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PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de Detección Bax® Método Automatizado

Ensayo de PCR 24LEB Para Detectar Listeria monocytogenes

CODIGO: P-SA-67 FECHA DE EMISION: 27/10/2015

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PAGINA: Página 1 de 15



AOAC Método Oficial Internacional 2003.12

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN




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1. OBJETIVO Establecer el Procedimiento para la Determinar la presencia de Listeria monocytogenes. por la Técnica Sistema de Detección Bax® Método Automatizado Ensayo de PCR 24E para detectar Listeria monocytogenes.

2. ALCANCE Esta técnica aplica para los siguientes productos: Salchichas, carne, espinacas, camarones, queso fresco.

3. DEFINICIONES

§ Listeria monocytogenes: Es un microorganismo ubicuo, se encuentra en la materia

vegetal en descomposición, en los suelos (principalmente de aquellos que presentan algún tipo de vegetación), en las heces de los animales y humanos en las aguas residuales, en el ensilado, fangos, forraje, abonos naturales, desagües de mataderos, plantas procesadoras de alimentos. Debido a su amplia distribución y a sus propiedades ecológicas, este microorganismo tiene oportunidad de contaminar alimentos en los distintos pasos de la producción alimentaria, siendo ésta la vía principal de infección tanto para humanos como para animales. La presencia de L. monocytognes en productos procesados térmicamente, indica tratamiento inadecuado o contaminación pos-proceso.

§ ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares.

4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico del Laboratorio de Salud Pública del Meta de aplicar este procedimiento en forma adecuada, sin hacer ningún cambio o variación que no esté debidamente documentado, autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras.

5. GENERALIDADES

El ensayo BAX® PCR System para 24E Listeria monocytognes ha sido certificado por el Instituto de Investigación de la AOAC como Performance Tested Método # 080901. Rendimiento Esta prueba kit's fue revisado por AOAC-RI y se encontró que realizar a las especificaciones del fabricante. Los estudios de validación en salchichas, espinacas, camarones cocidos, queso fresco y acero inoxidable demostraron sensibilidad Sistema BAX® y especificidad igual o mejor que los métodos oficiales basados en la cultura FDA-BAM o el USDA-FSIS.




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El ensayo de PCR System BAX® para Listeria monocytogenes 24E ha sido certificado (#QUA 18/05 - 07/08) de acuerdo con las reglas de validación AFNOR. Estudios Validaciones realizaron de acuerdo con las normas ISO16140 encontraron rendimiento esta prueba kit's para satisfacer las normas de certificación AFNOR para todos los productos de alimentación humana y del medio ambiente (método de referencia ISO 11290-1), salvo que el pescado ahumado y embutidos requieren la adición de la memoria intermedia 24 LEB Suplemento al (método de referencia ISO 11720-1) medios de enriquecimiento. Para obtener más información, consulte el certificado de validación AFNOR disponible en www.afnor-validation.com.

6. Referencias:

§ El Instituto de Investigación AOAC, ha validado el ensayo 24E del Systema BAX® para la

detección de Listeria monocytogenes en salchichas, espinacas, camarones, queso tipo queso fresco.

• La Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) a certificado el Systema BAX® en

concordancia a las reglas de validación de AFNOR para detectar Listeria monocytogenes en muestras medioambientales y todos los productos alimenticios para humanos.

§ Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA

7. DESARROLLO

7.1. FUNDAMENTO

§ Fundamento Técnica Sistema de Detección Bax® método automatizado Ensayo de PCR Estándar para detectar Salmonella spp: El Sistema Bax®, está enfocado en la estructura genética de las bacterias para detectar un único fragmento de ADN solamente encontrado en el microorganismo blanco (target). El Sistema Bax® usar la tecnología de la reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), el cual crea rápidamente millones de copias del fragmento de ADN buscado, solo sí está presente. Así, usted puede claramente detectar respuestas “si o no” (“yes or no”) pocas horas después de comenzar el ensayo, sin la necesidad de la interpretación de resultados por parte de expertos. Todos los reactivos necesarios (cebadores, enzima polimerasa, nucleótidos y control positivo) se encuentran combinados en una simple tableta, empacada de manera conveniente dentro de los tubos que usted recibe con cada kit de ensayo. Esto elimina la transferencia múltiple de líquidos usada en otros métodos y reduce efectivamente el potencial de error debido a la técnica del analista. Esta propiedad de las tabletas también permite el procesamiento eficiente de grandes números de muestras, 96 en una misma corrida.




