………………………………………………………..82

Tabla 6.5 Porcentajes de recuperación del método de SPE en bio-oil crudo y en agua…………...85

Tabla 6.6 Variables optimas para cada grupo de compuestos, y la propuesta realizada para la

determinación simultanea…………………………………………………………………………..90

Tabla 6.7 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de ácidos orgánicos en

muestras de bio-oil…………………………………………………………………………………90

Tabla 6.8 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de azúcares en muestras

de bio-oil…………………………………………………………………………………………...91

Tabla 6.9 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil, para ácidos orgánicos y

azucares, ambos por GC/MS………………………………………………………………………94

Tabla 6.10 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil por HPTLC y GC/MS

previa derivatización. En la determinación de levoglucosano y celobiosano……………………..95

Tabla 7.1 Parámetros analíticos de la curva de calibración instrumental de aldehídos por HPLC-

UV, previa derivatización con 2,4-DNPH………………………………………………………..108

Tabla 7.2 Métodos propuestos para la realización de forma automática del método OFD-HS-

SPME-GC/MS……………………………………………………………………………………118

Tabla 7.3 Variables empleadas en el diseño experimental para la optimización de la metodología

OFD-HS-SPME-GC/MS…………………………………………………………………………119

Tabla 7.4 Parámetros operativos óptimos para la determinación de aldehídos por OFD-HS-SPME-

GC/MS…………………………………………………………………………………………....122

Tabla 7.5 Principales parámetros analíticos obtenidos en ambas metodologías………………...124

Tabla 7.6 Comparación del análisis de muestras de bio-oil crudo por ambas metodologías. Los

aldehídos no detectados se abreviaron como ND………………………………………………...125

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa…………………………..4

Figura 1.2 Procesos de conversión térmica, productos principales y sus aplicaciones……………...4

Figura 1.3 Efecto de la temperatura del reactor en el rendimiento de los productos obtenidos en el

bio-oil………………………………………………………………………………………………...6

Figura 1.4 Fracciones de compuestos de importancia en el bio-oil y su detección mediante técnicas

cromatográficas……………………………………………………………………………………..14

Figura 1.5 Ejemplo de un esquema de fraccionamiento por solvente del bio-oil………………….15

Figura 1.6 Ejemplo N°2 de un esquema propuesto para la caracterización del bio-oil……………15

Figura 1.7 Termograma de una fracción de acuosa de una muestra de bio-oil, Señales a, b, c y d

corresponden a compuestos polares volátiles, compuestos polares de mediana volatilidad,

compuestos polares de alto peso molecular y azúcares…………………………………………….18

Figura 1.8 Típico cromatograma de bio-oil obtenido por GC/MS/FID, y la caracterización de los

principales compuestos……………………………………………………………………………..21

Figura 3.1 Esquema de la planta piloto para la producción de bio-oil…………………………….28

Figura 3.2 Dispositivo empleado en la SPME……………………………………………………..34

Figura 3.3 Esquema propuesto en este trabajo de tesis para la determinación de grupos químicos en

las diferentes muestras de bio-oil…………………………………………………………………...39

Figura 4.1 Esquema de fraccionamiento de bio-oil J. (Fraccionamiento realizado en UDT)…….44

Figura 4.2 Esquema de fraccionamiento de bio-oil L. (Fraccionamiento realizado en UDT)……45

Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J obtenido por la detección por FID. Desde 0 a 25 minutos..46

Figura 4.4 Cromatograma de un amuestra de bio-oil crudo por GC/MS, en modo SCAN, utilizando

una columna RTx-5 de 105 metros de largo. Señales: (1) ácido fórmico e hidroxiacetaldehído; (2)

ácido acético y acetol y (3) levoglucosano. Compuestos de derivados de la lignina pirolítica entre 30

y 88 minutos………………………………………………………………………………………...51

Figura 4.5 Cromatograma de bio-oil por GC/MS, separación entre hidroxiacetaldehído (1) y ácido

fórmico (2)………………………………………………………………………………………….52

Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN desde los 6

minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 0 a 40 minutos…………………...53

Figura 4.7 Cromatogramas por GC/MS en modo SCAN de las muestras de bio-oil crudo L1 A);

fracción acuosa L2 (B) y fracción orgánica L2.1. Señales: (1) hidroxiacetaldehído, (2) ácido acético,

(3) acetol, (4) ácido propiónico, (5) levoglucosano y (6) fluoranteno (patrón interno)……………56

Figure 5.1 Levoglucosan (A) and cellobiosan (B) chemical structures…………………………...61

Figure 5.2 HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using acetonitrile/water 80/20 v/v as

mobile phase……………………………………………………………………………………….64

Figure 5.3 HPTLC plates of bio-oil 4 and their fractions using acetonitrile/water as mobile phase.

I: bio-oil 4; II: pyrolytic lignin III: n-butanol and aqueous phase. Standards: cellobiosan (C),

arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X)…………………………………………………..65

Figure 5.4 HPTLC plate of bio-oil samples, cellobiosan and glucose standards using butanol/formic

acid as mobile phase. Cellobiosan (C) and glucose (G). Track 1 and 4 cellobisan and glucose

standards. Track 2 bio-oil 2 whithout glucose. Track 3 bio-oil 2 with glucose added…………...66

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ix

Figure 5.5 Screening of different bio-oil samples for glucose detection. Cellobiosan (C), glucose

(G) and levoglucosan (L). Sample 1, 2 and 3 correspond to bio-oil 4, pyrolytic lignin and bio-oil

aqueous phase respectively………………………………………………………………………….66

Figure 5.6 HPTLC plate of sugar standards using butanol/formic acid as mobile phase. cellobiosan

(C), glucose (G), arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X)…………………………………67

Figure 5.7 Proposed scheme for the determination of principal sugars in bio-oil samples………..67

Figura 6.1 HPLC-UV de la mezcla de estándares de ácido fórmico (1), ácido acético (2) y ácido

propiónico (3) en concentración de 30 mg L-1

cada uno…………………………………………….77

Figura 6.2 HPLC-UV de una muestra de destilado de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido

acético; (3) ácido propiónico………………………………………………………………………..78

Figura 6.3 HPLC-UV del extracto orgánico (MTBE) de bio-oil pre-tratado por evaporación y

reconstitución con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1

). Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético;

(3) ácido propiónico………………………………………………………………………………...81

Figura 6.4 HPLC/UV del extracto acuoso de una muestra de extracto orgánico (MTBE) de bio-oil.

Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico………………………………..82

Figura 6.5 HPLC-UV del extracto acuoso de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético;

(3) ácido propiónico………………………………………………………………………………...83

Figura 6.6 HPLC-UV del extracto en fase sólida de una muestra de bio-oil crudo. Señales 1, 2 y 3

corresponden respectivamente a los ácidos fórmico, acético y propiónico respectivamente……...85

Figura 6.7 Cromatograma de la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil. Señales:

(1) ácido fórmico-TMS: (2) ácido acético-TMS; (3) ácido propiónico-TMS; (4) ácido isobutírico-

TMS (estándar interno 100 mg L-1

); (5) ácido glicólico-TMS y (6) ácido láctico-TMS; (7) 2,5-

anhidro-D-manitol-TMS (estándar interno 100 mg L-1

); (8) levoglucosano-TMS; (9) celobiosano-

TMS………………………………………………………………………………………………..93

Figura 7.1 Reacción del 2,4-DNPH con grupos carbonilos. R1 y R2 pueden corresponder a H,

grupos alquil o aril………………………………………………………………………………..101

Figura 7.2 Reacción de derivatización para formación de oximas, mediante la reacción de PFBHA

con grupo carbonilos……………………………………………………………………………...102

Figura 7.3 Esquema de las estrategias de derivatización posibles utilizando SPME. (Modificación

esquema propuesto por J. Pawliszyn)…………………………………………………………….103

Figura 7.4 Etapas de las constantes de distribución propuestas en las cuatro etapas de la

derivatización on-fiber……………………………………………………………………………104

Figura 7.5 Cromatograma por HPLC-UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de estándares de aldehídos

en condiciones óptimas. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-

DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH……………………………………………………………….108

Figura 7.6 Cromatograma HPLC/UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de aldehídos presentes en una

muestra de bio-oil crudo. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-

DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH……………………………………………………………….109

Figura 7.7 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la derivatización/extracción de

formaldehido en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS………………………………………....111

Figura 7.8 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la derivatización/extracción

del acetaldehído en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS………………………………………112

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica x

Figura 7.9 Cromatograma de una muestra de bio-oil por D-HS-GC/MS, en modo SCAN. Señales: 1

= formaldehído-PFBHA oxima; 2 = acetaldehído-PFBHA oxima; 3 = propionaldehído-PFBHA

oxima and 4 = valeraldehído-PFBHA oxima (estándar interno)…………………………………..113

Figura 7.10 Esquema propuesto de las etapas y fases involucradas en la extracción/derivatización

de aldehídos “on-fiber”……………………………………………………………………………114

Figura 7.11 Evaluación de los diferentes recubrimientos poliméricos a distintas temperaturas de

extracción. (A) 30 °C; (B) 40 °C y (C) 60°C……………………………………………………...115

Figura 7.12 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la determinación de

formaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS………………………………120


acetaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS………………………………..121


propionaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS…………………………....122

Figura 7.15 Cromatograma de aldehídos de bajo peso molecular por OFD-HS-SPME-GC/MS.

Señal: 1 = oxima formaldehído-PFBHA; 2 = oxima acetaldehído-PFBHA; 3 = oxima

propionaldehído-PFBHA y 4 = oxima valeraldehído-PFBHA (estándar interno)………………..123

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xi

RESUMEN

En la presente tesis se desarrollaron y evaluaron diferentes metodologías para la determinación de

diversos componentes en el bio-oil. Para ello se emplearon distintas técnicas cromatográficas, con

el objetivo de determinar ácidos orgánicos de cadena corta, compuestos volátiles, azúcares y

aldehídos en bio-oil y sus fracciones. La caracterización y determinación de estos analitos además

sirve de base para evaluar las condiciones óptimas de pirólisis de biomasa, para orientar el proceso

hacia la obtención de productos químicos de interés industrial.

Para la determinación de los aldehídos de bajo peso molecular, como formaldehído, acetaldehído y

propionaldehído, se evaluó su determinación por HPLC-UV, previa derivatización con 2,4-DNPH.

Las condiciones de esta derivatización pueden provocar reacciones no deseadas que afecten la

estabilidad del bio-oil y de sus principales componentes.

Por ello fue necesario desarrollar una metodología de mayor selectividad y en que la reacción de

derivatización no se realice en condiciones que afecten la cuantificación. Este procedimiento está

basado en la utilización de la microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (head

space), empleando la derivatización directamente en la fibra con PFBHA como agente

derivatizante. Posteriormente la separación/detección es realizada en un sistema GC/MS. Esta

metodología demostró ser sencilla y rápida. Además es posible su optimización, empleando

herramientas quimiométricas. Alternativamente se desarrolló un método basado en la derivatización

en la solución de la muestra, empleando el sistema de inyección en modo espacio de cabeza. Los

aldehídos determinados por ambas metodologías fueron: formaldehído (~ 2 %), acetaldehído (~ 0.1

%) y propionaldehído (~ 0.05 %).

Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con

exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección

directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por

destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no

es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene.

Los azúcares en bio-oil fueron determinados por HPTLC. Con esta técnica fue posible la

cuantificación de los principales azúcares en el bio-oil. Para ello fue necesaria la implementación de

un sistema de screening para descartar la presencia de glucosa en las muestras, ya que de estar

presente en altas concentraciones, podría interferir en la cuantificación del celobiosano. Esta

metodología puede aplicarse directamente a muestras de bio-oil crudo, fracciones de solventes

orgánicos y fracciones acuosas e incluso a muestras de lignina pirolítica. Los principales azúcares

que se determinaron fueron: levoglucosano (~ 1.5-3 %), celobiosano (~ 0.5-2.0 %), xilosa y

arabinosa. Estos últimos en la mayoría de las muestras, si es que se detectaban, se encontraban bajo

los límites de cuantificación del método.

Además se desarrolló una metodología sencilla basada en la derivatización de analitos con BSTFA.

Ello permite determinar ácidos orgánicos y azúcares, los cuales pueden ser derivatizados de forma

simultánea y cuantificados en un solo cromatograma, empleando un estándar interno para cada

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xii

grupo de compuestos. Los principales ácidos determinados mediante este método fueron ácido

fórmico (~ 0.5-2 %), acético (~ 1.5-3.0 %), propiónico (~ 0.1-0.8 %), láctico (~ 0.1-0.6 %) y

glicólico. A su vez, los principales azúcares determinados fueron levoglucosano (~ 1.5-2.8 %),

celobiosano (~0.2-1.5 %), xilosa (~ 0.05 %) y arabinosa (~ 0.05 %).

Dependiendo de la utilidad que tenga el bio-oil a nivel industrial, las metodologías desarrolladas

pueden ser aplicadas de forma individual o complementada con el método general de

caracterización de bio-oil mediante su inyección directa a GC/MS. De esta forma es posible contar

con diferentes alternativas para la cuantificación de los compuestos en el bio-oil.

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiii

ABSTRACT

In this thesis different methodologies to determine composition of bio-oil were evaluated. For these

purpose different chromatographic techniques, to determine short chain organic acids, volatile

components, sugars and aldehydes were used. The importance of the characterization and

determination of these analyte serve as basis to evaluate the optimal pyrolysis conditions of

biomass, to orient the process towards to obtain chemical products of industrial interest.

Low molecular weight aldehydes; formaldehydes, acetaldehyde and propionaldehyde was evaluated

by HPLC-UV, previous derivatization with 2,4-DNPH. Considering that the derivatization

conditions can produce undesired reactions which can affect the stability of bio-oil and its main

components, it was necessary to develop a more selective methodology under condition which do

not affect the quantification. This procedure is based on the use of solid phase microextraction in

the headspace mode, using direct derivatization on fiber with PFBHA as derivatization agent. The

separation/detection is done by GC/MS. This methodology has demonstrated to be simple and fast.

Additionally is possible its optimization by chemometric tools. Alternatively was developed a

method based on the derivatization in the sample solution, using injection in the head space mode.

The aldehydes determined by both methodologies were formaldehyde (~ 2 %), acetaldehyde (~ 0.1

%) and y propionaldehyde (~ 0.05 %).

It is possible to determine organic acids by direct injection (formic, acetic and propionic) in bio-oil

fractions obtained by distillation through high performance liquid chromatography in the reversed

phase mode in series with ion exclusion and direct detection at 210 nm. In this procedure it is not

necessary sample pre-treatment, however this methodology cannot be applied to crude bio-oil

samples, due to the interferences that it contains.

Sugars in bio-oil were determined by HPTLC. With this technique was possible the quantitative

analysis of the main sugars in bio-oil. For this purpose it was necessary to implement a screening

system to discard the presence of glucose in the samples, because its presence at high

concentrations, it can interfere in the determination of cellobiosan. This methodology can be

applied directly to crude bio-oil, organic and aqueous fractions, inclusively pyrolytic lignin. The

main sugars determined in bio-oil were levoglucosan (~ 1.5-3 %), ~ 0.5-2.0 %), xylose and

arabinose. The latter, if detected, were below the quantification limit of the method.

Additionally a simple methodology based on the derivatization of analyte with BSTFA, was

developed. This make possible the determination of organic acids and sugars, which can be

derivatized simultaneously and quantified together in one chromatogram using one internal standard

for each group of compounds. The main acids determined by this method were formic (~ 0.5-2 %),

acetic (~ 1.5-3.0 %), propionic (~ 0.1-0.8 %), lactic (~ 0.1-0.6 %) and glycolic acid. On the other

hand, the main sugars were levoglucosan (~ 1.5-2.8 %), cellobiosan (~0.2-1.5 %), xylose (~ 0.05 %)

and arabinose (~ 0.05 %).

Depending on the use that will be given to the bio-oil at industrial scale, the methodologies

proposed in this thesis can be applied separately or complimented with the general characterization

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiv

method of bio-oil by direct injection into GC/MS. By this way are amenable different ways to

quantify bio-oil components.

Capítulo 1

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 1

CAPITULO 1

INTRODUCCIÓN

1.1 Introducción General

Se espera que en los próximos años el mundo se vea enfrentado con una seria realidad asociada al

futuro energético. El carbón, el petróleo, y el gas natural seguirán siendo indispensables para

satisfacer el crecimiento de demanda energética total esperada. Si bien el mundo no se está

quedando sin recursos energéticos, si se acumulan riesgos relacionados con la expansión continua

de la producción de petróleo y gas natural. Estos riesgos plantean desafíos significativos para poder

satisfacer la demanda energética esperada1.

Para reducir estos riesgos, se requerirá la expansión de todas las fuentes de energía económicas,

incluyendo el carbón, la energía nuclear, la biomasa, entre otras energías renovables, el petróleo y el

gas natural. Cada una de estas fuentes se enfrenta con desafíos importantes, que incluyen la

seguridad y la existencia de barreras ambientales, políticas o económicas, y requiere de

infraestructura para su desarrollo y distribución1. Bajo éste escenario se impulsa fuertemente el

desarrollo de fuentes alternativas renovables de energía.

Entre las fuentes alternativas renovables de energía, la biomasa es una alternativa atractiva ya que

permite obtener un combustible a partir de recursos biológicos y su utilización no produce impactos

significativos en el medio ambiente. La biomasa, a diferencia de la energía eólica y solar, es

relativamente fácil de almacenar pero en contrapartida, opera con enormes volúmenes de

combustibles que hacen su transporte oneroso y constituyen un argumento a favor de una utilización

local. En la actualidad las formas de utilización más difundidas de la biomasa como fuente de

energía son la combustión de residuos agrícolas y los procedentes de la industria maderera2.

1.2 Tipos y utilización de biomasa como fuente de energía

La biomasa, abreviatura de masa biológica, es un término genérico que hace referencia a la cantidad

de materia viva producida por plantas, animales, hongos o bacterias, en un área determinada. Se

suele utilizar para hacer referencia al combustible energético que se obtiene directa o

indirectamente de estos recursos biológicos. Hay otra característica que diferencia a la biomasa de

otros recursos energéticos, y es el hecho de que es un recurso potencialmente renovable. El carbón,

el gas, el petróleo y otros combustibles fósiles, no se consideran biomasa, aunque deriven de

material vivo. El tiempo necesario para la formación de estos combustibles hacen que no puedan ser

considerados como renovables3.

La biomasa como fuente para la producción de energía renovable puede clasificarse en:

a) Biomasa natural: Se produce de forma espontánea en la naturaleza, sin intervención

humana. Por ejemplo, las podas naturales de los bosques.

b) Biomasa residual seca: Procede de recursos generados en las actividades agrícolas,

forestales. También se produce este tipo de biomasa en procesos de la industria

agroalimentaria y de la industria de transformación de la madera. Dentro de este tipo de

biomasa, se puede diferenciar la de origen forestal y la de origen agrícola.

Capítulo 1


c) Biomasa residual húmeda: Procede de vertidos biodegradables formados por aguas

residuales urbanas e industriales y también de los residuos ganaderos.

d) Cultivos energéticos tanto forestales como agrícolas: Son aquellos cultivos realizados

tanto en terrenos agrícolas como forestales y que están dedicados a la producción de

biomasa con fines no alimentarios4.

Para el uso de la biomasa en general, es necesario un tratamiento de ésta, principalmente se utiliza

la conversión térmica.

1.3 Conversiones térmicas de biomasa

Hay tres procesos térmicos principales para la conversión de biomasa en energía útil. Estas son

pirólisis, gasificación y combustión. La combustión está ampliamente descrita y actualmente se

realizan estudios para disminuir el impacto ambiental que produce. De la combustión, el producto

primario que se genera es calor, para su uso en calderas, generando a través de ellas dos productos

para el mercado: calor y electricidad. La gasificación y pirólisis se detallan a continuación.

1.3.1 Gasificación de biomasa

En la gasificación el producto primario generado es gas combustible. El proceso de gasificación se

compone de dos etapas encadenadas. La primera consta de un secado de la biomasa (relativamente

rápido). La segunda etapa corresponde a una pirólisis (300-500°C). Estos procesos se pueden llevar

de distintas formas5:

1) La oxidación parcial con aire, de la cual los mayores productos generados son CO, CO2, H2,

CH4, N2 y alquitrán. Este proceso genera un poder calorífico aproximado de 5 MJm-3

.

2) La oxidación parcial con oxígeno donde los mayores productos generados son CO, CO2,

H2, CH4 y alquitrán. El poder calorífico de los gases generados es entre 10-12 MJm-3

;

3) Vapor (pirolítico): este proceso tiene dos etapas. El reactor principal produce gas y carbón.

La arena y el carbón pasan a un segundo reactor donde el carbón se quema con aire para

calentar la arena, que luego se vuelve a distribuir al primer reactor para proporcionar el

calor para la reacción. El gas calorífico se maximiza debido a un alto contenido de metano

y de hidrocarburos del gas, pero a expensas de una menor eficiencia global debido a la

pérdida de carbono en el segundo reactor. Los principales productos generados son CO,

CO2, H2, CH4 y alquitrán. El poder calorífico es entre 15-20 MJm-3

.

4) Gasificación por presión. Este proceso tiene un costo de capital y operación más alto que

los anteriores. Esto se debe a que trabaja a bajas presiones entre 15-50 bar.

5) Método con oxigenación. Este proceso es usado en conjunto con el de presión De esta

forma se obtienen mayores temperaturas de reacción y por tanto menores niveles de

alquitrán. Esta tecnología tiene un mayor costo asociado al uso de oxigeno5.

Capítulo 1


En general, el proceso de gasificación debe incluir una etapa de limpieza de los gases formados. La

contaminación puede provenir del alquitrán, material particulado, algunos metales, entre otros

formados en el proceso o impurezas de la biomasa.

1.3.2 Pirólisis de biomasa

La pirólisis es la descomposición térmica de la biomasa, proceso que ocurre en ausencia de oxígeno

y con temperaturas entre 300 a 500 °C. Los principales productos obtenidos son gases, carbón y

líquido. Estos productos varían dependiendo en gran medida de la temperatura de pirólisis y el

tiempo de residencia de la biomasa en el reactor6.

La pirólisis también es la etapa principal de los otros procesos térmicos descritos. Sin embargo, la

diferencia radica en que tanto la gasificación como la combustión son seguidas por una oxidación

parcial o total de los productos primarios. En la pirólisis, bajas temperaturas y alto tiempo de

residencia de la biomasa en el reactor beneficiaran la producción de carbón. A diferencia, altas

temperaturas y alto tiempo de residencia favorecerán la obtención de gas, y altas temperaturas y

corto tiempo de residencia en el reactor favorecerá la obtención de líquidos. En la Tabla 1.1 se

muestran los diferentes productos y rendimientos, de acuerdo al modo de pirólisis utilizado.

Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis6.

Modo Condición Liquido

%

Carbón

%

Gas

%

Rápida Temperatura alrededor 500°C, vapor caliente en

residencia por 1 segundo. 75 12 13

Intermedia Temperatura alrededor de 500°C, vapor caliente en

residencia por 10-20 segundos 50 20 30

Lenta Temperatura alrededor de 400°C, alto tiempo de

residencia 30 35 35

Gasificación Temperatura de 800°C, alto tiempo de residencia 5 10 85

El principal uso de esta pirólisis de biomasa es la obtención de un líquido, lo que tiene una gran

ventaja, ya que puede ser almacenado y transportado con mayor facilidad y a un costo menor que la

biomasa sólida debido a su menor volumen. Para favorecer el mayor rendimiento en el producto

líquido, la pirólisis se debe realizar con temperaturas moderadas y corto tiempo de residencia de la

biomasa, proceso llamado “Fast Pirolisis” o pirólisis rápida (Tabla 1.1)

En la pirólisis rápida, los procesos de transferencia de calor, cinética de reacción de los productos

químicos y la transferencia de masas, juegan un papel importante, pues en la pirólisis, la biomasa se

descompone en varios gases, aerosoles y carbón. Después del enfriamiento y condensación, se

forma un líquido oscuro de color café que tiene un poder calorífico menor que el combustible

convencional. Este líquido proveniente de biomasa forestal recibe el nombre de “bio-oil” o también

llamado líquido de pirólisis. En la Figura 1.1 se muestra un diagrama general del proceso de

pirolisis rápida y la obtención de bio-oil7.

Capítulo 1


Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa7.

Considerando que el producto principal de la pirólisis rápida de biomasa forestal es el bio-oil, es

necesario incluir un secado, de tal forma que la biomasa tenga menos de un 10 % de humedad con

el fin de minimizar el contenido de agua en el bio-oil. También es necesario que el material

utilizado tenga un tamaño de partícula pequeño (< 3 mm). De esta forma se puede asegurar una

reacción rápida. En la Figura 1.2 se muestran los principales procesos de conversión térmica y sus

productos con las aplicaciones respectivas. Este trabajo se acotará a la matriz de estudio bio-oil.

Figura 1.2 Procesos de conversión térmica, productos principales y sus aplicaciones7.

El bio-oil se obtiene por despolimerización y fragmentación rápida y simultánea de celulosa,

hemicelulosa y lignina, principales componentes de la madera. Al proseguir con un enfriamiento

rápido, se evita la degradación de los compuestos formados. Sin embargo, se produce degradación

de celulosa a las temperaturas entre (240-350 °C), generando anhidrocelulosa y levoglucosano. La

pirólisis de la celulosa además produce grupos carbonilos (aldehídos), ácidos orgánicos y furanos.

Capítulo 1


También se produce la degradación de hemicelulosa, entre 200-260 °C, generando principalmente

algunos ácidos, furanos, lactonas y algunos aldehídos. Por último, la descomposición de lignina

puede ocurrir en un amplio rango de temperatura (entre 280-500°C), produciendo un alto contenido

de grupos fenólicos y lignina pirolítica.

1.4 Propiedades físico-químicas del bio-oil

El bio-oil es un líquido oscuro de color café, el cual contiene una composición elemental

aproximada a la biomasa. Este líquido presenta una compleja composición de especies oxigenadas e

hidrocarburos, con una proporción no despreciable de agua. Los subproductos obtenidos del bio-oil,

como agua, gas, carbón y productos orgánicos dependerán en gran medida de la temperatura del

reactor. En la Tabla 1.2, se muestran algunas características del bio-oil. Las temperaturas de

pirólisis afectan el rendimiento de los productos. Es así que optimizando el proceso de pirólisis se

puede obtener un mayor rendimiento en bio-oil. En la Figura 1.3 se muestra un gráfico con los

rendimientos de estos productos, a diferentes temperaturas.

Tabla 1.2 Propiedades típicas y características del bio-oil obtenido de biomasa forestal.

Apariencia

Líquido oscuro, de color café. Dependiendo de la materia prima inicial y el

modo de pirólisis rápida, el color puede ser casi negro. Un alto contenido de

nitrógeno en el líquido puede dar un tinte de color verde oscuro.

Olor

El líquido tiene un olor particular a humo acre que puede irritar los

ojos si se expone durante un período prolongado. La causa de este olor es

debido a los aldehídos de bajo peso molecular y ácidos.

Miscibilidad

El líquido contiene cantidades variables de agua, que van desde un 15 % en

peso a un máximo de alrededor de 30 a 50 %. Este líquido puede tolerar la

adición de un poco de agua, antes que comience a separarse en dos fases. Es

miscible con solventes polares, tales como metanol y acetona.

Envejecimiento

La complejidad y la naturaleza del bio-oil, provoca un comportamiento

inusual en algunas propiedades. Estas tienden a cambiar con el tiempo,

aumentando la viscosidad, disminuyendo la volatilidad y produciéndose una

separación de fases.

Modificado de: A. Bridgwater, Bio-Energy Research Group, Aston University, 2004

Capítulo 1


Figura 1.3 Efecto de la temperatura del reactor en el rendimiento de los productos obtenidos en el

bio-oil7.

El bio-oil posee capacidad calorífica (alrededor de 16 – 17 MJ Kg-1

), y una gran variedad de

compuestos que pueden potencialmente poseer una gran utilidad. En la Tabla 1.3 se muestran las

principales características físicas del bio-oil.

Tabla 1.3 Algunas Propiedades físicas del bio-oil8.

Parámetros Valor típico Rango

Valor calórico 17 MJ/Kg 15-19 MJ/Kg

Punto de inflamación 55 ºC 51-58 ºC

Densidad 1.18 Kg/L 1.16-1.22 Kg/L

Acidez pH 2.5 pH 2.1-3.4

Humedad 22 % en peso 14-31 % en peso

Viscosidad (40ºC) 45 cp 35-55 cp

Solubilidad

Hexano 0.1 % --

Tolueno 16 % --

Acetona/ácido acético 99.86 % --

El bio-oil puede ser obtenido de diferentes materias primas. Entre ellas está la madera de pino. En

la Tabla 1.4 se presentan algunos de los principales compuestos químicos presentes en bio-oil

obtenido de madera de pino, realizado por la empresa “Dynamotive”.

Capítulo 1


Tabla 1.4 Principales compuestos presentes en el bio-oil9.

Compuestos Porcentaje en peso

Lignina 24.7

Hidroxiacetaldehído 9.4

Levoglucosano 7.3

Acetol 6.6

Ácido fórmico 4.6

Ácido acético 4.5

Formaldehído 3.4

Celobiosano 2.3

Glioxal 2.3

Considerando la variabilidad de compuestos, el bio-oil puede presentar diferentes reacciones

químicas, las cuales son catalizadas por el medio ácido en que se encuentra el bio-oil. A

continuación, se explican las principales reacciones químicas que pueden tener lugar.

1.5 Reactividad del bio-oil

La composición del bio-oil varía dependiendo de los siguientes parámetros10

.

- Nitrógeno orgánico y proteínas presentes en la biomasa.

- Parámetros del proceso de pirólisis como: temperatura de pirólisis, tasa de

transferencia de calor, tiempo y temperatura de los vapores en el reactor, eficiencia

de los equipos de condensación, entre otros.

- Contenido de agua del bio-oil

- La exposición al aire del bio-oil durante el almacenamiento

- El tiempo de almacenamiento

- Temperatura de almacenamiento

- El grado de contaminación que podría suceder durante el almacenamiento.

Estas condiciones determinarán los compuestos del bio-oil, en especial los de carácter orgánico. A

continuación se detalla brevemente la composición orgánica e inorgánica del bio-oil, junto con las

posibles reacciones implicadas.

1.5.1 Compuestos inorgánicos en el bio-oil

El contenido inorgánico o mineral del bio-oil, puede estar asociado en diferentes formas,

encontrándose principalmente en solución acuosa en formas de iones (fosfatos, oxalatos, carbonatos

etc.). Estas especies son de importancia en el bio-oil, ya que están involucradas principalmente en el

proceso de envejecimiento. Estas especies pueden catalizar las reacciones de polimerización durante

el almacenamiento, aumentando la viscosidad y el crecimiento del tamaño de partícula del carbón

presente en el bio-oil. En general, la presencia de compuestos inorgánicos puede afectar las

propiedades de combustión de cualquier bio-oil. Aunque hay una gran variabilidad de estas

especies, generalmente es posible encontrar en el orden de los ppm las siguientes especies: calcio,

silicio, potasio, hierro, aluminio, níquel, cromo, zinc, entre otros10

.

Capítulo 1


Afortunadamente las especies inorgánicas pueden ser disminuidas, modificando el proceso de

pirólisis.

1.5.2 Compuestos orgánicos en el bio-oil

La pirólisis involucra sólo una descomposición parcial de la biomasa, lo que implica, que gran parte

del contenido dependerá del tipo de biomasa utilizada. Por ejemplo, es posible esperar que el bio-oil

producido con alfalfa, la cual contiene niveles mayores de proteínas, se presente mayor contenido

de nitrógeno orgánico, en comparación con la madera. El nitrógeno orgánico puede causar

condiciones adversas por la presencia de NOx en la combustión y en las propiedades de

envejecimiento del bio-oil10

.

Otro componente importante es la lignina, de la cual sus principales derivados son los componentes

fenólicos. Además de la celulosa y la hemicelulosa, el bio-oil contiene más de 400 compuestos

orgánicos entre ácidos, alcoholes, aldehídos, ésteres, cetonas, azúcares, fenoles, guaiacoles,

siringoles, furanos y compuestos multifuncionales, como el ácido hidroxiacético,

hidroxiacetaldehído, hidroxicetona, y 3-hidroxi- 3-metoxi-benzaldehído10

.

Estos compuestos pueden generar diferentes tipos de reacciones químicas. Según literatura, las

posibles reacciones que pueden ocurrir en el bio-oil son las siguientes10

:

a) Esterificación: Reacción producida entres ácidos orgánicos y alcoholes, para la formación

de ésteres y agua. Esta reacción es catalizada en medio ácido, el pH del bio-oil está

comunmente entre 2 y 3. También es posible que los ácidos orgánicos reaccionen con

olefinas para formar iso-esteres, sin el agua como subproducto.

Reacción de esterificación.

b) Homopolimerización: Reacción entre aldehídos para generar polímeros oligómeros y

poliacetal.

c) Hidratación: La reacción ocurre entre aldehídos y agua es rápida. En el caso del bio-oil, el

cual contiene cerca de 25 % de agua y alrededor de un 3% de formaldehido, el 99 % de la

masa de formaldehído se encuentran en forma de hidratos. Si el porcentaje de acetaldehído

es de 3 % el 24 % en peso de este aldehído se encontrará como hidrato. La acetona, en

similares porcentaje se encontraría sólo un 0.04% (en peso) en su forma de hidrato.

Ejemplo de hidratación donde R’ corresponde a un hidrogeno o un grupo alquil.

Capítulo 1


d) Formación de hemiacetal: La reacción entre un aldehído y un alcohol para la formación de

hemiacetales, puede suceder en forma rápida y sin la presencia de un catalizador. El

formaldehido, puede reaccionar con grupos fenólicos para formar fenil-hemiformal, aunque

mayoritariamente forme metil-hemiformal.

e) Acetilación: En presencia de una catálisis ácida, aldehídos y alcoholes pueden formar

acetales estables. Debido a que la formación de acetales es reversible, pueden ocurrir

reacciones de transacetlilación.

f) Otras posibles reacciones son: fenol/formaldehido para la formulación de resinas;

polimerización de furanos; dimerización de compuestos orgánicos nitrogenados; oxidación,

hidrogenación, entre otras.

Reacción fenol/formaldehído.

Dimerización de compuestos orgánicos nitrogenados.

Es importante el conocimiento de las posibles reacciones que pueden ocurrir en la matriz de estudio.

Esto afectará a las metodologías que se implementarán y/o desarrollarán para la determinación de

componentes de interés en el bio-oil

1.6 Productos de interés nacional del bio-oil

Como ya se ha mencionado, además de su uso como combustible para la producción de energía y

calor, el bio-oil puede servir de base para la fabricación de una amplia gama de productos químicos

orgánicos.

a) Bio-oil como combustible: El uso comercial en el cual se puede utilizar bio-oil es en la

generación de energía y calor, sea en hornos, calderas, turbinas a gas entre otros9.

b) Bio-oil como fuente de productos químicos: Se puede obtener una amplia gama de

productos químicos a partir del bio-oil, ofreciendo un valor agregado más alto en

comparación con su uso como combustible. Los productos químicos pueden ser separados,

extraídos y procesados. Es necesario que los productos químicos presentes se encuentren en

Capítulo 1


una alta proporción para que el proceso sea económicamente viable. En el bio-oil obtenido

de madera los productos que se encuentran en mayor proporción son: hidroxiacetaldehído,

ácido acético, ácido fórmico, levoglucosano y levoglucosenona. Los principales usos están

destinados a lubricantes, fertilizantes, industria farmacéutica, aditivos en alimentos y como

antioxidantes9.

