procedimiento de toma de muestra, preservación y
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Procedimiento de toma de muestra, preservación y cuantificación
fluorométrica de la concentración de clorofila-a.
Carla Berghoff, Daniel Cucchi-Colleoni, Vivian Lutz
Proyecto DiPlaMCC - INIDEP
La concentración de clorofila-a se emplea para estimar en forma indirecta la biomasa
fitoplanctónica. La fluorometría es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar la concentración
de clorofila-a en una muestra de agua.
A continuación se describe el procedimiento de la toma de la muestra y su preservación así
como la extracción del pigmento y cuantificación fluorométrica de la concentración de clorofila-a en
muestras naturales.
Para facilitar la comprensión del procedimiento, el mismo se explica en 6 secciones:
A) Adquisición de la muestra de agua.
B) Filtración de la muestra para concentrar las células fitoplanctónicas.
C) Almacenamiento de la muestra de pigmento.
D) Extracción del pigmento de las células.
E) Cuantificación de clorofila-a en el extracto mediante fluorómetro Turner 10-AU.
F) Cálculo de la concentración de clorofila-a.
A) ADQUISICIÓN DE LA MUESTRA DE AGUA.
Materiales:
- Botellas de muestreo de color negro (~550 ml).
- Canasta contenedora de botellas de muestreo.
- Balde con cabo y embudo para toma de muestras en superficie.
- Botellas Niskin para las muestras en la columna de agua.
Precauciones a tener en cuenta:
- Todo el material que se utilizará para la toma de muestras de clorofila debe estar limpio,
seco y sin residuos de ácido. Los residuos de ácido pueden conducir a la conversión de la
clorofila-a en feopigmentos, dando como resultado una subestimación de la
concentración de clorofila-a. Enjuagar las botellas de muestreo con agua de mar filtrada (2
o 3 veces).
- Utilice botellas de muestreo negras (o blancas forradas con contact negro), para evitar la
exposición a la luz durante el muestreo.
Procedimiento:
a. Antes de llegar a la estación preparar todas las botellas de muestreo a ser llenadas.
b. Las muestras de agua de superficie pueden tomarse mediante un balde; para las muestras de
agua en las diferentes profundidades de la columna de agua se utilizan las botellas Niskin.
c. Enjuagar las botellas con la muestra.
d. Las botellas de muestreo están calibradas en volumen hasta el tope, asegurarse que se llenen
con la muestra.
B) FILTRACIÓN DE LA MUESTRA
Fundamento:
Se filtra una muestra de agua de mar a través de un filtro de fibra de vidrio sobre el cual se
retienen las partículas en suspensión. Entre estas partículas se encuentra el fitoplancton, que posee
clorofila-a.
Materiales:
- Filtros de fibra de vidrio Whatman grado GF/F o su equivalente, con tamaño de poro
nominal de 0.7 μm de 25 mm diámetro.
- Sistema de filtración: tren de filtración con sus correspondientes copas de filtración de 25
mm, mangueras de silicona, trampa de vacío y recipiente de reservorio de filtrado (o
Kitasato grande de al menos 4 litros de material fuerte -vidrio o plástico de alta densidad).
- Pinzas para manipular los filtros.
- Probetas graduadas (500 y 200 ml).
- Papel absorbente para secar el filtro.
- Marcadores indelebles, etiquetas, papeles de aluminio cortados en cuadrados (de ~ 8 cm
de lado); ‘sombreritos’ de papel de aluminio para todos los embudos de filtración.
Equipamiento:
- Bomba de vacío
Precauciones a tener en cuenta:
- Las muestras deben ser filtradas tan pronto como sea posible luego de su recolección y
deben protegerse de la exposición a la luz intensa.
- Todo el material que se utilizará para la filtración debe estar limpio y sin residuos de
ácido.
- Previo a iniciar la filtración se debe controlar que el sistema de filtración se encuentre
correctamente instalado. Corroborar que las mangueras que conectan el tren de filtración
con la bomba y con el recipiente de almacenamiento de filtrado se encuentren
correctamente conectadas. Asimismo que el recipiente de almacenamiento de filtrado se
encuentre vacío y que la trampa de vacío de la bomba no contenga restos de agua.