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El sistema automatizado Bax® combina PCR con detección fluorescente, que reduce significativamente las horas de trabajo, minimiza el potencial de contaminación cruzada y provee resultados coherentes basados en algoritmos computarizados para análisis. Usted simplemente carga las muestras preparadas, corre el programa y lee los resultados en la pantalla.

§ Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): El PCR es una herramienta analítica para replicar rápidamente un fragmento blanco de ADN. En una aplicación típica, la muestra de ADN es combinada con ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores que son específicos para una secuencia de nucleótidos dada. Esta mezcla luego pasa una serie de ciclos de calentamiento y enfriamiento. El calentamiento denatura el ADN, separándolo en dos hebras simples, en los cambios de disminución de temperatura, el cebador reconoce y se une (alinea) a la secuencia de ADN blanco complementaria. La enzima Taq Polimerasa luego usa los nucleótidos para extender la secuencia a partir de los cebadores, creando dos copias del fragmento del ADN blanco (amplificación). La repetición del ciclo de denaturación, alineación y extensión produce un incremento exponencial en el número de fragmentos de ADN blanco, creando millones de copias en un corto tiempo. Si la secuencia blanco no está presente, no hay amplificación.

7.2. MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1. Equipos

• Incubadora a 37°C+/-2°C • Bloques de calentamiento y fíjelos a temperaturas de 37°C y 95°C • Bloques de enfriamiento (Refrigeración 2°C-8°C ) • Equipo Bax® System Q7 • Micropipeta (Para medir volúmenes: 40 ul, 150 ul) • Micropipeta (Para medir volúmenes: 5 ul, 10 ul) • Micropipeta Multicanal (Para medir volúmenes: 5 ul, 30 ul, 50 ul) • Micropipeta (Para medir volúmenes: 500 ul)

7.2.2. Reactivos

• Caldo LEB 24E • Kit para detección de L. monocytogenes 24E • Agar Oxford (Para confirmación) • Agar Palcam (Para confirmación) • Agar ATN(Para confirmación) • Pruebas rápidas – Kit para confirmación bioquímica de Listeria monocytogenes)




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7.2.3. Cepas de Referencias • Cepas Listeria monocytogenes ATCC 19115 • Cepas Staphylococcus aureus ATCC 25923 • Enterococcus faecalis ATCC 29212

7.3.1. Condiciones Ambientales Y Manejo De Equipos

• El acondicionamento y manejo de equipo se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los

mismos.

• El método no establece condiciones ambientales de temperatura y humedad específicas. • La muestra se debe analizar en cuarto de siembra y cabina de bioseguridad.

7.3.2. Condiciones Generales Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.3.2.1. Condiciones Previas

• Usar nueva punta cuando transfiera muestra o hidrate las tabletas. • Cambiar de guantes entre cada uno de los pasos. • Use pinzas cuando remueva los tubos y las tapas de la bolsa. Una vez la bolsa sea

abierta, almacene las tapas en un contenedor que se pueda cerrar. • Corte o separe los tubos en strip antes de ser usados para prevenir post- contaminación

entre las muestras durante la transferencia. • No reusar ninguna tapa o tubos de PCR. • Usar los termómetros para asegurar la temperatura de incubación correcta. • Nota: Los guantes NO deben tener polvo, deben ser de Nitrilo. 7.3.3. Descripción del método

La detección de Listeria spp incluye 5 etapas.

a. Enriquecimiento de la Muestra

Pesar en la bolsa para homogenización de muestras previamente tarada 25g ó ml representativos de la muestra total (tomando de la superficie como de su interior) la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.




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Adicionar en 225ml de caldo 24 LEB a temperatura ambiente (medio pre enriquecimiento no selectivo). Incubar a 37°C X 24 - 28 horas.

Nota: para ciertos comestibles es necesarios de otros procedimientos de pre enriquecimiento. “ver preparaciones específicas”.

Preparaciones específicas para ciertos alimentos:

b. Preparación del Equipo

• Encienda los bloques d calentamiento y fíjelos a temperaturas de 37°C, 55°C y 95°C.