Lignina pirolítica y fenoles polisubtituidos

En presencia de agua el bio-oil se separa en una fase acuosa y una fase orgánica más densa. La fase

orgánica contiene lignina pirolítica y la mayor parte de los fenoles polisubtituidos. La aplicación

más promisoria de la fracción fenólica es en la formulación de resinas fenol-formaldehído11

.

Propuesta de la estructura de lignina

Si bien no es posible definir una estructura de la lignina, si se han propuesto diferentes modelos que

la pueden definir.

http://wapedia.mobi/es/Archivo:Lignin_structure.svg

Capítulo 1


Hidroxiacetaldehído

Uno de los compuestos más abundantes en el bio-oil de madera de pino es el hidroxiacetaldehído

(9-12%), producto de las reacciones de fragmentación de celulosa y hemicelulosa. Su química es

similar a la del glioxal y formaldehído.

HO

O

O

O OH

HO Glicolaldehído (dímero) Hidroxiacetaldehído

El hidroxiacetaldehído es el componente más reactivo del humo líquido y su acción bronceadora es

aproximadamente 2000 veces superior a la de la glucosa. Otras aplicaciones son la reducción de la

reversión de la blancura inducida térmicamente o por la luz en pulpas que contienen ligninas12

y la

eliminación de H2S utilizando emulsiones agua aceite13

. La oxidación selectiva del

hidroxiacetladehído permite obtener ácido glicólico14

, materia prima para polímeros PGA (ácido

poliglicólico) con propiedades de barrera de gases, de alto interés en la industria de envases para

alimentos y bebidas.

Levoglucosano y Celobiosano

El levoglucosano (1,5 anhidro β-D-glucopiranosa) y el celobiosano (1,6-anhidro-β-celobiosa) son

productos de la depolimerización de la celulosa. El levoglucosano en el bio-oil alcanza

concentraciones de 3 a 6%. Se produce debido a la fragmentación de la celulosa y a la formación de

hidroxiacetaldehído. Este compuesto tiene aplicaciones en la industria farmacéutica, en la

producción de polímeros y resinas especiales, surfactantes glucósidicos y poliglucosas no

hidrolizables. Otra aplicación que requiere anhidroazúcares puros y para la cual existe actualmente

un mercado, es la metabolización por microorganismos para la producción de ácidos carboxílicos o

etanol15

.

Levoglucosano Celobiosano

También estos anhidroazúcares pueden ser convertidos en azúcares por hidrólisis ácida. Algunos

trabajos han demostrado que al agregar ácido sulfúrico al líquido de pirólisis, se forma una alta

cantidad de glucosa, dependiendo del nivel de levoglucosano presente16

.

Capítulo 1


Ácidos carboxílicos de cadena corta (C1-C3)

La fracción de ácidos carboxílicos de cadena corta en el bio-oil es de 6 a 10%, principalmente

ácido acético, fórmico y propiónico. El ácido acético es un importante commodity con una

producción mundial sobre las 8 millones t/año, de origen fundamentalmente no renovable (etano).

La producción de ácido acético se ha incrementado por la creciente demanda de sus derivados

como el acetato de vinilo. Como los ácidos hacen ser corrosivo al bio-oil, su separación mejora las

características de los combustibles, elevando su atractivo comercial.

H O

OH

CH3

O

OH

H3C

O

OH

Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiónico

1.7 Analítica del bio-oil

Por la importancia que presenta el bio-oil, se han reportado diferentes metodologías aplicadas a su

caracterización y la posible cuantificación de los compuestos presentes en éste. Cabe destacar que

es de gran importancia el desarrollo de metodologías analíticas, validadas y eficaces, para la

producción de los compuestos de interés en el bio-oil.

Dependiendo del uso que se le de al bio-oil, es necesario determinar las propiedades de este líquido

ya que tanto sus propiedades físicas como químicas juegan un rol importante. En esta sección se

describen brevemente los métodos para la caracterización física del bio-oil y las metodologías tanto

químicas como instrumentales en la determinación de sus componentes.

1.7.1 Parámetros físicos del bio-oil

La utilización de bio-oil como combustible requiere de características especiales. Las principales

propiedades físicas que deben ser evaluadas son contenido de agua, sólidos, silicio, homogeneidad,

estabilidad y punto de inflamación. Estos test se encuentran descritos por la American Society for

Testing and Materials (ASTM) 17

.

a) Contenido de agua: Se recomienda realizar la determinación de agua por el método Karl

Fischer (ASTM E-203). En este método, se pesa alrededor de 0.2 gramos de muestra, se

agrega cloroformo/metanol 1/3 v/v, y el agua es titulada con 2-metoxi etanol18, 19

.

b) Sólidos y otros compuestos: Es recomendado determinar los sólidos, como material

insoluble de la solución metanol/diclorometano 1/1 v/v. Posteriormente se filtra (1 µm de

tamaño de poro). Silicio y otros metales pueden ser analizados a partir de cenizas, ya sea

por XRF (espectrometría de fluorescencia de rayos X) o por ICP 17,19

.

Capítulo 1


c) Homogeneidad: El alto contenido de agua causa un efecto negativo en la homogeneidad del

bio-oil. Es posible realizar determinaciones microscópicas para la información sobre la

separación de fases, sólidos, compuestos inorgánicos etc. Además es recomendable dejar el

bio-oil por 7 días en reposo y determinar en distintos niveles el contenido de agua por el

método de Karl Fischer17, 19

.

d) Estabilidad: Es posible determinar la estabilidad por el cambio de viscosidad del bio-oil.

Esto debido a los cambios químicos que ocurren durante el almacenamiento, aumentando

los compuestos insolubles en agua por el aumento del peso molecular de las especies

presentes, lo que se traduce en un aumento de la viscosidad. La prueba de envejecimiento

acelerado es de utilidad en esta determinación. Para ello la muestra debe estar por 24 horas

a 80 °C. Posteriormente se determina la viscosidad a 40 °C. La viscosidad es determinada

según el método ASTM D-44517,19

.

e) Punto de inflamación: El método de prueba se realiza bajo el procedimiento ASTM D-93.

El principal inconveniente es que la temperatura de inflamación es entre 70-100 °C. Siendo

poco aplicable al bio-oil, por la evaporación del agua17, 19

.

f) Densidad: En el bio-oil ésta se correlaciona con la concentración de agua presente. La

determinación es sencilla, utilizando un densímetro según la norma ASTM D-405217,19

.

1.7.2 Análisis del bio-oil por método químicos

Los aldehídos y las cetonas participan de las reacciones de envejecimiento durante el

almacenamiento del bio-oil. Por lo tanto, se ha sugerido utilizar el contenido del grupo carbonilo

como un indicador de estabilidad.

La determinación del grupo carbonilo se basa en la reacción cuantitativa de clorhidrato de

hidroxilamina con aldehídos y cetonas en presencia de piridina. La función de la piridina en el

sistema de reacción es la permanencia de la formación de la oxima. El ácido liberado en forma de

clorhidrato de piridina se determina por titulación y es una medida directa de la concentración de

grupos carbonilo originalmente presentes en la muestra. Por lo general, el contenido de carbonilos

de un bio-oil fresco está en el rango de 4-6 carbonilo mol/kg de líquido17

.

En el caso de los ácidos orgánicos, se utiliza como determinación rápida la acidez total mediante

titulación volumétrica ácido/base con indicador, considerando que el bio-oil tiene un pH entre 2 y 3

debido fundamentalmente a los ácidos carboxílicos (fórmico, acético y propiónico) presentes en

bio-oil. Los resultados se expresan como mg de KOH equivalentes por gramos de muestra. Esta

metodología está estandarizada en la norma ASTM D-924. Sin embargo, el bio-oil al ser un líquido

oscuro, las valoraciones volumétricas presentan la desventaja en la visualización del punto final de

la reacción18

. En algunos casos para mejorar esta determinación se ha empleado la titulación

potenciométrica.

Capítulo 1


1.7.3 Análisis del bio-oil por métodos instrumentales

La caracterización completa del bio-oil es poco factible. El bio-oil contiene especies de alto peso

molecular, incluyendo productos de degradación como pentosas, hexosas, y lignina. Sólo una

fracción de los componentes del bio-oil puede ser analizado a través de GC, utilizando programas

de alta temperatura. Además, el bio-oil contiene componentes polares, que sólo pueden ser

analizados sin pre-tratamientos por HPLC o por GPC20

. En la Figura 1.4 se muestra un gráfico con

las fracciones del bio-oil, junto con su posible detección y cuantificación por cromatografía líquida

y de gases.

Figura 1.4 Fracciones de compuestos de importancia en el bio-oil y su detección mediante técnicas

cromatográficas14

.

Los componentes volátiles y no volátiles del bio-oil pueden ser analizados por GC/MS y HPLC

respectivamente. FT-IR sirve para detectar grupos funcionales de interés, GPC para la distribución

de peso molecular y RMN para la determinación de tipos de hidrógeno o carbonos en grupos

estructurales específicos.

La alta complejidad del análisis del bio-oil por estas técnicas se debe especialmente a los grupos

fenólicos complejos (pesos moleculares hasta 500 amu), que provienen de la descomposición de la

lignina. En estos fragmentos oligoméricos existen diferentes concentraciones variables de ácidos

fenólicos, ácidos carboxílicos y grupos hidroxilo, así como presencia de aldehídos, alcoholes, y

funciones éter. También hay una diversidad de enlaces puentes de hidrógeno que pueden formar

miscelas, geles, etc. Una consecuencia de esto es por ejemplo que el análisis por GPC puede

sobreestimar el peso molecular debido a estas interacciones.

El análisis por HPLC puede ser afectado por la combinación de compuestos con diferentes

polaridades y diferencias en el peso molecular. Estas diferencias pueden producir el solapamiento

de las señales, afectando la caracterización y la cuantificación de las especies.

En la caracterización del bio-oil se han propuesto diferentes técnicas, en las cuales es necesaria la

extracción de los distintos componentes, basándose en criterios de solubilidad. De acuerdo a esto, se

separan las muestras en fracciones, las cuales son analizadas por las diferentes técnicas. En las

Figuras 1.5 y 1.6 se muestran diferentes esquemas de fraccionamiento propuestos en literatura para

la caracterización de compuestos en muestras de bio-oil21, 22

. No obstante, hay autores que previo al

fraccionamiento realizan un análisis completo del bio-oil. Las principales técnicas que se utilizan

Capítulo 1


son FT-IR, RMN, GPC, DTG, GC-MS y HPLC. Además se ha utilizado un tratamiento de

pirolización (Py) de la muestra, acoplado a un GC/MS.

Figura 1.5 Ejemplo de un esquema de fraccionamiento por solvente del bio-oil21

.

Figura 1.6 Ejemplo N°2 de un esquema propuesto para la caracterización del bio-oil22

.

1.7.3.1 Caracterización por FT-IR y 1H NMR

El análisis por FT-IR se ha aplicado en gran medida a la caracterización de la lignina pirolítica

obtenida por el tratamiento del bio-oil. En este análisis es posible la caracterización de los grupos

carbonilos, éster y aromáticos, entre otros. No obstante, no muestra una mayor aplicación a la

caracterización del bio-oil por presentar una gran mezcla de compuestos con diferentes propiedades

físico-químicas23

, lo que dificulta su utilización, limitándola al uso de fracciones del bio-oil22, 24-28

.

Bayerbach et. al28

determinan grupos carbonilos y grupos OH en la fracción acuosa de bio-oil. Los

Capítulo 1


grupos OH se determinan como contenido total de fenoles y alifáticos, además de utilizar una

relación entre OHfen/OHalif.

Uno de los usos del FT-IR es en la caracterización de la lignina pirolítica. Esta es secada y

mezclada con KBr. De esta forma se obtienen las principales señales en la región 1750 cm-1

a 1000

cm-1

.

Las bandas características encontradas son31

:

1701-1734: C=O, correspondiente a cetonas, carbonilos y grupos éster

1652-1666: C=O (strech), correspondiente a sistema conjugado aril-cetonas.

1593-1609: C=O (vibracional) correspondiente a grupos aromáticos.

1510-1515: anillo aromático (vibracional)

1443-1463: C-H, correspondiente a grupos –CH3, -CH2-

1422-1431: C-H, correspondiente a grupos aromáticos

1214-1233: C-C, C-O

Al igual que FT-IR, la aplicabilidad de la técnica RMN sólo es posible al utilizar un

fraccionamiento del bio-oil. La utilización que ha presentado es a la caracterización de los grupos

aromáticos y alifáticos26, 27

. Si bien las principales aplicaciones de la resonancia magnética nuclear

son la identificación y confirmación de estructuras, también es posible realizar determinaciones

cuantitativas, ya que muestra señales que son directamente proporcionales al número de núcleos en

que originan24

. Sin embargo, mientras más compleja sea la muestra, hay una mayor probabilidad de

solapar algunas señales.

Los principales grupos que se caracterizan y cuantifican por NMR, en este caso de protones son

compuestos aromáticos, fenólicos y alifáticos. Bayerbaceth28

determinó OH totales en diferentes

tipos de bio-oil, obtenidos de madera de haya, Pícea y bambú. Esta técnica junto con FT-IR puede

ser utilizada como apoyo para el conocimiento de algunos grupos funcionales en el bio-oil.

1.7.3.2 Análisis por cromatografía de permeación por gel

La cromatografía de permeación en gel (GPC) separa moléculas en virtud de sus diferencias de

tamaño molecular. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número

de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros

unidas entre si, por enlaces químicos para formar una red tridimensional.

Bajo ciertas condiciones es posible la separación de oligómeros y especies poliméricas. Esto

dependerá del tamaño de poro de la fase estacionaria utilizada y el límite de exclusión que ésta

presente. La principal ventaja que presenta es la determinación rápida de distribución de pesos

moleculares en polímeros, lo cual puede favorecer la determinación de pesos en la fracción que

contiene lignina. También permite determinar azúcares. Las mayores desventajas es que no es

aplicable a muestras de componentes de tamaño molecular similar, ya que se necesita por lo menos

Capítulo 1


una diferencia del 10 % entre los pesos moleculares y que las especies poliméricas del bio-oil no

tienen un peso molecular único, sino que determinados intervalos.

La aplicación habitual de esta técnica en muestras de bio-oil es la determinación de la masa

molecular media. Para ello se utiliza THF como disolvente (muestras en un 10 % en peso),

columnas de HP PL gel 10.000, 500 y 50 Å en serie17

.

1.7.3.3 Análisis por termogravimetría derivada

El análisis termogravimétrico es una técnica en la que la masa de la muestra es registrada en

función del tiempo o de la temperatura cuando la temperatura de la muestra sigue cierto programa,

en una atmósfera específica. Estos análisis se basan en la medida de la relación entre la temperatura

y alguna propiedad de un sistema, como la masa o el calor de reacción. Los métodos térmicos más

utilizados son tres Análisis termogravimétrico (ATG), análisis térmico diferencial (ATD) y

calorimetría diferencial de barrido (DSC).

En el ATG se registran cambios de peso de las sustancias y en los otros dos (ATD y DSC) se

registran cambios de energía. En termogravimetría puede obtenerse también la derivada del peso

respecto al tiempo, dando lugar a la técnica denominada DTG. Se han descrito diversas técnicas

múltiples que combinan varios métodos térmicos o bien un método térmico y un método de

detección de gases.

En el análisis termogravimétrico se registra de forma continua la masa de una muestra a medida que

aumenta su temperatura en forma lineal, desde la temperatura ambiente hasta temperaturas del

orden de 1200 °C. La gráfica de la masa en función de la temperatura se denomina termograma y

proporciona información cualitativa y cuantitativa de las muestras30

.

Esta técnica encuentra su mayor aplicabilidad en la determinación de especies poliméricas, ya que

pueden mostrar la información de la descomposición de las diversas preparaciones poliméricas. Al

utilizar la derivada, esta proporciona una mayor información que no es detectable en un termograma

común. La mayor desventaja de este método es la limitación de compuestos detectables, ya que el

cambio de temperatura debe causar un cambio en la masa del analito, evitando la descomposición,

vaporización, oxidación u otro cambio físico-químico que afecte al analito. En la Figura 1.7 se

presenta un ejemplo de termograma correspondiente a una fracción acuosa de una muestra de bio-

oil.

Capítulo 1


Figura 1.7 Termograma de una fracción de acuosa de una muestra de bio-oil, Señales a, b, c y d

corresponden a compuestos polares volátiles, compuestos polares de mediana volatilidad,

compuestos polares de alto peso molecular y azúcares32

.

Las principales familias de compuestos que pueden ser caracterizadas en diferentes fracciones de

bio-oil son las siguientes32

:

- Especies volátiles no-polares: Los principales compuestos corresponden a la familia

del etilbenceno y p-xileno. Presentan señal entre 116 °C y 153°C.

- Monoligninas: Estas especies presentan señal entre 100 °C y 300 °C, y se pueden

encontrar derivados del fenol, o productos de degradación de la lignina.

- Compuestos de extracción: Se pueden encontrar entre los 225 °C y 296 °C. Las

principales especies determinadas son: resinas, parafinas y fenantrenos.

- Compuestos no polares de alto peso molecular: Presentan una pequeña señal

alrededor de los 350 °C.

- Compuestos polares volátiles: Esta macrofamilia posee especies solubles en agua y

que son determinadas por DTG en temperaturas entre 50 °C y 220 °C. Los

principales componentes identificados corresponden a la familia de las cetonas.

- Compuestos polares de mediana volatilidad: Estos compuestos no pueden ser

seleccionados en una sola familia, ya que las especies presentan una alta polaridad

y similar volatilidad. Las señales máximas se encuentran entre 178 °C y 198 °C.

Las identificaciones corresponden a algunos fenoles, aldehídos, y derivados de la

celulosa y hemicelulosa.

- Compuestos polares de alto peso molecular: Estas señales son apreciadas a

temperaturas entre 340 °C y 365 °C por DTG. Se identifican pequeñas señales

correspondientes a la familia de la lignina.

- Azúcares: Las señales son observadas entre 235 °C y 300 °C.

Capítulo 1


1.7.3.4 Caracterización por cromatografía líquida

HPLC es una de las mejores formas para determinar los compuestos moleculares polares y de

mayor masa. En la Figura 1.4 se muestra el porcentaje de compuestos del bio-oil que pueden ser

determinados por esta técnica. Las columnas de resina tienen una capacidad única para retener y

separar las moléculas neutras tales como azúcares y alcoholes. Actualmente las condiciones

cromatográficas para el análisis de bio-oil por HPLC corresponden al uso de una columna Aminex

HPX-87H, empleando fase móvil de ácido fosfórico 0.007 N, temperatura de 30 °C, de n-propanol

como estándar interno y detección refractométrica19,30,32

. Los principales compuestos que se han

determinados son manosa, xilosa, glucosa, arabinosa, galactosa, levoglucosano, celobiosano, ácido

fórmico y acético, formaldehido, hidroxiacetaldehído, glioxal, metanol y etanol.Cabe destacar que

en los trabajos publicados en los cuales se utiliza la técnica de HPLC, no se muestran los

cromatogramas respectivos.

La detección refractométrica diferencial, si bien es presentada por algunos autores como un detector

universal, presenta la desventaja de ser poco sensible y ser dependiente de la temperatura. Además

es posible que por la gran complejidad de la muestra de bio-oil, este detector no presente una

selectividad adecuada. Estos detectores no se pueden utilizar con protocolos de HPLC en que se

utilice un método de elución con gradiente de temperatura, lo cual es una limitante, para la

optimización de un método.

Autores como A. Oasmaa19

y C. Mullen 31

, reportan la utilización de HPLC para la determinación

de compuestos como ácidos, azúcares, cetonas y aldehídos en bio-oil (previa derivatización con 2,4-

dinitrofenilhidrazina). En estos trabajos no se presenta información de los parámetros

cromatográficos obtenidos ni de las características analíticas de la metodología empleada. A su vez,

tampoco se presentan cromatogramas y tampoco el tratamiento que se le ha dado a la muestra de

bio-oil.

Actualmente se ha reportado el uso de HPLC con detección UV/vis para la determinación de ácidos

orgánicos, derivados de del furfural y aldehídos. Para ello se utilizó una columna Aminex TMHPX-

87H para los ácidos orgánicos (fórmico y acético), y una columna RP-18 para derivados del

furfural. Sin embargo en el trabajo no se muestran los cromatogramas obtenidos ni las condiciones

de separación a excepción de las columnas ya mencionadas33

.

1.7.3.5 Análisis por cromatografía de gases

Esta técnica presenta una gran aplicabilidad, siendo posible la determinación de compuestos en bio-

oil de forma directa y también en fraccionamiento22, 36-41

. El bio-oil, al presentar numerosos

compuestos, presenta una alta variabilidad en sus propiedades. Sin embargo, es necesario tener en

consideración que entre la lignina y el agua presentes en el bio-oil representan entre un 45 % a un

60% de la masa y que los carbohidratos, ácidos carboxílicos de bajo peso molecular, representan en

conjunto entre un 15 % a un 25 %. Por tanto, resta alrededor de un 15 % de la masa del bio-oil, que

es fácilmente volatilizable y térmicamente estable y por tanto analizable por GC (Ver Figura 1.4).

Para los analitos que no cumplen dichos requisitos, es posible la formación de derivados volátiles

que si permiten su análisis por GC, aumentando de esta forma el porcentaje de compuestos que

Capítulo 1


pueden ser determinados por GC-MS, aunque la limitante sigue siendo válida para compuestos muy

polares o de peso molecular algo mayor. A continuación se detalla el uso de los diferentes

detectores empleados.

Detector de conductividad térmica Si bien el uso de esta detección no se ha utilizado en muestras de bio-oil, si se utiliza en el proceso

de pirólisis, para la determinación de los gases producidos, como CO, CO2, CH4 y H2. La principal

importancia de la determinación de estos gases, es su recirculación como gases combustibles en el

reactor de pirólisis39

.

Detector de ionización de llama

De los detectores empleados para la caracterización de compuestos en bio-oil, éste es el que

presenta un mayor uso, principalmente por la cantidad de compuestos que pueden ser determinados.

Sin embargo, gran parte de las cuantificaciones con este detector se realizan empleando un sistema

GC/MS y un GC/FID40

o actualmente, realizando la determinación paralela en ambos detectores

GC/MS/FID17, 41

. De esta forma realizan la identificación por MS y la cuantificación en el sistema

FID.

Detector selectivo de masas

El amplio uso del detector selectivo de masas se debe a alto número de compuestos que pueden ser

identificados. Gran parte de los trabajo en que se realizan caracterizaciones al bio-oil han empleado

el sistema GC/MS, por ejemplo autores como Sipilä et.al22

, realizan fraccionamiento del bio-oil

con diferentes solventes, e inyección en GC/MS con una columna capilar HP Ultra 1, 50 m x 0,32

mm x 0,52 µm. Sin embargo los cromatogramas presentados muestran baja resolución (alrededor

de 45 compuestos en un tiempo de 25 minutos). Rutkowski et al36

emplea una columna capilar HP-

1 de 25 m x 0,2 mm x 0,33 µm, utilizando m/z entre 15-450. En este estudio, el bio-oil se fracciona

con benceno y con hexano, identificando 15 compuestos en la primera extracción y 28 en la

segunda extracción. Tsai et al35

, utiliza una columna HP-1 MS de 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm, en

modo scan con m/z desde 45-500. El trabajo no presenta cromatogramas y solo se realiza una

caracterización del bio-oil sin fracciones, logrando identificar alrededor de 48 compuestos.

Se ha desarrollado un método para la cuantificación de compuestos en bio-oil, empleando un

sistema GC/MS/FID en el cual la caracterización se realiza con el detector de masas, y la

cuantificación con el detector FID, obteniendo resultados reproducibles. La metodología empleada

es utiliza una columna VF-1701 (14%-cianopropil-fenil-86%-dimetilpolisiloxano, 60m x 0.25mm,

0.25 μm) 17, 41

utilizando acetona como solvente para la dilución de la muestra. Con esta

metodología es posible eluir entre un 25-40 % en peso de los compuestos presentes en el bio-oil, e

identificar cerca del 70-90% de los compuestos eluidos17

. En la Figura 1.8 se muestra un

cromatograma típico obtenido por la metodología descrita.

Figura 1.8 Cromatograma típico de bio-oil obtenido por GC/MS/FID, y la caracterización de los

principales compuestos17

.

Capítulo 1


Considerando la complejidad de la muestra de bio-oil se han empleado diversos tratamientos de

muestra, para determinar tanto compuestos de una forma selectiva o para la determinación de

compuestos que no poseen características químicas para ser determinadas directamente por GC/MS.

Una técnica rápida y poco costosa para la extracción de los compuestos volátiles es la

microextracción en fase sólida (SPME). Tiene dos funciones importantes: la extracción de analitos

y la desorción en instrumentos analíticos (en este caso GC). A.Oasmaa et.al17

evaluó esta técnica

para la extracción de los compuestos volátiles del bio-oil y su posterior desorción en un sistema

GC/MS. La principal ventaja es la mayor selectividad en la extracción. Los principales compuestos

identificados por esta técnica son: acido acético, acetol, furfural, fenoles, guaiacoles, siringoles,

eugenol17

.

Para compuestos de alto peso molecular, que no son posibles de determinar directamente por GC, se

puede utilizar esta misma técnica, previa pirólisis de la muestra. La pirólisis es un método

degradativo de gran interés para el estudio de especies macromoleculares, el cual da lugar al

rompimiento térmico del polímero, donde los compuestos monoméricos obtenidos se pueden

determinar por ejemplo por GC/MS. A las temperaturas de trabajo no tan solo se produce el

rompimiento de los enlaces éster o éter, sino también los enlaces C-C. Esto solo es posible si la

pirólisis se realiza en atmósfera inerte, altas temperaturas y por un corto tiempo.

Actualmente la nueva técnica GC x GC-TOF-MS para el análisis de bio-oil ha sido reportada por

Sfetsas et.al42

en la cual lograron identificar alrededor del 70 % de las señales obtenidas en un

cromatograma de bio-oil, a diferencia de la técnica GC/MS, en que sólo el 47 % de las señales son

posibles de caracterizar. El fundamento de la cromatografía de gases multidimensional es el que

todos los analitos de interés sean sometidos a dos etapas de separación independientes y que los

analitos permanezcan separados hasta que se complete todo el análisis. Para ello, el análisis de la

Capítulo 1


primera columna cromatográfica es reanalizado por una segunda columna con una fase estacionaria

de distinta selectividad. Este sistema responde a la necesidad de aumentar el poder de separación en

la cromatografía. Con respecto a los parámetros analíticos evaluados, estos presentan menores

límites de detección en comparación con un sistema GC/FID, pero sólo para algunas especies.

Las técnicas pirolíticas presentan la ventaja de ser rápidas, utilizar pequeña cantidad de muestra y

permitir el análisis in-situ. El compuesto que se encuentra en un alto porcentaje en el bio-oil, y no

puede ser caracterizado por GC, es la lignina pirolítica. Las ligninas son fracciones no

carbohidratadas de la madera libre de extraíbles, extremadamente complejas y difíciles de

caracterizar, por lo que la pirólisis acoplada a un GC/MS se presenta como una buena opción en la

determinación de la lignina pirolítica29, 37,44

.

Para la pirólisis se debe utilizar 60 µg de lignina pirolítica, la cual es pirolizada en un tubo de

cuarzo comenzando a 450 °C hasta 1000 °C. Este pirolizador está acoplado al sistema GC-MS. Las

condiciones son: columna capilar Chrompack DB 1701 60 m x 0,25 mm, 0,25 µm film; gas de

arrastre helio; Inyector 250 °C; detector 280 °C29

. Los principales compuestos identificados son

guaiacoles, vainilina y derivados, siringoles y coniferaldehídos entre otros derivados fenólicos26

.

Últimamente se ha utilizado para la caracterización de lignina las técnicas MALDI-TOF-MS que

presenta la ventaja de ser altamente sensible y determinar el extenso de una molécula sin realizar el

fraccionamiento de ésta43

. Como desventaja, es la señal que puede presentar la matriz,

especialmente en los rangos de menor masa. La técnica LDI-TOF-MS, presenta la ventaja de evitar

las interferencias de la matriz, sin embargo, la aplicación de esta técnica es sólo para moléculas más

pequeñas43

. Por último la Py-FIMS es una técnica por la cual es posible extraer e ionizar especies

monoméricas o subunidades de dímeros a partir de polímeros u oligómeros. Las cuales por su alto

costo no han demostrado una gran aplicabilidad43

.

Se han evaluado variadas técnicas analíticas tanto para el análisis cualitativo y cuantitativo del bio-

oil, enfocando cada vez más a técnicas con mayor sensibilidad y selectividad, siendo este último

parámetro el de mayor interés considerando la alta complejidad de la matriz de bio-oil. Sin

embargo, las técnicas actuales tienen la gran desventaja de presentar un alto costo en la adquisición

y la mantención de estas, siendo por esta razón que en este trabajo de tesis se buscó el desarrollo de

metodologías analíticas con una alta selectividad, orientando el estudio a los posibles tratamientos

de la muestra de bio-oil.

Cabe destacar que en bibliografía se ha reportado el uso de más de una técnica analítica, con el fin

de complementarse y lograr determinar un mayor número de compuestos. Esto debido

principalmente al elevado número de compuestos presentes en el bio-oil, y que no todos presentan

una compatibilidad con la técnica empleada.

Capítulo 1


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24 (2010) 2078–2085.

42. T. Sfetsas, C. Michailof, A. Lappas, Q. Li, B. Kneale, Qualitative and quantitative

analysis of pyrolysis oil by gas chromatography with flame ionization detection and

comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass

spectrometry, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 3317–3325.

43. B. Scholze, C. Hanser, D. Meier, Characterization of the water-insoluble fraction from

pyrolysis oil. Part II, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 58-59 (2001) 387-

400.

44. R. Bayerbach, D. Meier, Characterization of the water-insoluble fraction fron pyrolysis

oil. Part III, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 77 (2006) 95-101.

Capítulo 2


CAPÍTULO 2

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

El uso de biomasa forestal como materia prima para la obtención de productos químicos de alta

demanda industrial requiere desarrollar e implementar metodologías analíticas para la

caracterización y cuantificación de los compuestos de interés.

Desde un punto de vista industrial es un desafío el que se pueda contar con procesos de pirólisis

eficaces que se enfoquen en la producción de los principales compuestos del bio-oil (ácidos

orgánicos, aldehídos, azúcares etc.) en la extracción de estos compuestos desde la matriz

(purificación) y además en la utilización del bio-oil como un posible combustible.

En virtud de los antecedentes reportados se propone el desarrollo y optimización de metodologías

analíticas para la caracterización y cuantificación de los compuestos de interés del bio-oil como

ácidos orgánicos, aldehídos, azúcares y la posible automatización de las metodologías a emplear.

La estrategia analítica a desarrollar debe ser lo suficientemente selectiva y sensible para cuantificar

al menos todos los componentes más relevantes del bio-oil, pero no ser demasiado compleja,

evitando una preparación de muestra muy tediosa, asegurando así un razonable balance entre el

esfuerzo analítico a realizar y el grado de detalle de la información requerida para la optimización

de los procesos de pirólisis y del fraccionamiento del bio-oil.

Se propone además una priorización en el desarrollo de metodologías analíticas que presenten una

innovación en el ámbito analítico para la determinación de los compuestos de mayor interés en la

matriz de bio-oil.

De acuerdo con esta propuesta, las hipótesis y objetivos de la presente tesis son:

2.1 Hipótesis General

En base a los antecedentes bibliográficos, considerando la complejidad de la matriz de bio-oil y

debido a la presencia de gran cantidad de interferentes, es posible la caracterización cualitativa y

cuantitativa de compuestos de interés de bajo peso molecular, mediante el desarrollo y aplicación de

métodos analíticos avanzados que incluyan técnicas de extracción u otro tratamiento de muestra

acopladas con técnicas cromatográficas (HPLC, GC y HPTLC), permitiendo la resolución de

posibles interferencias y análisis de distintos grupos de compuestos por separado.

Desde un punto de vista industrial, es posible dirigir la producción de bio-oil como materia prima

para la obtención de productos químicos de alta demanda.

Capítulo 2


2.1.2 Hipótesis derivadas

La aplicación de metodologías analíticas basadas en la cromatografía gaseosa acoplada a un

detector de masas (GC/MS), cromatografía liquida acoplada a un detector UV (HPLC-UV), y

cromatografía en capa fina de alta eficiencia (HPTLC), permitirán la determinación de familias de

compuestos.

La posible automatización de algunas de las metodologías desarrolladas, considerando que la

determinación de los compuestos en bio-oil debe ser viable como análisis de rutina.

2.2 Objetivos Generales

En virtud de los antecedentes anteriormente presentados se plantea como objetivo general de esta

tesis desarrollar metodologías analíticas para la determinación de ácidos orgánicos de cadena corta,

compuestos volátiles, azúcares y aldehídos en matriz de bio-oil.

2.2.1 Objetivos específicos

El análisis de bio-oil requiere de varias etapas de tratamiento de muestra, cuya selección dependerá

de la naturaleza de las muestras y de la técnica instrumental seleccionada. En este estudio los

métodos cromatográficos han sido seleccionados para la separación de los analitos. De esta manera,

los objetivos específicos planteados para este proyecto son:

a) Determinación de compuestos volátiles en bio-oil por GC/MS.

Se evaluarán dos técnicas analíticas de tal forma de utilizar la matriz de bio-oil sin

tratamiento previo. Las técnicas a evaluar son: Extracción en espacio de cabeza o

“headspace” (HS) y microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (HS-

SPME), para este último considerando diferentes tipos de recubrimientos de la fibra.

b) Determinación de ácidos orgánicos por HPLC con detección UV. La aplicación de ésta

técnica de análisis requiere una etapa previa de tratamiento de muestra. Para tal efecto se

estudiará la extracción de los analitos mediante una extracción liquido-liquido, seguido de

una extracción en fase sólida, basados en el intercambio aniónico, utilizando rellenos

compuestos por amina cuaternaria. La separación por HPLC se basará en la metodología

para la determinación de ácidos orgánicos en matriz de vino.

c) Determinación de azúcares, la cual contempla la implementación y validación de la técnica

HPTLC para la determinación de los principales azúcares presentes en el bio-oil, y

desarrollar un método de confirmación por GC-MS para los azúcares, principalmente

levoglucosano y celobiosano, previa derivatización.

d) Determinación de aldehídos y cetonas. Evaluación de la determinación de aldehídos y

cetonas, como hidroxiacetaldehído, glioxal, hidroxiacetona, entre otros, por HPLC con

detección en el visible, previa derivatización con 2,4-dinitrofenilhidrazina.

Capítulo 3


CAPÍTULO 3

ESTRATEGIA ANALÍTICA Y MATERIAL DE ESTUDIO

Uno de los objetivos generales de esta tesis es el desarrollo de metodologías analíticas para la

caracterización de compuestos de interés en bio-oil, con el objeto de utilizarlo como una fuente de

obtención de grupos de compuestos químicos de interés, como ácidos orgánicos, azúcares y

aldehídos. Como estrategia analítica se plantea el uso de diversas técnicas de separación

cromatográficas, como GC/MS, HPLC-UV y HPTLC.

Uno de los principales énfasis está en el desarrollo de sistemas de tratamientos de muestras de bio-

oil y sus diferentes fracciones, estas pueden incluir extracción líquido-líquido, extracción en fase

sólida, microextracción en fase sólida, derivatización en medio acuoso y derivatización por medio

de modificación de fibras de SPME. La aplicación de estos sistemas de tratamientos, fue

desarrollada en consideración del tipo de muestra (bio-oil crudo, fracciones acuosas y orgánicas de

bio-oil, lignina pirolítica) la técnica analítica y el grupo de compuestos de interés.

La optimización de estos métodos analíticos se realizó mediante optimización multivariada para

tener en cuenta las diferentes interacciones entre las variables.