Procedimiento:
a. Con una pinza colocar un filtro fibra de vidrio Whatman GF/F en cada porta-filtro del tren de
filtración. Colocar cuidadosamente el embudo de filtración. Comprobar que los filtros se
encuentren en su lugar y que los embudos de filtración están bien asentados en la base1.
b. Invertir suavemente la botella de muestra 2 veces inmediatamente antes de la filtración para
homogeneizar su contenido.
c. Filtrar todo el volumen de la botella (ya calibrada) o medir un volumen de muestra conocido
con una probeta graduada y verterla en el embudo de filtración.
NOTA: El volumen a filtrar depende de la cantidad de fitoplancton presente en el agua. El
volumen adecuado debe ser suficiente para permitir lecturas dentro del rango de la calibración
del fluorómetro pero no demasiado alto como para requerir dilución. Esto último tiene como
desventaja que aumenta la incertidumbre del método. Por tanto es recomendable filtrar no
más de 500 ml en aguas oligotróficas, menos incluso >100 ml en aguas eutróficas.
d. Encender la bomba de vacío y abrir la válvula del paso de agua del tren de filtración.
Comprobar que la presión de vacío no exceda <35 kPa (es decir, <5 PSI) para no romper las
células o succionar células pequeñas.
e. Cuando la muestra se ha terminado de filtrar2, cerrar la válvula, apagar la bomba y utilizando
pinzas quitar el filtro del tren de filtración y colocarlo sobre papel secante con el contenido
hacia arriba. Con las pinzas tomar suavemente el filtro por sus bordes y plegarlo a la mitad de
modo que las mitades filtradas con el contenido fitoplanctónico se encuentren hacia adentro.
Una vez plegado secar 3 veces el filtro en el papel secante.
1 Si los filtros se encuentran colocados incorrectamente o los embudos de filtración están flojos ello resultará en
la pérdida de muestra. 2 Se recomienda no pre-filtrar las muestras de agua para eliminar zooplancton grande y partículas, ya que se
puede excluir fitoplancton colonial y de formación de cadena como las diatomeas. Use unas pinzas para quitar zooplancton grande del filtro después de la filtración.
f. Tomar un cuadrado de papel de aluminio3, y envolver el filtro en papel de aluminio de la
siguiente manera: doblar el papel aluminio para formar un pliegue que sea ligeramente más
grande que el filtro plegado y colocar el filtro plegado en el pliegue de modo tal que el filtro
quede completamente envuelto. Colocar sobre el pliegue la primera etiqueta identificadora de
la muestra (donde usualmente estarán registrados: campaña, nº estación, profundidad,
volumen filtrado). Doblar los otros lados del cuadrado de papel aluminio de modo tal de
proteger la etiqueta y encerrar completamente el filtro. Colocar, por fuera, una segunda
etiqueta identificadora con la misma información que la primera. Colocar inmediatamente en
el termo de nitrógeno líquido.
g. Para cada muestra registrar en una planilla la siguiente información de la muestra:
identificador de la muestra, estación, volumen de agua filtrada en ml. y profundidad de la
muestra de agua. Asimismo adjuntar información de fecha, hora, posición de estación y modo
de toma de la muestra (nro. de casting de botella Niskin y o balde) y demás observaciones
(color del filtro, iniciales de la persona que filtró la muestra,etc.) (Ver Anexo I).
h. Enjuagar el sistema de filtración con agua de mar filtrada 3 veces y por último, de ser posible,
realizar un enjuague final con agua destilada (si es posible al menos una vez al día).
C) ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA DE PIGMENTO PREVIO A SU ANÁLISIS.
Equipamiento:
- Termo con nitrógeno líquido para preservar las muestras durante la campaña.
- Ultrafreezer a -80°C para preservar las muestras en laboratorio hasta su lectura.
A bordo colocar las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y en el laboratorio pasar a
ultrafreezer (-86 ºC). Siguiendo estas recomendaciones de almacenamiento 4se pueden preservar las
muestras con una degradación mínima por un lapso de no más de un año.