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• Asegúrese que los bloques de enfriamiento están en el refrigerador a 2-8°C. Si

encuentra que estos no han sido refrigerados correctamente, llame para asistencia técnica. Una vez los bloques ha sido retirados del refrigerador, deben usarse en un tiempo no mayor a 30 minutos.

• Crear el Archivo (Favor ver creación de rack BAX® System Software detalles en la hoja de vida F-SA-18 del equipo en Manejo del: “Preparación del equipo”).

c. Etapa de Lisis

Primera Parte de la Lisis

o Añadir 1,8 ml de agua destilada estéril a la botella de totalmente descongelado

agente de lisis 1 y mezclar.

o Nota: 1 agente de lisis es sólido por debajo de la temperatura ambiente,

o Combinar agentes de lisis en proporción 4: 1 (40μl de diluido agente de lisis de 1 a 10μl agente de lisis de 2 por muestra) en tubos de lisis.

o Nota. Una vez el agente 1 es mezclado con el agente 2 debe ser usada en un tiempo

menor a cuatro (4) horas.

o En el tubo que contiene los 50µl de las lisis combinadas (1y2), adicionar 500 ul de muestra.

Ø Muestras Viscosas: Cuando transfiera estas muestras, inserte sola y únicamente la

punta den trapo limpio o tela la punta de la pipeta en la muestra; esto con el fin de evitar que se recubra toda la punta por la muestra. Limpie cualquier exceso de muestra realizando un raspado de la punta sobre el borde.

Ø Muestras con partículas: Cuando se observan partículas en el caldo de enriquecimiento, pipetear desde la superficie del líquido y no desde el fondo.

Ø Muestras con capas de grasa o aceite: Pipetear solo la fase acuosa que se encuentra por debajo de la capa de grasa/aceite y limpie cualquier exceso de muestra realizando un raspado de la punta sobre el borde.

a. Los tubos que contienen los agentes combinados (1 y 2) con la muestra, colocar en bloque de calentamiento a 37 ° C durante 30 minutos. Nota: Marcar cada tubo de lisis con el número de la muestra

Segunda Parte de la Lisis

b. Mezclar 150μl de la proteasa con 12 ml de buffer de lisis.




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c. Transferir de 200μl de la mezcla de la proteasa a los tubos de lisis (Esta mezcla

tapada tiene una estabilidad de hasta 15 días en refrigeración de 2 a 8 °C) d. Una vez finalizado los 30 minutos de incubación a 37°C (punto d).

Nota la plancha de calentamiento que está a 37°C pasarla a 55°C. e. De la mezcla precalentada a 37°C, transferir 5 ul a los tubos de buffer de lisis y

tapar.

Nota: Marcar cada tubo de lisis con el número de la muestra

Calentar el grupo de tubos

f. Cliente el grupo de tubos a 55°C por 30 minutos. g. Luego los tubos se transfieren al bloque de calentamiento 95°C durante 10

minutos. h. Y finalmente los tubos de trasladan los bloque de enfriamiento (2 - 8 °C) enfriar

durante 5 minutos.

d. Hidratación de la tableta de PCR con el lisado

o Ponga el rack de PCR en el bloque.

o Ponga los tubos en el soporte. Marque la parte superior de la tirilla para mantener la orientación cuando se pongan las tirillas en el instrumento.

§ Una vez hidratadas las tabletas colocar en el equipo antes que pasen 10

minutos.

o Verificar que el equipo ha alcanzado la temperatura para continuar, después remueva las tapas de los tubos con la herramienta y transfiera 30μL del lisado a los tubos de PCR.

o Ponga las tapas ópticas en la tirilla y asegúrelas.

o Repita el mismo procedimiento desde el punto 4, hasta que todos los tubos se hallan

tapado nuevamente.

o Tome el rack de los tubos que se encuentran en el bloque de enfriamiento al Equipo BAX® System. Cargue las muestras como se describe en la hoja de vida del equipo F-SA-18 en Manejo del equipo: “Amplificar y detectar”.

Nota: Las muestras deben permanecer refrigeradas de 2-8°C hasta que se llevan al equipo.

Desinfecte el bloque de enfriamiento y la gradilla con hipoclorito de sodio al 10% y enjuagar con agua desionizada.




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7.4. CÁLCULOS Y/O VALORES DE REFERENCIA El método no requiriere cálculos para la expresión de resultado y el valor de referencia para los alimentos debe ser NEGATIVO.