3.1 Obtención del bio-oil

Las muestras de bio-oil analizadas en este trabajo son obtenidas de dos fuentes, la primera

corresponde a un reactor a escala de laboratorio del Departamento de Ingeniería Metalúrgica,

Universidad de Concepción, y las otras muestras son obtenidas de la planta piloto productora de

bio-oil de la Unidad de Desarrollo Tecnológico. En la Figura 3.1 se muestra un esquema de este

último reactor de pirólisis a escala piloto.

Figura 3.1 Esquema de la planta piloto para la producción de bio-oil. (Gentileza UDT)

Capítulo 3


3.2 Procesos de fraccionamiento del bio-oil para la obtención de grupos de compuesto de

interés a nivel industrial

Como ya se ha indicado, el interés de esta investigación no sólo está enfocado en la caracterización

de bio-oil crudo, sino que también en poder caracterizar diferentes fracciones de éste, lo que se

llevara a cabo para la obtención de productos de interés a nivel industrial. Esto plantea el desafío de

desarrollar métodos analíticos versátiles que puedan ser empleados en la caracterización del bio-oil

crudo, junto con las fracciones acuosas, orgánicas, lignina pirolítica entre otras. Para esto el

conocimiento de la posible composición de estas fracciones es de gran importancia para lograr

elegir el tratamiento de muestra adecuado y la técnica instrumental a utilizar. En este apartado se

describen las diferentes muestras que se caracterizaran, cuyo fraccionamiento se llevó a cabo en la

UDT.

La finalidad del proceso de separación o fraccionamiento del bio-oil, es de acuerdo a la aplicación

que se le quiera dar. En el caso de la refinación de bio-oil, el producto combustible es claramente

un “commodity”, mientras que los productos químicos (componentes de resina y aditivo de

ensilaje) se ubican más cerca del espectro de productos de química fina o especialidades

(“specialities”). El “commodity” combustible siempre va a tener un mercado, mientras que las

especialidades pueden o no ser vendibles, dependiendo de las alternativas que hay en el mercado

y la relación precio/beneficio del producto. Por lo tanto, las estrategias del fraccionamiento están

enfocadas en 3 principales objetivos.

Obtención de productos químicos: para este objetivo el bio-oil debe ser sometido a un

fraccionamiento completo, en el cual se prioriza la mayor recuperación de los productos y la

pureza que se requiere. Los residuos obtenidos pueden ser quemados para su uso como

combustible. La desventaja de utilizar este proceso es que los compuestos químicos no se

encuentran en un alto porcentaje y la alta complejidad del bio-oil demanda fraccionamientos

altamente selectivos, haciendo de este punto una solución poco viable. Además, un

fraccionamiento completo del bio-oil producirá un gran número de sub-fracciones que no pueden

ser utilizadas como combustibles.

Obtención de combustible: el objetivo es centrar las separaciones hacia la obtención de un

combustible con mejores propiedades que el bio-oil crudo. Los residuos obtenidos pueden ser

utilizados para la obtención de subproductos. De igual forma que en el ítem 2, para la obtención

exclusiva de combustible desde el bio-oil se deben realizar extracciones selectivas para la

eliminación de los interferentes o compuestos indeseados.

Obtención de combustible y productos químicos: En este caso la prioridad de la separación es

obtener tanto productos químicos como combustibles. Este procedimiento muestra mayores

ventajas, al incluir el combustible como un producto del fraccionamiento, considerando que la

producción exclusiva de productos químicos es poco factible por su baja concentración.

En esta investigación el fraccionamiento del bio-oil es llevado a cabo con el objetivo de obtener,

tanto productos químicos como combustible.

Capítulo 3


Es importante considerar que la formación de bio-oil se realiza lejos del equilibrio

termodinámico, y por consiguiente, el bio-oil fresco es una mezcla de componentes reactivos que

experimentan reacciones químicas que tienden a aumentar su peso molecular medio, disminuir la

polaridad de algunos constituyentes, y aumentar el contenido de agua1. En consecuencia, la

solubilidad mutua de los componentes cambia, y el bio-oil es propenso a separarse en dos o más

fases, una fase acuosa y otra orgánica resinosa.

La separación fue evaluada para grupos de compuestos, de esta forma a continuación se detalla el

procedimiento seguido en cada caso.

3.2.1 Extracción de compuestos volátiles del bio-oil

La extracción de compuestos volátiles permite una mejor estabilidad del bio-oil, junto con mejorar

su olor2. Los principales compuestos volátiles son cetonas, aldehídos y ácidos orgánicos de bajo

peso molecular. El fraccionamiento completo de bio-oil por destilación no es posible, ya que el 50

% en peso del bio-oil está constituido por compuesto de alto punto de ebullición, muchos de ellos se

descomponen con la temperatura, o aumentan su reactividad. No obstante, utilizando sistemas de

vacío o la utilización de solventes, es posible crear una mezcla azeotrópica. Teniendo presente lo

expuesto, para la separación se proponen tres procesos de destilación:

1) Destilación a vacío de bio-oil

Diferentes fracciones fueron obtenidas, variando la temperatura del baño y la presión. 1ra

fracción: 60 minutos, 55 mbar; 2da

fracción: 50 minutos, 70-50 mbar; 3ra

fracción: 38 minutos,

50 mbar; 4ta fracción 60 minutos, 50 mbar.

2) Destilación atmosférica de bio-oil con glicerol

El glicerol es un solvente de alto punto de ebullición, que permite la destilación de bio-oil

(temperaturas de 95-105 °C) a presión atmosférica, evitando la coquificación del residuo. Para

separar el glicerol, es necesario añadir agua para precipitar la lignina pirolítica. El agua es

removida por evaporación, para recuperar el glicerol.

3) Destilación atmosférica de bio-oil con n-pentanol y n-butanol

Es posible realizar una destilación azeotrópica de bio-oil con n-butanol y n-pentanol. Éstos

forman destilados que se separan en dos fases, una fase solvente y otra fase acuosa, por lo que es

fácil devolver todo o una parte de una u otra fase como reflujo a la columna de destilación.

3.2.2 Extracción de ácidos y aldehídos por extracción con solvente

Una alternativa de refinación que extrae los ácidos y aldehídos desde el bio-oil crudo es la

utilización de un solvente poco polar que no disuelve apreciablemente la lignina pirolítica. Entre

los solventes comunes utilizados, el metil ter-butil éter (MTBE). Este es uno de los pocos que

además del agua, no disuelve apreciablemente la lignina pirolítica y que al mismo tiempo es

suficientemente polar para extraer aldehídos y ácidos. Es posible recuperar entre un 70-80 % de los

ácidos, usando una extracción en caliente de bio-oil con MTBE a 45 °C. La principal desventaja es

Capítulo 3


que utilizando temperatura hay una mayor solubilidad de la lignina pirolítica. Esto es posible debido

a que el MTBE en medio ácido y en presencia de temperatura, se puede descomponer en isobutileno

y metanol. Este último logra disolver la lignina. Por lo tanto, es de esperar que este tipo de muestras

presenten un nivel importante de lignina pirolítica.

3.2.3 Extracción con solventes

En esta extracción se prioriza la utilización de solventes que sean inmiscibles con agua, presenten

característica polar y que puedan solubilizar gran parte del bio-oil, junto con la lignina pirolítica.

a) Extracción con metil-isobutil cetona.

Usando una relación 1:5 de bio-oil:solventes hacen posible la extracción de aproximadamente

el 85 % de los ácidos. El extracto contiene también gran parte de la lignina pirolítica. La

presencia de un solvente con grupo carbonilo, interferirá en el método químico para la

determinación de grupos carbonilos.

b) Extracción con n-butanol.

El n-butanol es un solvente que se puede obtener de fuentes renovables y se encuentra en la lista

de solventes ambientalmente favorables3. Presenta una miscibilidad parcial con el agua. La fase

acuosa contiene hasta un 10% en peso de n-butanol y la fase orgánica cerca de un 50% de agua.

Desde el punto de vista de un solvente de extracción, la miscibilidad parcial usualmente es

indeseable, pues dificulta la recuperación del solvente. No obstante, la miscibilidad es muy

sensible a la presencia de sales en la fase acuosa, las que disminuyen significativamente la

solubilidad mutua agua/n-butanol. Para el trabajo con este solvente es necesario agregar agua

para producir la separación de fases. Estas corresponden a fase orgánica y fase acuosa (o

refinado acuoso). La fase orgánica contiene principalmente ácidos carboxílicos, lignina

pirolítica y carbonilos. En el refinado acuoso se puede encontrar algunos ácidos y carbonilos

que no fueron completamente extraídos con n-butanol en una primera extracción y azúcares.

c) Extracción con n-pentanol

El n-pentanol presenta una menor solubilidad en agua que el n-butanol. En la fracción acuosa es

posible encontrar lignina pirolítica, aldehídos volátiles, ácidos orgánicos y azúcares. En la fase

orgánica es posible encontrar gran parte de los aldehídos, también una fracción de ácidos

orgánicos.

d) Extracción con n-butanol y NaHCO3

El uso de NaHCO3 influye en la miscibilidad que presenta el n-butanol con agua. Similar al

punto (b), de esta extracción obtendremos 2 fases. En la fase orgánica se encontrará

principalmente ácidos y algunos aldehídos, en la fase acuosa se espera encontrar azúcares.

Capítulo 3


e) Separación de solventes de la fase orgánica

La separación del solvente por destilación azeotrópica a presión atmosférica, retornando la fase

acuosa del destilado a la columna, es una manera para recuperar el solvente por destilación. La

destilación subsecuente del agua permite recuperar también parte de los ácidos presentes

f) Extracción con acetato de etilo y acetato de butilo

La finalidad de esta extracción es la obtención de la lignina pirolítica, junto con los compuestos

fenólicos en la fase orgánica y los azúcares, ácidos y grupos carbonilos en la fase acuosa.

3.2.4 Separación de la lignina pirolítica del bio-oil

La separación de lignina desde el bio-oil se realiza adicionando agua. Uno de los procedimientos es

agregar agua y dejar decantar la lignina pirolítica. La fase acuosa es comúnmente llamada humo

líquido y contiene principalmente ácidos orgánicos, aldehídos y azúcares. También es posible

encontrar en la fase orgánica, en baja concentración ácidos orgánicos, azúcares y aldehídos.

3.3 Métodos analíticos de tratamientos de muestras

Considerando la diversidad de muestras de bio-oil, es necesario evaluar distintos procesos de

tratamiento de diferentes tipos de muestras. La finalidad de la metodología de preparación de

muestra es disponer del analito en un estado en el cual pueda ser determinado lo más selectivamente

posible, evitando las posibles interferencias que afectan la cuantificación. Además las muestras se

deben encontrar en un disolvente compatible con la técnica de determinación utilizada. Para ello, en

la mayoría de los casos es necesario realizar una primera etapa en la cual se aísla los analitos de la

matriz que los contiene, consiguiendo su purificación y concentración. En muchos casos, es

inevitable una etapa de transformación de los analitos, variando una serie de propiedades de los

mismos para facilitar su determinación. Se ha descrito en los capítulos precedentes la alta

complejidad de las muestras de bio-oil, por lo que es inevitable la evaluación de los posibles

tratamientos de la muestra, junto con la modificación química de los analitos a determinar.

En las siguientes secciones se describen brevemente los posibles procedimientos de tratamiento de

muestras, considerando al bio-oil como una muestra liquida. Además, reseñan las modificaciones

químicas que se pueden emplear.

Tratamiento de muestras

Generalmente las matrices complejas presentan una incompatibilidad con la técnica a utilizar, por lo

cual suele ser necesaria una etapa de preparación de muestra, que nos permite separarlos de otros

compuestos que puedan interferir en su determinación y si es necesario, concentrar los analitos.

Capítulo 3


Entre los métodos de preparación de muestra empleados en esta tesis figuran la extracción

líquido‐líquido (LLE), la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase sólida

(SPME).

Es de importancia considerar que los compuestos de mayor relevancia de analizar en el bio-oil no se

encuentran en bajos niveles de concentración, por lo que en el momento de elegir una técnica se

deberá priorizar su selectividad, sobre su sensibilidad, sin dejar de considerar esta última.

3.3.1 Extracción líquido‐líquido

El principal inconveniente que presentan las fracciones de bio-oil son los solventes en los que se

obtuvieron. Las fracciones necesarias de analizar son tanto las orgánicas como las acuosas. Las

fracciones en MTBE tienen la ventaja de no presentar un alto contenido de lignina pirolítica y que

además contienen en gran medida a los ácidos orgánicos. Si esta fracción se analiza por HPLC,

tiene la limitante de dañar la columna cromatográfica.

Este inconveniente hace necesario evaluar la LLE como posible pre-tratamiento de las fracciones

orgánicas, de tal forma que la muestra no presente una incompatibilidad con el instrumento a

utilizar. Como se expuso en el Capítulo 1, es posible determinar azúcares, ácidos orgánicos y

aldehídos por HPLC, utilizando una columna Aminex HPX-87, con ácido fosfórico diluido como

fase móvil. Esto requiere que las muestras necesariamente sean solubles en la fase móvil, condición

inversa a las fracciones orgánicas obtenidas del bio-oil, en las cuales el objetivo es la inmiscibilidad

en solución acuosa.

Una de las principales desventajas de emplear esta técnica es que las muestras ya provienen de una

extracción. Si se agrega otra LLE puede que los porcentajes de recuperación no sean los adecuados,

afectando la cuantificación. Otra desventaja es que la opción de solventes que pueden ser

compatibles con la técnica instrumental, y que además sea la adecuada para la extracción del analito

por LLE, es limitada, reduciendo en gran medida la aplicabilidad de esta técnica.

La LLE fue evaluada en fracciones orgánicas de bio-oil para la obtención de solución acuosa, en la

determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV.

3.3.2 Extracción en fase sólida

La SPE se desarrolló a mediados de los años 70 como alternativa a la LLE. Hoy en día es una de las

técnicas de preparación de muestra más ampliamente utilizadas en el caso de matrices líquidas e

incluso gaseosas. Mediante SPE se consigue concentrar y/o purificar los analitos mediante su

retención en una fase sólida o una fase líquida inmovilizada sobre un soporte sólido, para a

continuación proceder a su elución con un disolvente adecuado.

Entre las múltiples ventajas que presenta destacan las siguientes:

- baja manipulación de la muestra

- alto poder de concentración

- obtención de extractos purificados con altas recuperaciones

Capítulo 3


- menor consumo de disolventes en comparación con LLE

- ausencia de emulsiones

- posibilidad de automatización

- versatilidad en el tipo de adsorbentes utilizados

La SPE fue evaluada en la determinación de ácidos orgánicos desde bio-oil crudo y fracciones

acuosas de éste.

3.3.3 Microextracción en fase sólida

La técnica de SPME se basa en la extracción de los analitos de la matriz de la muestra mediante una

fibra de sílice fundida de 10 mm, de muy pequeñas dimensiones, recubierta por un sorbente de 80-

100 μm (del orden de 0.5 μL casi siempre polimérico). El tamaño pequeño de la fibra y su

geometría cilíndrica permiten incorporarla a una jeringa. De esta forma, se facilita la manipulación

y se protege la fibra cuando ésta no se utiliza (Figura 3.2). Esta técnica fue desarrollada por

Pawliszyn en 1992 y durante la última década se ha aplicado a múltiples analitos.

Figura 3.2 Dispositivo empleado en la SPME4.

Las principales ventajas de la técnica de SPME son:

- Gran simplicidad

- Utiliza pequeños volúmenes de muestra

- No necesita disolventes orgánicos

- Fácilmente transportable

- Útil para todo tipo de muestras gaseosas, liquidas y sólidas

- Posibilidad de automatización

- Permite la concentración de compuestos volátiles y semi-volátiles

- El límite de detección puede ser muy bajo (del orden de ppt), lo que demuestra la

sensibilidad de esta técnica

Capítulo 3


Sus principales inconvenientes son:

- Limitada capacidad de las fibras debido a que contienen una cantidad muy pequeña

de recubrimiento.

- La presencia de materia suspendida en la muestra puede dañar el recubrimiento de

la fibra durante la agitación. Compuestos de elevado peso molecular pueden

adsorberse irreversiblemente en la fibra cambiando sus propiedades.

- La formación de burbujas de gas en la superficie de la fibra puede afectar a tasa de

transferencia de masa.

- Pueden aparecer problemas de sensibilidad. La sensibilidad de la técnica de SPME

depende de la cantidad de analitos extraídos de la muestra; si el volumen de la

muestra (Vs) es muy elevado, será mucho mayor al producto entre la constante de

distribución (Kfs) y el volumen de recubrimiento (Vf) de la fibra (Kfs×Vf<<Vs) y,

por tanto, aunque se aumente el volumen de muestra no se consigue aumentar la

sensibilidad.

3.3.3.1 Variables que afectan el proceso de SPME

El proceso de SPME se puede ver afectado por una serie de variables experimentales que influyen

sobre el equilibrio de analito extraído o bien sobre su desorción. Estas variables pueden ser

modificadas para incrementar la eficacia del proceso de extracción, pero cualquier modificación de

las variables o condiciones experimentales repercute en la cantidad de analito que se determina y en

la repetitividad del análisis.

Los parámetros que pueden afectar el proceso de extracción por SPME son los siguientes:

a) Tiempo de extracción5: Es necesario determinar el tiempo necesario para llegar al estado de

equilibrio, e intentar trabajar en estas condiciones. Es decir, tiempo a partir del cual la

cantidad de analito que se extrae se mantiene constante y es característico de cada pareja

analito-fibra. Para algunos compuestos el tiempo necesario para llegar al punto de

equilibrio es muy elevado, mientras que para otros es corto. Generalmente, en estos casos

se fija un tiempo de extracción de compromiso. Se suele optar por seleccionar tiempos de

extracción inferiores para no alargar el tiempo de análisis, con lo cual para algunos analitos

se trabajará en condiciones de no equilibrio. En estos casos, es muy importante controlar

estrictamente el tiempo de extracción en aras a la repetitividad de los análisis, ya que

pequeñas variaciones pueden variar considerablemente la cantidad de analito extraída.

b) Temperatura de extracción

5: Este parámetro contribuye de dos formas opuestas en el

proceso de SPME. En el modo de espacio de cabeza, al aumentar la temperatura aumenta la

concentración de los analitos en el espacio de cabeza, por lo que la extracción es más

rápida, ya que se necesita menos tiempo para alcanzar el equilibrio. Pero, por otra parte,

reduce la eficacia de la extracción, ya que un aumento de la temperatura disminuye los

coeficientes de partición del analito entre el espacio de cabeza y la fibra y, por tanto,

disminuye la cantidad de analito extraída por la fibra en el equilibrio.

Capítulo 3


c) Presencia de sales en la muestra5: Generalmente la presencia de electrólitos en un sistema

de adsorción disminuye la solubilidad de los compuestos hidrofóbicos en la fase acuosa.

Este efecto se llama “salting out” y se utiliza para incrementar la sensibilidad de un método

analítico. Pero si los analitos se encuentran en forma no ionizada, se observa una

disminución de la eficacia de la extracción debido probablemente, a un aumento del

coeficiente de actividad de las especies iónicas al aumentar la fuerza iónica de la solución.

La adición de sal no es siempre conveniente para moléculas de elevado peso molecular, ya

que provoca que los analitos se adhieran al vidrio del contenedor de la muestra o vial. Para

la extracción de analitos volátiles y semivolátiles por HS-SPME se usa habitualmente NaCl

y, a veces, Na2SO4.

d) pH de la muestra5: Este factor está relacionado con el apartado anterior, ya que los analitos

deberán estar mayoritariamente presentes en su forma neutra para favorecer su extracción.

e) Volumen de la muestra5: El volumen debe seleccionarse en función de los coeficientes de

distribución de los analitos, Kfs. n = K fs Vf Co en esta ecuación se puede observar que la

cantidad de analito extraída (n) es directamente proporcional a la concentración de analito

en la muestra e independiente del volumen de la muestra, lo cual significa que, previo al

análisis, no es necesario estudiar el volumen de muestra más adecuado a elegir, ya que la

fibra puede ser directamente expuesta al aire.

f) Agitación de la muestra5: En SPME hay que tener en cuenta la cinética del proceso. Los

analitos deben ser transportados desde la matriz de la muestra a la fibra en inmersión o, si la

extracción se realiza mediante HS/SPME, desde la matriz de la muestra al espacio de

cabeza y, de allí, a la fibra. La efectividad de la agitación determinará el tiempo de

equilibrio en muestras acuosas.

g) Tipo de fase5: La eficacia de la extracción depende de la constante de distribución (Kfs) que

es característica de cada pareja analito-fibra y determina principalmente las propiedades del

recubrimiento de la fibra y la afinidad del analito respecto a otros componentes de la matriz.

En la tabla 3.1, se muestra un resumen de las propiedades de diferentes fibras.

h) Desorción

5: La constante de distribución (Kfs) disminuye al aumentar la temperatura. Por lo

tanto la desorción térmica de los analitos usando un cromatógrafo de gases, dependerá de la

volatilidad, temperatura del inyector, tiempo de desorción, ubicación de la fibra en el

inyector y el espesor de la fibra.

Capítulo 3


Tabla 3.1 Principales propiedades de las fibras de SPME5.

Fase Estacionaria T° máxima

de uso

Proceso de

extracción Polaridad

Uso

recomendado

PDMS

(polidimetilsiloxano) 280 °C Absorción Apolar GC/HPLC

PDMS/DVB

(PDMS/divinilbenceno) 270 °C Adsorción

Polaridad

media GC/HPLC

PA

(poliacrilato) 320 °C Absorción Polar GC/HPLC

CAR/PDMS

(carboxen/PDMS) 320 °C Adsorción

Polaridad

media GC

CW/DVB

(carbowax/DVB) 265 °C Adsorción Polar GC

CW/TPR

(CW/resina templada) - Adsorción Polar HPLC

DVB/CAR/PDMS 270 °C Adsorción

Polaridad

media GC

A diferencia de la LLE y la SPE, esta técnica no requiere del uso de solventes para la extracción,

limpieza o elución de los compuestos. Además es posible emplear sumergiendo la fibra en la

solución de la muestra o realizarla en modo espacio cabeza.

La modalidad de inmersión de la fibra en muestras de bio-oil, puede causar la sobresaturación tanto

por parte de los compuestos de interés como de la matriz, causando el deterioro inmediato de la

fibra utilizada.

La modalidad espacio de cabeza, proporciona una mayor versatilidad en el momento de la

extracción. Como se muestra en la Tabla 3.1, la diversidad de fibras es útil cuando se requiere

analizar muestras de alta complejidad como el bio-oil. La desventaja es que esta modalidad es útil

sólo para compuestos volátiles o semivolátiles, reduciendo el espectro de compuesto a determinar.

No obstante esta desventaja es útil al buscar una selectividad en el análisis.

En el caso de compuestos que presenten una incompatibilidad con la técnica instrumental o

presenten baja volatilidad, es posible recurrir a la modificación del analito (derivatización). Este

método puede tener principalmente el inconveniente de que la reacción de derivatización no se

produzca de manera óptima, evitando la determinación fiable de los compuestos, por la complejidad

de la matriz (posibles interferentes en la reacción) y el solvente en que se encuentra cuando

corresponden a diferentes fracciones.

Esta técnica se utilizará en la determinación de aldehídos por GC/MS, mediante la modificación

química del recubrimiento de la fibra.

Capítulo 3


3.4 Métodos de derivatización

Las dificultades más habituales en el desarrollo de una metodología analítica son la complejidad de

la matriz, analitos diluidos que dificultan su detección y la incompatibilidad de la muestra y/o los

analitos de interés con el sistema instrumental.

La derivatización es una reacción química del analito (alta constante de equilibrio, e irreversible),

que permite la modificación de éste en una especie que presenta compatibilidad con el sistema

instrumental. Además, la derivatización puede eliminar las interferencias de la muestra, ya que el

reactivo derivatizante reaccionará selectivamente con ciertos grupos químicos. Dependiendo del

sistema a utilizar, hay una variedad de reactivos derivatizantes. Las principales reacciones de

derivatización son las siguientes:

a) Alquilación: Tiene como finalidad la reducción de la polaridad de los compuestos mediante

sustitución de hidrógenos lábiles por un alifático o alifático aromático. Entre las ventajas

que presentan las reacciones de alquilación está el alto número de reactivos disponibles, las

condiciones de reacción son muy amplias, variando entre medios muy ácidos a medios muy

básicos. Algunas de las reacciones de alquilación pueden realizarse en medios acuosos.

Además los derivados obtenidos son generalmente muy estables6.

b) Sililación: Es la reacción de derivatización más usada por su sencillez y la rapidez de la

reacción. Esta reacción tiene como finalidad la sustitución de un hidrógeno activo por un

grupo de silicio trisustituido. Estos compuestos generan mayor volatilidad, menor polaridad

de la molécula y estabilidad térmica6.

c) Acilación: Tiene similares ventajas a la sililación. Las reacciones de acilación reducen la

polaridad de los grupos amino, hidroxilo, tioles y adiciona funcionalidades halogenadas. La

acilación transforma los compuestos con hidrógenos ácidos en ésteres, tioésteres y amidas6.

El empleo de algunos de estos reactivos en compuestos del bio-oil, puede ser de utilidad, en

especial en cromatografía de gases, para favorecer su volatilidad y estabilidad térmica.

La derivatización en esta tesis se evaluó en la determinación de aldehídos por HPLC-UV, ácidos

orgánicos y azúcares por GC/MS y aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS, en muestras de

bio-oil.

3.5 Métodos quimiométricos

Para el desarrollo de las metodologías propuestas, se utilizaron herramientas quimiométricas, en

especial el diseño experimental. El objetivo de utilizar esta herramienta fue, determinar cuáles son

las variables que tienen un efecto significativo sobre la respuesta, determinar el mejor valor de las

variables controlables que influyen en la respuesta, de manera que ésta, sea casi siempre cercano al

valor nominal deseado, determinar la mejor combinación de las variables controlables que ayuden a

reducir la variabilidad de la respuesta y establecer la combinación óptima de las variables

controlables, con el objetivo de minimizar los efectos de las variables incontrolables7.

Capítulo 3


Para ello se emplearon diversos diseños, dependiendo de la cantidad de variables utilizadas, y las

condiciones técnicas que permitieron realizar los experimentos.

El screening, diseño experimental y la optimización del diseño, se realizaron con el programa

estadístico MODDE 7.0, facilitado por el Dr. David Contreras de la Facultad de Química de la

Universidad de Concepción.

3.6 Propuesta de la estrategia analítica

Para la determinación de los diferentes compuestos en el bio-oil, se consideró como metodología

general de base, la determinación de compuestos por GC/MS en la modalidad de inyección directa.

Considerando que por esta metodología no es posible la determinación de algunos compuestos que

presenta alto interés industrial, se desarrolló un esquema (ver Figura 3.3), en el cual se considera el

tipo de muestra, sea fracción acuosa u orgánica, destilados de bio-oil o bio-oil crudo, el tipo de

grupo químico a determinar, y las posibles técnica instrumentales propuestas, junto con los

tratamientos previos de la muestra.

Figura 3.3 Esquema propuesto en este trabajo de tesis para la determinación de grupos químicos en

las diferentes muestras de bio-oil.

TIPO DE MUESTRAS DE BIO-OIL

Bio-oil crudo

Fase acuosaFase orgánicaDestilación de

bio-oil

CARACTERIZACIÓN

GENERAL

ALDEHÍDOS

AZÚCARES

ÁCIDOS

ORGÁNICOS

GC/MS iny.dir.

HPTLC

GC/MS der. BSTFA

D-HS-GC/MS

OFD-HS-SPME-GC/MS

HPLC-UV trat.SPE

HPLC-UV der. DNPH

GC/MS iny.dir.

GC/MS der. BSTFA

HPLC-UV trat. SPE

GC/MS iny.dir.

HPLC-UV trat. LLE

GC/MS der. BSTFA

GC/MS iny.dir.

HPLC-UV iny.dir.

GC/MS der. BSTFA

GC/MS der. BSTFA

D-HS-GC/MS

OFD-HS-SPME-GC/MS

HPLC-UV der. DNPH

D-HS-GC/MS

OFD-HS-SPME-GC/MS

D-HS-GC/MS

OFD-HS-SPME-GC/MS

HPTLC

GC/MS der. BSTFA

HPTLC

GC/MS der. BSTFA

HPTLC

GC/MS der. BSTFA

Iny. Dir Inyección directa, Der: derivatización, Trat: tratamiento de muestra, LLE: extracción

líquido líquido, SPE: extracción en fase sólida, HS: modalidad espacio de cabeza, SPME:

microextracción en fase sólida, OFD: derivatización on-fiber.

De acuerdo a este esquema se evaluaron las diferentes metodologías analíticas propuestas. En los

capítulos posteriores se desarrollan con más detalle, y se evalúan las ventajas y desventajas de cada

metodología, al ser empleada en esta matriz.

Capítulo 3


3.7 Bibliografía

1. J. Diebold, A review of the chemical and physical mechanisms of the storage stability of

fast pyrolysis bio-oils, ttp://home.rmi.net/~dieboljc, Thermalchemie Inc. (1999).

2. A. Oasmaa, K. Sipila, Y. Solantausta, E. Kuoppala, Quality improvement of pyrolysis

liquid: Effect of light volatiles on the stability of pyrolysis liquids, Energy Fuels 19 (2005)

2556-2561.

3. D. Li, Z. Yan, Y. Fu, Q.X. Guo, Green Solvent for Flash Pyrolysis Oil Separation, Energy

& Fuels 23 (2009) 3337-3338.

4. J. Pawliszyn, Applications of solid phase microextraction, The Royal Society of Chemistry,

Cambridge, UK, (1999).

5. J. Pawliszyn, Handbook of Solid Phase Microextraction, Chemical Industry Press, China,

(2009).

6. K. Blau, J.M. Halket, Handbook of derivatives of chromatography, Second Edition, John

Wiley & Sons, London UK, (1993) 51-74.

7. R. Brereton, Applied Chemometrics for Scientists, John Wiley & Sons, Chichester, UK,

(2007).

Capítulo 4


CAPÍTULO 4

CARACTERIZACIÓN DE BIO-OIL POR INYECCIÓN DIRECTA EN GC/MS

En este capítulo se aborda lo que hoy en día es la metodología estándar para el análisis y

caracterización de bio-oil, con ciertas modificaciones orientadas a los objetivos específicos de esta

tesis.

4.1 Resumen

La metodología que actualmente es usada para la caracterización y cuantificación de compuestos

volátiles en el bio-oil es GC/MS/FID. En el presente trabajo se evalúan diferentes fracciones de bio-

oil usando dicha método, desarrollada en el Institute for Wood Technology and Wood Biology

(Hamburgo-Alemania). Junto con ello se implementa, tanto para análisis cualitativo como

cuantitativo, un método usando un sistema GC/MS desarrollado en el Departamento de Análisis

Instrumental (Facultad de Farmacia - Universidad de Concepción). Con este último, se logró

cuantificar los principales compuestos de interés, tanto en bio-oil crudo como en las respectivas

fracciones acuosas y orgánicas, poniendo énfasis en la determinación de hidroxiacetaldehído

(glicolaldehído), ácido acético, acetol y levoglucosano.

4.2 Introducción

La determinación de compuestos por GC/MS/FID es actualmente la mejor opción en la

caracterización general del bio-oil, permitiendo la determinación de grupos químicos como ácidos

orgánicos, alcoholes, aldehídos y cetonas no aromáticas, furanos, piranos, azúcares, benceno,

catecoles, aldehídos y cetonas aromáticas, derivados de lignina pirolítica y guaiacoles entre otros 1-4

.

Esta metodología se basa en la disolución del bio-oil en acetona y su posterior inyección directa en

un sistema GC/MS/FID utilizando fluoranteno como patrón interno. Es posible identificar los

compuestos con el detector selectivo de masas para luego cuantificarlos usando el detector de

ionización de llama. Con esta metodología es posible cuantificar alrededor de 100 compuestos

presentes en el bio-oil, utilizando normalización interna con factores de respuesta relativo como

método de cuantificación. La principal desventaja es que esta cuantificación es posible de utilizar

principalmente en detectores como el FID, por presentar una mayor estabilidad. Sin embargo en un

detector selectivo de masas la variabilidad de los factores de respuestas es alta, por lo que se

necesita el uso de curvas de calibración con patrón interno.

Uno de los objetivos de este trabajo es la implementación de un método basado en el descrito, pero

utilizando un sistema GC/MS, sin acoplar un segundo detector como el FID. Esto implica que tanto

la identificación como la cuantificación deben ser realizadas usando el detector de masas, mientras

que en el sistema convencional, usando el detector FID se realiza la cuantificación. Para ello fue

necesario construir curvas de calibrado para cada compuesto en estudio, usando fluoranteno como

patrón interno. Considerando la gran diversidda de compuestos que se pueden identificar y

cuantificar por esta metodología, en este trabajo se priorizaron aquellos que representaban un mayor

interés para los objetivos de esta tesis, siendo acetol, hidroxiacetaldehído (HAA), ácido acético,

ácido propiónico, 2-furaldehído, 2(5H)-furanona, guaiacol, vainillina y levoglucosano los

compuestos considerados, ya que representan principal interés hacia la obtención de productos

químicos desde el bio-oil.

Capítulo 4


El objetivo de esta parte del trabajo fue la transferencia tecnológica de una metodología de análisis

general de bio-oil y sus fracciones, con ciertas modificaciones, para lograr su caracterización

rápida.

4.3 Materiales y métodos

4.3.1 Reactivos

Ácido propiónico > 99,5 %, 2-furaldehído 99 %, 2(5H)-furanona 98 %, guaiacol, acetol 90 %,

fluoranteno 99 % y glicolaldehído dímero cristalino fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis

MO, USA). Ácido acético glacial 100% anhidro p.a, Acetona (SupraSolv), vainillina cristalino p.a,

y levoglucosano fueron adquiridos en Merck (Darmstadt, Germany).

4.3.2 Instrumentación

Sistema GC/MS/FID

El sistema GC/MS/FID estaba compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-

Packard con inyector split/spltless. Acoplado en forma paralela se contaba con un FID y un detector

MS HP 5972. Las muestras se inyectaban con un autosampler multifuncional CTC Analytics,

Combi PAL y el sistema estaba controlado por el programa ChemStation G1701DA y el programa

Cycle composer 1.4.0 para el autosampler. La identificación de los componentes se realizó con el

programa Mass Finder 4 comparando el índice Kovat’s y los espectros de masas con los de la

librería NIST y la librería desarrollada en el Institute for Wood Technology and Wood Biology.

Sistema GC/MS

El sistema GC/MS estaba compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-

Packard (Palo Alto, CA, USA) equipado con un inyector split/splitless, detector de selectivo de

masas HP 5973 y autosampler Combi PAL CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El

sistema es controlado por MSD ChemStation G1701AA, versión D.03.00.611 y el programa Cycle

Composer versión 1.6.0 para el autosampler.

4.3.3 Condiciones cromatográficas

Sistema GC/MS/FID

Según lo descrito previamente por A. Azeez et al4. Se utilizó una columna Varian DB-1701 de 60

m x 0.25mm x 0.25 μm. El programa de temperatura fue de 45 °C por 4 minutos, hasta 280 °C

(razón de 3 °C min-1

) manteniéndose constante a 280 °C por 20 minutos. Se utilizó como gas de

arrastre helio con un flujo constante de 2.0 mL min-1

. La temperatura del FID fue de 280 °C. Los

parámetros de la detección por MS fueron: modo SCAN, solvente delay de 5 minutos; energía de

ionización de 70 eV y el volumen de inyección fue 1.0 uL

Capítulo 4


Sistema GC/MS

Se utilizó una columna Varian VF-1701 de 60 m x 0.25mm x 0.25 μm. El programa de temperatura

fue de 45 °C por 4 minutos, hasta 60 °C (razón de 1 °C min-1

) seguido por una rampa de 3 °C min-1

hasta 280 °C, manteniéndose por 20 minutos. Se utilizó como gas de arrastre helio a un flujo

constante de 2.0 mL min-1

. Los parámetros de detección por MS fueron: modo SCAN, solvente

delay de 3 minutos, con m/z entre 15-220 y desde 5.5-6.0 minutos m/z entre 30-31. La energía de

ionización fue de 70 eV y el volumen de inyección de 1.0 uL.