D) EXTRACCIÓN DEL PIGMENTO DE LAS CÉLULAS.
Fundamento:
El procedimiento que se describe a continuación sigue los lineamientos propuestos por Holm-
Hansen (1965) y Welschmeyer (1994) con algunas modificaciones (Lutz et al., 2010). Dicho método
3 Se recomienda utilizar papel de aluminio como contenedor de muestra por ser un recipiente sencillo pero eficaz, barato y fácil de usar. Asimismo permite minimizar el tamaño a ocupar en el recipiente de almacenamiento. 4 Recomendaciones sobre almacenamiento: A una temperatura de -196 °C (nitrógeno líquido) se obtiene > 90% de recuperación después de 60 días y ~ 90% de recuperación después de ~ 1 año; almacenando a -90 °C (Congelador ultra-frío) > 90% de recuperación después de 60 días; probablemente bueno después de ~ 1 año. Por otra parte en congelador a -20 °C solo se aseguran para ~ 10 días con <70% de recuperación después de 60 días.
proporciona una manera más selectiva de medir clorofila-a, ya que minimiza la interferencia de
clorofila-b y feopigmentos, y evita la etapa de acidificación propuesta en otros métodos. Entre las
modificaciones se encuentran el uso de metanol como un solvente de extracción debido a su mayor
eficiencia (Holm-Hansen y Riemann, 1978) y el empleo de ultrasonido para ayudar a la ruptura de las
células para extraer sus pigmentos y para romper el filtro (Wright et al., 1997).
Materiales:
- Tubos de vidrio con tapa con volumen de 10 ml para procesar las muestras.
- Gradilla para tubos de 10 ml.
- Dispensador de volumen variable con recipiente contenedor tipo “Repipette” que pueda
ajustarse a un volumen de 8 ml. En su defecto utilizar pipetas aforadas de 3 y 5 ml.
- Pinzas para la manipulación de los filtros.
- Varilla de vidrio para abrir los filtros.
- Etiquetas para rotular los tubos
- Cinta adhesiva del tipo “mágica” para proteger los rótulos de los tubos.
- Recipiente con agua y hielo.
Reactivos:
- Metanol 100% PA.
Equipamiento:
- Sonicador.
- Agitador orbital tipo “vortex”.
- Centrífuga.
- Freezer común para dejar las muestras 14 hs. mientras se extrae el pigmento.
Precauciones a tener en cuenta:
- Lavar todo el material de vidrio (celdas, pipetas, etc.) con agua destilada y secar. Lavar
cualquier otro material que no sea de vidrio con detergente, agua corriente y finalmente
con agua destilada. Todo el material debe estar limpio, seco y sin residuos de ácido.
- Todo el material volumétrico debe estar calibrado.
- Los reactivos deben ser de la mejor calidad posible (espectroscópico). La mínima calidad
aceptable para el metanol 100% es grado PA; asimismo debe permanecer libre de
residuos de ácido.
- En todos los pasos, recuerde evitar la exposición de los pigmentos a la luz y el calor. El
procedimiento debe realizarse en un ambiente con luz tenue y temperatura que no
supere los 25°C.
- Es recomendable el uso de guantes.
Procedimiento:
a. Rotular los tubos de vidrio de 10 ml. de acuerdo a las muestras. Colocar sobre el rótulo cinta
adhesiva (teniendo precaución de dar una vuelta y media; i.e. pegar cinta sobre cinta).
b. Antes de abrir la muestra, transcribir la información de la etiqueta con la procedencia de
muestra en la planilla de análisis de muestras.
c. Abrir los paquetes de las muestras y con la ayuda de una pinza retirar el filtro y colocarlo en el
interior de un tubo de vidrio.
d. Agregar 8 ml de metanol 100% con un dispensador tipo “repipette” o una pipeta. Asegurarse
de que el filtro está completamente sumergido en el metanol, y sólo haya un filtro en cada
tubo de ensayo.