7.4.1. Obtención de resultados

Cuando se complete el proceso (aproximadamente 3,5 horas), siga las instrucciones en pantalla para retirar sus muestras y revisar los resultados. Los resultados se muestran en una cuadrícula de iconos y en la mitad superior de la pantalla:

• Si la L. monocytogenes está presente en la muestra, el pozo es de color rojo con un "plus" signo (positivo).

• Si no hay L. monocytogenes está presente en la muestra, el pozo es de color verde con un signo "menos" (negativo).

• Si el objetivo y el control positivo interno (IPC) son negativos, el pozo es de color amarillo con un signo de "signo de interrogación" (indeterminado).

• Un bien que es de color amarillo y autlined en rojo con una barra roja en el centro indica un error de señal. Llame a DuPont para obtener ayuda.

• Reacción positivos muestran típicamente uno o dos picos en el control positivo son (76-81 ° C) y un pico en el rango meta (83 a 88° C). Fuerte señal positiva para L. moncytogenes con doble pico de control

• Las reacciones negativas sólo muestran el pico control positivo (s).

Perfiles negativos de la curva de denaturación o Melt de Listeria monocytognes 24E • No se encuentran picos del gen blanco, un pico grande del control es presente




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Leve señal negativa para L. monocytogenes

Confirmación de Resultados positivos FDA – BAM para la detección de la Listeria moncytoenes: La presente técnica para la detección de L. moncytogenes en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: ü Enriquecimiento Selectivo Primario, es el paso en donde la muestra es enriquecida en

un medio nutritivo no selectivo. ü Aislamiento, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un

lado debe incrementar las poblaciones de Listeria monocytogenes y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.

ü Primera Purificación, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan Agar Triptosa ácido nalidixico (ATN).

ü Segunda Purificación, a partir del anterior se repica por agotamiento en placas con agar tripticasa de soya extracto de levadura (TSAYE)

ü Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

El resultado del análisis se registra en el resultado microbiológico de alimentos F-SA-75

8. VERIFICACIÓN

8.1. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS

Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Salmonellas con el método y los medios descritos en este procedimiento se cuenta con control positivo y control negativo, los cuales se procesan como una muestra normal: Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo y se procesa como una muestra (actividad 7.5).

8.1.1. Control de Calidad Interno




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En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 25923 de Staphylococcus aureus (control negativo) En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 19115 Listeria monocytogenes (Control positivo)

Medio de Cultivo Cepa de Referencia Imagen

Agar Oxford

Listeria monocytogenes ATCC 19115

Colonias de color verde.negro con halo negro (Por hidrolisis de la esculina: +)

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Poco crecimiento y esculina negativa (Transparentes)

Agar Palcam

Listeria monocytogenes ATCC 19115

Colonias de color verde-grisáceo con halo marrón- negro sobre el fondo rojo cereza (Por hidrolisis de la esculina: + y No fermentación de manitol: -)

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Colonias amarillas con halo amarillo y poco crecimiento.

Registrar en los formatos

• F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos • F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas • F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos • F-SA-34 Control Interno de Equipos • F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos. • F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico Criterios Para Aprobación O Rechazo De La Muestra




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• Verificar el crecimiento en el control (+) observando que el crecimiento sea adecuado y

las colonias características. • El control (-) no debe presentar crecimiento. Las colonias no deben poder diferenciarse

claramente si los medios utilizados son selectivos. • La prueba de esterilidad de los medios utilizados, no debe presentar crecimiento de

ningún tipo. Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101

6.3.7.1 Control de Calidad Externo El laboratorio participa en programas de evaluación externa como API para alimentos.

Los resultados de los controles se registran en el análisis de resultados de control de calidad externo F-SA-109

9. REGISTROS

Registro Responsable Como conservarlo Donde conservarlo Tiempo de

conservación Disposición final

F-SA-18 Hoja de Vida de

Equipos

Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico y/o Electrónico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico







F-SA-46 Control De

Temperatura, Limpieza y

Desinfección de Equipos

Auxiliar de



Laboratorio

Físico










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Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo Tiempo de conservación Disposición final

F-SA-64 Identificación de Sustancias

Químicas

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental



F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Profesional del Laboratorio





F-SA-109 Análisis de

resultados de control de

calidad externo

Profesional Universitario / Profesional de

Laboratorio








10. ANEXOS




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11. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS

1 27/10/2015 Versión inicial.

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