4.3.4 Preparación de muestras de bio-oil crudo y fracciones

Para ambos sistemas cromatográficos las muestras de bio-oil crudo, fracciones orgánicas y acuosas

fueron masadas (20-60 mg) y llevadas a 1 mL con una solución de estándar interno fluoranteno

(200 mg L-1

) en acetona.

4.3.5 Identificación y cuantificación

En el sistema GC/MS/FID la identificación fue realizada con el detector de masas, comparando los

espectros de masas y el índice Kovat’s de cada compuesto. La cuantificación se realizó utilizando la

información del detector FID, empleando factor de respuesta relativo con estándar interno de

fluoranteno.

En el sistema GC/MS, tanto la identificación y la cuantificación se realizó con los datos

proporcionados con el detector de masas. Sin embargo la cuantificación se realizó por curva de

calibrado con estándar interno de fluoranteno entre concentraciones de 0.01 y 1.6 mg mL-1

para

cada uno de los compuestos estudiados.

4.3.6 Muestras y fracciones

El objetivo general de los fraccionamientos fue la evaluación de diferentes solvente, hacia la

extracción de ácidos orgánicos, azúcares, aldehídos. Como también la separación de la lignina

pirolítica del bio-oil en los procesos de extracción. El objetivo final de los fraccionamientos es la

búsqueda de condiciones que permitan la separación de compuestos de interés para luego a escala

piloto y convertir al bio-oil en una fuente de este tipo de compuestos. En ambos sistemas, se

analizaron diferentes fraccionamientos que se detallan a continuación

4.3.6.1 Sistema GC/MS/FID

Se realizaron análisis a muestras de bio-oil crudo “J” y diferentes fracciones empleando como

solventes: agua, n-butanol y n-pentanol. En la Figura 4.1 se muestra un esquema del

fraccionamiento del bio-oil J.

Capítulo 4


Figura 4.1 Esquema de fraccionamiento de bio-oil J. (Fraccionamiento realizado en UDT)

Bio-oil Jn-butanol + NaHCO3

n-butanol + agua

agua n-pentanol + agua

F. acuosa

F. orgánicaF. acuosa

F. orgánica

Lignina

pirolíticaF. orgánicaF. acuosa F. acuosa

M2

M1

M3

M4

M5

Las fracciones analizadas fueron M1, M2, M3, M4 y M5, el detalle de cada muestra se explica a

continuación:

M1: 117.4 g de bio-oil J con 0.86 g de n-butanol se dispersaron en 99.528 g de agua. Separación

por decantación, muestra de fase acuosa.

M2: Se dispersan 117.11 g de bio-oil en 49.73 g de agua. La fase acuosa resultante se utiliza para

dispersar otros 116.27 g de bio-oil. Muestra de fase acuosa resultante. Se esperan altas

concentraciones de los compuestos del bio-oil soluble en agua, pero también puede tener más

lignina pirolítica solubilizada.

M3: Extracción de 119.13 g de bio-oil J con 40.5415 g de n-pentanol y 49.8848 g de agua. La fase

orgánica resultante se lava con 49,9 g de agua. Muestra de la fase orgánica lavada. Se espera que

contenga pocos compuestos volátiles, pocos azúcares, ácidos y toda la “lignina”.

M4: 116.7 g de bio-oil se mezclan con 40.1406 g de n-butanol y se extraen con 50.773 g de

solución de NaHCO3 al 5%. La fase acuosa salina se extrae (lava) sólo una vez con 40.5319g de n-

butanol. Muestra de la fase acuosa salina. Se espera que tenga glicolaldehído, acetol, butanol y

levoglucosano y muy pocos otros compuestos.

M5: Muestra de fase butanol correspondiente al lavado de la fase acuosa salina (ver muestra M4).

Se espera que tenga poco glicolaldehído, acetol, butanol y levoglucosano.

4.3.6.2 Sistema GC/MS

Se analizaron muestras de bio-oil crudo “L” y las fracciones con solventes como agua, acetato de

butilo y metil isobutil cetona. La cuantificación fue realizada por calibración interna y con

fluoranteno4 como estándar interno. En la figura 4.2 se muestra el esquema de fraccionamiento

utilizado.

Capítulo 4


Figura 4.2 Esquema de fraccionamiento de bio-oil L. (Fraccionamiento realizado en UDT)

L1

Bio-oil L

Agua

Acetato de butilo

3 extracciones

F. acuosa

Lignina

pirolíticaF. acuosa F. acuosa

Lignina

pirolítica

Agua

Metil isobutil cetona

3 extracciones

F. Orgánica

(1) extracción

F. Orgánica

(2) extracción

F. Orgánica

(3) extracción

F. Orgánica

(1) extracción

F. Orgánica

(2) extracción

F. Orgánica

(3) extracción

F. acuosa

L2 L3

L3.1 L3.0

L3.2

L3.3

L2.0

L2.1

L2.2

L2.3

4.4 Resultados y discusión

4.4.1 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS/FID

El uso de esta metodología permite una caracterización rápida del bio-oil, presentando una gran

utilidad en los métodos de fraccionamiento para la obtención de productos químicos. Con este

objetivo se evaluaron muestras de bio-oil crudo y diferentes fracciones de éste en los sistemas de

GC/MS/FID y GC/MS. A continuación se discuten los resultados obtenidos en cada caso.

En la Figura 4.3 se presenta el cromatograma por detección en FID de un bio-oil (bio-oil J). Como

se evidencia en ella, se identifican 53 compuestos, sin embargo en muchos casos la resolución es

pobre. Se observa bastante tailing por las diferentes velocidades en la transferencia de masas

producidas por la alta heterogeneidad en la polaridad de los compuestos presentes y el hecho que la

fase estacionaria empleada no es apolar, si no que de polaridad intermedia. Además para algunos

compuestos no se observa una adecuada sensibilidad del método, lo cual no permite su correcta

cuantificación. A pesar de estas limitaciones, mediante el método de normalización interna con

factores de respuesta relativa, es posible estimar el % p/p de compuestos o grupos de compuestos de

interés. A este respecto, es necesario precisar que fue posible identificar un 95.3 % de las señales

obtenidas en el cromatograma. Además fue posible la cuantificación del 21.3 % en peso húmedo de

diferentes compuestos en la muestra de bio-oil J y la determinación de los principales compuestos

de interés como el ácido acético, acetol, hidroxiacetaldehído y levoglucosano. Sin embargo, no

todos los compuestos de mayor concentración en el bio-oil se pueden determinar bien por esta

metodología, en especial compuestos polares de bajo peso molecular de los principales grupos

químicos como formaldehído, acetaldehído, ácido fórmico y azúcares como celobiosano, xilosa y

arabinosa.

Capítulo 4


Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J obtenido por la detección por FID. Desde 0 a 25 minutos

Capítulo 4


6.61 Acetaldehyde, hydroxy-6.91 Formicacid

7.67 Aceticacid

9.11 Acetol (Hydroxypropanone)

11.86 Propanoicacid

13.16 Cyclopentanone13.41 Butanone, 1-hydroxy-2-

13.65 Propionaldehyde, 3-hydroxy

15.22 Furaldehyde, 3-

15.87 Butandial or Propanal

16.22 Butyric acid16.44 Cyclopenten-1-one, 2-

16.60 Furaldehyde, 2-

17.14 Diacetone alcohol

18.49 impurity in Acetone

19.17 Acetyloxypropane-2-one, 1-

19.61 unknown compound (similar to 2-Butanone spectrum)

20.18 Ethanone, 1-(2-furanyl)-

21.54 unknown compound (unspecific spectrum)

22.32 Cyclopentene-1-one, 2-hydroxy-2-

22.82 Acetonylacetone (Hexandione, 2,5-)

23.65 Furaldehyde, 5-methyl-2-

24.36 Cyclopenten-1-one, 3-methyl-2-24.62 Butyrolactone, gamma-

7.5

010.0

012.5

015.0

017.5

020.0

022.5

0m

in

0.5

e6

1.0

e6

1.5

e6

2.0

e6

cts

.

[CT

OIL

-FID

1A

-in

teg

] TIC

#1

Capítulo 4


Continuación Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J desde 25 a 50 minutos.

25.13 Furanone, 2(5H)-

27.02 Cyclopenten-1-one, 2,3-dimethyl-2-27.31 Furanone, 3-methyl-2(5H)-

27.89 sugarderivedcompound

29.00 Phenol

29.62 Guaiacol

30.10 Cyclopenten-1-one, 3-ethyl-2-

31.32 Cresol, o-

32.00 sugar derived compound with Phenol, dimethyl-

32.55 Benzaldeyde, hydroxy-methyl-

33.07 Cresol, m-

33.61 Lactone derivative

34.47 Guaiacol, 4-methyl34.87 Phenol, 2-ethyl-

35.22 Phenol, 2,4-dimethyl-

36.10 Phenol, 2,4,6-trimethyl-

36.84 Phenol, dimethyl-overlapping with Phenol, C4-37.11 Phenol, 4-ethyl-

38.27 Phenol, 3,5-dimethyl-

38.97 Phenol, ethyl-methyl-

39.75 Inden-1-one, 2,3-dihydro-1H-40.08 Dianhydro-alpha-D-glucopyranose, 1,4:3,6-

40.92 Phenol, propyl-

42.56 Phenol compound (perhaps ethyl-methyl-or ethyl-dimethyl-)

47.36 Vanillin

47.93 Hydroquinone

48.35 Benzaldehyde, hydroxy-with overlapping compounds

49.52 Benzenediol, methyl-

27.5

030.0

032.5

035.0

037.5

040.0

042.5

045.0

047.5

0m

in

0.5

e6

1.0

e6

1.5

e6

2.0

e6

cts

.

[CT

OIL

-FID

1A

-inte

g] T

IC #

1

Capítulo 4


Continuación Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J desde 50 a 75 minutos.

56.61 Anhydro-beta-D-glucopyranose(Levoglucosan)

68.74 Fluoranthene

52.5

055.0

057.5

060.0

062.5

065.0

067.5

070.0

072.5

0m

in

0.5

e6

1.0

e6

1.5

e6

2.0

e6

cts

.

[CT

OIL

-FID

1A

-inte

g] T

IC #

1

Capítulo 4


El ácido fórmico presenta una baja sensibilidad en un detector FID junto con la co-elución con el

HAA, siendo recomendable cuantificar este compuesto en un detector de masas. Sin embargo, el

ácido fórmico también puede presentar problemas de retención, al ser un compuesto altamente

polar, evitando su retención en columnas apolares y produciendo el efecto tailing en columnas de

mediana polaridad.

En cuanto al análisis cuantitativo de los compuestos de interés, en la Tabla 4.1 se muestran los

resultados generales obtenidos en las diferentes muestras analizadas en el sistema GC/MS/FID

usando las condiciones descritas en materiales y métodos.

Tabla 4.1 Concentraciones de compuestos de interés identificados en bio-oil y sus fracciones.

Compuestos

% p/p en base húmeda

Bio-oil J M1 M2 M3 M4 M5

Acido acético 3.7 2.9 3.5 1.4 NDa 0.05

Hidroxiacetaldehído (HAA) 3.4 2.8 3.7 0.6 2.9 0.8

Acetol 2.9 1.8 2.9 0.4 1.9 1.2

Levoglucosano 3.6 1.6 2.3 0.1 1.6 0.6

Totales

Cetonas no aromáticas 5.1 2.6 4.3 1.5 2.4 1.7

Furanos 1.1 0.5 0.8 0.9 ND 0.3

Catecoles 0.2 0.03 ND

ND

0.06 ND

Guaiacoles 0.2 0.01 0.02 0.07 ND

0.01

Fenoles derivado de lignina 1.2 0.2 0.31 1.5 ND 0.08 a No detectado

Los resultados obtenidos del análisis de bio-oil J muestran un bajo porcentaje de

hidroxiacetaldehído (3.4 %) en comparación con niveles reportados en literatura, donde se

describen porcentajes cercanos al 10.0 %. Además, llama la atención que el ácido acético se

encuentra en una mayor proporción que el HAA, lo que no es frecuente en este tipo de muestras.

Por otro lado, análisis realizados por el método químico de oximación mostraron que había un 50 %

más de grupos carbonilos en bio-oil, y considerando que el HAA es el aldehído que se encuentra en

mayor porcentaje, se estaría observando que el método de inyección directa de bio-oil estaría

presentando una subestimación de la concentración de este compuestos. Si bien el método químico

por oximación presenta inconvenientes al utilizarlo en muestras de bio-oil, por la adición de

diferentes reactivos que pueden causar interferencias o reacciones cruzadas en el análisis, si puede

presentar una estimación general de la cantidad de grupos carbonilos presentes. Esto demuestra la

necesidad de evaluar la cuantificación del HAA por una metodología analítica alternativa, dado que

este método de cuantificación presenta ciertas limitaciones.

Por otro lado, se observa que, a excepción del HAA, los otros compuestos de interés detectados en

bio-oil presentan concentraciones cercanas a las reportadas en bibliografía3.

Capítulo 4


En cuanto a las fracciones, las observaciones más interesantes son:

- La fracción acuosa de la extracción con n-butanol/agua (M1) contiene altos niveles de ácido

acético y levoglucosano (aproximadamente el 70 % del presente en bio-oil). La principal

ventaja se muestra en que es posible la separación de la lignina pirolítica, lo que se

evidencia por el bajo porcentaje de fenoles derivados de lignina, ya que la lignina pirolítica

tiene mayor afinidad por la fase orgánica.

- La fracción acuosa M2, que proviene de la directa separación de fases ocurrida al agregar

agua al bio-oil, muestra las concentraciones más altas de compuestos de interés, sin

embargo también presenta una mayor solubilización de la lignina pirolítica, impidiendo el

uso directo de esta fracción para la obtención de estos compuestos.

- La fracción orgánica M3, proveniente de la extracción con n-pentanol/agua, presenta

concentraciones bajas, por lo que se postula que hay un reparto equitativo en ambas fases,

lo que permite concluir que no es un solvente adecuado para la extracción de estos

compuestos, no obstante presenta un ventaja al solubilizar un alto porcentaje de lignina

pirolítica, en comparación con el n-butanol.

- Con respecto a la extracción con n-butanol/ NaHCO3 al 5 %, donde M4 es la fase acuosa y

M5 la orgánica, se observa que el uso de una sal redujo la solubilidad del agua en butanol,

favoreciendo la neutralización y la extracción de los ácidos orgánicos en M4. No obstante

en M5 permanecen concentraciones importantes de los compuestos de interés como acetol,

HAA y levoglucosano, por lo que esta extracción no representa una vía de separación de

estos compuestos, y sólo serviría para la extracción de ácidos orgánicos, los cuales como se

observa, quedan neutralizados en la fase acuosa.

Considerando los resultados obtenidos, queda de manifiesto la necesidad de desarrollar

metodologías en las cuales sea posible la determinación de los compuestos de interés industrial en

la matriz de bio-oil. Sin embargo es necesaria la implementación de esta metodología en el

laboratorio de Análisis Instrumental en un sistema GC/MS, para obtener una caracterización general

del bio-oil, y lograr comparar los resultados obtenidos con las futuras metodologías desarrolladas. A

continuación se detalla la metodología implementada en un sistema GC/MS

4.4.2 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS

Hasta la fecha, el uso de la cromatografía gaseosa con detección de masas ha sido de gran utilidad

al momento de realizar una caracterización del bio-oil en conjunto con técnicas espectroscópicas.

De esta forma han logrado identificar los diferentes compuestos (más de 100 compuestos), dando

un especial énfasis en el estudio de la composición en la fracción de la lignina pirolítica, diferentes

fracciones realizadas para la separación de compuestos y en la evaluación en el proceso de

producción del bio-oil 5-10

. En todos los casos se ha empleado columnas capilares apolares y en

mayor orden columnas capilares de mediana polaridad. Considerando la complejidad de la muestra,

y la presencia de compuestos de diferentes polaridades, el uso de una columna de mediana

polaridad permite la separación de la mayor cantidad de compuestos en el bio-oil, en especial los

de mayor interés.

En este apartado se describen algunos análisis realizados a muestras de bio-oil, como a diferentes

fracciones por un sistema GC/MS, para ello fue necesaria la implementación y optimización del

método propuesto, considerando que la identificación de compuestos y la cuantificación, se

Capítulo 4


realizarían con la detección selectiva de masas. Por ello se optimizaron tanto el programa de

temperatura como los parámetros de detección.

Previo a la implementación del método propuesto, se evaluó una columna RTx-5 de 105 metros de

largo, con una pre-columna Hidroguard deactivation de 5 metros de largo, junto con la evaluación

de diferentes programas de temperaturas. El uso de esta columna fue con el objetivo de evaluar una

columna apolar, con mayor número de platos teóricos, esperando la obtención de una mayor

resolución cromatográfica considerando el gran número de compuestos presentes. En la Figura 4.4

se muestra el cromatograma de un amuestra de bio-oil obtenido con la columna mencionada.

Figura 4.4 Cromatograma de una muestra de bio-oil crudo por GC/MS, en modo SCAN, utilizando

una columna RTx-5 de 105 metros de largo. Señales: (1) ácido fórmico e hidroxiacetaldehído; (2)

ácido acético y acetol y (3) levoglucosano. Compuestos de derivados de la lignina pirolítica entre 30

y 88 minutos.

8 . 0 0 1 0 . 0 01 2 . 0 01 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 03 2 . 0 03 4 . 0 00

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

4 5 0 0 0

5 0 0 0 0

5 5 0 0 0

6 0 0 0 0

6 5 0 0 0

7 0 0 0 0

T im e - - >

A b u n d a n c e

T I C : B I O M E O H . D

12

3

De esta forma queda de manifiesto que en el caso del bio-oil, el cual presenta una gran variabilidad

de compuestos con diferentes características químicas, el empleo de columnas cromatografías con

una mayor polaridad pueden mejorar la separación cromatográfica logrando una mejor resolución

de los compuestos. Otra posible opción empleando esta columna, es la derivatización de los

compuestos o grupos químicos, para la obtención de derivados con las características químicas

apropiadas para ser separados en una columna apolar.

Según lo expuesto con anterioridad y empleando una columna de mediana polaridad como VF-1701

se evaluó el programa de temperatura propuesto por A. Azeez et.al4, el cual mostró problemas de

separación entre HAA y ácido fórmico (ver Figura 4.5). Si bien el ácido fórmico no puede ser

cuantificado por este método, ya que no presenta un buen comportamiento cromatográfico por sus

características químicas, se hace necesaria la evaluación de un programa de temperatura que

permita la separación de éste con el HAA, con el fin de evitar un error en la cuantificación del

HAA. Los diferentes programas evaluados no mostraron una separación adecuada para estos

compuestos. Como medida alternativa se realizó una razón selectiva de masas en el tiempo de

Capítulo 4


retención correspondiente al hidroxiacetaldehído (m/z 31, mayoritaria en la fragmentación del

HAA) disminuyendo así, la señal producida por el ácido fórmico.

Figura 4.5 Cromatograma de bio-oil por GC/MS, separación entre hidroxiacetaldehído (1) y ácido

fórmico (2).

Abundancia

Tiempo (min)

1

2

Con el método implementado y optimizado, se realizaron análisis a diferentes muestras de bio-oil

y sus respectivas fracciones. No obstante la cuantificación de los compuestos en el bio-oil se enfocó

sólo en los compuestos de mayor interés como HAA, ácido acético, acetol, ácido propiónico, 2-

furaldehído, 2(5H)-furanona y levoglucosano. Este hecho no impide el uso de esta metodología para

otros compuestos ya que también sería posible su cuantificación. En la Figura 4.6 se muestra un

cromatograma de una muestra de bio-oil crudo, con los principales compuestos identificados.

Para la cuantificación se evaluaron los siguientes procedimientos: curva de calibrado, curva de

calibrado con estándar interno, adición estándar y factores de respuesta relativos. Los factores de

respuesta relativos para cada compuesto presentaron una alta variabilidad entre las inyecciones

realizadas. La adición estándar presentó una baja linealidad. Se postula que se debe a la adición de

reactivos en un sistema inestable como lo es la matriz de bio-oil. La cuantificación empleando

curvas de calibrado también presentó una alta variabilidad en cada inyección, la cual fue mejorada

empleando el estándar interno. No obstante, considerando la alta sensibilidad del detector de masas,

es necesaria la evaluación continua de estas curvas, de tal forma de obtener resultados confiables.

Capítulo 4


Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN desde los 6

minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 0 a 40 minutos.

Hidroxiacetaldehído

Ácido acético

Acetol

2-Furaldehído

2(5H)-Furanona

Fenol

Ácido propiónico

Capítulo 4


Continuación Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN

desde los 6 minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 40 a 80 minutos.

2-metil fenol

4-metil fenol

Vainillina

Levoglucosano

Fluoranteno

(estándar interno)

Capítulo 4


Posteriormente, se procedió al estudio de las fracciones del bio-oil. El fraccionamiento realizado

estuvo enfocado principalmente a la separación de compuestos como ácidos orgánicos y azúcares

desde la fracción acuosa, empleando solventes como acetato de butilo y metil isobutilcetona. En la

Tabla 4.2 se muestra el detalle de los resultados obtenidos para las diferentes fracciones y la

muestra de bio-oil crudo.

Tabla 4.2 Resultados obtenidos para el bio-oil L y las diferentes fracciones. Los resultados están

expresados en % p/p húmedo.

Muestras HAAa Ácido

acético Acetol

Ácido

propiónico Levoglucosano

L1 (Bio-oil L) 10.8 3.4 6.6 0.2 3.4

L2 6.6 2.8 4.4 0.2 1.7

L3 6.2 2.0 3.3 0.1 2.0

Extracción con acetato de butilo

L2.0 fase acuosa 6.0 1.7 3.1 NDb

1.8

L2.1 fase orgánica 0.6 1.2 0.9 ND ND



Extracción con metil isobutilcetona

L3.0 fase acuosa 6.0 1.9 3.2 0.1 1.9



L3.3 fase orgánica 0.3 0.9 0.8 ND ND aHidroxiacetaldehído

bNo detectado: ND

Respecto a las fracciones analizadas, se puede concluir que el uso de metil isobutil cetona como

solvente de extracción presenta una mayor eficiencia en la recuperación del ácido acético respecto a

lo que se logra con acetato de butilo. Con tres extracciones de metil isobutil cetona es posible lograr

una recuperación cercana al 85 % de los ácidos presentes en la fase acuosa.

Ambos solventes permiten separar los azúcares de ambas fases. El solvente metil isobutil cetona

permite una mejor recuperación de ácidos orgánicos desde la fase orgánica. De esta forma, se puede

eliminar el solvente y extraer los ácidos con un menor porcentaje de agua que si se realizara

exclusivamente la extracción de ácidos con agua. Por otra, parte es posible la separación de los

azúcares en la fase acuosa, ya que estos no presentan un reparto en la fase orgánica.

En la Figura 4.7 se muestran tres cromatogramas por GC/MS correspondientes a bio-oil crudo,

fracción acuosa y una fracción orgánica.

Capítulo 4


Figura 4.7 Cromatogramas por GC/MS en modo SCAN de las muestras de bio-oil crudo L1 A);

fracción acuosa L2 (B) y fracción orgánica L2.1. Señales: (1) hidroxiacetaldehído, (2) ácido acético,

(3) acetol, (4) ácido propiónico, (5) levoglucosano y (6) fluoranteno (patrón interno).

C

1

2

3

6

Deri

vados d

e la l

ignin

a p

irolí

tica

Solv

ente

1

2

3

4

56

Deriv

ad

os d

e la l

ign

ina p

iro

líti

ca

A B

12

3

4

56

Deriv

ad

os d

e l

a l

ig

nin

a p

iro

lítica

Capítulo 4


Un aspecto importante a considerar es que con el uso de una columna de mediana polaridad, los

compuestos derivados de la lignina pirolítica, presentan menor interferencia, y a la vez una mejor

resolución que los observados en la Figura 4.4 con el uso de una columna apolar, permitiendo de

esta forma la cuantificación de los componentes restantes y que presentan un porcentaje importante

en el bio-oil.

Al hacer una comparación de las concentraciones de los principales compuestos de interés en bio-

oil, determinada por ambos sistemas GC/MS y GC/MS/FID, se observa que tanto para ácido acético

y levoglucosano, las concentraciones son comparables. De acuerdo a ello, se puede postular que a

pesar de ser dos muestras diferentes de bio-oil, pero dado que ambas tienen el mismo origen

(aserrín de Pinus radiata), tanto desde el punto de vista de materia prima como proceso de

producción, se pueden comparar. Sin embargo, tanto para HAA como para el acetol, el método por

GC/MS reporta mayores porcentajes de ambos compuestos que el método por GC/FID. Esto es

atribuible a la mayor selectividad del detector MS y principalmente a que efectivamente se logra

obtener una calibración externa adecuada, considerando solo señal de hidroxiacetaldehído y no de

otros interferente.

4.5 Conclusiones

La transferencia tecnológica del método mediante GC/MS/FID para caracterización de bio-oil y/o

sus fracciones es posible caracterizar en un sistema que sólo cuenta con un detector selectivo de

masas (GC/MS). Incluso es más eficiente desde el punto de vista de la exactitud, ya que el sistema

MS permite una mayor selectividad para la detección, lo que incide en una mayor exactitud en la

cuantificación por eliminación selectiva de señales interferentes que coeluyen con los compuestos

de interés. Esto se puede confirmar al comparar los resultados con un método independiente, como

lo es el método de oximación, que detecta en forma selectiva grupos carbonilos.

Los sistemas de fraccionamiento del bio-oil mediante el uso de solventes, en mayor o menor forma

permiten la separación de los compuestos de interés para posteriores aplicaciones industriales.

Dentro de ellos, el agua, n-butanol y metil isobutil cetona serían los solventes que mejor permiten

estos procesos de separación. Sin embargo, el uso de agua como solvente de extracción implica una

mayor dilución de los compuestos presentes en el bio-oil y una mayor dificultad al extraer los

compuestos desde la fase acuosa, a diferencia de los solventes orgánicos, los cuales presentan una

mayor facilidad al extraer los compuestos desde dichas fases.

Los bio-oil analizados con la metodología transferida, muestran interesantes porcentajes de HAA,

levoglucosano y ácidos orgánicos, observándose concentraciones similares a las descritas, y

representando una fuente interesante de estos compuestos presentes en el bio-oil crudo.

Si bien esta metodología permite la cuantificación de un gran número de compuestos en el bio-oil,

no permite la cuantificación de otros compuestos de interés como el ácido fórmico, aldehídos de

bajo peso molecular y algunos azúcares, dejando de manifiesto la necesidad de desarrollar

metodologías con una alta selectividad que permitan la cuantificación de los compuestos

mencionados.

Capítulo 4


4.6 Bibliografía

1. A. Oasmaa, E. Kuoppala, Y. Solantausta, Fast Pyrolysis of Forestry Residue. 2.

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3. A. Oasmaa, D. Meier, Norms and standards for fast pyrolysis liquids 1. Round robin test, J.

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of bio-oil from rice husks with fast pyrolysis in a fluidized-bed reactor, Bioresource

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7. R. Lu , G.P. Sheng, Y.Y. H, P. Zheng, H. Jiang, Y. Tang, H.Q. Yu, Fractional

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oil from Pine Sawdust Fast Pyrolysis Using a Fluidized-Bed Reactor, Energy Fuels (2010),

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9. P. Das, T. Sreelatha, A. Ganesh, Bio oil from pyrolysis of cashew nut shell-characterisation

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the product yields and bio-oil properties, J. Anal. Appl. Pyrolysis 84 (2009) 151-156.

Capítulo 5


CAPÍTULO 5

DESARROLLO DE METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES EN

BIO-OIL POR HPTLC

Los azúcares en bio-oil se encuentran en 5-10 % en peso, la importancia de estos compuestos a

nivel nacional corresponde a las aplicaciones en la industria farmacéutica, en la producción de

polímeros y resinas especiales, surfactantes glucósidicos y poliglucosas no hidrolizables. Otra

aplicación que no requiere anhidro-azucares puros y para la cual existe actualmente un mercado es

la metabolización por microorganismos para la producción de ácidos carboxílicos o etanol (Olson &

Free 2007)1.

La determinación de azúcares en bio-oil, en particular el levoglucosano se realiza por inyección

directa en GC/MS, de bio-oil diluido con acetona y empleando fluoranteno como patrón interno

(columna VF-1701). La ventaja de esta metodología es que no necesita previa derivatización o

tratamiento de la muestra de bio-oil, los valores encontrados para el levoglucosano por este método,

fluctúan entre los 3-5 %. Al realizar una inyección directa de la solución de bio-oil, sin tratamiento

previo, no tan solo ingresarán al sistema cromatográfico compuesto de mediana o baja volatilidad,

si no que un gran porcentaje corresponde a lignina pirolítica (24 %), la cual con el tiempo puede

quedar adherida en las paredes de la columna capilar, disminuyendo, la vida útil de la columna.

También se ha reportado el uso de HPLC con detección IR para otros azúcares en el bio-oil. Los

azúcares reportados por esta metodología son: levoglucosano, glucosa, xilosa y celobiosano con

porcentajes alrededor de un 3-7 % para el levoglucosano, seguido por la xilosa y celobiosano con

porcentajes cercanos al 1-2 %. Estos valores son proporcionados por test “Round Robin” realizado

el año 2005, en el cual sólo 3 laboratorios realizaron la experiencia, uno de ellos por GC (no se

especifica metodología) y los dos restantes por HPLC (no se especifica metodología), los análisis

por GC sólo se determinó levoglucosano, en los análisis por HPLC, fue posible determinar

levoglucosano, xilosa y celobiosano, siendo este último, el segundo azúcar con mayor porcentaje en

bio-oil.

La determinación de azúcares por HPLC, con detección IR puede ser una opción para determinar no

tan sólo el levoglucosano, si no que otros azúcares presentes en el bio-oil. La principal desventaja es

las interferencias producidas por la lignina pirolítica y los compuestos restantes del bio-oil.

Al desarrollar una metodología por HPTLC, se tomaron en cuenta principalmente los siguientes

factores: rapidez de análisis, costos (reactivos e instrumentales) y tratamiento de la muestra. La

técnica de HPTLC está ampliamente descrita en la determinación de diferentes tipos de azúcares, en

diferentes tipos de matriz, en el caso del levoglucosano y el celobiosano no hay información al

respecto de la determinación por esta técnica, ni tampoco en matriz de bio-oil (esta última sólo se

menciona una evaluación por TLC).

Capítulo 5


De acuerdo a estos antecedentes, se desarrolló una metodología capaz de determinar los principales

azúcares del bio-oil, sin tratamiento previo de la muestra, y aplicable a bio-oil crudo, como a

fracciones orgánicas y acuosas, incluso a la fracción de lignina pirolítica.

HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY DETERMINATION OF

CELLOBIOSAN AND LEVOGLUCOSAN IN BIO-OIL OBTAINED BY FAST PYROLYSIS

OF SAWDUST

Catherine Tessini, Mario Vega, Niels Müller, Luis Bustamante, Dietrich von Baer, Alex Berg, Claudia Mardones.

Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 3811–3815

5.1 Abstract

In this work, high performance thin layer chromatography (HPTLC) is applied to the determination

of sugars in fast pyrolysis liquids (bio-oil) and fractions thereof. The proposed procedure allows the

separation of anhydrosugars levoglucosan and cellobiosan, as well as glucose, arabinose, xylose and

cellobiose. Pre-treatment and derivatization of samples are not necessary and volatile compounds

present in bio-oil do not interfere with sugar analysis. The detrimental effect of the complex bio-oil

matrix on columns and detector lifetime is avoided by using disposable HPTLC plates. Prior

screening of glucose, present especially in aged and aqueous bio-oil fractions, is required to

quantify cellobiosan without interference. Concentrations of levolucosan and cellobiosan in bio-oil

samples obtained from Pinus radiata sawdust was ranged between 1.27 % - 2.26 % and 0.98 %-

1.96 % respectively, while a bio-oil sample obtained from native wood contained a higher

levoglucosan concentration.

5.2 Introduction

Bio-oil, the liquid product of fast biomass pyrolysis, is attracting considerable interest as a

renewable source of liquid fuels and chemicals. There are several methods for thermal biomass

conversion. One of them is fast pyrolysis, which maximizes the yield of this liquid fuel2. It is a

high-density fuel that can be transported and used by conventional systems like power generation

turbines3. The biomass is decomposed to generate mostly vapors, aerosols and some charcoal. After

cooling and condensation, a dark brown liquid is formed (crude bio-oil), with yields of up to 75%

wt (on a dry-feed basis) 2-6

.

Characterization of bio-oil is a challenge and several analytical techniques must be applied to obtain

a detailed product distribution which is still incomplete. Only about 40% of bio-oil compounds can

be quantified by gas chromatography (GC), especially volatile and thermostable compounds7, 8

. On

the other hand, 10-15% polar and nonvolatile compounds have been determined by high

performance liquid chromatographic (HPLC) 7, 8

. Such complexity requires laborious sample pre-

treatment, including sequential extractions, and derivatization8. However, for the development of

bio-oil applications, simple and direct analytical methods for bio-oils and their fractions are

preferred.

The ‘sugar’ fraction of bio oil has particular interest as a fuel and as a source of chemicals. As

chemical, levoglucosan (1,5-anhydro-β-D-glucopyranose) and cellobiosan (1,6-anhydro-β-

Capítulo 5


cellobiose) may have pharmaceutical applications, for example, in the synthesis of macrolide

antibiotics9. The use of anhydrosugars in polymer production, non-ionic surfactants and non-

hydrolysable polyglucose has also been described10-11

. Due to the reactivity and sticking tendency12

,

components of the ‘sugar fraction’ should be separated from the whole bio-oil to improve its fuel

properties. Anhydrosugars present in bio-oil can be hydrolysed to cellobiose and glucose1, 12

and be

used for ethanol production.

The main compounds in the ‘sugar’ fraction are levoglucosan (Figure 5.1A) and cellobiosan (Figure

5.1B) with concentrations between 3-6% and 1-3%, respectively. Low concentrations of glucose,

xylose, arabinose and cellobiose have also been reported7. The concentrations of levoglucosan and

cellobiosan, product of cellulose depolymerization, depend on pyrolysis conditions and the raw

material employed, with maximum yields obtained at around 500 ºC. Pretreatments of biomass by

hydrolysis or demineralization can substantially improve the yields of sugars13

.

Figure 5.1 Levoglucosan (A) and cellobiosan (B) chemical structures.

For rough determination of ‘sugars’ in bio-oil, a method based on solvent fractionation of the water

soluble fraction and analysis by refractive index has been proposed12

. Levoglucosan determination

has been described using HPLC and especially GC/MS methods14, 15

. Identification of cellobiosan

has been described using GC/MS and HPLC in products of pyrolysate cellulose matrix, using

spectra libraries16, 17

. Silylation using TMS of bio-oil samples has also been tested for cellobiosan

detection by GC/MS18

. However, no quantification of sugars in bio-oil has been previously

described.

Other sugars, like monosaccharides, disaccharides and polysaccharides have of course been

determined in different matrices (e.g., food, drugs and human fluids) using high performance thin

layer chromatography (HPTLC) 19-23

. However, this technique has not been used extensively for

bio-oil analysis, or for anhydrosugar separation. The content of arabinose, galactose, glucose,

mannose and xylose has been determined and compared in acid hydrolysis products of woods by

three different chromatographic methods24

. These are borate complex anion-exchange

chromatography, anion-exchange chromatography in NaOH medium and HPTLC. Determination of

cellobiosan and levoglucosan by the latter has not been described before.