e. Debido a que los filtros se encuentran plegados, abrirlos suavemente con la ayuda una varilla
de vidrio para que de esta manera se exponga el contenido del filtro al metanol 100%.
f. Enjuagar la varilla de vidrio con metanol 100% antes de su uso y entre cada muestra (poner un
tubo limpio con metanol 100% y sumergir allí la varilla).
g. Prender el sonicador y setearlo con una amplitud de 30, 2.5 pulsos y un tiempo de sonicación
de 30 segundos. Colocar los tubos en un baño de hielo-agua fría con la sonda de ultrasonido
parcialmente sumergida en el tubo. La sonda debe estar lo más perpendicular posible y no
tocar las paredes del tubo. Cerrar la puerta del sonicador y comenzar con el sonicado. Una vez
finalizado el tiempo de sonicado, retirar con cuidado el tubo y taparlo. Entre muestra y
muestra, limpiar la punta del sonicador (con un pañuelo tipo Kimwipe).
h. Colocar los tubos con las muestras en un freezer (-20 ºC) y dejarlos durante un período de 12-
14 hs.
i. Retirar los tubos del freezer y repetir el procedimiento de sonicación explicado en el ítem f.
j. Vortear los tubos durante 10 segundos para homogeneizar el contenido.
k. Encender la centrífuga 10 minutos antes de usarla y setear la temperatura en 16-18 °C. Colocar
los tubos con las muestras en la centrífuga. Asegurarse de que los tubos estén bien cerrados y
que sean del tipo correcto para el cabezal del rotor que está utilizando. Asimismo verificar que
la centrífuga esté balanceada. Centrifugar las muestras durante un tiempo de 20 minutos a una
velocidad de 6000 rpm.
l. Retirar los tubos con las muestras cuidadosamente de la centrífuga evitando que se agite su
contenido. Mantener siempre los tubos con las muestras protegidos de la luz tanto luego de la
centrifugación como antes de la lectura en el fluorómetro.
E) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE CLOROFILA-a EN EL EXTRACTO MEDIANTE EL
FLUORÓMETRO TURNER 10-AU.
Para poder llevarse a cabo la determinación fluorométrica se requiere tener correctamente
calibrado el fluorómetro. Esta operación se realiza siguiendo las instrucciones del manual de usuario
(versión 1.4) provisto por Turner Designs. Asimismo se encuentra información adicional en el manual
de inicio rápido y en las distintas notas de aplicación que se pueden descargar de la página de Turner
Designs (www.turnerdesigns.com), y en el ‘Protocolo de Calibración Fluorómetro INIDEP’.
Materiales:
- Celdas de 13 mm. específicas para el fluorómetro.
- Paños para tareas delicadas tipo “Kimwipes”
- Tubos de 10 ml con tapa para realizar diluciones.
- Pipeta automática monocanal de volumen variable de 100-1000 µl.
- Vaso de precipitado (2 litros) para descartar las muestras una vez leídas.
- Referencia sólida secundaria “L & H” Turner Desings.
Reactivos:
- Metanol (CH3OH) 100% grado espectroscópico o PA, libre de ácidos.
Equipamiento:
- Fluorómetro 10-AU Turner Designs.
Precauciones a tener en cuenta:
- La lectura de las muestras debe realizarse en un ambiente con luz tenue.
- La fluorescencia depende de la temperatura. Por lo tanto, realizar las lecturas a una
temperatura ambiente constante entre 20-25 °C. asegurarse luego de la centrifugación
que las muestras han alcanzado la temperatura ambiente.
- Mantener las celdas del fluorómetro boca abajo para evitar que penetren partículas de
polvo.
1) Seteo de los parámetros de funcionamiento del fluorómetro Turner 10-AU.
a. Enchufar el Fluorómetro 10-AU y encender el instrumento al menos 30 minutos antes de su uso. El botón de encendido-apagado es rojo y se encuentra en el lado inferior derecho, cercano a la toma de conexión eléctrica (Foto 1).
