PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

Introducción al microscopio

El microscopio óptico: fundamentos y tipos

• Del griego mikrós (pequeño) y skopéin (observar).• Permite ver objetos por debajo del límite de resolución del ojo

humano (alrededor de 100 a 200 μm (0,1 a 0,2 mm).• En la mayoría de los casos la observación microscópica se realiza

sobre células muertas procesadas para eliminar el agua, preservar lo mejor posible su estructura, dar contraste a sus distintos componentes y obtener una sección lo suficientemente delgada para que la luz o los electrones la atraviesen. En determinadas circunstancias, sin embargo, también pueden observarse células vivas.

• Las células eucariotas tienen un tamaño que oscila entre 10 y 30 μm de diámetro, mientras que las procariotas y los componentes celulares son aún menores.

• Su visualización sólo es posible utilizando diferentes tipos de microscopios que, por efecto de sus lentes combinadas, poseen mayor límite de resolución (hasta 0,2 μm en el MO o unos pocos nm en el caso del MET – microscopio electrónico de transmisión -).

Microscopio simple (lupa o microscopio estereoscópico)

• Consta de una sola lente o sistema de lentes convergentes biconvenxas (parte óptica) sostenidas por un soporte con tornillos de enfoque (parte mecánica).

• La distancia focal varía entre 5 y 10 cm.• Proporciona una imagen virtual, derecha,

aumentada entre 2 y 20-30 veces.• Los estereomicroscopios modernos

cuentan con mayor distancia útil de trabajo, tienen sistemas de iluminación direccionable, de luz polarizada, de campo oscuro y es posible adaptar cámara fotográfica y vídeo.

• Las lupas se utilizan como auxiliares en la observación o disección de piezas anatómicas pequeñas.

Microscopio óptico compuesto (convencional)

• También llamado microscopio de campo claro o fotónico, ya que se utiliza un haz de luz común (luz blanca) que atraviesa la muestra e ilumina el campo de observación.

• La muestra debe ser lo suficientemente fina como para que la luz pueda atravesarla.

• Los detalles se visualizan debido a las diferencias de absorción de la luz en las distintas partes del material biológico.

• Este microscopio se suele utilizar para observar preparaciones histológicas coloreadas.

• Se obtiene una imagen fina, virtual, invertida y aumentada de los objetos observados.

• El MO cuenta con tres sistemas de lentes:– El condensador, que enfoca los rayos de luz sobre la muestra;– Los objetivos, que magnifican la imagen;– Y los oculares, que agregan una mayor magnificación y permiten la

visualización directa del preparado.

MO. Parte mecánica• Pie. Debe ser sólido y amplio.• Columna. Sostiene el tubo y la platina.• Tubo. Lleva los oculares y objetivos.

Puede ser monocular, binocular o trinocular. Los objetivos están enroscados en un sistema de revólver que permite colocar uno u otro en el eje óptico.

• Platina. Superficie horizontal donde se coloca el preparado sujeto con pinzas. Generalmente permite el desplazamiento del preparado a derecha e izquierda o de atrás a delante. Un orificio en la parte central de la platina permite el paso de la luz que atraviesa la muestra.

• Los tornillos de enfoque. Permiten regular la distancia entre el preparado y los objetivos con el fin de obtener una imagen nítida de la muestra. Generalmente hay un tornillo macrométrico y uno micrométrico.

• Debajo de la platina hay soportes para el condensador, el diafragma y los filtros.

MO. Parte óptica• Objetivos. En el revólver de un MO hay generalmente objetivos de

diferentes aumentos: uno llamado lupa, o de campo (3,5x, 4x ó 5x); otro de 10x y/o de 25x, uno de 40 ó 45x; y, con frecuencia, uno de inmersión de 100x. El objetivo de inmersión se utiliza frecuentemente para exámenes citológicos.

• Oculares. Son las lentes que recogen la imagen dada por el objetivo. Tienen grabado el aumento que proporcionan. El aumento final se calcula multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular.

• Condensador. Concentra los rayos luminosos y los proyecta sobre el preparado a través del orificio de la platina. Para observaciones con objetivos de gran aumento se requiere que el condensador esté cerca de la platina; por el contrario, para trabajar con bajo aumento conviene bajar el condensador para obtener una iluminación más pareja en todo el campo observado.

• Diafragma del condensador. Gradúa la cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto. Para preparaciones sin teñir o con poco contraste es conveniente cerrar el paso de la luz un poco más de lo habitual para aumentar el contraste.

• Sistema de iluminación. Consta de luz, espejo, filtros y diafragma.• Filtros. Se colocan en aros portafiltros situados debajo del condensador.

Microscopios especiales• Microscopio de campo oscuro. Generalmente utilizado para observación de células vivas

y móviles, como bacterias y espermatozoides.• Microscopio de contraste de fases. Permite observar células y tejidos sin colorear y es

especialmente útil para la observación de células vivas.• Microscopio de interferencia. Es una modificación del anterior y es muy utilizado en

cultivos celulares.• Microscopio de polarización. Usa luz polarizada (luz que vibra en un solo plano). Permite

estudiar tejidos duros (hueso, diente), estructuras que tengan simetría lineal (tejido muscular), y la presencia o deposición de colágeno.

• Microscopio invertido. Tiene el revólver portaobjetivos situado debajo de la platina y el sistema de iluminación por encima de la misma. Esto permite contar con una mayor distancia de trabajo y poder observar células creciendo en medios de cultivo de varios mm de espesor.

• Microscopio de fluorescencia. Permite detectar moléculas que fluorescen, que absorben determinada longitud de onda y reemiten luz de una longitud de onda mayor. Las estructuras fluorescentes aparecen luminosas y brillantes, resaltando sobre fondo oscuro.

• Microscopio de luz ultravioleta. Usa exclusivamente esta luz para atravesar la muestra. Es particularmente útil para detectar la presencia de distintos tipos de moléculas (ácidos nucleicos) en las células. La visualización sólo puede realizarse con fotografías.

• Microscopio láser confocal. Permite obtener imágenes de excelente definición y de una resolución un 30% superior a la de un MO común. Combina partes de un MO al que se adapta un equipo fluorescente, con un sistema de barrido en el que se emplea un rayo láser. Pueden lograrse imágenes de la muestra a diferentes profundidades, como si se observara capa por capa, pudiendo reconstruir una imagen tridimensional completa de la célula estudiada.

Campo oscuro Contraste de fases

Polarización

Polarización

Láser confocal

El microscopio electrónico:fundamentos y tipos

• Utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones "visibles".

• Existen dos tipos principales: el de transmisión o TEM (Transmission electron microscope), desarrollado en primer lugar, y el de barrido o SEM (Scanning electron microscope).

TEM• El microscopio electrónico

de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, generalmente no mayores de unos 5000 Å (10 ángstrom= 1nm), o sea, 0,5 μm. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.

SEM• En el microscopio electrónico de barrido la

muestra es recubierta con una capa de metal delgado, generalmente oro depositado mediante la técnica del sombreado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. El haz de electrones no está fijo, sino que se mueve y rastrea continuamente la superficie de la muestra. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

• Se suele emplear para la observación tridimensional de estructuras completas, pequeños organismos o partes de órganos (cristalino), pequeñas estructuras (esporas, polen), células completas (eritrocitos), así como orgánulos en células fraccionadas.

Comparación de la formación de la imagen en un microscopio de transmisión óptica, un microscopio electrónico de transmisión (TEM), un microscopio

electrónico de barrido (SEM) y un tubo de rayos catódicos (CRT) de pantalla de TV