The main aim of this work is to determine sugars, especially anhydrosugars in bio-oil and fractions

thereof, by using a HPTLC technique. This offers great advantages in biomass pyrolysis research,

especially considering that bio-oils are complex matrices with different kinds of compound, some of

Capítulo 5


which can be retained in the HPLC column and damage it. For GC analysis, sugars need complex

derivatization procedures. On the other hand, bio-oil has many volatile compounds that will not

remain on the plate after sample application and will not interfere with sugar separation. HPTLC

has the additional advantage over HPLC that the separation layer (the plate) is used just once, so

compounds that are irreversibly bonded to the plate are not important. Because the separated

analyte remains on the plate after chromatography, multiple development procedures that definitely

improve separation can be used, giving reproducible and confident quantitative results, especially if,

as in this work, the Automatic Development Chamber (ADC2) is used.

5.3 Materials and methods

Reagents and standard

Levoglucosan (1,6-anhydro-β-D-glucopyranose) was obtained from Merck (Hohenbrunn,

Germany). Cellobiosan (1,6-anhydro-β-cellobiose) from Sussex Research Laboratories Inc.

(Ottawa, Canada). D-(+)-cellobiose was obtained from Sigma-Aldrich. L(+)-arabinose, D(+)-

xylose, D(+)-glucose, methanol (liquid chromatography grade), acetonitrile (liquid chromatography

grade), 1-butanol (Lichrosolv), aniline p.a, diphenylamine p.a, di-potassium phosphate anhydro p.a,

formic acid (98-100%) and orto-phosphoric acid (85%) p.a, were all obtained from Merck

(Darmstadt, Germany),. Deionized water (18 mΩ) was produced with a water purification system

Millipore Milli-Q (Bedford, MA, USA).

Instrumentation

The HPTLC system was constituted by a Scanner 3 spectrodensitometer, running winCATS 1.4.3

software, an automatic application band device ATS 4 and an automatic developing chamber ADC

2, all from CAMAG (Muttenz, Switzerland). Chromatographic plates were 20 cm × 10 cm silica gel

60 F254 HPTLC plates (extra thin) from Merck (Darmstadt, Germany), impregnated with

phosphate. Glucose screening method used the same HPTLC not impregnated plates. CAMAG TLC

Immersion Device III and a CAMAG TLC Plate Heather III were used for plate treatment and

visualization. Evaluation of different mobile phases used in separation of cellobiosan from glucose

was carried out using a HPTLC Vario Chamber.

5.4 Standard solutions and bio-oil samples

Stock solutions of sugars were prepared in methanol/water 70/30 v/v at 1.0 mg mL-1

. Bio-oil

samples and extracts were diluted 1:25 (v/v) in methanol. No other sample treatment was required

before HPTLC analysis.

The samples were weighted on analytical balance and dissolved in methanol. This last step was

carried out at the moment of analysis, because methanol can react over time with compounds

present in bio-oil. Generally, sugars can react with acids, esters or alcohols by acid catalysis25

; with

bio-oil at pH around 2-3, can react during storage of diluted samples.

Bio-oils samples (1, 2, 3 and 4) were produced in a bench–scale pyrolysis plant at the Metallurgical

Engineering Department of the University of Concepción. In each run, oven-dry sawdust was fed

into a fluidized bed reactor using nitrogen and pyrolyzed in contact with hot sand. After removing

Capítulo 5


char, bio-oil was condensed and collected in two catch pots. The first one collected was the main

liquid product after the condenser and cyclone; the second one collected was bio-oil drops trapped

in a demister. Bio-oil sample 1 and 4 were obtained by mixing the two liquid products, while bio-oil

2 and 3 were samples of the two liquids. Table 5.1 shows a summary of some of the physico-

chemical characteristics of the obtained bio-oils.

In addition, three bio-oil fractions were prepared from bio-oil 4 for ‘sugar’ analysis in different

matrices: a water insoluble lignin derived precipitate, an aqueous phase and an organic extract

obtained as described below.

Table 5.1 Physico-chemical properties of analyzed bio-oil samples obtained by pyrolysis at 500 °C

Bio-oil

samplesa

Sawdust

source

Viscosity (at

40ºC)

cSt

Density

(at 20ºC)

g/cm3

Total acids

mg KOH / g

Bio-oil 1 Pinus radiata 13.6 1.18 54



Bio-oil 4 Native wood 7.7 1.18 66 aBio-oil 2 corresponds to the main liquid product collected in catch pot A (after condenser and

cyclones); Bio-oil 3 is the liquid product received in catch pot B (demister). Bio-oil 1 and 4 are the

mixtures of products collected in catch pot A and B.

Bio-oil extraction with n-butanol

100 mL sample of bio-oil (bio-oil 4) was extracted with 50 mL of n-butanol and 50 mL of water.

The heavier, water-rich fraction was extracted again with the same mixture, and another time with

50 mL of n-butanol. The water-rich fraction (water phase) and the mixture of 3 n-butanol extracts

(butanol-phase) were analyzed.

Pyrolytic lignin

20 mL sample of bio-oil 4 was very slowly dispersed in 200 mL cold water (5 ºC) with the help of

an IKA T-25 Ultra-Turrax at 6000 rpm. The precipitate or “pyrolytic lignin”, was filtered off and

the filtrate was analyzed.

5.5 HPTLC quantification of main sugars

HPTLC silica-gel plates were impregnated with anhydrous di-potassium phosphate (0.2

M)/methanol 1:1 (v/v), using the TLC Immersion Device with a dipping speed of 2 cm s-1

and

dipping time of 8 s. The drying was carried out at 120 ºC for 20 minutes. Sample application was

done as 8 mm bands, using 0.1-1 uL of the standard solution (100-800 ng per band) in the

calibration. The chromatographic procedure was a multiple development (three times) with

water/acetonitrile 20/80 v/v as mobile phase26

. The development distance was 70 mm from the

lower edge of the plate. A solution containing 1.2 g of aniline, 1.2 g of diphenylamine, 10 mL of

phosphoric acid and 100 mL of methanol was used as chromogenic reagent27

. Post-chromatographic

derivatization on silica-gel was performed with the TLC Immersion Device using the same

Capítulo 5


condition as described before. Sugars were visible after 15 minutes in the plate heater at 120 °C.

Detection was performed by scanning the plate at 520 nm in the reflectance/absorbance mode.

Different mobile phases were evaluated in order to detect glucose, especially in aged bio-oil

samples. Finally the separation was carried out on plates without impregnation and using butanol /

formic acid 45:5 (v/v) 28

as the mobile phase. Development distance, chromogenic reagent and

detection wavelength were as described in the preceding paragraph for the other sugars.

5.6 Results and discussion

Separation of main sugars and calibration curves

Figure 5.2 shows the HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using the methodology

described in Section 5.5. The calibration curves for levoglucosan and cellobiosan were prepared

between 100 and 800 ng by band, 50-400 ng by band for xylose and cellobiose, and 50-300 ng by

band for arabinose. The chromatographic development was carried out using the procedure

described in Section 5.5. As can be seen, the five analytes are adequately separated with Rf 0.29,

0.35, 0.42, 0.49 and 0.69 for cellobiose, cellobiosan, arabinose, xylose and levoglucosan,

respectively. No other interfering compounds from the bio-oil matrix are observed, allowing the

quantification of these sugars without major sample pretreatment steps, as required in GC or HPLC.

Figure 5.2 HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using acetonitrile/water 80/20 v/v as

mobile phase

In Figure 5.3 are included the HPTLC plates of the fraction obtained from bio-oil 4. It is possible to

detect the studied sugars in these fractions with the optimized method using the procedure described

in Section 5.5. Therefore, the developed method can also be used for different fractions of bio-oil.

Capítulo 5


Figure 5.3 HPTLC plates of bio-oil 4 and their fractions using acetonitrile/water as mobile phase.

I: bio-oil 4; II: pyrolytic lignin III: n-butanol and aqueous phase. Standards: cellobiosan (C),

arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X).

Linearity, detection and quantification limits and intermediate precision (the latter measured with a

bio-oil sample) are summarized in Table 5.2. The detection limits obtained for levoglucosan and

cellobiosan were acceptable, considering that the reported concentrations of these sugars in bio-oils

from sawdust are around 1-6 wt %3.

Table 5.2 Analytical parameters for HPTLC sugar determination in bio-oil.

Sugars Linear range

ng

Detection limit

ng

Quantification limit

ng

Intermediate precisiona

RSD (n=3)

Levoglucosan 100-800 60 180 11 %

Cellobiosan 100-700 80 240 20 %

Xylose 50-400 16 48 -

Arabinose

Cellobiose

50-300

50-300

14

18

42

59

-

- a The intermediate precision was determined using three different bio-oil samples in triplicate, at

different days and with different HPTLC plates.

Capítulo 5


The determination of anhydrosugars in crude bio-oil and fractions can be affected by the presence

of glucose, produced by first-order hydrolysis reactions of levoglucosan and cellobiosan. The decay

in anhydrosugar concentrations was notorious in aqueous fractions of bio-oil and aged bio-oil

samples. Hence, for quantification of the main sugars in bio-oil and aqueous fractions, the presence

of glucose must be established. This separation has not been studied before using any

chromatographic method. The first results of HPTLC analysis showed good separation between

levoglucosan and cellobiosan, but not between cellobiosan and glucose. Different mobile phases

were studied for HPTLC separation of cellobiosan from glucose (butanol / boric acid (100 mg / 20

mL water / iso-propanol 30:50:10 (v/v)25

; ethyl acetate / hexane 1:9 (v/v)29

; benzene /acetone 10:1

(v/v)30

; chloroform / methanol / water / acetic acid 30:12:4:5 (v/v)31

and butanol / formic acid 45:5

(v/v)28

. Finally, separation of both analytes was achieved by using a mobile phase of butanol /

formic acid 45:5 (v/v). In Figure 5.4 the separation of cellobiosan and glucose in a sample of crude

bio-oil 2 using these conditions is shown. The screening of glucose in bio-oil and different fractions

is shown in Figure 5.5. In figure 5.6 is shown the glucose screening in presence of all sugar

standards. Under these conditions, xylose and levoglucosan are not separated.

Figure 5.4 HPTLC plate of bio-oil samples, cellobiosan and glucose standards using butanol/formic

acid as mobile phase. Cellobiosan (C) and glucose (G). Track 1 and 4 cellobisan and glucose

standards. Track 2 bio-oil 2 whithout glucose. Track 3 bio-oil 2 with glucose added.

Figure 5.5 Screening of different bio-oil samples for glucose detection. Cellobiosan (C), glucose

(G) and levoglucosan (L). Sample 1, 2 and 3 correspond to bio-oil 4, pyrolytic lignin and bio-oil

aqueous phase respectively.

Capítulo 5


Figure 5.6 HPTLC plate of sugar standards using butanol/formic acid as mobile phase. cellobiosan

(C), glucose (G), arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X).

Considering that this procedure is effective only to separate glucose from cellobiosan, it was used

just for screening purposes, avoiding the overestimation of cellobiosan due to the presence of

glucose. Based on this fact, Figure 5.7 shows the scheme adopted for the determination of principal

sugars in bio-oil samples.

Figure 5.7 Proposed scheme for the determination of principal sugars in bio-oil samples.

Quantification of sugars in bio-oil samples and fractions

Table 5.3 shows the results obtained by the proposed HPTLC method for seven samples of fresh

bio-oil and bio-oil fractions. Different samples were selected for analysis, including bio-oils

produced from soft- and hardwood sawdust, bio-oils collected at different points in the pyrolysis

condensation train, and samples from exploratory bio-oil fractionations.

Bio-oil sample

Glucose detection in bio-oil samples using HPTLC-

plate (without treatment), and butanol/formic acid as

mobile phase.

Determination and quantification only of cellobiosan using mobile phase butanol/formic

acid, followed by determination of other sugars

using HPTLC-plates (with treatment) and water/acetonitrile as mobile phase (procedure

5.5).

Determination and quantification of cellobiosan, levoglucosan and the other sugars in bio-oil

samples according to procedure 5.5.

NO YES

Capítulo 5


Analysis revealed no presence of glucose, cellobiose, or arabinose in the freshly produced bio-oils.

Analytical signals for xylose were observed, but their values were below the detection limit of the

methodology (see Figure 5.2). However, in aged bio-oil samples, detectable amounts of

monosaccharides were found (results not shown).

The raw material for the production of bio-oils 1-3 was sawdust of Pinus radiata, and for bio-oil 4 a

mixture of native woods was used (see table 5.1). The concentration of levoglucosan was higher for

bio-oil 4, which is in accordance with those reported by Ingram et al, where shows higher

concentrations of this sugar in hardwood (oak wood) than in softwood32

.

The bio-oil 2 and 3 were collected at different steps of the pyrolysis condensation train: bio oil 2 at

the exit of the cyclone after the condenser, and bio oil 3 at the bottom of the demister. The presence

of anhydrosugars in bio-oil 3 shows that high-molecular-weight compounds are not condensed and

are not trapped effectively in the condenser and these are carried over to the demister. Pyrolysis

products tend to form aerosols difficult to trap successfully. In this case, no final electrostatic

precipitator has been used.

Common bio-oil fractionation schemes start by removing high-molecular-weight compounds

derived from lignin by addition of water and precipitation. A heavy, viscous organic fraction settles

down and sticks to the walls of the recipient. However, if an excess of cold water and a

homogenizer are used, a fine precipitate can be collected. In Table 5.3, the fine precipitate (bio-oil 4

pyrolytic lignin) displays a similar concentration of anhydrosugars, compared to the source bio-oil.

As this fraction accounts 19-23% wt of the whole bio-oil, a similar percentage of anhydrosugars

remains trapped in the pyrolytic lignin. Re-suspension in water and repeated filtration and washing

may be necessary to improve the separation of anhydrosugars from pyrolytic lignin.

Table 5.3 Sugar concentrations in fresh bio-oil samples and extracts.

Samples Glucose Levoglucosan

wt %

Cellobiosan

wt %

Xylose

wt %

Arabinose

wt %

Bio-oil 1 NDa

1.27 1.46 ND ND

Bio-oil 2 ND 1.90 1.99 ND ND



Bio-oil 4 aqueous phase ND 1.81 0.93 ND ND

Bio-oil 4 n-butanol/ phase ND 0.78 0.82 ND ND

Bio-oil 4 pyrolytic lignin ND 0.75 0.88 ND ND a ND: Not detected; wt%: weight/weight percent

An alternative bio-oil fractionation scheme involves an organic polar solvent that dissolves the

hydrophobic lignin compounds, giving a lighter organic phase and a heavier water fraction. In the

case of bio-oil extracted with n-butanol/water, the yield of pyrolytic lignin in the butanol phase,

determined by the same method of dispersion and precipitation in an excess of cold water (1:10 v),

is almost the same as the yield from bio-oil. Therefore, the high-molecular-weight lignin-derived

Capítulo 5


compounds ends up effectively in the butanol phase, as intended; but anhydrosugars as can be seen

from Table 5.3, are also significantly extracted into the butanol phase.

Our results show that a high percentage of sugars still remain in the pyrolytic lignin fraction,

obtained either by dispersion using water or organic polar solvent, producing both treatments

similar sugar levels. Another dispersion step, using water, followed by filtration and washing could

allow the separation between anhydrosugar and pyrolytic lignin.

5.7 Conclusions

The HPTLC technique displays a major advantage in the analysis of bio-oil samples than other

expensive or laborious procedures using HPLC or GC: no sample pre-treatment and disposable

HPTLC plates providing a new separation layer for each sample. The proposed HPTLC method

shows adequate analytical parameters for the quantification of main sugars in bio-oil samples and

their fractions. In addition, the same methodology can be used to quantify the main sugars in

different bio-oil extracts (butanolic, pyrolytic lignin and aqueous extract) with adequate

intermediate precision. In all studied bio-oils, cellobiosan and levoglucosan were detected but not

xylose, arabinose and cellobiose. On the other hand, glucose screening of bio-oil samples is needed,

because of its interference with cellobiosan, especially for aged bio-oil samples. A separation using

butanol/formic acid as mobile phase allows for this purpose. Considering this fact, a scheme for the

determination of principal sugars in bio-oil samples is proposed. Separation of anhydrosugars from

pyrolytic lignin is complex. To achieve their separation, an additional resuspension in water may be

necessary.

Acknowledgements

The authors thank the financial support received from FONDEF Chile, Grant N° DO7-I-1137 and

from CONICYT Chile, Grant PFB-27/PCS 003 and the postgraduate fellowship of Dirección de

Postgrado, Universidad de Concepción for Catherine Tessini in the Programa de Doctorado en

Ciencia y Tecnología Analítica.

Capítulo 5


5.8 References

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Capítulo 5


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Capítulo 6


CAPÍTULO 6

DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS EN BIO-OIL POR HPLC-UV Y SU

DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA CON AZÚCARES POR GC/MS

En este capítulo se presentan el desarrollo de metodologías analíticas orientadas a la determinación

de ácidos orgánicos en bio-oil. La determinación de diversos grupos de componentes en bio-oil se

realiza con el objeto de cuantificar la mayor cantidad de compuestos químicos de forma selectiva y

orientada a la extracción de productos químicos a escala industrial desde el bio-oil.

6.1 Resumen

La determinación de ácidos orgánicos en bio-oil se puede realizar en parte, mediante la inyección

directa en un sistema GC/MS, con el inconveniente de que no todos los ácidos de interés pueden ser

cuantificados. En este capítulo se evalúa la determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV,

adaptando y optimizando una metodología previamente desarrollada para el análisis de vinos. Sin

embargo, la selectividad obtenida no fue adecuada, inclusive después de realizar diferentes

tratamientos previos a las muestras de bio-oil. Por ello, se desarrolló y evaluó una metodología

mediante GC/MS previa derivatización con BSTFA, la cual no sólo permitió la determinación de

ácidos orgánicos sino que junto con ellos fue posible la cuantificación de azúcares, con un

tratamiento de muestra simple. Finalmente, se comparan los resultados obtenidos para ácidos y

azúcares por el método propuesto con aquellos obtenidos por GC/MS (inyección directa) y HPTLC.

6.2 Introducción

La alta concentración de ácidos orgánicos en el bio-oil, específicamente ácido fórmico y acético,

producen un pH entre 2 y 3. Las concentraciones de estos dos ácidos oscilan entre un 70 % y 80 %

del total de ácidos presentes en el bio-oil. Estos a la vez representan entre un 60 % y 70 % de la

acidez del bio-oil, ya que los valores de sus pKa son los más bajos de los componentes presentes en

el bio-oil. No obstante, otros compuestos como las especies fenólicas y los ácidos grasos aportan

entre un 10 % y un 5 % respectivamente a su acidez 1-5

.

La condición de acidez del bio-oil impide su uso directo como combustible, al ser altamente

corrosivo e incompatible con las estructuras actuales. Sin embargo estos ácidos pueden ser

removidos del bio-oil y pueden ser usados como aditivos de ensilaje (en el caso del ácido fórmico),

el cual actúa como inhibidor de la fermentación, asegurando la preservación del ensilaje6. En el caso

del ácido acético es posible su aplicación en el proceso de pulpaje Acetosolv7. Considerando estos

antecedentes, es importante la determinación y cuantificación de los ácidos orgánicos presentes en

el bio-oil.

Tal como se describe en el capítulo 4, la determinación de diferentes grupos químicos en el bio-oil

puede ser realizada mediante inyección directa en un sistema GC/MS empleando una columna de

mediana polaridad. Usando el método descrito fue posible la identificación de ácido acético y ácido

propiónico, pero para este último no fue posible su cuantificación dado que las concentraciones

presentes en bio-oil no son detectables por este método10

. El ácido fórmico, segundo en porcentaje

en bio-oil, presenta inconvenientes al ser determinado por GC/MS, principalmente por ser un

compuesto altamente polar. Otros ácidos como el ácido glicólico y el ácido láctico, aunque no se

Capítulo 6


encuentran en concentraciones importantes, pueden aportar información sobre la oxidación de un

compuesto de interés como el glicolaldehído (hidroxiacetaldehído), por lo tanto su determinación

también se hace necesaria.

Otra alternativa que ha sido descrita para análisis de ácidos orgánicos es su derivatización y su

posterior separación por cromatografía de gases8, en particular para la determinación de ácido

fórmico, ya que este presenta incompatibilidad con las columnas cromatográficas empleadas como

columnas apolares y de mediana polaridad en la inyección directa. La derivatización más usada es

la formación de ésteres de bencilo8, 9

.

Por otro lado, hay dos referencias bibliográficas sobre determinación conjunta de ácidos orgánicos y

azúcares en bio-oil, mediante HPLC con detector refractométrico8, 9

Se describe la determinación de

ácidos orgánicos (principalmente ácidos fórmico y acético), azúcares (celobiosano, levoglucosano

entre otros) y aldehídos (incluyendo el hidroxiacetaldehído), utilizando una columna Aminex HPX-

87H. A pesar de ser un método interesante desde el punto de vista de su capacidad de determinar un

gran número de compuestos polares en bio-oil en un solo análisis, dichas publicaciones no

presentan ni cromatogramas, ni características analíticas del método descrito, por lo que su

transferencia y utilización son poco factibles, sobre todo considerando la pobre selectividad que

representa un detector refractométrico. Los azúcares presentes en el bio-oil (como se explicó en el

Capítulo 5) son importantes en la obtención de productos químicos, como por el inconveniente que

causarían al utilizar el bio-oil como combustible. Estos antecedentes hacen necesario desarrollar

metodologías que permitan determinar dichos compuestos tanto en bio-oil crudo como en diferentes

fracciones de éste, con metodologías suficientemente selectivas.

Considerando estas referencias, en el presente trabajo se plantea evaluar la determinación de ácidos

orgánicos mediante HPLC-UV, considerando que la detección espectrofotométrica es más selectiva

que la refractométrica. Para ello se adaptó una metodología implementada para el análisis de ácidos

orgánicos en vino, la cual consiste en la inyección directa de la muestra, sin tratamiento previo (sólo

filtración) 11

. Sin embargo, considerando lo complejo de la matriz del bio-oil y de sus fracciones, se

hace necesario evaluar diversos sistemas de pre-tratamiento de muestra.

Además se desarrolló un método para la determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares

en bio-oil por GC/MS, previa derivatización con BSTFA. Se fundamenta el desarrollo de esta

metodología como medida de comparación de los resultados obtenidos en la inyección directa de

bio-oil en GC/MS, la determinación de azúcares por HPTLC y la determinación de ácidos orgánicos

que no pueden ser determinados por los métodos descritos.

Capítulo 6



6.3.1 Reactivos

Acido fórmico 98-100%, ácido acético glacial, ácido láctico 90 %, ácido glicólico, ácido

isobutírico, ácido sulfúrico, L(+)-arabinosa, D(+)-xylosa, 1,6-anhidro-β-D-glucopiranosa

(levoglucosano) y metanol (grado HPLC) fueron obtenidos en Merck (Darmstadt, Alemania). Ácido

propiónico > 99.5 % y N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) fueron adquiridos en

Sigma (St. Louis MO, USA). Celobiosano (1,6-anhydro-β-cellobiosa) fue adquirido en Sussex

Research Laboratories Inc. (Ottawa, Canadá). 2,5-anhidro-D-manitol fue adquirido en ACROS

organics (Geel-Belgium). Agua desionizada (18 mΩ) es obtenida en un sistema Millipore Milli-Q

(Bedford, MA, USA).

6.3.2 Materiales

Columnas de extracción en fase sólida, de intercambio aniónico SAX column, 3 mL, 500 mg (amina

cuaternaria –NR3+) adquiridas en Agilent Technologies (CA, USA), sistema de extracción en fase

sólida Supelco Visiprep SPE Vacuum Manifold Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), bomba de vacío y

filtros Millex-GV, con membrana Durapore (PVDF), tamaño poro 0.22 µm, diámetro 13 mm,

fueron obtenidos por Millipore (Bedford, MA, USA).

6.3.3 Instrumentación

Sistema HPLC-UV

Sistema HPLC Merck Hitachi equipado con un autosampler L-2200, bomba L-2130 y detector L-

2400 UV–vis (Merck, Darmstadt, Alemania). La temperatura de la columna fue de 65 °C, en un

horno CTO-10AVP Shimadzu (Kyoto, Japón). El programa de integración corresponde Interactive

Graphics, versión 6.20 de Varian Inc. (Palo Alto, CA, USA).

Sistema GC/MS

Sistema GC/MS compuesto por cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-Packard (Palo Alto,

CA, USA) equipado con un inyector split/splitless. Detector selectivo de masas HP 5973 y

autosampler Combi Pal CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El sistema es

controlado por MSD ChemStation G1701AA, versión D.03.00.611 y el programa Cycle Composer

version1.6.0 para el autosampler.

6.3.4 Condiciones cromatográficas

Sistema HPLC-UV

La separación se realizó con dos columnas en serie. Como pre-columna se utilizó la columna

LiChrospher®

RP-18, (5 µm), 100 mm (Darmstadt, Alemania), seguida por una columna Aminex

HPX-87H de exclusión iónica de 300 mm de largo y 97.8 mm de diámetro interno (Bio-Rad

Laboratories, California, USA). La composición de la fase móvil fue de H2SO4 0.005 mol L-1

a un

flujo de 0.5 mL min-1

en modo isocrático. La detección se realizó a 210 nm, con un volumen de

inyección de 5 µL.

Sistema GC/MS

En la separación cromatográfica se utilizo una columna VF-1701 de 60 m × 0.25 mm I.D, 0.25 µm

film y helio electrónico grado 6.0 (99.9999%) con un flujo de 1.0 mL min−1

como fase móvil. El

Capítulo 6


programa de temperatura fue el siguiente: temperatura inicial de 45 °C constante por 4 minutos, con

un incremento de 3 °C min−1

hasta 120 °C constante por 10 minutos, un incremento de 7 °C min−1

hasta 280 °C constante por 10 minutos. La temperatura del inyector fue de 250 °C con un volumen

de inyección de 1.0 µL utilizando el sistema Split 100:1.

Los parámetros del detector fueron los siguientes: Modo SIM.

- Grupo 1 desde 0 a 11.7 minutos las siguientes masas: 103, 117, 131 y 145.

- Grupo 2 desde 11.7 a 11.8 la masa 131.

- Grupo 3 desde 11.8 minutos en adelante, las siguientes masas: 103, 117, 131, 145,

204, 217, 328 y 361.

6.3.5 Preparación de estándares y muestras

6.3.5.1 Sistema HPLC-UV

Preparación de la curvas de calibrado para HPLC-UV

Las soluciones estándar de ácidos orgánicos se prepararon en concentraciones entre 1.0–150 mg L-1

y fueron guardadas a una temperatura de 4 °C. Cada punto de la curva de calibración fue preparado

por triplicado e inyectado 3 veces.

Tratamiento de muestra de bio-oil y sus fracciones para análisis por HPLC-UV En el Capítulo 2 describen las fracciones en las cuales es posible extraer los ácidos orgánicos desde

la matriz del bio-oil. No todas las fracciones son compatibles con la metodología descrita, para lo

cual fue necesario un tratamiento previo de la muestra. Las principales fracciones que se evaluaron

son las siguientes: acuosas, destilados de bio-oil y orgánicas. A continuación se detallan los

procedimientos a seguir, dependiendo del tipo de muestras.

a) Destilados de bio-oil: Estas muestras corresponden a bio-oil previamente evaporado con

rotavapor. El bio-oil se sometió a una destilación fraccionada a presión atmosférica y a

destilación en vacío. Es necesario tener presente que los destilados de bio-oil no contienen

lignina pirolítica ni tampoco compuestos de alto peso molecular, por lo cual se postula que

la metodología implementada no requiere de tratamiento previo de la muestra.

b) Fracciones orgánicas de bio-oil: Tienen la desventaja de estar en solventes que son

inmiscibles con la fase móvil empleada, además de dañar la columna cromatográfica. Para

estas fracciones se propusieron 2 posibles procedimientos: (1) extracción líquido-líquido

con agua a pH 7, de esta forma los ácidos de mayor interés pueden ser extraídos en su

forma aniónica (2) evaporación con N2 a temperatura ambiente, para la eliminación del

solvente. En ambos casos, la muestra puede ser reconstituida en fase móvil. El principal

inconveniente de realizar la extracción es la recuperación de los ácidos desde la fracción

orgánica.

c) Bio-oil crudo: Como se ha mencionado en el Capitulo 1, el bio-oil contiene un alto número

de compuestos orgánicos que pueden interferir en la determinación de los ácidos orgánicos

lo que obstaculiza su análisis por inyección directa. Como tratamiento se evaluaron 2

Capítulo 6


procedimientos: (1) Eliminación de lignina pirolítica del bio-oil mediante la adición de agua

y posterior centrifugación y (2) SPE usando columnas de intercambio aniónico (SAX). Este

último procedimiento se aplica en el caso en que la separación de lignina pirolítica no sea

suficiente en la eliminación de las interferencias.

6.3.4.2 Sistema GC/MS

Preparación de estándares y muestras de bio-oil para análisis por GC-MS

Todas las soluciones estándar de ácidos y azucares fueron preparados con metanol y fueron

almacenadas a -4 °C. El tratamiento de las muestras de bio-oil consistió en la dilución del bio-oil en

metanol, y la realización de diluciones con el mismo solvente en los casos necesarios.

Derivatización de muestras con BSTFA

Para la reacción de derivatización se agrega una alícuota adecuada de bio-oil, conteniendo 100 mg

L-1

de cada patrón interno (ácido isobutírico y 2,5-anhidro-D-manitol). Esta solución se evapora a

sequedad con N2, a temperatura ambiente. Inmediatamente se reconstituye con 140 µL de piridina y

60 µL de BSTFA. La reacción tiene lugar a 60 °C por 50 minutos.

Optimización de la reacción de derivatización

Para realizar la optimización de los parámetros de la reacción, se realizó una evaluación para

determinar los factores con mayor significancia en la derivatización. Los factores estudiados fueron

el tiempo de reacción, la temperatura de reacción y la concentración de BSTFA, esto último debido

a que, si bien en las reacciones de derivatización el reactivo debe estar en exceso, de tal forma de no

ser el reactivo limitante en la reacción, el exceso de reactivo puede provocar problemas de

resolución cromatográfica de los ácidos orgánicos presentes en el bio-oil, en especial a los de bajo

peso molecular.

Posteriormente y luego de evaluar la significancia mediante un test ANOVA, se realizó un diseño

experimental con las variables con efecto significativo sobre la derivatización, optimizando la

respuesta y validando los resultados mediante un test de ANOVA.

6.4 Resultados y Discusiones

En este apartado se describe en primer lugar la determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y

diferentes fracciones por HPLC-UV, empleando diferentes tratamientos de muestras.

Posteriormente se describe la determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil

por GC/MS previa derivatización con BSTFA.

6.4.1 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y sus fracciones mediante HPLC-UV

Como se mencionó con anterioridad, la determinación de ácidos orgánicos en bio-oil se realizó

adaptando una metodología para análisis de ácidos orgánicos en vino11

. Considerando la alta

complejidad del bio-oil, es inminente el uso de tratamientos de muestras previos al análisis.

Capítulo 6


En la separación cromatográfica de los ácidos orgánicos se emplearon 2 columnas cromatográficas:

una columna de fase inversa, que efectúa la función de pre-columna y que retiene a los compuestos

de menor polaridad, dejando eluir a los ácidos orgánicos, los cuales se encuentran al pH del análisis

a la forma ácida (pH ~ 3.0). La segunda columna, de exclusión iónica, permite la separación de

ácidos basados en el mecanismo de exclusión de Donnan, donde compuestos de la misma carga son

repelidos y eluídos en el volumen intersticial. Los compuestos no iónicos o débilmente iónicos

pueden penetrar la estructura de la resina, por lo que la separación de los compuestos se realiza por

la exclusión estérica y los efectos de partición. La separación de los ácidos orgánicos depende de la

disociación del ácido y de la interacción con la fase estacionaria.

Primeramente, se realizó la evaluación de la separación cromatográfica y los parámetros analíticos

de una solución estándar de los 3 principales ácidos orgánicos: ácido fórmico, ácido acético y ácido

propiónico. En la Figura 6.1, se muestra una cromatograma de la mezcla de patrones de los ácidos

de interés en una concentración de 30 mg L-1

cada uno.

Figura 6.1 Cromatograma HPLC-UV de la mezcla de estándares de ácido fórmico (1), ácido

acético (2) y ácido propiónico (3) en concentración de 30 mg L-1

cada uno.

La separación de la solución estándar de la mezcla de ácidos presenta una resolución adecuada

(R>2) y un tiempo de análisis de 30 min. Se evaluaron los principales parámetros analíticos de esta

metodología, con las soluciones estándar de cada ácido, realizando las curvas de calibración

correspondientes y la determinación de los límites de detección de cada ácido. En la Tabla 6.1 se

exponen los parámetros analíticos instrumentales obtenidos para las respectivas curvas de

calibración.

Capítulo 6


Tabla 6.1 Parámetros analíticos instrumentales obtenidos de la curva de calibración, para los

principales ácidos orgánicos presentes en el bio-oil.

Parámetros analíticos Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiónico

Rango lineal mg L-1

LCb-150 LC-150 LC-150

Ecuación de la recta y=0.547x -2.309 y=0.302x-1.345 y=0.294x-2.011

R

0.9998 0.9999 0.9997

Observaciones 19 19 19

Límite de deteccióna (mg L

-1) 4.1 6.2 6.5

Límite de cuantificación (mg L-1

) 13.6 20.6 21.6

aLímite de detección obtenido por el Sy/x de los 4 primeros puntos de la curva de calibrado.

bLC: límite de cuantificación.

Considerando que los ácidos orgánicos a determinar se encuentran en un alto porcentaje en el bio-

oil, el rango lineal y los límites de detección obtenidos, principalmente para el ácido fórmico y

acético, son satisfactorios, desde el punto de vista instrumental, para evaluar la aplicación de esta

metodología a muestras crudas y fracciones de bio-oil, aspecto que se discute a continuación..

6.4.1.1 Determinación de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil

En el análisis de destilados de bio-oil se utilizó la inyección directa de las muestras, previa dilución

con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1

), no siendo necesario ningún otro tipo de tratamiento. En la

Figura 6.2, se presenta un cromatograma de una muestra de destilado de bio-oil.

En el cromatograma no tan solo se observan las señales correspondientes a los ácidos orgánicos,

sino que además es posible visualizar otras señales cromatográficas que no afectan la resolución del

ácido fórmico y ácido acético (R>2). Sin embargo la señal correspondiente al ácido propiónico,

muestra una señal pequeña que puede ser debido a una coelución de este con otra especie.

Figura 6.2 Cromatograma HPLC-UV de una muestra de destilado de bio-oil. Señales: (1) ácido

fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico.

Para resolver el problema con el ácido propiónico se evaluaron diferentes concentraciones de H2SO4

en la fase móvil, y diferentes temperaturas de la columna de exclusión iónica. Sin embargo los

Capítulo 6


mejores resultados, que no involucraron una pérdida de resolución de los ácidos fórmico y acético,

fueron obtenidos con la metodología propuesta inicialmente. Esto implicó que no fue posible

obtener una mejor separación entre ácido propiónico y su interferente sin afectar a los otros ácidos

presentes.

Dado que no se dispone de un material de referencia de bio-oil, tanto la repetibilidad como la

recuperación del método fueron evaluados con un destilado de bio-oil. Para evaluar repetibilidad,

tres muestras de destilados al vacío de bio-oil fueron inyectadas por triplicado. Para evaluar el error

sistemático, se adicionaron 10 y 20 mg L-1

de una mezcla estándar que contenía los tres ácidos a una

muestra de destilado al vació de bio-oil. En la Tabla 6.2 se resumen los resultados obtenidos.