Foto 1. Vista general del fluorómetro Turner Designs 10-AU.
b. Una vez encendido el equipo, se observa la pantalla de lectura “HOME” (Foto 2.a). Desde la
pantalla "HOME" presione <ENT> usando el teclado. Esto conduce a la pantalla del menú principal "MAIN MENU", que posee diferentes opciones de configuración del instrumental, indicados con números (Foto 2.b). El acceso a la pantalla de interés se da oprimiendo los números correspondientes en el teclado. El número de la pantalla aparece en la esquina derecha de la pantalla con el símbolo “#” antepuesto.
Foto 2. Vistas de la (a) pantalla de lectura “HOME” y (b) pantalla del menú principal “MAIN MENU” del fluorómetro Turner Designs 10-AU.
c. Verificar que el modo de lectura se encuentre en fluorescencia relativa. Para ello se debe leer
en la pantalla “HOME” de lectura lo siguiente: (RAW) (Foto 3). En caso contrario, desde el menú principal “MAIN MENU” oprima el número <1> para acceder a la pantalla 1.0.: “Operational Parameters” que corresponde a la pantalla de seteo de los parámetros de operacionales (Foto 4.a). Desde la pantalla 1.0. pulsar el <2> para acceder a la pantalla: 1.2. “Home display options” (Opciones de Visualización de Inicio) y a continuación pulsar el <1> para acceder a la pantalla 1.2.1.: “Readout” y seleccionar “RAW FLUORESCENCE” (Foto 4.b). En
Botón de encendido-
apagado
este modo de funcionamiento las lecturas corresponden a una fluorescencia relativa (proporcional a la concentración de la muestra) y no se mostrarán unidades de medida. Presione el botón <ESC> dos veces para retornar al menú principal “MAIN MENU”.
Foto 3. Vista de la pantalla de lectura (“HOME”) en la que se muestra indicado el modo de lectura de fluorescencia relativo (“RAW”) y el modo de automático (“AUTO”) de seteo del rango de concentración.
Foto 4. Vista de las pantallas (a) 1.0.: menú principal de seteo de los parámetros de operacionales y b) 1.2.: menú de opciones de visualización de Inicio del fluorómetro Turner Designs 10-AU. En la imagen (b) se observa en “Readout” el modo de fluorescencia relativa “RAW FLUORESCENCE”.
d. Verificar que el control del rango de concentración se encuentre en selección automática
(“AUTO”), para ello se debe leer en la pantalla “HOME” de lectura lo siguiente: CONC: LOW (AUTO) (Foto 5). En caso contrario, desde el menú principal “MAIN MENU” oprima <2> para acceder a la pantalla de calibración 2.0.: “Calibration”. A continuación oprima <4> para acceder a la pantalla de 2.4. de establecimiento del intervalo de concentración “Set Concentration Range”. Presione <3> para acceder a la pantalla 2.4.3.: “Set range control” y presione <ENT>
para llevar a “AUTO”5 y ajustar el control de rango de concentración en selección automática (Foto 4). Presione el botón <ESC> dos veces para retornar al menú principal “MAIN MENU”.
Foto 5. Vista de las pantallas (a) 2.4.: menú principal de seteo del rango de concentración y b) 2.4.3.: menú de seteo del control del rango de concentración del fluorómetro Turner Designs 10-AU. En la imagen (b) se encuentra indicado el modo de seteo automático (“AUTO”) del rango de concentración.
2) Blanqueo del fluorómetro Turner 10-AU.
Antes de la medición de una muestra, debe utilizarse un blanco para configurar el cero del instrumento. Un blanco es el mismo solvente en el cual se extrajo la clorofila-a.
a. Desde el menú principal “MAIN MENU” oprima el número<2> para acceder a la pantalla de
calibración 2.0.: “Calibration”. A continuación oprima <2>, acceda a la pantalla 2.1.2. y seleccione o “NO” para setear el instrumental de modo que NO substraiga el blanco (Foto 6).
b. Llenar una cubeta de 13 mm con metanol 100%. Secar el exterior de la cubeta con un papel para tareas delicadas e insertar la cubeta en la abertura del compartimiento de muestra. Luego colocar el cobertor de luz.
c. El blanco se corre en la pantalla 2.1.1. Pulse el botón <ESC> dos veces para volver a la pantalla
de calibración de 2.0. Desde la pantalla 2.0 oprima <1> para acceder a la pantalla 2.1 del menú de blanqueo “Blanking” y luego oprima <1> para acceder a la pantalla 2.1.1. “Run Blank” (Foto 3).