Tabla 6.2 Repetibilidad y error en la determinación de ácidos orgánicos en fracciones de destilado

al vacío de bio-oil mediante HPLC-UV.

Ac. fórmico Ac. acético Ac. propiónico

Repetibilidad (RSD) 9.5 7.1 9.1

Error (%) -9.7 -6.3 -8.9

Si bien los resultados obtenidos son satisfactorios, es necesario confirmar la identidad de estos

ácidos por un sistema más selectivo como GC/MS, ya que dependiendo de las condiciones bajo las

cuales se obtienen las fracciones de destilados de bio-oil, se podrían observar otros compuestos

interferentes en el cromatograma. Esto debido principalmente a la alta concentración de compuestos

volátiles que presenta el bio-oil.

Con el objeto de confirmar estos resultados, se determinó la concentración de ácidos orgánicos por

el método químico TAN el cual, tal como se describe en la sección 1.7.2, permite estimar la

concentración de ácidos orgánicos mediante su titulación ácido/base. En la Tabla 6.3 se muestra una

comparación de los resultados obtenidos por HPLC-UV y la determinación de ácidos TAN. Para la

comparación fue necesario realizar la suma de los ácidos orgánicos determinados por HPLC-UV, y

expresarlos como mg de KOH por gramos de muestra.

Tabla 6.3 Concentración de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil. Comparación de los métodos

TAN y HPLC-UV.

Muestras Total de ácidos orgánicos

determinados por HPLC TAN (método químico)

M2 47.0 40.9

M3 59.3 48.6

M4 86.0 74.3

M5 141.1 112.0

M6 48.4 41.1

Valores expresados como mg de KOH por gramos de muestra de bio-oil.

Se observa que los resultados no son estadísticamente iguales (95 % de confianza). Se encuentra

mayor concentración de ácidos con el método propuesto (HPLC-UV) que con el método químico

Capítulo 6


(TAN). Considerando que por este último método la concentración de ácidos es determinada

mediante la acidez total del bio-oil, lo cual no solo incluye los ácidos estudiados, sino que también

otros grupos de ácidos, como grupos fenólicos, los cuales también pueden ser neutralizados con

KOH. Se esperaría que los valores fueran mayores por el método químico que por HPLC-UV, ya

que este último sólo considera los tres principales ácidos.

Con los resultados obtenidos mediante HPLC-UV, se realizó un balance de masa después de

realizado en proceso de destilación a vacío del bio-oil, obteniéndose 140 % quedando de manifiesto

que la señal del ácido propiónico debe estar coeluyendo con algún otro compuesto del bio-oil,

produciendo la sobreestimación de su concentración.

Considerando que para obtener mejor resolución de este ácido se evaluaron otras condiciones de

separación las que no fueron satisfactorias, se plantea como alternativa para confirmar su coleución

con otra especie, la utilización de un detector de fila de diodos, donde sea posible evaluar la pureza

de la señal a diferentes longitudes de onda y verificar de esta forma la presencia de algún

interferente, considerando que también en las fracciones de destilados de bio-oil, se esperan

encontrar no tan solo ácidos orgánicos, sino que también otros compuestos de bajo peso molecular.

6.4.1.2 Determinación de ácidos orgánicos en fracciones orgánicas

La determinación de estas fracciones, se realizó bajo las mismas condiciones cromatográficas

expuestas en el ítem 6.3.4. Las fracciones orgánicas analizadas corresponden a la extracción de

ácidos orgánicos con metil ter-butiléter (MTBE).

Para la primera evaluación del tratamiento de la muestra a seguir, se realizó la evaporación de una

alícuota de la muestra con N2 a temperatura ambiente. La reconstitución se realizó con fase móvil

(H2SO4 0.005 mol L-1

). En la solución final se observó la presencia de un precipitado junto con una

película adherida a las paredes del material. El precipitado formado fue eliminado en el proceso de

filtración de la solución previo a la inyección en el sistema HPLC-UV. Este precipitado podría

corresponder a lignina pirolítica, la cual debería solubilizarse en MTBE. En la Figura 6.3 se muestra

el cromatograma obtenido mediante este proceso.

Capítulo 6


Figura 6.3 Cromatograma HPLC-UV del extracto orgánico (MTBE) de bio-oil pre-tratado por

evaporación y reconstitución con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1

). Señales: (1) ácido fórmico; (2)

ácido acético; (3) ácido propiónico.

5 10 15 20 25 30

Minutes

-2

0

5

10

15

mVolts

X:

Y:

WI:8 W

I:16

WI:3

2

1

2

3

Las señales cromatográficas observadas son poco eficientes y están poco resueltas. Para los ácidos

fórmico y acético no superan el valor de 1.4. Además, la señal correspondiente al ácido fórmico

presenta una deformación que puede ser explicada por una posible coelución con otra especie. La

resolución para ácido propiónico es inferior a 0.8 respecto a la señal cromatográfica que le

antecede. Con estos antecedentes se concluye que el tratamiento de muestra propuesto, el cual

consiste en la volatilización del solvente orgánico y posterior reconstitución en fase móvil no es

adecuado para cuantificar los ácidos orgánicos en esta fracción orgánica, ya que en la etapa de

solubilización, un alto porcentaje de compuestos indeseados pueden ser solubilizados e ingresar al

sistema cromatográfico.

Otra opción para la extracción de los ácidos orgánicos desde esta fracción es realizar una extracción

líquido-líquido con agua desionizada, de tal forma de dejar la mayor cantidad de interferentes en la

fase orgánica, y los ácidos orgánicos en la fase acuosa.

La extracción de ácidos desde la fracción orgánica se realizó directamente con agua desionizada

usando diferentes razones entre agua y MTBE: 0.5/1; 1/1; 2/1; 3/1; 4/1; 5/1 v/v. Los mejores

resultados se obtuvieron usando una relación de 3/1 de agua/fase orgánica, observándose un pH

entre 2.8-3.2 de la fracción acuosa. También se evaluó la recuperación de tres extracciones

sucesivas usando la proporción óptima. Los resultados mostraron que tanto en la segunda como en

la tercera extracción no se encontraron niveles detectables de los ácidos de interés. Por ello se optó

por realizar sólo una extracción líquido-líquido.

Si bien la adición de una mayor cantidad de agua aumentará la dilución de la muestra, esto no es un

inconveniente debido a que las muestras de bio-oil presentan altos niveles de ácidos orgánicos. En

la Figura 6.4 se presenta un cromatograma del extracto acuoso obtenido con una extracción liquido-

liquido 3/1 de agua/fracción MTBE. Es posible visualizar que hay una mayor presencia de

compuestos que presentan absorción a esa longitud de onda, más que en las fracciones de destilado

de bio-oil. Esto se atribuye a la mayor solubilización de compuestos de mayor peso molecular, junto

con la solubilización de una fracción menor de lignina pirolítica.

Capítulo 6


Figura 6.4 Cromatograma HPLC/UV del extracto acuoso de una muestra de extracto orgánico

(MTBE) de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico.

1

2

3

Si bien el cromatograma presenta un mayor número de señales cromatográficas, la resolución

obtenida para los ácidos de interés es mayor a 1.7, y no se observa una deformación de la señal de

ácido fórmico en comparación con el cromatograma obtenido por la evaporación y posterior

reconstitución de la muestra (ver Figura 6.3). Esto estaría demostrando que la mayor cantidad de

interferentes quedaron disueltos en la fase orgánica (MTBE). De acuerdo a ello, se determinaron

algunas características analíticas, las cuales son presentadas en la Tabla 6.4. La repetibilidad se

determinó por medio de tres extracciones, inyectando cada una por triplicado (n=9). Para la

recuperación se adicionaron 2 niveles de concentración de una mezcla de ácidos orgánicos de 10,

20 y 30 mg L-1

en tres diferentes muestras (fracciones de MTBE), obteniendo su valor promedio.

Tabla 6.4 Repetibilidad y recuperación de ácidos orgánicos desde fracciones orgánicas (MTBE) del

bio-oil. (n=9)

Ac. fórmico Ac. acético Ac. propiónico

Repetibilidad (RSD) 12.1 13.6 17.2

Recuperación (%) 82.5 88.7 81.1

Si bien la repetibilidad presenta valores superiores al 12 %, se debe considerar que se realizó con

diferentes muestras, y además la extracción liquido-liquido es un método que puede presentar

problemas de reproducibilidad por los diferentes equilibrios químicos que se presentan en cada

extracción. La recuperación presenta un nivel promedio de un 84 %. Este valor puede ser

incrementado agregando una sal a la solución acuosa con la cual se realiza la extracción, para

extraer los ácidos orgánicos en forma iónica y así aumentar su solubilidad en el agua. Sin embargo

el principal inconveniente de esta opción es la incompatibilidad que presenta el uso de una sal con

la columna de exclusión iónica, impidiendo la aplicación por este método.

No obstante, en las fracciones analizadas por el método químico TAN, la concentración de ácido

propiónico sigue manteniendo porcentajes de recuperación sobre el 100 %. Esto puede corresponder

a la coelución de esta especie con un posible interferente. La baja selectividad que presenta esta

metodología puede provocar un error en la determinación de los compuestos del bio-oil, lo cual

Capítulo 6


afectará directamente en las decisiones adoptadas para el proceso de fraccionamiento del bio-oil a

nivel industrial, impidiendo así su uso como una fuente productos químicos.

6.4.1.3. Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil crudo

Tanto las muestras de fracciones orgánicas de bio-oil como los destilados de bio-oil presentaron

inconvenientes para la determinación de sus ácidos orgánicos usando HPLC-UV. En todos los casos

se observan errores por exceso en la cuantificación. Es esperable que las muestras de bio-oil crudo

presenten una mayor cantidad de interferentes, los cuales se podrían visualizar en los

cromatogramas por HPLC-UV. Por ello se optó por realizar un tratamiento de muestra más

selectivo, empleando una extracción en fase sólida con columnas de intercambio aniónico.

El primer procedimiento realizado fue la evaluación en la remoción de la lignina pirolítica mediante

la adición de agua al bio-oil y una posterior centrifugación. Se evaluaron diferentes razones de bio-

oil/agua 1/10; 1/50; 1/100 v/v. La fase acuosa obtenida después de la centrifugación fue filtrada e

inyectada directamente en el sistema HPLC-UV (pH ~ 2.8). La fase orgánica que se formó,

consistió en un líquido muy viscoso que en gran parte de los ensayos quedó adherido a las paredes

del material. La homogenización del bio-oil fue laboriosa porque se encontraba separado en dos

fases. Los primeros ensayos se realizaron con un bio-oil de más de 2 años. Este tiempo de

antigüedad permitió que el bio-oil fuera más viscoso presentando una separación de fases.

En la Figura 6.5 se muestra un cromatograma de la fase acuosa (bio-oil/agua 1/50 v/v). El

cromatograma presenta una muy baja selectividad para determinar ácidos orgánicos. Las fracciones

realizadas con la razón 1/100, presenta de igual forma las interferencias, y las posibles señales de

los ácidos orgánicos son bajas, al presentar una mayor dilución de la muestra.

Figura 6.5 Cromatograma HPLC-UV del extracto acuoso de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2)

ácido acético; (3) ácido propiónico.

5 10 15 20 25

1

5

10

15

20

mVolts

2

3 ¿?

1

Se debe considerar que en la fracción acuosa de bio-oil es posible encontrar un alto número de

compuestos. Esto se ve reflejado en el cromatograma por GC/MS de la Figura 4.7 del capítulo 4. Si

bien se logra la precipitación de la lignina pirolítica, una cantidad importante se solubiliza en la fase

acuosa, encontrándose no tan sólo azúcares, aldehídos y ácidos orgánicos, sino que también

compuestos fenólicos que pueden afectar la separación cromatográfica.

Capítulo 6


Es necesario realizar un tratamiento del bio-oil más selectivo, removiendo los compuestos que

presentan una interferencia en la separación cromatográfica. Para ello se evaluó la extracción en

fase sólida usando cartuchos de intercambio aniónico SAX.

El fundamento principal de esta extracción es la retención de los ácidos orgánicos, en su forma

aniónica en el sorbente compuesto por aminas cuaternarias. Para lograr este objetivo, se debe ajustar

a pH básico la matriz de bio-oil. Posteriormente se debe realizar la elución de estos compuestos ya

retenidos en los cartuchos SAX con una solución a pH neutro o ácido, para su posterior inyección

en el sistema HPLC-UV.

Tanto el acondicionamiento (3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada) de los cartuchos para la

activación de la resina, como el lavado (3 mL de agua desionizada) fueron realizados por

recomendación del fabricante de los cartuchos SAX. Sin embargo hay una diferencia entre las

constante de distribución de los ácido de interés (3.7 para el ácido fórmico, 4.8 para el ácido acético

y 4.9 para el ácido propiónico), lo que hace difícil adecuar el pH para lavar la muestra sin producir

una pérdida en la recuperación. Esto fue demostrado analizando los lavados realizados, donde

señales importantes correspondientes a ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico fueron

detectadas.

Por lo tanto las condiciones que deben ser evaluadas corresponden a la extracción de ácidos

orgánicos desde la matriz de bio-oil, la solución de lavado de la muestra en la extracción en fase

sólida y la solución empleada en la elución de los ácidos orgánicos desde los cartuchos SAX. Todas

las condiciones se evaluaron por separados, esto a raíz de que se analizaron conjuntamente los

residuos obtenidos en cada etapa de la SPE.

Método de extracción de ácidos orgánicos desde bio-oil crudo

En primer lugar se extrajeron los ácidos orgánicos desde bio-oil con una solución de NaOH 0.3 N,

durante 30 minutos con agitación constante y a temperatura ambiente. Posteriormente se filtró la

solución acuosa para eliminar la lignina pirolítica precipitada. A continuación se procedió con la

SPE. Los mayores rendimientos de ácidos orgánicos después de la SPE se obtuvieron con el

siguiente procedimiento:

- Acondicionamiento de la columna SAX con 3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada

- Carga de 5 mL de extracto acuoso del bio-oil a pH 10.

- Solución de lavado básica (3 mL de solución de NaOH 0.05 N y 1.5 mL de agua

desionizada) para eliminar el exceso de la solución básica

- Elución con 2 mL de fase móvil H2SO4 0.005 M.

Posteriormente a la optimización de la SPE, se realizó la optimización de la extracción de los ácidos

orgánicos desde la matriz de bio-oil. Para ello se evaluaron diferentes concentraciones de NaOH y

tiempos de extracción. Los valores óptimos encontrados fueron:

- Extracción con solución acuosa de NaOH 0.9 N

- Tiempo de extracción de 45 minutos a temperatura ambiente, en agitación constante.

5 mL del extracto acuoso de bio-oil (previamente filtrado) realizado de acuerdo a lo descrito, se

extrajeron en cartuchos SAX de acuerdo al método de SPE optimizado para finalmente inyectar el

Capítulo 6


extracto en el HPLC-UV. En la Figura 6.6 se muestra el cromatograma de la extracción de ácidos

desde una muestra de bio-oil crudo.

Figura 6.6 Cromatograma HPLC-UV del extracto en fase sólida de una muestra de bio-oil crudo.

Señales 1, 2 y 3 corresponden respectivamente a los ácidos fórmico, acético y propiónico

respectivamente.

El cromatograma presenta una adecuada separación cromatográfica, con una resolución mayor a 2.

Además esta metodología presenta una mayor selectividad, al realizar primeramente una extracción

de los ácidos orgánicos desde el bio-oil y luego una SPE de intercambio aniónico. Sin embargo, el

principal inconveniente del uso de este método de extracción es la utilización de una alta

concentración de NaOH que puede causar reacciones indeseadas que pueden afectar la

cuantificación de los ácidos orgánicos. Por ello también fue evaluado el uso de NaHCO3 el cual no

presentó rendimientos satisfactorios. Considerando estos antecedentes, se evaluó la eficiencia de la

recuperación el método de extracción, tanto para patrones como para una muestra de bio-oil, para lo

cual se realizaron adiciones de ácidos orgánicos en ambas matrices (agua y bio-oil crudo),

sobrecargando ambos con iguales concentraciones. Los ácidos añadidos fueron ácido fórmico y

acético, los cuales se encuentran en un mayor porcentaje en el bio-oil. En la Tabla 6.5 se muestran

los resultados obtenidos.

Tabla 6.5 Porcentajes de recuperación del método de SPE en bio-oil crudo y en agua.

% Recuperación

Agua Bio-oil crudo

mg L-1

añadidos Ác. fórmico Ác. acético Ác. fórmico Ác. acético

3.0 98 94 73 71

7.0 99 100 70 66

12.0 103 95 65 64

Los porcentajes promedio de recuperación en la matriz de agua resultan satisfactorios con un valor

promedio de un 98 %, sin embargo en las muestra de bio-oil el porcentaje de recuperación

disminuye considerablemente a un 68 % como valor promedio. Esto se puede deber a problemas en

la extracción de ácidos desde el bio-oil crudo o a la capacidad de la resina en la sorción de los

Capítulo 6


ácidos en medio aniónico. Sin embargo, las concentraciones adicionadas están consideradas en la

capacidad de intercambio de la resina. Los porcentajes de recuperación son bajos para el bio-oil

crudo, lo cual podría explicarse por la adición de NaOH, la cual puede causar una reacción de

saponificación de los ésteres presentes en el bio-oil, produciendo los carboxilatos correspondientes

y metanol. Este último, en parte podría explicar la solubilidad que presenta parte del bio-oil con la

solución alcalina.

Los métodos propuestos en este trabajo no lograron la eliminación de las interferencias en la

determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV en la matriz de bio-oil, obteniendo baja

resolución y selectividad además de posibles reacciones químicas, impidiendo una cuantificación

confiable de los ácidos presentes en el bio-oil. Sin embargo, tanto para el ácido fórmico como para

el ácido acético es útil su aplicación a muestras de destilados de bio-oil y a las fracciones con

solventes orgánicos, a diferencia del ácido propiónico, el cual presentó inconvenientes en la

separación cromatográfica.

Queda de manifiesto la necesidad de emplear un sistema con una detección más selectiva y la

realización de tratamientos de la muestra de bio-oil con reactivos menos agresivos. Es importante

considerar que los resultados obtenidos por estas metodologías influyen directamente en el posible

uso del bio-oil como fuente de obtención de productos químicos. Para lograr este objetivo se

desarrolló una metodología por GC/MS, previa derivatización de sililación, la cual presenta la

ventaja de ser más selectiva y tener una mayor versatilidad ya que es posible aplicar tanto a la

determinación de ácidos orgánicos y azúcares de forma simultánea. A continuación se detalla el

método desarrollado.

6.4.2 Determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares por GC/MS previa

derivatización con BSTFA

Las reacciones de derivatización tienen como objetivo la modificación química de la molécula de

los analitos, principalmente con tres propósitos. Mejorar la volatilidad, aumentar la detectabilidad y

mejorar a su vez la selectividad del método.

La derivatización formando Trimetilsilil derivados (TMS), es ampliamente utilizada, ya que los

reactivos de sililación reaccionan con una gran variedad de grupos funcionales que poseen un

protón-activo, como los grupos hidroxilos12, 13

. De los reactivos empleados para la derivatización el

que presenta una mayor reactividad es el N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA),

utilizando como catalizador/solvente piridina, dimetilformamida, tetrahidrofurano, entre otros12,13

.

Además se encuentra ampliamente descrito el uso de mezclas de reactivos silalizantes, los cuales

para ciertos análisis puede mejorar la reacción12, 13

.

La derivatización de ácidos orgánicos con BSTFA se encuentra ampliamente descrita en diferentes

tipos de muestra. Asimismo la derivatización de azúcares en especial para levoglucosano con N–

trimethylsilylimidazol (TMSI) 14,18

. Ambos reactivos proponen una reacción de sililación, en el caso

de los ácidos orgánicos ayuda a disminuir polaridad y en los azúcares a aumentar su volatilidad.

Capítulo 6


En el presente trabajo se evalúa la derivatización simultánea de ácidos orgánicos y azúcares en

muestras de bio-oil. Sin embargo, considerando la inestabilidad de esta matriz en presencia de

diferentes reactivos, se debe emplear una reacción sencilla, en el cual el solvente empleado pueda

cumplir su función de disolver completamente la matriz de bio-oil. La evaluación de diferentes

reacciones de derivatización para la determinación de estos grupos de compuestos en bio-oil se

hace necesaria dado que como ya se ha discutido, es una matriz de alta complejidad y que podría

presentar importantes interferencias analíticas.

En el caso de matrices ambientales, se ha descrito la derivatización de ácidos orgánicos y azúcares,

empleando BSTFA como reactivo derivatizante 16

. Además para estas matrices la misma reacción

ha sido usada para la determinación de azúcares empleando otros reactivos como el TMSI15

.

De acuerdo a lo expuesto se evaluó el uso de los reactivos derivatizantes TMSI y BSTFA con el

objeto de determinar simultáneamente ácidos orgánicos y diferentes azúcares.

Elección reactivo derivatizante

El principal objetivo al elegir el reactivo derivatizante para esta metodología es que permita

derivatizar tanto ácidos orgánicos como azúcares, priorizando aquellos analitos que se encuentran

en mayor porcentaje en el bio-oil, es decir, principalmente ácido fórmico, ácido acético, ácido

propiónico, levoglucosano y celobiosano. Es importante señalar este último sólo ha sido

cuantificado por la metodología desarrollada por HPTLC, descrita en el capítulo 5.

Por otra parte, los reactivos silanizantes no presentan selectividad de grupos químicos, por lo que

tanto alcoholes, ácidos orgánicos, fenoles, azúcares y otros compuestos pueden ser silanizados.

Considerando que el bio-oil contiene todos estos grupos de compuestos, es necesario realizar la

detección en modo SIM, de tal forma de que la detección sea más selectiva. Para ello cada

compuesto por separado fue analizado en modo SCAN, posteriormente se eligió la razón m/z de

mayor abundancia para cada uno de ellos.

Se realizaron ensayos preliminares para la evaluación de ambos reactivos derivatizantes (TMSI y

BSTFA) bajo las condiciones experimentales especificadas por los fabricantes de cada reactivo. Los

ácidos orgánicos (fórmico y acético) lograron ser derivatizados con ambos reactivos. El

levoglucosano fue derivatizado tanto por TMSI y BSTFA, sin embargo el celobiosano sólo

reaccionó con BSTFA. El celobiosano es un disacárido, por lo tanto su derivatización se debe

realizar en condiciones de reacción más extremas que las evaluadas o emplear un reactivo

silanizante de mayor reactividad. Esto explicaría que sólo reaccionó con BSTFA. Si bien es posible

evaluar las condiciones de reacción con TMSI y hacerlas favorables para que reaccione con este

azúcar, condiciones de reacción extremas pueden afectar la estabilidad del bio-oil causando

equilibrios químicos que pueden afectar la cuantificación de las especies de interés. Por ello en

definitiva se eligió el BSTFA como reactivo derivatizante.

Capítulo 6


Selección de variables experimentales y optimización mediante diseño experimental en la

silanización simultanea de ácidos orgánicos y azúcares en muestras de bio-oil con BSTFA

La optimización de la derivatización se llevó a cabo por medio de un diseño experimental. El

procedimiento evaluado consistió en la solubilización de la muestra de bio-oil con metanol, y

evaporación del solvente con N2 a temperatura ambiente, para su reconstitución con piridina como

solvente y catalizador, añadiendo además el reactivo BSTFA. Se seleccionó como patrones internos

el ácido isobutírico y el 2,5-anhidro-D-manitol para la determinación de ácidos orgánicos y

azúcares, respectivamente.

En una primera etapa se evaluó la significancia estadística de las siguientes variables: temperatura,

tiempo de reacción y concentración de BSTFA. Para la evaluación se realizó un diseño factorial

ortogonal, de 12 análisis y 4 puntos centrales. Este diseño fue elegido para el screening

principalmente por presentar una evaluación rápida y sencilla a diferentes niveles de cada variable.

La respuesta para este diseño estuvo dada por la abundancia de las masas. Para encontrar las

variables significativas se realizó un test de ANOVA, validando a un nivel de confianza del 95 %,

con un valor-p < 0.05.

Para los ácidos orgánicos las tres variables estudiadas resultaron significativas, mientras que para

los azúcares sólo el tiempo y la temperatura de reacción fueron variables significativas. La

explicación a este resultado puede ser que los ácidos orgánicos, en especial los de bajo peso

molecular, reaccionan en forma instantánea con el BSTFA, por lo que mayores excesos de reactivo

silanizante permiten mayor probabilidad de reacción. Considerando estos antecedentes y además el

número de compuestos a determinar se optimizó el método para los ácidos fórmico y acético y los

azúcares levoglucosano y celobiosano.

Entre los diferentes diseños de superficie de respuesta posibles se eligió el diseño de Doehlert, dado

que ofrece una distribución uniforme de puntos en el espacio de respuesta experimental. Dicha

uniformidad en la distribución describe una figura romboidal (en el caso de dos variables se

produce un hexágono). Los rangos para las variables evaluadas en el caso de la determinación de

ácidos orgánicos fueron los siguientes: Temperatura (X1) de 40 a 80 °C, Tiempo (X2) de 30 a 160

minutos, concentración de BSTFA (X3) fue de 10 a 80 %v/v. Se realizaron un total de 15 análisis

con 3 puntos centrales.

Modelo matemático para el ácido fórmico:

y = 28594 (± 2670) + 12391 X1 (± 3404) + 3650 X2 (± 3404) + 17891 X3 (± 3404) + 9641 X3*X2 (±

3404)

El tiempo (X2) presentó alta variabilidad para este ácido. Esto puede corresponder a que el ácido

fórmico es la molécula más pequeña de los compuestos analizados, por lo tanto el posible

impedimento estérico que puede presentar al momento de la silanización es menor que los otros

ácidos, disminuyendo el tiempo de reacción, produciéndose de forma instantánea la derivatización

Capítulo 6


de este compuesto, más aún en presencia de temperatura y en exceso del reactivo derivatizante. Sin

embargo, y considerando este efecto, el diseño experimental fue optimizado y validado empleando

el test de ANOVA

En el caso del ácido acético, para el cual no se logró validar el modelo, se obtuvo un valor-p = 0.08

(95 % de confianza), y se visualizó que el tiempo de reacción fue la variable con mayor

significancia, seguida por la temperatura de reacción, lo cual es lógico considerando que la

molécula es mayor que la del ácido fórmico.

La evaluación de la concentración del BSTFA se realizó sólo porque un alto exceso de ésta genera

interferencia con la señal del ácido propiónico. Por lo tanto, es necesario buscar una concentración

que sea suficientemente alta para la derivatización, pero que no afecte la resolución del ácido

propiónico. Esta interferencia se observó al emplear una concentración superior a 70 % v/v. Este

parámetro fue de guía hacia la optimización de la reacción de los azúcares.

Para la optimización del diseño experimental de los azúcares, los rangos de temperaturas y tiempo

de reacción fueron mediante los mismos que se realizaron para los ácidos orgánicos. La

concentración de BSTFA se mantuvo constante a 40 % v/v (concentración en exceso que no

representa un interferencia en la determinación del ácido propiónico). Los modelos matemáticos

para ambos azúcares, se presentan a continuación.

Levoglucosano

y = 230677 (± 11074) + 27441 X1 (± 1356) + 61188 X2 (± 1356)

Celobiosano

y = 26935 (± 2847) + 6410 X1 (± 348) + 16951 X2 (± 348)

El modelo obtenido para ambos azúcares fue validado por el test ANOVA al 95 % de confianza

(Valor-p < 0.05). En ambos casos el efecto del tiempo (X2) fue significativo, sin embargo la

temperatura favoreció una reacción más corta, en especial para los azúcares. Por ello junto con

considerar las diferencias químicas entre ambos grupos de compuestos (ácidos orgánicos y

azúcares) y que las diferentes condiciones óptimas, se buscó un compromiso para la optimización

de la reacción, que fuera eficiente en conjunto tanto para ácidos como para azucares.

En la Tabla 6.6 se muestra un resumen de las variables óptimas para cada grupo de compuestos, y la

propuesta realizada para la determinación simultánea de ambos grupos.

Capítulo 6


Tabla 6.6 Variables optimas para cada grupo de compuestos, y la propuesta realizada para la

determinación simultanea.

Variables experimentales Ácidos orgánicos

(ácido fórmico) Azúcares

Ácidos orgánicos +

azúcares

Tiempo de reacción (min) 30 50 50

Temperatura de reacción (°C) 40 80 60

Concentración de BSTFA (% v/v) 35 - 40

Un aumento de la temperatura afecta considerablemente la determinación de los ácidos orgánicos, a

diferencia de los azúcares, en que la disminución de los productos es mínima, observándose para

este caso mayor estabilidad a los cambios de temperatura. El tiempo es la variable cuyo efecto sobre

la reacción es mayor (ver modelos matemáticos, variable X2). Por ese motivo, se mantuvo constante

el tiempo de reacción de los azúcares y sólo se modificó la temperatura de reacción, disminuyendo

posibles inestabilidades de los ácidos orgánicos silanizados ya formados.

Determinación de parámetros analíticos y análisis de muestras de bio-oil

Usando las condiciones de derivatización óptimas, se evaluaron los parámetros analíticos para la

determinación de ácidos orgánicos y azúcares en muestras de bio-oil. En la Tabla 6.7, se muestra el

resumen de los parámetros analíticos para los ácidos orgánicos. En la Tabla 6.8 se muestran los

parámetros analíticos correspondientes a la determinación de azúcares y en la Figura 6.7 se muestra

un cromatograma de los ácidos orgánicos y azúcares determinados en una muestra de bio-oil.

Tabla 6.7 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de ácidos orgánicos en

muestras de bio-oil.

Parámetros analíticos Ácido

fórmico

Ácido

acético

Ácido

propiónico

Ácido

láctico

Ácido

glicólico

Ecuación de la recta

instrumental

y=0.026x +

0.0926

y=0.0415x +

0.0656

y=0.0153x -

0.0383

y = 0.4029x-

0.9073

y = 0.070x +

0.0442

R 0.9963 0.9879 0.9934 0.9889 0.9795

LDa (mg L

-1) 10.5 3.4 25.1 13.3 6.5

Rango lineal (mg L-1

) LCb-200 LC-200 LC-150 LC-200 LC-200

% Recuperación (muestras de bio-oil )

86±5 74±6 98±4 79±4 74±4

Precisión intermedia 11.1 6.9 5.4 11.8 6.2 a Límite de detección (LD), calculado como 3*Sy/x/m, donde Sy/x corresponde al error típico de la curva de

calibración, considerando los primeros 4 puntos y m corresponde a la pendiente. bLC: limite de cuantificación.

Los parámetros analíticos como límite de detección y rango lineal cumplen satisfactoriamente,

aunque los valores de los limites de detección pueden ser elevados considerando la detección

Capítulo 6


empleada, sin embargo, para este caso particular se priorizó la selectividad por sobre la sensibilidad

del método desarrollado, considerando que estos compuestos se encuentran en concentraciones

suficientemente altas para ser identificados y cuantificados.

Con respecto a los valores de R, estos muestran una disminución de la linealidad en el intervalo

estudiado en comparación con los resultados obtenidos por HPLC-UV. Sin embargo, la

cuantificación en general en un detector selectivo de masas presenta mayor dificultad por tener una

alta sensibilidad a pequeñas variaciones, por lo que se confirma el uso de un estándar interno. El

ácido isobutírico se emplea como estándar interno principalmente para las variaciones que afecten

la reacción de derivatización, para obtener una mejor linealidad de las curvas de calibrado. Es

posible emplear un segundo estándar interno que permita la corrección de las fluctuaciones propias

del sistema empleado, no obstante los valores proporcionados fueron considerados satisfactorios, al

ser una metodología en la cual se realiza previamente una derivatización de dos diferentes grupos

químicos.

La precisión se obtuvo realizando 3 niveles de adiciones de la mezcla de los ácidos orgánicos

estudiados (total de muestras n = 9), las concentraciones adicionadas fueron 10, 20 y 30 mg L-1

de

cada ácido. Ácido fórmico y propiónico presentan los mayores porcentajes de recuperación de los

ácidos estudiados. La disminución de los porcentajes puede corresponder a la disminución del

exceso del reactivo derivatizante, lo que causó una disminución de la recuperación.

La precisión fue evaluada considerando un mismo bio-oil, realizando 3 diferentes derivatizaciones e

inyectando cada una por duplicado (n=6), logrando desarrollar un método con una alta precisión.

Tabla 6.8 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de azúcares en muestras

de bio-oil.

Parámetros analíticos Arabinosa Xilosa Levoglucosano Celobiosano

Ecuación de la recta

instrumental

y=0.0045x -

0.0074

y=0.0079x -

0.0253

y=0.0127x -

0.0709

y = 0.0161x -

0.0302

R 0.9966 0.9855 0.9977 0.9899

LDa (mg L

-1) 3.6 3.8 2.16 15.2

Rango lineal (mg L-1

) LCb-80 LC-80 LC-200 LC-200

% Recuperación

(muestras de bio-oil) 100±2 99±3 103±3 101±4

Precisión intermedia 2.5 1.9 1.6 8.4 a Límite de detección (LD), calculado como 3*Sy/x/m, donde Sy/x corresponde al error típico de la curva de

calibración, considerando los primeros 4 puntos y m corresponde a la pendiente. bLC: limite de cuantificación.

Capítulo 6


A diferencia de los ácidos orgánicos, lo azúcares presentan parámetros analíticos más favorables,

tanto en linealidad del rango de concentración estudiado, en recuperación y en precisión intermedia.

La obtención de estos resultados puede ser explicada por la estabilidad que presentan los azúcares al

formar los derivados silanizados.

En la Figura 6.7 se muestra el cromatograma en modo SIM, obtenido de una muestra de bio-oil.

Para todos los compuestos estudiados la resolución fue mayor a 2. A los 15 minutos se puede

observar la señal correspondiente al reactivo BSTFA, el cual, como se mencionó con anterioridad

en un exceso sobre un 70 % v/v puede afectar la resolución de las señales correspondiente tanto al

estándar interno y el ácido propiónico. También se puede observar que al emplear la detección en

sistema SIM, se favorece la selectividad, ya que la formación de derivados silanizados no es

selectiva a ácidos o azúcares, si no que a una amplia gama de grupos funcionales.

Figura 6.7 Cromatograma de la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil. Señales:

(1) ácido fórmico-TMS: (2) ácido acético-TMS; (3) ácido propiónico-TMS; (4) ácido isobutírico-

TMS (estándar interno 100 mg L-1

); (5) ácido glicólico-TMS y (6) ácido láctico-TMS; (7) 2,5-

anhidro-D-manitol-TMS (estándar interno 100 mg L-1

); (8) levoglucosano-TMS; (9) celobiosano-

TMS.

1

2

3

4

5

6

78

9

Capítulo 6


Si bien la metodología desarrollada fue optimizada para ácido fórmico, ésta presenta características

aceptables para los otros ácidos orgánicos presentes en bio-oil. La principal desventaja es el tiempo

de extracción (50 minutos) más el tiempo en la separación cromatográfica (72 minutos),

disminuyendo el número de muestras que puedan ser analizadas por unidad de tiempo. Sin

embargo, el desarrollo de una metodología con una alta selectividad y la opción de determinar 2

familias de compuestos de forma simultánea, implica un gran avance respecto a las metodologías

que actualmente se aplican para el análisis de bio-oil. En este sentido, en la Tabla 6.9 se presentan

los resultados obtenidos para 3 muestras de bio-oil, aplicando la metodología que actualmente se

utilizada para análisis de bio-oil, es decir inyección directa en un sistema GC/MS y la metodología

desarrollada en este trabajo.

Tabla 6.9 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil, para ácidos orgánicos y

azucares, ambos por GC/MS.

Compuestos Bio-oil L Bio-oil Q Bio-oil R

Ácido acético (% p/p)

Método derivatización con BSTFA 2.5 2.6 2.9

Método por inyección directa 1.7 2.4 3.2

Ácido propiónico (% p/p)


Método por inyección directa 0.1 0.1 ND

Levoglucosano (% p/p)


Método por inyección directa 1.8 2.3 1.2

*No detectado.

Los resultados obtenidos se evaluaron estadísticamente mediante un test t, en el cual la hipótesis

nula considera que no hay diferencia significativa entre los resultados obtenidos por ambos

métodos. Sin embargo la comparación se realizó sólo para el ácido acético y levoglucosano, ya que

son los dos compuestos que se han detectado y cuantificado en los tres bio-oil por ambas

metodologías. Previamente se verificó la igualdad de varianzas. El valor-p para ambos compuestos

fue superior a 0.05. El resultado demuestra que no hay diferencia significativa (a un nivel de

confianza del 95 %) entre los resultados obtenidos por ambas metodologías.

De igual forma, se realizó el contraste t para los azúcares levoglucosano y celobiosano

determinados por HPTLC y GC/MS previa derivatización. En la Tabla 6.10 se muestra la

comparación del análisis de diferentes bio-oil. Al igual que en la comparación anterior, se verificó

la igualdad de varianzas mediante el contraste F.

Capítulo 6


Tabla 6.10 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil por HPTLC y GC/MS

previa derivatización. En la determinación de levoglucosano y celobiosano.

Muestras de bio-oil crudo HPTLC (% p/p) GC/MS (% p/p)

Levoglucosano Celobiosano Levoglucosano Celobiosano

Bio-oil (atrapa niebla) 1.6 0.8 1.5 0.3

Bio-oil (ciclón) 1.7 0.9 2.1 0.4

Bio-oil N°1 1.3 0.7 1.5 0.3

Bio-oil K 2.3 1.2 2.8 0.5

La comparación estadística se realizó mediante de la misma forma anterior. El valor-p calculado

para levoglucosano y celobiosano fue de 0.462 y 0.001 respectivamente. El resultado muestra que

no hay diferencia significativa (a un nivel de confianza del 95 %) entre los resultados obtenidos por

ambas metodologías para el caso del levoglucosano, a diferencia del celobiosano, en el cual hay una

diferencia en ambos resultados. Esta diferencia se puede atribuir a que los resultados obtenidos por

la metodología desarrollada por HPTLC, puede presentar un error en la cuantificación debido a que

el celobiosano es el azúcar que presenta un menor Rf, con un desplazamiento cercano a la siembra

de la muestra, aumentando la probabilidad de que el azúcar se desplace en conjunto con otros

compuestos, causando un error por exceso en la cuantificación. Otra explicación puede ser debido a

que las condiciones de la reacción de derivatización no son suficientes para silanizar todo

celobiosano, lo que causaría un error por defecto en la cuantificación, sin embargo, este efecto en

parte se vería reflejado en los porcentajes de recuperación (ver Tabla 6.8) obtenidos para el

celobiosano.

6.6 Conclusiones

La determinación de ácidos orgánicos mediante inyección directa de bio-oil (sin tratamiento previo)

en un sistema HPLC-UV, no permite la determinación de estos compuestos debido a la presencia de

una gran variedad de compuestos químicos que interfieren en la detección UV, disminuyendo

considerablemente la selectividad del método. Sin embargo, si se puede aplicar este método para

estimar el porcentaje de ácido fórmico y ácido acético en muestras de destilados y en fracciones

orgánicas de bio-oil, previa extracción líquido-líquido.

Se logró implementar una metodología que permitió la determinación simultánea de ácidos

orgánicos y azúcares en bio-oil, usando un sistema GC/MS previa derivatización con BSTFA, la

cual contó con características analíticas satisfactorias para el objetivo propuesto. Además fue

posible aumentar la selectividad realizando una derivatización de los compuestos y usando un

detector de masas trabajando en modo SIM. Si bien la reacción de derivatización no es específica

para ácidos o azúcares, se puede optimizar la reacción hacia la formación de estos derivados.

La principal desventaja es el tiempo requerido para realizar tanto la reacción de derivatización,

como la separación cromatográfica (aproximadamente 130 minutos). En comparación con la

Capítulo 6


inyección directa en GC/MS sin tratamiento de muestra, la cual toma un tiempo de separación de

112 minutos.

Los resultados obtenidos comparando GC/MS (inyección directa) y HPTLC son considerados

estadísticamente iguales. Sin embargo, si bien es posible determinar celobiosano por GC/MS,

previa derivatización, las concentraciones detectadas por este método fueron menores a las

obtenidas por HPTLC. Es posible atribuir esta diferencia, principalmente a que en la determinación

por HPTLC, el celobiosano puede coeluir con un interferente (aparte de la glucosa).

Esta metodología desarrollada aporta un avance tecnológico en la determinación de compuestos en

bio-oil, principalmente por la determinación selectiva de los compuestos de interés, tanto en

azúcares y en ácidos orgánicos, logrando un aporte en el desarrollo de procesos industriales

destinados a la extracción de productos químicos desde el bio-oil, además fue posible determinar

especies como ácido láctico y glicólico, que si bien no presentan una opción como productos

químicos, si pueden ayudar al conocimiento de las diferentes reacciones que ocurren en el bio-oil.

Además es posible ampliar esta metodología a otros ácidos o azúcares que se requieran determinar.

Capítulo 6


6.7 Bibliografía


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Capítulo 6


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Capítulo 7

CAPÍTULO 7

DETERMINACIÓN DE ALDEHÍDOS DE BAJO PESO MOLECULAR EN BIO-OIL POR

HPLC-UV Y POR GC/MS, PREVIA DERIVATIZACIÓN/EXTRACCIÓN SIMULTÁNEA

POR HS-SPME

En este capítulo se desarrollaron metodologías analíticas para la determinación de aldehídos de bajo

peso molecular en muestras de bio-oil, orientado principalmente a lograr mayor selectividad

mediante el desarrollo de una nueva tecnología basada en SPME.

7.1 Resumen

En la presente sección se evalúan dos caminos para la determinación de aldehídos, el primero

mediante HPLC-UV previa derivatización con 2,4-DNPH y el segundo por GC/MS previa

derivatización con PFBHA. En este último caso se evalúan además diferentes métodos de

extracción. El método de HPLC-UV presenta baja selectividad, además, de ciertos problemas

relacionados con la reacción de derivatización. El método propuesto basado en GC/MS y la

derivatización/extracción automática in-situ sobre la fibra, muestra alta selectividad, rapidez y

sencillez en la determinación de aldehídos de bajo peso molecular, en especial para el formaldehido,

analito que hasta ahora había presentado dificultades mayores para su determinación.

7.2 Introducción

La aplicación directa del bio-oil como combustible está limitada por el alto porcentaje de agua y

oxígeno presentes en él, y también por el alto contenido de especies como los ácidos orgánicos,

aldehídos, azúcares y otros compuestos con varios grupos funcionales1-3

.

En el corto plazo, la ampliación de la producción industrial de bio-oil depende de su utilización para

la fabricación de productos químicos y materiales de mayor valor agregado que los combustibles1.

En general un alto contenido de especies oxigenadas reactivas hace que el bio-oil sea inestable y

corrosivo. Esta inestabilidad del bio-oil se debe a diversas reacciones químicas que tienen lugar

cuando se encuentra almacenado, donde aldehídos y ácidos se consideran los principales

compuestos reactivos3. La inestabilidad se puede manifestar en (1) un lento incremento de la

viscosidad del bio-oil durante el almacenamiento, comunmente llamado “envejecimiento” (2) un

rápido incremento de la viscosidad al aplicar calor, produciendo polimerización y separación de

fases formando un tipo de goma y carbón, (3) evaporación de los compuestos volátiles y la

oxidación de compuestos al contacto con el aire4.

Por otra parte, la expansión del uso de sistemas de pirólisis rápida para la producción de bio-oil

expone cada vez más a un elevado número de personas a potenciales peligros para su salud.

Estudios vigentes han evaluado los peligros producidos por la exposición prolongada al líquido de

pirólisis de la madera. La toxicidad del bio-oil depende de su composición, la cual es función del

proceso de pirólisis y la materia prima empleada. Sobre la base de las concentraciones de

determinados compuestos del bio-oil y los niveles de exposición, se puede concluir que algunos

aldehídos (formaldehído, acroleína), furanos y fenoles, pueden requerir prevención debido a su

toxicidad. La proyección de la toxicidad oral aguda sería de alrededor de 700 mg/kg de peso

Capítulo 7

corporal5. En especial la presencia de formaldehido y acetaldehído podría causar efectos adversos a

largo plazo5.

Considerando estos aspectos, es necesaria la remoción de estos compuestos desde el bio-oil. Sin

embargo, estos compuestos pueden ser utilizados a nivel industrial. El formaldehído puede

reaccionar con especies fenólicas para formar resinas fenol-formaldehido6-8

.

Unos de los aldehídos que se encuentran en mayor concentración en el bio-oil es el

hidroxiacetaldehído (HAA), el cual está principalmente en la fase acuosa, predominantemente como

hidrato, lo que disminuye notablemente su volatilidad. Su principal uso es para producir un efecto

dorado en los alimentos y para la producción de sabores, reaccionando con aminas o amoniaco9.

Además es utilizado para elaborar productos artificiales con acción bronceadora, de la piel9.

La determinación de HAA se realiza principalmente por inyección directa en GC/MS (ver capítulo

4). Se ha reportado su determinación por HPLC-IR10, 11

, del cual no se presentan cromatogramas ni

los parámetros analíticos correspondientes. Además se ha reportado la determinación por 13

C NMR,

mediante una extracción de la lignina pirolítica seguida por una extracción con dietiléter. Esta

determinación permite tanto la cuantificación como la identificación de los principales monómeros

y dímeros del HAA en el bio-oil12

.

El formaldehído y el acetaldehído al igual que el HAA, se pueden determinar por HPLC-IR11

, con

los inconvenientes indicados en el párrafo anterior. Además se ha reportado su identificación por

GC/MS, pero sin éxito en la cualificación por la coelución con el solvente empleado.

En este capítulo, se evalúa la determinación de los principales aldehídos por HPLC-UV, previa

derivatización con 2,4-dinitrophenylhidrazina (DNPH). Además, considerando la complejidad de la

muestra, se desarrolló una metodología basada en SPME y GC-MS mediante la modificación

química del recubrimiento de una fibra de microextracción en fase sólida (SPME) con o-(2, 3, 4, 5,

6-Pentafluorobenzyl) hydroxylamine hydrochloride (PFBHA), realizando la extracción en el

espacio de cabeza de la solución. Por último esta metodología fue comparada con una metodología

basada en la derivatización de aldehídos en solución y su posterior extracción directa desde su

espacio de cabeza, seguido por la separación mediante GC-MS.

En cuanto a la determinación de aldehídos por HPLC, ésta se encuentra ampliamente descrita en

diferentes matrices como aire, agua, bebidas alcohólicas, alimentos entre otras13-17

, principalmente

realizando una reacción de condensación entre los grupos carbonilos con 2,4-DNPH, generando

compuestos coloreados que pueden ser determinados a una cierta longitud de onda. Esta reacción es

catalizada en medio ácido y tiene como resultado final la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas.

En la Figura 7.1 se presenta la reacción para la formación de hidrazonas.

Capítulo 7

Figura 7.1 Reacción del 2,4-DNPH con grupos carbonilos. R1 y R2 pueden corresponder a H,

grupos alquil o aril.

Para muestras de bio-oil, se ha reportado el uso de esta metodología en la determinación de

aldehídos10

. Sin embargo no se informan las condiciones de derivatización y separación, los

parámetros analíticos ni un cromatograma de dicha determinación. Por esta razón, se evaluaron y

optimizaron las condiciones propuestas en diferentes trabajos publicados.

Es posible realizar la formación de hidrazonas con aldehídos de bajo peso molecular a temperaturas

cercanas al ambiente, entre 15 a 25 °C y con tiempos de reacción de 30 minutos, en un medio ácido

empleando ácido fosfórico16, 17,19

. Considerando la variabilidad de aldehídos que se desean

determinar es necesaria la optimización de esta reacción de derivatización. Para tal efecto se deben

evaluar los parámetros como tiempo de reacción, temperatura de reacción y pH de la solución.

a) Tiempo de reacción: tiempo en que los aldehídos reaccionan cuantitativamente para formar

hidrazonas. En la mayoría de las publicaciones, este tiempo no supera los 30 minutos.

b) Temperatura de reacción: En este método la temperatura de reacción tiene una mayor

incidencia por la presencia de HAA, el cual con temperatura mayor puede separar el dímero

y afectar la derivatización. En la mayoría de la bibliografía se describe la determinación de

aldehídos alifáticos sin aplicación de temperatura. La desventaja es que a mayor

temperatura se puede producir la descomposición de las hidrazonas formadas.

c) pH de la reacción: La reacción de derivatización es catalizada en medio ácido

(principalmente ácido fosfórico), ya que favorece el ataque nucleofílico del grupo –NH2 al

grupo carbonilo. En literatura se ha demostrado que el pH tiene una gran incidencia en el

tiempo de reacción. A pH cercanos a 1.8 la reacción puede tener lugar en sólo 30 minutos19

.

En relación a la determinación de aldehídos mediante GC, la EPA (Environmental Protection

Agency) describe la determinación de grupos carbonilos en agua, mediante la derivatización con o-

(2,3,4,5,6-pentafluorobencil) hidroxilamina clorhidrato (PFBHA) y posterior separación por

cromatografía de gases con detección por captura de electrones (método 556)20

. Este método

propone la extracción líquido-líquido de las oximas generadas usando n-hexano como solvente. Un

esquema de la reacción de derivatización con PFBHA se muestra en la Figura 7.2. Esta reacción

genera oximas volátiles y térmicamente estables21

. El uso de PFBHA como reactivo derivatizante

permite establecer selectividad analítica y permite el uso de detectores convencionales. La

Capítulo 7

derivatización está basada en una cinética de reacción de primer orden, permitiendo la

cuantificación de los analitos, siendo utilizado como método de screening para la identificación de

ciertos aldehídos en muestras de aire22

.

Figura 7.2 Reacción de derivatización para formación de oximas, mediante la reacción de

PFBHA con grupo carbonilos22

.

C

O

RH

F

F

CH2

F

F

F

O

NH2

+

PFBHA

Aldehído

R= H, HCHO

F

F

CH2

F

F

F

O

N C

R

H

F

F

CH2

F

F

F

O

N C

H

R

PFBHA- Carbonil-oxima

Cabe señalar que en la reacción de derivatización cuando R no corresponde a H (Figura 7.2),

genera los 2 compuestos (E, Z), los cuales corresponden a los isómeros de cada aldehído. Por lo

tanto, en el cromatogramas se observan dos señales de cada aldehído, a excepción del

formaldehído.

Una de las desventajas del uso de la extracción líquido-líquido es la baja recuperación de las

oximas generadas en la fase acuosa mediante un solvente orgánico específico, lo que afecta al

rendimiento de la reacción. El proceso de tratamiento de muestra, derivatización y extracción,

puede ser simplificado empleando SPME en conjunto con el reactivo derivatizante PFBHA.

Se han propuesto varios enfoques en el uso de la SPME en esta reacción, principalmente porque

permite realizar una derivatización en diferentes etapas. En la Figura 7.3 se muestra un esquema

de las posibilidades que ofrece esta técnica.

Capítulo 7

Figura 7.3 Esquema de las estrategias de derivatización posibles utilizando SPME. (Modificación

esquema propuesto por J. Pawliszyn)25

.

Estrategias de

derivatización en

SPME

Derivatización de la

muestra, seguida por

SPME

Extracción de analitos por

SPME, seguida por una

derivatización on-fibre

Paso 1

Añadir reactivo

derivatizante a la

solución de la muestra y

procede la reacción

Simultanea

Extracción / on-fibre

derivatización

Paso 1

Exponer la fibra en la

solución de la muestra, para

la extracción de los analitos

Paso 1

Exponer la fibra en la solución del

reactivo derivatizante, para la

modificación química de la fibra

Paso 2


solución de la muestra,

para la extracción de los

analitos derivatizados

Paso 2


solución del derivatizante

Paso 2

Exponer la fibra en la solución de

la muestra, para la reacción de

derivatización en la fibra

Paso 3

Desorción y análisis

La primera opción, que corresponde a la derivatización en la solución de la muestra, y

posteriormente la extracción, puede ser aplicada principalmente a muestras que no presenten

problemas de complejidad de la matriz. Esto debido a que la fibra del SPME puede sorber tanto los

aldehídos derivatizados, como los otros compuestos presentes en la matriz.

La segunda opción, que corresponde a la extracción de los analitos por SPME y posteriormente

derivatización en la fibra, al igual que el primer caso, presenta el inconveniente que la matriz de la

muestra contenga una alta concentración de otros compuestos, que pueden tener afinidad por la

fibra empleada, lo cual puede ser una fuente de interferencias.

La tercera opción contempla realizar una modificación química de la fibra del SPME, exponiendo

primero la fibra en la solución del reactivo derivatizante, para luego exponer esta fibra modificada a

la muestra. Este método presenta la ventaja de poder ser utilizado en muestras de alta complejidad,

más aun cuando el reactivo derivatizante presenta una alta selectividad.

Capítulo 7

Considerando los antecedentes anteriormente presentados para el análisis de aldehídos, en primer

lugar se desarrolló e implementó una metodología basada en extracción/derivatización de forma

simultánea, lo que permite aumentar la selectividad especialmente al ser realizada en modo espacio

de cabeza (HS).

En bibliografía se ha descrito la extracción/derivatización on-fiber para determinación de aldehídos

usando PFBHA (Figura 7.4), la cual involucra la sorción del derivatizante en el recubrimiento de la

fibra, seguido por la derivatización de los aldehídos en la fibra (on-fiber) y la posterior desorción en

el sistema cromatográfico22

. Denominado en este trabajo como OFD-HS-SPME-GC/MS.

Figura 7.4 Etapas de las constantes de distribución propuestas en las cuatro etapas de la

derivatización on-fiber22

.

PFBHA * S Sorción (A) PFBHA + S

k1

PFBHA * S

k-1

PFBHA + S Desorción

Carbonil * S Sorción (B) Carbonil + S

k2

Carbonil * S

k-2

Carbonil + S Desorción

Oxima * S Reacción (C) Carbonil + PFBHA * S

K*

Oxima * S

k3

Oxima + S Desorción (D)

La primera etapa (A) consiste en la sorción del PFBHA en la superficie de la fibra (S), en la cual la

sorción de este reactivo es significativamente mayor que la desorción (k1 >>> k-1)22

. La segunda

etapa (B) considera la posibilidad que los carbonilos ocupen espacios de la fibra. Esta etapa se

considera nula (k2 = 0), entendiendo que la capacidad de sorción de la fibra está completa con el

PFBHA22

. La tercera etapa (C), se refiere a la velocidad de reacción de los grupos carbonilos

(gaseosos) con el reactivo PFBHA (en la fibra) 22

. El grupo aromático del PFBHA (ver Figura 7.2)

proporciona la mayor afinidad con el recubrimiento de la fibra, dejando a la hidroxilamina

disponible para la reacción con los grupos carbonilos que se acercan. La cuarta etapa (D), considera

la posibilidad de la desorción (a temperatura ambiente) de la oxima formada. Los estudios

demuestran que la afinidad de la oxima por el recubrimiento de la fibra es muy alta, por lo que K3

tiende a cero22

.

Por otra parte, considerando que las etapas involucradas en el proceso mencionado pueden afectar

la reproducibilidad del método y que el trabajo en un sistema HS otorga mayor selectividad que la

inyección directa, se desarrolló una segunda metodología, en la cual se realizó la derivatización de

los aldehídos en la solución de la muestra y la extracción de las oximas generadas se hizo por el

sistema HS25

. Sin embargo, se debió considerar que la selectividad se ve afectada, ya que sería

posible extraer mejor los analitos volátiles en el bio-oil. Esta última metodología, correspondiente a

Capítulo 7

la derivatización de aldehídos en la solución de la muestra y su extracción mediante el sistema HS,

fue denominada con la abreviación D-HS-GC/MS.


7.3.1 Reactivos

Formaldehído 37%, valeraldehído, 2,4-dinitrophenylhidrazina (DNPH), metanol y acetonitrilo

(ambos grado HPLC), fueron adquiridos en Merck (Darmstadt, Germany). Acetaldehído 99.5 %,

propionaldehído 97 %, 2-furaldehído, glicolaldehído (dímero) y o-(2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorobenzyl)

hydroxylamine hydrochloride > 99 % (PFBHA), fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis,

MO, USA). Agua desionizada (18 mΩ) fue obtenida por un sistema Millipore Milli-Q (Bedford,

MA, USA).

7.3.2 Materiales

Fibras para SPME manual, polyacrylato 85 µm (PA), polydimethylsiloxane/divinylbenceno 85 µm

(PDMS/DVB), carboxen/polydimethylsiloxano 75 µm y fibras para SPME StableflexTM

para

autosampler, polydimethylsiloxane/divinylbenceno 65 µm (23GA), fueron adquiridas a Supelco

(Bellefonte, PA, US). Placa agitadora y calefactora RTC-basic y control de temperatura ETS-D4

fuzzy fueron adquiridos a Kika labortechnik (Alemania).

7.3.3 Instrumentación y condiciones cromatográficas

Sistema HPLC-UV

Sistema HPLC Merck-Hitachi compuesto por autosampler L-2200, bomba L-2130, detector UV L-

2400. Columna Shim-Pack VP-ODS 25 cm x 4,6 mm. Programa de integración Graphics versión

6.20 de Varian Inc. El gradiente utilizado consistió en 45 % de acetonitrilo, 55 % de agua por 1

minuto, incrementando linealmente hasta 65% de acetonitrilo (durante 5 minutos), quedando

constante hasta los 9 minutos, decrece hasta 60 % de acetonitrilo en 16 minutos y permanece

constante hasta los 25 minutos. Un flujo de 1.5 ml min-1

, detección a 360 nm, y volumen de

inyección de 10 µL.

Sistema GC/MS

Compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-Packard (Palo Alto, CA, USA)

equipado con un inyector split/splitless, detector de selectivo de masas HP 5973 y autosampler

Combi PAL CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El sistema es controlado por HP

ChemStation G1701AA, versión A.03.00 y el programa Cycle composer software 1.4.0, para el

autosampler.

En la separación cromatográfica se utilizó la columna VF-1701 (14% cyanopropyl/phenyl, 86%

polydimethylsiloxane) de 60 m × 0.25 mm I.D, 0.25 µm film. Helio electrónico grado 6.0

(99.9999%) con un flujo de 2 mL min−1

. La detección se realizó en modo SCAN.

Se utilizaron dos programas de temperaturas, dependiendo de la técnica de

derivatización/extracción.

Capítulo 7

La abraviatura D-HS-GC/MS, corresponde a la determinación de aldehídos por GC/MS previa

derivatización con PFBHA en solución y posterior extracción de los derivatizados usando sistema

espacio de cabeza (HS).

La abreviatura OFD-HS-SPME-GC/MS corresponde al proceso simultaneo de

derivatización/extracción “on-fiber” de aldehídos empleando un sistema de microextracción en fase

sólida (SPME) en modalidad HS.

Rampa de temperatura para sistema D-HS-GC/MS: Temperatura inicial de 80 °C, con un

incremento de 3 °C min−1

hasta 150 °C (rampa 1), 40 °C min−1

hasta 280 °C (rampa 2), y una

limpieza a 280 °C por 5 min. La temperatura del inyector fue de 260 °C con un volumen de

inyección de 1000 µL utilizando el sistema Split 250:1.

Rampa de temperatura para sistema OFD-HS-SPME-GC/MS: Temperatura inicial de 45 °C, con

un incremento de 3 °C min−1

hasta 150 °C (rampa 1), 40 °C min−1

hasta 280 °C (rampa 2), y una

limpieza a 280 °C por 5 min. Temperatura del inyector fue de 260 °C, utilizando el sistema split

250:1.

7.3.4 Preparación de estándares y tratamiento de muestras de bio-oil

Sistema HPLC-UV

Todos los estándares de aldehídos fueron preparados en acetonitrilo y almacenados a 4 °C.

a) Preparación de reactivo derivatizante: 5 mg de 2,4-DNPH fueron disueltos en 5 mL de una

solución que contiene 1.25 mL de HCl, 3.12 mL de agua y 625 µL de acetonitrilo. Esta

solución se mantuvo a temperatura ambiente.

b) Preparación de muestras de bio-oil: 250 µL of bio-oil fueron disueltos en 4 mL de

acetonitrilo/agua 50/50 v/v. Es necesario realizar diluciones posteriores, empleando la

misma solución de acetonitrilo/agua.

c) Derivatización de muestras y estándares: 100 µL de 2,4-DNPH fueron añadidos a 500 µL

de las respectivas soluciones.

Sistema GC/MS

Todas las soluciones, incluido el patrón interno (valeraldehído), fueron preparadas con metanol y

almacenadas a una temperatura inferior a -10 °C. Las diluciones sucesivas se realizan sólo con

agua. La preparación de estas soluciones en agua se realizó en el momento del análisis. El PFBHA

se preparó a concentración de 50 mg mL-1

en metanol/agua 50/50 % v/v. Es recomendable la

preparación de este reactivo en el momento del análisis.

El tratamiento de las muestras de bio-oil consistió en la precipitación de la lignina pirolítica

adicionando agua en una razón 1/10 bio-oil/agua. Posteriormente la muestra fue centrifugada para

facilitar la separación de la lignina. Estas muestras fueron diluidas empleando agua como solvente.

Considerando la hidratación de los aldehídos, fue necesario preparar las muestras en el momento

del análisis.

Capítulo 7


a) Derivatización de aldehídos en bio-oil por HS-GC/MS

Se agrega 1.0 mg mL-1

del reactivo derivatizante PFBHA al vial de 2 mL que contiene una alícuota

adecuada de bio-oil, con una concentración de 100 µg L-1

del estándar interno. El volumen total

corresponde a 2 mL y el vial debió ser sellado herméticamente con tapas magnéticas

b) Derivatización de aldehídos en bio-oil por HS-SPME-GC/MS

La derivatización “on-fiber” requiere la preparación del derivatizante en un recipiente aparte de la

muestra, donde 3.0 mg mL-1

de PFBHA se mezclan con 2 mL de agua en un vial de 20 mL, Por otro

lado, la muestra se preparó en un recipiente de 20 mL conteniendo una alícuota adecuada de bio-oil

y estándar interno en una concentración de 100 µg L-1

. Ambas soluciones deben ser selladas

herméticamente empleando tapas magnéticas.

7.3.5 Optimización de metodologías D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS

Ambas metodologías fueron optimizadas mediante una construcción de un diseño experimental. El

programa estadístico empleado fue el MODDE 7.0, proporcionado por el Dr. David Contreras de la

Facultad de Química de la Universidad de Concepción.

7.4 Resultados y discusión

7.4.1 Determinación de aldehídos por HPLC previa derivatización con 2,4-DNPH

Los compuestos que se evaluaron por esta metodología corresponden a los aldehídos de bajo peso

molecular (formaldehído, acetaldehído), HAA, y 2-furaldehído como compuesto mayoritario del

grupo de los furanos. Estos dos últimos, como ya se describió en el capítulo 4, también pueden ser

determinados por GC/MS.

Optimización de la reacción de derivatización

Considerando que formaldehído y acetaldehído son compuestos que se encuentran presentes en el

bio-oil y actualmente no hay una metodología propuesta para su determinación, la optimización de

esta reacción se focalizó en la obtención de las hidrazonas de estos compuestos. No obstante

también se tomó en consideración la determinación de HAA y 2-furaldehído.Se evaluaron

diferentes tiempos de reacción entre 15 a 45 minutos a temperatura ambiente y pH 1.8. Por otro

lado, se evaluaron temperaturas entre 20 y 40 °C, manteniendo un tiempo de reacción de 30

minutos.

Las condiciones óptimas encontradas fueron 35 °C por 30 minutos, para formaldehido, acetaldehído

y 2-furaldehído. No obstante, en la literatura se reportan tiempos y temperaturas menores para la

determinación de formaldehído y acetaldehído, principalmente. Esta diferencia se debe a que el bio-

oil contiene 2-furaldehído, el cual es un compuesto de estructura y características químicas

diferentes a los aldehídos alifáticos de bajo peso molecular, por lo tanto, la reacción tendrá lugar en

condiciones que aumenten tanto la cinética de reacción como el tiempo necesario para la

derivatización de este compuesto.

Capítulo 7


En la Figura 7.5 se muestra un cromatograma de mezcla de estándares de aldehídos, donde es

posible observar adecuada resolución (mayor a 2 para todos los pares de compuestos). En la Tabla

7.1 se muestran los principales parámetros analíticos determinados con una mezcla de estándares.

Figura 7.5 Cromatograma por HPLC-UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de estándares de aldehídos

en condiciones óptimas. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-

DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH.

1

2

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

Minutes

-19

0

50

100

2.2

41

7.3

22

8.4

50

3 4

Tabla 7.1 Parámetros analíticos de la curva de calibración instrumental de aldehídos por HPLC-

UV, previa derivatización con 2,4-DNPH.

Aldehídos Rango lineal

mg L-1

Ecuación de la recta R

Limite de deteccióna

mg L-1

HAA 40 - 125 y=5.4735x-204.03 0.996 > 25

Formaldehído 1.5 - 7.0 y=481.8x + 108.5 0.985 0.98

Acetaldehído 0.5 - 20 y=15.56x + 32.42 0.956 2.73

2-furaldehído 5.0 - 40 y=26.45x + 57.18 0.978 1.28 aLímite de detección calculado a partir del Sy/x obtenido de la curva de primeros cuatro puntos.

El HAA presenta una curva polinomial de coeficientes y = -5E-06x4 + 0,0007x

3 + 0,0205x

2 -

0,7391x - 0,1003, presentando linealidad sólo desde 40 mg L-1

hasta 125 mg L-1

(ver Tabla 7.1).

Esto puede deberse a que esta especie forma diferentes hidratos estables en solución acuosa, el alto

porcentaje de agua que contiene el bio-oil influye negativamente en la posibilidad de derivatizar el

HAA a temperatura ambiente. Es por esta razón se observó que a mayores temperaturas se produjo

un aumento del rendimiento en la formación de hidrazonas. La desventaja es que a altas

temperaturas el derivatizado es mucho más inestable, en especial del formaldehido.

Por otra parte el método muestra un rango lineal estrecho para formaldehido, lo que representa un

inconveniente dado que este compuesto se encuentra en altas concentraciones en bio-oil (1.0-3.5 %

en peso)2. El método no presenta problemas de linealidad para acetaldehído ni 2-furaldehído,

mostrando un rango lineal de trabajo aceptable. Sin embargo el límite de detección del acetaldehído

es alto, por lo que la dilución del bio-oil deberá ser menor para lograr cuantificar este compuesto.

Capítulo 7


No obstante una menor dilución del bio-oil interfiere en la cuantificación del formaldehído, por lo

que el método no es apropiado para la cuantificación de simultánea de ambos compuestos en esta

matriz.

Se evaluó la derivatización en de bio-oil crudo, para lo cual fue necesario encontrar la razón óptima

de los solventes agua y acetonitrilo para la solubilización del bio-oil, encontrándose como

proporción óptima una mezcla 50/50 v/v. En la Figura 7.6 se muestra un cromatograma de una

muestra de bio-oil crudo, derivatizado con 2,4-DNPH, a 360 nm.

Figura 7.6 Cromatograma HPLC/UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de aldehídos presentes en una

muestra de bio-oil crudo. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-

DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH.

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

Minutes

-20

0

50

100

150

200

mVolts

1.8

26 2

.23

9

2.5

08

3.2

31

3.6

33

3.7

94

4.3

05

4.6

27

5.1

81

5.4

36

5.5

49

5.8

35

6.5

17

6.7

59

7.1

32

7.3

46

7.7

04

7.9

67

8.3

02

8.4

65

8.5

86

8.9

09

9.1

91

9.7

68

10.3

92

10

.51

3

10

.86

8

12.2

91

13.3

28

13

.770

14

.62

1

15

.30

6

15

.61

1

16

.47

5

1

2

34

En el cromatograma de una muestra de bio-oil se observa que es posible la separación de los

aldehídos, sin embargo la resolución respecto a interferentes no es suficiente (aproximadamente

1.0). Esto es debido a que la selectividad de esta derivatización es baja, considerando que participan

todas las familias químicas que poseen el grupo carbonilo y además, las especies que pueden

presentar una absorción a 360 nm.

En la bibliografía se describe que esta metodología se ha aplicado a diferentes tipos de muestras con

resultados satisfactorios, en especial muestras atmosféricas. No obstante para muestras de bio-oil se

observan varias limitaciones, entre las cuales está que las reacciones de derivatización en la

solución de bio-oil deben competir con las sucesivas reacciones que se pueden producir al emplear

un catalizador a pH muy ácido. Además no tan sólo el HAA puede estar presente como dímero y los

aldehídos en general pueden formar hidratos en medio acuoso. Por otra parte, si bien no se observan

problemas en la coelución de esta especie con otros compuestos, la resolución es baja y de todas

maneras es necesaria la confirmación de la presencia de estos aldehídos mediante una técnica más

selectiva.

Capítulo 7


Considerando los inconvenientes en la aplicación de esta metodología, a continuación se desarrollan

y evalúan dos metodologías para la determinación de aldehídos de bajo peso molecular en muestras

de bio-oil mediante GC/MS previa derivatización con PFBHA, una en modalidad espacio de cabeza

(HS) y la segunda mediante microextracción en fase sólida (SPME) previa modificación química

de la fibra de extracción posterior derivatización/extracción, todo ello realizado de manera

automática.

7.4.2 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS previa derivatización

con PFBHA. Comparación de procedimientos de derivatización en solución y derivatización

en fibra (D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS respectivamente)

Ambas metodologías fueron optimizadas mediante diseño experimental y junto con ello se utilizó

como patrón interno valeraldehído con el objetivo de minimizar el error asociado a la inyección de

la muestra y a la reacción de derivatización.

Como se mencionó con anterioridad, ambas metodologías propuestas para la determinación de

aldehídos en bio-oil presentan varias etapas, las cuales pueden afectar la reproducibilidad del

método, en mayor proporción la que utiliza la técnica de microextracción en dase sólida. Este

inconveniente puede ser disminuido empleando un sistema de introducción de muestra automático.

Además cabe destacar que en trabajos publicados, la optimización de los métodos en que evaluaban

la derivatización de aldehídos “on-fiber” (empleando PFBHA) se realizó evaluando

individualmente cada parámetro o factor24, 28

. En este trabajo se empleó un diseño experimental para

la optimización de los métodos propuestos.

7.4.2.1 Optimización del método D-HS-GC/MS

Para la optimización de esta metodología se empleó un diseño central centrado en las caras con

puntos estrellas y 4 puntos centrales, con un total de 18 experimentos.

Considerando que el procedimiento consiste en la derivatización en la solución de la muestra los

factores experimentales evaluados fueron los siguientes:

a) Temperatura de derivatización y extracción: corresponde a la temperatura a la cual la

derivatización tiene lugar y la temperatura a la cual las oximas formadas se encuentren en la

fase HS. Se ha demostrado que el incremento de la temperatura favorece significativamente

la reacción, disminuyendo los tiempos de reacción. La ventaja de esta reacción es que las

oximas formadas son térmicamente estables. El principal inconveniente es que usa agua

como solvente, por lo cual la temperatura no excedió los 85 °C. El rango evaluado fue entre

35 – 85°C.

b) Tiempo de derivatización: corresponde al intervalo de tiempo en el cual la muestra es

agitada en el sistema. El objetivo es favorecer la reacción de derivatización y facilitar la

distribución de las oximas entre la fase acuosa y gaseosa. El tiempo evaluado para estos

compuestos es entre 5 -70 minutos.