5 Cuando se establece el modo de rango automático “AUTO”, el instrumento selecciona automáticamente los
rangos en respuesta a las diferentes concentraciones de la muestra para así proporcionar la mejor resolución a cada muestra que se está leyendo.
Foto 6. Vista de las pantallas 2.0.: menú de calibración (a) y 2.1.: menú de blanqueo (b) del fluorómetro Turner Designs 10-AU.
d. Permitir que el porcentaje de lectura del blanco se estabilice; ello se comprueba cuando el "TC"
en la pantalla 2.1.1. cambia de 1 a 8 segundos. Asimismo comprobar que el porcentaje de lectura del blanco sea inferior a 200% de FS. Es preferible sea un número de porcentaje bajo (Foto 7.a).
e. Presionar <0> y esperar 15 segundos. Cuando aparece la palabra "FINISHED" en la pantalla (Foto 7.b) significa que se completó el proceso y que se ha registrado valor del blanco6.
Foto 7. Vistas de la pantalla 2.11. de blanqueado del fluorómetro para clorofila-a. (a) previo al blanqueo; (b) una vez finalizado el blanqueo. Observar el % de blanqueo y el TC en la figura (a) y el vocablo inglés “FINISHED” al final el proceso de blanqueado.
6 Si uno quisiera conocer el valor del blanco, la señal de fluorescencia para el blanco se almacena como "blank" y
se puede acceder a la misma en la pantalla 3.2.
f. Una vez que el blanqueado se ha completado, presionar <ESC> cuatro veces para salir del
menú y volver a la pantalla “HOME” de lectura.
g. Con el blanco todavía en el fluorómetro, observar en la pantalla “HOME” la lectura del blanco, la cual debe ser cercana a 0.000. Registrar este valor y retirar el blanco.
h. Ir a la pantalla de sustracción del blanco 2.12: “subtract blank” y seleccionar “YES” o “NO” dependiendo si desea o no que se reste el blanco automáticamente. Un ajuste de "NO" significa que el blanco no se restará. En nuestro caso setear en “YES”.
3) Lectura de la referencia sólida secundaria.
Es conveniente verificar la estabilidad del equipo antes del análisis utilizando la referencia
sólida secundaria “L & H” suministrada por Turner Designs. La referencia de Turner Designs viene
sellada y se encuentra en un soporte sólido que se ajusta directamente en el adaptador de la cubeta de
13 mm. No requiere ninguna manipulación o condiciones especiales de almacenamiento. El soporte
contiene dos concentraciones diferentes que deben leerse en los intervalos de concentración bajo
(“LOW”) y alto (“HIGH”) respectivamente.
a. Enfrentando el instrumento, colocar la referencia sólida secundaria en el compartimento de
medición de modo que la letra "L" (grabada en la parte superior del soporte) se encuentre
hacia el lado izquierdo (Foto 8.a). Asegurarse de que el perno de metal esté completamente
asentado en la muesca del adaptador de cubeta de 13 mm. Esperar durante 5 a 10 segundos,
mientras que el instrumento encuentra el rango de concentración adecuado, que en este caso
debe ser “LOW”. Desde la pantalla de lectura “HOME” oprima la tecla <*> para leer el valor.
Cuando la palabra "done" aparece en la esquina superior derecha de la pantalla significa que la
lectura se ha completado y se puede tomar nota del valor en “LOW” ("L").
b. Abrir la tapa de la cubeta, levantar ligeramente la referencia y rotar la referencia 180 grados de
modo tal que la letra "H" (grabada en la parte superior del soporte) se encuentre hacia el lado
izquierdo (Foto 8.b). Realizar la misma operatoria que en el inciso anterior y tomar nota del
valor en “HIGH” ("H").