Capítulo 7


c) Agitación: La agitación en los procedimientos de extracción presenta gran importancia, al

estar directamente relacionados en la difusión de las especies formadas hacia la fase HS. El

rango de agitación. Se evaluó un rango entre 250-700 rpm.

Los resultados obtenidos se analizaron sólo para el formaldehído y el acetaldehído. El

propionaldehído estaba en bajos niveles de concentración en las muestras de bio-oil. En la Figura

7.7 se presenta el gráfico de los coeficientes de los factores obtenidos para el formaldehído, junto

con su error estándar. En la Figura 7.8 se presenta el mismo gráfico para el acetaldehído.

Figura 7.7 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la derivatización/extracción de

formaldehido en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS.

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

Abundancia

X1

X2

X3

X3X3

Donde: X1 es tiempo de reacción, X2 temperatura y X3 agitación.

Ecuación de la optimización para el formaldehido:

y = 2.458+06

(± 295601) + 558143 X1 (± 198918) - 793458 X2 (± 209268) - 53309 X3 (± 214856) –

1.478+06

X32 (± 357597)

El formaldehído es el compuesto que muestra mayor variabilidad según muestran los resultados,

debido principalmente a que este compuesto presenta mayor volatilidad, afectando el equilibrio

entre la fase acuosa y la fase HS, por esta razón, al aumentar la temperatura se produce una

disminución de la formación de oxima.

Capítulo 7


Figura 7.8 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la derivatización/extracción del

acetaldehído en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS.

X1 X2

X3

X3X3

-40000

-30000

-20000

-10000

0

10000

20000

30000

C1

Ab

un

dan

cia

Donde: X1 es tiempo de reacción, X2 temperatura y X3 agitación.

Ecuación de la optimización para el acetaldehído:

y = 55527 (± 6202.1) + 15111 X1 (± 4173) + 24421 X2 (± 4391) – 12977 X3 (± 4508) – 32186 X32

(± 7503)

El acetaldehído presenta menor variabilidad que el formaldehido. Además se observa que la

temperatura de la reacción tiene un efecto positivo sobre la formación y la extracción de las oximas

generadas.

Ambos modelos obtenidos fueron validados por el test ANOVA al 95 % de confianza (valor-p <

0.05). Las condiciones óptimas del método fueron temperatura 80 °C, 60 minutos de reacción y

agitación de 350 rpm. En la figura 7.9 se muestra un cromatograma de una muestra de bio-oil,

previa formación de las oximas (aldehído-PBHA), en las condiciones optimizadas obtenido por esta

metodología.

Capítulo 7


Figura 7.9 Cromatograma de una muestra de bio-oil por D-HS-GC/MS, en modo SCAN. Señales: 1

= formaldehído-PFBHA oxima; 2 = acetaldehído-PFBHA oxima; 3 = propionaldehído-PFBHA

oxima and 4 = valeraldehído-PFBHA oxima (estándar interno).

Como se mencionó anteriormente (ver Figura 7.2), para las señales correspondientes al

acetaldehído, propionaldehído y el estándar interno (valeraldehído), se observan 2 señales

cromatográficos, las cuales corresponden a los isómeros de cada aldehído. Para efecto de la

cuantificación, y obtención de los parámetros analíticos se consideraron las sumas de las áreas de

ambas señales obtenida para cada aldehído.

Tanto para el formaldehído, acetaldehído, propionaldehído y el patrón interno, se obtiene una alta

resolución de las señales cromatográficas mayor a 2.5. Además se observa una alta selectividad del

método propuesto. Ésta se evaluó a través de la comparación de los espectros de masas obtenidos

para cada señal cromatográfica tanto de la solución estándar como de la muestra de bio-oil. Esto

permitió realizar la detección en modo SCAN. La mayor abundancia tanto para los aldehídos

derivatizados y reactivo derivatizante (PFBHA) corresponde al m/z = 181. Por esta razón se

descartó el uso del sistema SIM.

Posterior a la optimización de esta metodología, se procedió a la optimización de la metodología

OFD-HS-SPME-GC/MS.

Capítulo 7


7.4.2.2 Optimización del método OFD-HS-SPME-GC/MS

El modo de extracción/derivatización, mediante empleo de una fibra polimérica, presenta algunas

ventajas con respecto a la D-HS-GC/MS. Esta corresponde principalmente a la alta selectividad que

permite, con lo cual se puede lograr la exclusiva derivatización de los aldehídos más volátiles,

además de la reducción del tiempo de análisis. La principal desventaja se presenta al estar dividida

en dos etapas de extracción. La primera consiste en la modificación química de la fibra a emplear.

Para ello el reactivo PFBHA deben ser extraídos desde la fase acuosa hacia el recubrimiento de la

fibra. La segunda etapa contempla la extracción de aldehídos desde la fase acuosa mediante HS

hacia la fibra que contiene adherido o absorbido (dependiendo del tipo de recubrimiento) el reactivo

derivatizante. En la Figura 7.10, se presenta un esquema de las dos etapas involucradas y las

diferentes fases.

Figura 7.10 Esquema propuesto de las etapas y fases involucradas en la extracción/derivatización

de aldehídos “on-fiber”.

PFBHA

PFBHA

PFBHA

Fase gaseosa

Fase polimérica

Fase acuosa

Aldehídos

Aldehídos-

PFBHA

Aldehídos

Etapa 1 Etapa 2

El recubrimiento polimérico de la fibra también es un factor que debe ser evaluado. En literatura se

presenta como recubrimiento más adecuado la fibra recubierta con DVB/PDMS 22-29

, en la etapa de

sorción del derivatizante PFBHA en la fibra.

En este trabajo se evaluaron diferentes fibras, con respecto a la matriz de la muestra, considerando

la gran cantidad de compuestos volátiles que están presentes en el bio-oil y que pueden presentar

una sorción en la fibra, produciendo la desorción del reactivo derivatizante e impidiendo la

formación de las oximas correspondientes.

Además, el uso de un sistema de inyección automático favorece la reproducibilidad que se puede

obtener. Los principales inconvenientes son el realizar en forma reproducible las dos etapas que

contempla este procedimiento, para lo cual no hay un sistema de inyección automático de muestra

que pueda realizar ambas etapas de forma automática. Para superar esta limitante en el presente

trabajo se creó un sistema virtual con el mismo sistema de inyección, el cual permitió realizar

ambas etapas de forma automática.

Capítulo 7


Primeo se evaluó el tipo de recubrimiento polimérico y el uso de un sistema automático, lo cual se

realizó mediante un diseño experimental, optando por una única etapa, lo cual se detalla a

continuación junto con el posterior diseño y optimización de la metodología.

Elección del tipo de recubrimiento polimérico de la fibra para OFD-HS-SPME-GC/MS

Como ya se indicó, se han publicado trabajos donde se evaluaron diferentes recubrimientos

poliméricos para el análisis de aldehídos usando un método de derivatización/extracción

simultánea22-24

. Las fibras evaluadas corresponden principalmente a fibras mixtas y fibras como

DVB/PDMS/DVB. La fibra PDMS/DVB proporcionó la mejor retención del reactivo PFBHA, y de

la oxima formada22-24

. No obstante, el bio-oil contiene una gran diversidad de compuestos

orgánicos, que pueden competir con el reactivo derivatizante por dicha la fibra. Esto no ha sido

evaluado, ya que en los trabajos mencionados esta tecnología se aplicó a muestras de menor

complejidad como muestras de agua y bebidas alcohólicas. Por ello se evaluó la capacidad de

extracción de diferentes compuestos que están presentes en bio-oil usando diferentes

recubrimientos poliméricos y diferentes temperaturas, mediante la modalidad de derivatización “on-

fiber”. En la Figura 7.11, se muestran gráficos con las abundancias de los compuestos extraídos por

las diferentes fibras.

Figura 7.11 Evaluación de los diferentes recubrimientos poliméricos a distintas temperaturas de

extracción. (A) 30 °C; (B) 40 °C y (C) 60°C.

0

5500000

11000000

16500000

22000000

27500000

33000000

38500000

Abundancia

Compuestos

Evaluación de diferentes recubrimientos poliméricos en muestra de

bio-oil a 30 °C por HS-SPME-GC/MS

CAR/PDMS PA

DVB/PDMS

(A)

Capítulo 7


0

5500000

11000000

16500000

22000000

27500000

33000000

38500000

Abu

ndancia

Compuestos

Evaluación del recubrimiento poliméricos en muestras de bio-oil a

40 °C por HS-SPME-GC/MS

CAR/PDMS

PA

DVB/PDMS

(B)

05500000

110000001650000022000000275000003300000038500000

Abudancia

Compuestos

Evaluación de diferentes recubrimientos poliméricos dn bio-oil a

60 °C por HS-SPME-GC/MS

CAR/PDMS

PA

DVB/PDMS

(C)

Los compuestos del bio-oil que presentan una mayor sorción en los recubrimientos poliméricos,

corresponden a compuestos fenólicos y sus derivados, junto con compuestos aromáticos en general.

Considerando que las fibras de SPME que combinan más de un recubrimiento son las más

adecuadas para la determinación de una amplia gama de compuestos, el recubrimiento PDMS/DVB

no tan sólo puede extraer compuestos por medio de la absorción (recubrimiento PDMS), sino que

también por adsorción, debido a la porosidad del DVB. Estas características en conjunto con un

aumento de la temperatura favorecen la extracción de gran parte de los compuestos del bio-oil, en

especial considerando que a la muestra de bio-oil no se le realiza un tratamiento previo.

De la Figura 7.11, se puede observar que el recubrimiento que presenta mayor sorción de los

compuestos del bio-oil, corresponde al CAR/PDMS, y en menor grado la fibra PDMS/DVB. Si bien

ambas fibras presentan características de polaridad media, la CAR/PDMS presenta mayor afinidad

con compuestos apolares. En el caso del recubrimiento con PA, a medida que aumenta la

Capítulo 7


temperatura es posible la sorción de compuestos con mayor polaridad como los fenoles y derivados

fenólicos.

Considerando este análisis, el recubrimiento PDMS/DVB es el que presenta una menor sorción de

los compuestos del bio-oil que pueden afectar en la etapa de derivatización/extracción de las oximas

formadas.

De esta forma, fue posible determinar que el recubrimiento polimérico de DVB/PDMS, cumplió

satisfactoriamente tanto como el mejor recubrimiento en la etapa de sorción de reactivo

derivatizante (PFBHA) y en la menor sorción de compuestos volátiles del bio-oil, los que pueden

causar una disminución de la eficiencia del método propuesto.

Implementación de una secuencia automática para la determinación de aldehídos por OFD-HS-

SPME-GC/MS

La principal limitante de esta metodología es que se realiza en dos etapas, usando diferentes

recipientes. En una primera fase del trabajo, esta metodología se realizó en modo manual,

empleando una placa calefactora con control de temperatura, para lo cual se colocó el vial que

contenía el PFBHA. Posteriormente se introdujo la fibra en el espacio de cabeza. Una vez

transcurrido el tiempo de extracción se retiró la fibra y rápidamente se cambió el vial por el que

contenía la muestra de bio-oil, colocando la fibra modificada en el espacio de cabeza de la muestra.

Después de la derivatización/extracción se procedió a la desorción de la fibra en el sistema

cromatográfico. De esta forma no fue posible mantener un control exacto de los tiempos de cada

etapa, además de ser poco factible la implementación de esta metodología como un análisis de

rutina. Considerando este aspecto se optó por desarrollar este procedimiento en forma automatizada

en el sistema de inyección automático del GC/MS. Sin embargo, este aparato no posee la opción de

realizar dos extracciones con SPME con una sola desorción en el sistema cromatográfico. Para ello

fue necesario implementar un sistema de desorción virtual con el software Cycle Composer. Para

ello se indicó mediante las coordenadas X, Y, Z que posterior a la modificación de la fibra, ésta no

realice desorción en el inyector cromatográfico, si no que ésta sea en un sistema virtual, en el vial

de la muestra (momento en que se produce la derivatización/extracción) y posterior a ello la

inyección en el GC-MS. Para esto fue necesario el desarrollo de 2 métodos. En la Tabla 7.2 se

exponen los parámetros del sistema de inyección automático para el método A (etapa 1) y el método

B correspondiente a la etapa 2.

Capítulo 7


Tabla 7.2 Métodos propuestos para la realización de forma automática del método OFD-HS-

SPME-GC/MS.

Método A Método B

Pre incubation time (m:ss) 3:30 0:30

Incubation temperature (°C) 40 40

Agitator speed (rpm) 250 250

Agitator on time (m:ss) 0:05 0:05

Agitator off time (m:ss) 0:02 0:02

Vial penetration (mm) 31 31

Extraction time (m:ss) 10:00 30:00

Desorb to GC-Iny 2 (virtual

injector)

GC-Iny 1(real

injector)

Injection penetration (mm) 44 54

Desorption time (m:ss) 0:05 11:00

Como se mencionó con anterioridad, el software no presenta la opción de “no desorb” la fibra en el

inyector e ir a la búsqueda de otro vial. No obstante la creación de un sistema virtual indicado como

GC-Iny 2 (método A), permite indicar la desorción en un vial.

La principal ventaja que presenta realizar esta metodología en forma automática, es que el tiempo

de espera de la fibra para ser expuesta en un segundo vial para la derivatización, disminuye en gran

medida los problemas de reproducibilidad presentados en forma manual, además de lograr realizar

una secuencia de muestras sin la intervención del analista y permitir la implementación de este

método como análisis de rutina.

Con este proceso automatizado es posible realizar un diseño experimental uniendo ambas etapas del

proceso en una etapa global.

Optimización mediante diseño experimental del método OFD-HS-SPME-GC/MS

Para la optimización de esta metodología también se empleó un diseño central, centrado en las caras

con puntos estrellas y además 4 puntos centrales, con un total de 30 experimentos.

Para la optimización de estas etapas se tuvo en cuenta los parámetros que tienen directa relación con

los procesos físico-químicos involucrados. La extracción por HS-SPME nos obliga a considerar un

sistema trifásico (fase acuosa, gaseosa o HS y la fase polimérica, ver Figura 7.10). De esta manera

la primera etapa de modificación química consta de las siguientes variables:

a) Tiempo de extracción: La cantidad de analito (PFBHA) extraído por la fibra depende de las

constantes de distribución en cada una de las fases. En literatura, el tiempo de extracción

del PFBHA es entre 5 y 10 minutos. En el presente trabajo el tiempo se evaluó entre 5 y 30

minutos.

Capítulo 7


b) Concentración del PFBHA: La finalidad de la primera etapa es la modificación del

polímero de la fibra con el derivatizante, el que debe quedar adsorbido o absorbido en

cantidad suficiente, de tal forma que no sea una limitante en la posterior reacción de

derivatización. En literatura se utiliza una alta concentración del reactivo (17.0 mg mL-1

),

concentración que eleva excesivamente el costo de análisis. Por ello, en base a este dato se

evaluó diferentes niveles de concentración de este reactivo, entre 0.5 y 17.0 mg mL-1

. En

concentraciones de 0.5 mg mL-1

, se observó la disminución de la abundancia de los

aldehídos derivatizados, de tal forma que se optó por el rango entre 1.0 y 10 mg mL-1

.

c) Temperatura de extracción: Esta variable, posee una gran importancia en la extracción,

principalmente por favorecer la evaporación del PFBHA desde la fase acuosa a la fase

gaseosa. Sin embargo, un aumento puede significar la desorción de las moléculas ya

adsorbidas en el recubrimiento polimérico. En literatura se propone desde temperatura

ambiente hasta los 50 °C. En el presente trabajo se evaluó el rango entre 27 y 50 °C.

La segunda etapa correspondiente a la derivatización on-fiber. Se utilizaron los mismos conceptos

físico-químicos considerados en la primera etapa. En la Tabla 7.3 se muestra un resumen de las

variables involucradas en ambas etapas.

a) Temperatura de derivatización: En literatura se proponen temperaturas alrededor de 40 °C,

en este diseño el rango propuesto fue entre 35 y 60 °C.

b) Tiempo de derivatización: El tiempo en este caso es mayor que el implicado en la etapa 1.

El rango evaluado fue entre 5 y 60 minutos.

La agitación al igual que en el caso de HS, cumple un papel fundamental en la distribución de los

compuestos entre las diferentes fases, en esta metodología la agitación no puede superar los 250

rpm, por la posibilidad de una rompimiento de la fibra polimérica. Por lo tanto, este parámetro se

mantiene constante en ambas etapas.

Tabla 7.3 Variables empleadas en el diseño experimental para la optimización de la metodología

OFD-HS-SPME-GC/MS.

Variables experimentales Identificación -1 +1

PFBHA mg mL-1

X1 1.0 10.0

Temperatura de sorción PFBHA en la fibra (°C) X2 27.0 50.0

Tiempo de sorción del PFBHA en la fibra (min) X3 5.0 30.0

Tiempo de derivatización (min) X4 5.0 60.0

Temperatura de derivatización (°C) X5 35.0 60.0

Capítulo 7


En este método fue posible la evaluación de los tres compuestos estudiados. Las Figuras 7.12, 7.13

y 7.14 muestran los gráficos de los coeficientes del modelo que describe la respuesta con su

respectivo error estándar.

Los tres modelos obtenidos fueron validados por el test ANOVA al 95 % de confianza (Valor-p <

0.05).

Figura 7.12 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la respuesta para la determinación de

formaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.

X1

-500

0

500

Abundancia

X3X2

X4 X5

X4 *X4

X1* X4

X1 *X5

X2 *X3

X4 *X5

Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción para el formaldehído

y = 970.5 (± 59.5) – 295.1 X1 (± 44.3) - 4.4 X2 (± 44.3) + 87.8 X3 (± 44.3) – 429.5 X4 (± 44.3) –

425.2 X5 (± 44.3) + 410.1 X42 (± 74.2) + 332.7 X1* X4 (± 47.0) + 188.1 X1* X5 (± 47.0) – 350.5 X2*

X3 (± 47.0) + 434.3 X4* X5 (± 47.0).

En una reacción de derivatización, el reactivo derivatizante debe encontrarse en exceso. Aunque los

rangos de concentración evaluados en este diseño presentan un exceso de reactivo con respecto a

los aldehídos, el efecto de este parámetro es negativa (Figura 7.12), aunque cabría de esperar lo

contrario. Una posible explicación este fenómeno podría ser la sobresaturación de la fibra con

reactivo desfavoreciendo la derivatización/extracción de los aldehídos. En el caso del formaldehído,

por sus características físico-químicas, se derivatiza rápidamente, por lo cual la etapa de la sorción

del reactivo derivatizante no presenta una mayor significancia, en conjunto con la etapa de

derivatización, lo cual tanto el tiempo y la temperatura, pueden provocar una desorción de los

compuestos derivatizados o del mismo derivatizante, disminuyendo el rendimiento de la

derivatización/extracción.

Capítulo 7



acetaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.

-600

0

600Abundancia

X3

X1

X2

X4 X5

X4 *X4

X1* X4

X1 *X5

X2 *X3

X4 *X5

Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción del acetaldehído

y = 936.2 (± 110.6) – 366.8 X1 (± 82.4) + 179.1 X2 (± 82.4) + 34.8 X3 (± 82.4) – 532.6 X4 (± 82.4)

– 508.8 X5 (± 82.4) + 596.5 X42 (± 137.9) + 437.3 X1* X4 (± 87.4) + 297.3 X1* X5 (± 87.4) – 338.7

X2* X3 (± 87.4) + 666.6 X4* X5 (± 87.4)

Para el acetaldehído, al igual que el formaldehído es posible apreciar que la concentración del

PFBHA presenta una efecto negativo en el rendimiento de la derivatización/extracción, por lo tanto

se postula que la sobresaturación del recubrimiento de la fibra puede afectar la determinación de los

compuestos en general. Sin embargo, en este modelo se aprecia que la temperatura de sorción del

PFBHA tiene un efecto significativo, lo que se puede atribuir en mayor grado a la propia

variabilidad del método.

Considerando que los analitos estudiados presentan una alta volatilidad, es posible postular que

tanto la temperatura como el tiempo de derivatización presenten una significancia negativa, ya que

ambos pueden favorecer la desorción de los compuestos ya derivatizados en la fibra. No obstante,

ambos parámetros en conjunto influyen positivamente el mayor rendimiento por esta metodología.

Capítulo 7



propionaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.

-500

0

500

Abundancia

X3

X1

X2

X4 X5

X4 *X4

X1* X4

X1 *X5

X2 *X3

X4 *X5

Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción del propionaldehído

y = 678.5 (± 79.8) – 335.9 X1 (± 59.5) + 152.7 X2 (± 59.5) + 66.1 X3 (± 59.5) – 442.5 X4 (± 59.5) –

478.9 X5 (± 59.5) + 445.9 X42 (± 99.5) + 321.4 X1* X4 (± 63.1) + 182.8 X1* X5 (± 63.1) – 222.1 X2*

X3 (± 63.1) + 385.6 X4* X5 (± 63.1)

Los tres analitos estudiados, mantienen un compartimiento similar, lo cual fue esperable al tratarse

de compuestos de características físico-químicas similares.

El formaldehído presenta valores óptimos de temperaturas en la etapa de reacción inferiores a los

del acetaldehído y propionaldehído. Además de un menor tiempo de reacción. Además, este

aldehído presenta la mayor volatilidad, logrando su derivatización a temperatura ambiente y un

tiempo de 15 minutos. Temperaturas altas y tiempo excesivos favorecerán la desorción de la oxima

formaldehído-PFBHA en la etapa 2. Por ello fue necesario llegar a un compromiso, en que

temperatura y tiempo de reacción fueran lo suficientemente altos para determinar acetaldehído y

propionaldehído, sin presentar o afectar demasiado la determinación del formaldehído. En la Tabla

7.4 se resumen los parámetros operativos óptimos de la metodología.

Tabla 7.4 Parámetros operativos óptimos para la determinación de aldehídos por OFD-HS-SPME-

GC/MS.

Variables experimentales Valores óptimos

PFBHA (mg mL-1

) 1

Temperatura de sorción PFBHA en la fibra (°C) 40

Tiempo de sorción del PFBHA en la fibra (min) 10

Tiempo de derivatización (min) 30

Temperatura de derivatización (°C) 40

Capítulo 7


Como medidas de índole técnicas, es necesario que las temperaturas involucradas sean iguales,

debido a que el horno no presenta un sistema de enfriamiento, lo que significaría esperar un mayor

tiempo entre la etapa 1 y 2, siendo posible la desorción del PFBHA en el recubrimiento de la fibra.

Además, es necesario que el material empleado para la disolución de la muestra de bio-oil, presente

un mayor volumen, ya que en la agitación con la fibra en el interior del vial, puede contaminar

irreversiblemente la fibra con bio-oil. Para prevenirlo, los recipientes de vidrio empleado son de 20

mL.

En la Figura 7.15 se muestra un cromatograma típico de una muestra de bio-oil, realizado en

modalidad SCAN bajo las condiciones optimizadas, tanto en el recubrimiento de la fibra, la

automatización de las etapas involucradas en el análisis y la optimización de éstas.

Figura 7.15 Cromatograma de aldehídos de bajo peso molecular por OFD-HS-SPME-GC/MS.

Señal: 1 = oxima formaldehído-PFBHA; 2 = oxima acetaldehído-PFBHA; 3 = oxima

propionaldehído-PFBHA y 4 = oxima valeraldehído-PFBHA (estándar interno).

Al igual que en el análisis de bio-oil por D-HS-GC/MS, todas las señales cromatográficas presentan

una alta resolución con un valor superior a 2.5. Además las señales cromatográficas fueron

comparadas con los espectros de masas de los estándares de aldehídos utilizados, logrando una

determinación con un alto grado de selectividad. Para efectos de cálculos de los parámetros

analíticos y la posterior cuantificación de los aldehídos presentes en la matriz de bio-oil, se optó por

considerar el área de ambas señales de cada aldehído. Con ambas metodologías optimizadas, se

determinaron los parámetros analíticos, que se resumen en la Tabla 7.5.

Capítulo 7


7.4.2.3 Determinación de parámetros analíticos y cuantificación de muestras de bio-oil por D-

HS- GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS.

Los principales parámetros analíticos evaluados para ambas metodologías se presentan en la Tabla

7.5, La evaluación de la recuperación se realizó adicionando una mezcla de aldehídos a una bio-oil,

en dos niveles de concentración 50 y 100 µg L-1

. La reproducibilidad intermedia fue determinada

utilizando tres diferentes bio-oil, analizados por triplicado (n=9).

Tabla 7.5 Principales parámetros analíticos obtenidos en ambas metodologías.

OFD-HS-SPME-GC/MS D-HS-GC/MS

Formaldehído Acetaldehído Propionaldehído Formaldehído Acetaldehído Propionaldehído

Ecuación de la

recta

y=0.0107x +

0.1982

y=0.0162x +

0.0093

y=0.0182x +

0.2143

y = 0.0305x

- 0.0303

y = 0.0213x –

0.4547

y = 0.0331x -

0.8298

R 0.9970 0.9831 0.9871 0.9989 0.9835 0.9769

LD (µg L-1) 0.2 4.4 6.4 1.2 7.1 15.2

Linealidad LCa-200 LC-200 LC-200 LC-350 LC-350 LC-350

Recuperación

en bio-oil (%) 89.9 84.7 81.8 89.5 73.5 66.1

Precisión

intermedia

(RSD)

8.1 6.8 11.5 8.4 5.2 23.3

aLC: Límite de cuantificación.

Ambas metodologías presentan aceptables parámetros analíticos considerando que son

metodologías en que el resultado depende de la optimización de los procesos físicos-químicos

involucrados. Los limites de detección para los tres aldehídos determinados, fueron menores en la

metodología que emplea SPME, pero a su vez el rango de trabajo es menor empleando esta técnica.

Sin embargo tanto el rango lineal como el límite de detección permiten la cuantificación de

propionaldehído, especie que no fue posible cuantificar en ciertos bio-oil por encontrarse en niveles

no detectables. Las recuperaciones obtenidas por el método OFD-HS-SPME-GC/MS, presentan un

mejor porcentaje que las obtenidas por D-HS-GC/MS, esto puede corresponder a que las

condiciones de la derivatización/extracción por el sistema HS no fueron las óptimas, en especial

para el propionaldehído el cuál presenta el valor más bajo de recuperación.

La precisión intermedia se mantuvo similar para formaldehído y acetaldehído por ambas

metodologías, por lo tanto la posible desventaja que se postuló al principio de este capítulo sobre la

reproducibilidad del método OFD-HS-SPME-GC/MS puede ser descartada, considerando que los

valores determinados son satisfactorios.

Considerando las diferencias de las metodologías desarrolladas. Se analizaron 8 muestras de bio-oil

por ambas metodologías. Los resultados obtenidos de la cuantificación de las muestras de bio-oil, se

muestran en la Tabla 7.6.

Capítulo 7


Tabla 7.6 Comparación del análisis de muestras de bio-oil crudo por ambas metodologías. Los

aldehídos no detectados se abreviaron como ND.

Bio-oil Formaldehído (% wt) Acetaldehído (% wt) Propionaldehído (% wt)

D-HS OFD-HS-SPME D-HS OFD-HS-SPME D-HS OFD-HS-SPME

1 1.6 ± 0.3 1.9 ± 0.2 0.08 ± 0.03 0.03 ± 0.01 0.03 ± 0.02 0.012 ± 0.007

2 0.8 ± 0.2 1.3 ± 0.3 0.03 ± 0.01 0.01 ± 0.01 ND LD > LC

3 1.8 ± 0.3 2.2 ± 0.2 ND

0.03 ± 0.01 ND LD > LC

4 0.9 ± 0.1 1.7 ± 0.2 0.09 ± 0.04 0.12 ± 0.07 ND 0.04 ± 0.01

5 1.1 ± 0.3 1.7 ± 0.2 0.07 ± 0.01 0.04 ± 0.01 ND 0.010 ± 0.005

6 3.2 ± 0.5 3.6 ± 0.4 ND 0.05 ± 0.01 ND 0.023 ± 0.007

7 2.1 ± 0.4 2.4 ± 0.3 0.06 ± 0.01 0.02 ± 0.01 ND 0.014 ± 0.003

8 2.3 ± 0.4 2.0 ± 0.2 0.11 ± 0.04 0.03 ± 0.01 ND 0.010 ± 0.003

Los valores (±) corresponden a la desviación estándar de cada determinación. La abreviación ND corresponde a compuestos con niveles bajo el límite de detección. LD >LC corresponde a concentraciones en

niveles trazas, que se encuentran entre el límite de detección y el de cuantificación.

El propionaldehído no es posible cuantificar en estas muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS, por

encontrarse en bajos niveles de concentración en estas muestras. Además cabe mencionar que por la

alta sensibilidad de estas técnicas el bio-oil debe ser diluido por lo menos 200 veces, si se utiliza

una dilución menor de la muestra para cuantificar el propionaldehído, la cuantificación del

formaldehído no sería posible, ya que se encontraría fuera de la linealidad del método.

Con la metodología OFD-HS-SPME-GC/MS es posible cuantificar los tres aldehídos, debido a la

mayor sensibilidad que presenta. Sin embargo, la principal desventaja que presenta esta técnica es la

vida útil de la fibra, esto debido a que el bio-oil al contener varios compuestos orgánicos volátiles

necesita un proceso de limpieza de la fibra después de cada inyección. Además, fue posible detectar

un efecto memoria entre los análisis. Considerando estos efectos, fue necesario implementar un

proceso de limpieza más prolongado. Sin embargo, la exposición de la fibra a altas temperaturas por

tiempos prolongados reduce la vida útil de esta, se registraron alrededor de un máximo de 20

muestras de bio-oil por fibra, sin que ésta presente señales de deterioro.

7.5 Conclusiones

Aunque se reporta en bibliografía la determinación de aldehídos por HPLC-UV previa

derivatización con 2,4-DNPH, no es la mejor opción para la determinación de aldehídos en

muestras de bio-oil debido a las interferencias que la afectan. En bibliografía no se detallaban las

condiciones de reacción y separación empleadas. Sin embargo, en el presente trabajo se comprobó

que dicho método no es lo suficientemente selectivo. Además, las condiciones de reacción (pH

ácido) pueden causar sucesivas reacciones indeseadas en la matriz de bio-oil, impidiendo la

adecuada derivatización de estas especies. Aún bajo las condiciones más favorables el método

presentaba un bajo rango lineal para el formaldehído y no era lineal para el hidroxiacetaldehído.

Como alternativa, se desarrolló una metodología más selectiva, con tratamientos de muestras que no

implican la adición de catalizadores a pH extremos, empleando la SPME como técnica de

derivatización y extracción, comunmente llamada derivatización “on-fiber” con el reactivo PFBHA.

Capítulo 7


La implementación de una metodología basada en la microextracción en fase sólida y el uso del

sistema HS mostraron un potencial analítico adecuado para el análisis de muestras de bio-oil. La

aplicación de un diseño experimental facilitó la optimización de los factores que influyen en las

etapas involucradas, junto con la automatización de la técnica. Así fue posible obtener una buena

reproducibilidad del método Además, se desarrolló una metodología en la cual la derivatización se

realiza en la solución de la muestra y la extracción de las oximas formadas es por sistema HS.

Ambas metodologías cumplen satisfactoriamente con la selectividad requerida. Sin embargo, el

método OFD-HS-SPME-GC/MS, presenta una mayor sensibilidad, y mejores porcentajes de

recuperación, siendo posible determinar selectivamente aldehídos de bajo peso molecular. Debido a

la complejidad de las muestras de bio-oil, la vida útil de las fibras utilizadas no supera las 20

inyecciones.

En el caso de la determinación de otros aldehídos de mayor peso molecular, es posible emplear este

método con la condición de re-evaluar los tiempos y temperaturas de reacción, ya que estos

parámetros son óptimos sólo para aldehídos de bajo peso molecular. No obstante uno de los

aldehídos de interés en bio-oil, el hidroxiacetaldehído, no fue posible de determinarlo por esta

metodología, por las diferentes estructuras que presenta en solución acuosa, los cuales dificultan su

derivatización, por lo que este aldehído debe ser cuantificado por el método de inyección directa por

GC/MS.

Capítulo 7


7.6 Bibliografía

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Conclusión General

CONCLUSIÓN GENERAL

Las metodologías analíticas desarrolladas en el marco de esta tesis representan un avance para el

estudio del bio-oil. Siendo el principal objetivo de este trabajo incrementar la selectividad analítica,

debido a la alta complejidad de la matriz, fue posible también desarrollar metodologías con

adecuada sensibilidad, logrando límites de detección que permiten cuantificar los analitos de interés

en muestras que presentan una alta dilución.

La determinación de compuestos en el bio-oil por inyección directa en GC/MS/FID es una buena

opción en la caracterización general del bio-oil, por lo cual será siempre una herramienta muy útil

en ese sentido. Sin embargo, algunos analitos de interés no pueden ser determinados por esta

metodología, por presentar propiedades físico-químicas que los hacen incompatibles con la

inyección directa. Cabe destacar que ésta permite cuantificar hidroxiacetaldehído, cuya

determinación por otras metodologías alternativas se ve dificultada por presentarse en diferentes

formas químicas en solución.

Por otro parte, debido a la presencia de interferentes en el bio-oil, es necesario implementar

métodos de pre-tratamiento de la muestra, que permitan una resolución de las posibles

interferencias y el análisis de diferentes grupos de compuestos por separado.

Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con

exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección

directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por

destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no

es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene.

La determinación de los principales azúcares por HPTLC, muestra una metodología sencilla, en la

cual no se necesita un tratamiento de la muestra de bio-oil y además puede ser utilizada en las

diferentes fracciones obtenidas a partir de bio-oil crudo, incluyendo la lignina pirolítica. No

obstante, es necesario emplear un método de screening para la determinación de la presencia de

glucosa, ya que ésta, de estar presente a concentraciones mayores en bio-oil, pueden interferir en la

determinación del celobiosano.

La cromatografía gaseosa permite la determinación del mayor número de compuestos volátiles en

bio-oil. Sin embargo, algunos analitos de interés presentan incompatibilidad con el sistema

cromatográfico. Ello se supera en la mayoría de los casos mediante su derivatización. La

determinación de aldehídos empleando el sistema OFD-HS-SPME-GC/MS permite mejorar la

selectividad y sensibilidad de dos pasos críticos, la extracción de los compuestos más volátiles y la

derivatización de los aldehídos de bajo peso molecular. Con este método es posible la

determinación de formaldehído en bio-oil, cuya determinación es especialmente relevante desde el

punto de vista toxicológico.

Los ácidos orgánicos y azúcares se pueden determinar de forma simultánea por GC-MS mediante la

derivatización con BSTFA, logrando la cuantificación de ácidos orgánicos (fórmico, propiónico,

Conclusión General


acético, láctico entre otros) y azúcares (levoglucosano y celobiosano, entre otros). Tanto la OFD-

HS-SPME-GC/MS como la GC-MS previa derivatización con BSTFA permiten incrementar el

número de analitos a determinar. En el caso de los aldehídos alifáticos, es posible incluir

compuestos con mayor número de carbonos. En la derivatización con BSTFA se puede determinar

un mayor número de azúcares y ácidos de interés, junto con otros compuestos que puedan ser

derivatizados.

Dependiendo del objetivo del análisis del bio-oil, las metodologías propuestas pueden ser

empleadas de forma individual o en forma combinada con la caracterización general del bio-oil por

inyección directa en GC/MS. De esta forma es posible la cuantificación de los compuestos en el

bio-oil que presentan un alto interés a nivel industrial.

programa de doctorado en ciencias y tecnologÍa …

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