Foto 10. Vistas del compartimiento de medición en el que muestra la posición correcta de la referencia sólida secundaria del fluorómetro Turner Designs 10-AU. (a) posición para lectura en “LOW”; (b) posición para lectura en “HIGH”.
4) Lectura de las muestras naturales7.
a. Verter aproximadamente 0.5 ml de la muestra en la cubeta, teniendo cuidado de no perturbar
el filtrante en la parte inferior del tubo; enjuagarla y vaciarla. Con el mismo cuidado llenar la
cubeta con la muestra entre dos tercios y tres cuartos de su capacidad8. Limpiar las paredes de
los tubos con un paño para tareas delicadas y verificar que no se encuentren partículas dentro
de la cubeta9.
b. Las muestras se leen desde la pantalla “HOME”. Colocar la cubeta en el fluorómetro, colocar la
tapa de luz y esperar entre 5 a 10 segundos, mientras que el instrumento encuentra el rango
correcto. Si en la pantalla de lectura "HOME" se lee un valor menos a 999, oprima la tecla <*>
para iniciar la secuencia discreta de promedio de la muestra10. Cuando la palabra la palabra
"done" aparece en la esquina superior derecha de la pantalla, se han completado la lectura. La
lectura se mostrará durante 10 segundos. Tomar nota del valor de lectura de fluorescencia
como F0 y el rango de concentración (Ver Anexo II). Si el fluorómetro lee “OVER” en el rango
“HIGH” significa que la muestra es demasiado concentrada para ser leída en la calibración
actual y probablemente en el rango lineal. En este caso, la muestra debe ser diluida y re-
analizada.
NOTA: La forma correcta de proceder para realizar las diluciones es tomar con una pipeta
automática un volumen directamente de la cubeta y trasvasarlo a otra cubeta, tratando de no
tocar los bordes de la cubeta. Luego con otra pipeta agregar el volumen de metanol. Por
último agitar la cubeta para mezclar el contenido. Asegurarse de registrar el volumen de la
muestra y el volumen de metanol utilizados para la dilución.
c. Retirar la cubeta. Remover la muestra y enjuagar la cubeta con metanol 100% al menos 2
veces. Voltear la cubeta sobre un papel absorbente para retirar el excedente de metanol.
d. Colocar la siguiente muestra tal como lo indicado en el paso a. Repetir las instrucciones
indicadas en los pasos a-c hasta que todas las muestras hayan sido leídas.
7 Para mayor detalles véase la Section 3C: “Routine operation” del manual de usuario de Turner Desings.
8 El volumen de medición mínimo que se requiere utilizar con las cubetas de 13 mm para medir con precisión es de 4,5 ml. 9 Si se perturba o se observan partículas en la cubeta debe volver a centrifugarse la muestra.
10 Cuando se presiona la tecla asterisco se inicia una secuencia discreta de promedio de la muestra, donde el
instrumento realiza un período de retardo (“delay”) de 15 segundos permitiendo que la lectura se estabilice, y luego promedia las lecturas (“average”) durante un período de 10 segundos, permitiendo que cada muestra sea leída en un mismo período de tiempo.
e. Una vez finalizada la lectura de las muestras, medir la referencia secundaria tal como se indicó
en el apartado anterior, y utilizar esta lectura para verificar la estabilidad del equipo. Si se tiene
una gran cantidad de muestras se recomienda leer la referencia sólida secundaria cada 30-40
muestras. Comparar la lectura con aquella realizada al principio para asegurarse que el
instrumento no ha derivado11.
f. Oprimir el botón rojo para apagar el fluorómetro.
F) CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE CLOROFILA-a.
La concentración de clorofila-a se calcula de acuerdo a la siguiente expresión:
Chla [µg/l]= k*Ve*Fo*d/ Vf Siendo:
Fo = lectura de fluorescencia de la muestra.
k = factor de calibración del fluorómetro que relaciona la cantidad de pigmento con la
intensidad de fluorescencia12.
Ve= volumen de metanol utilizado para la extracción (ml).
Vf = volumen de agua de mar filtrada (litros).
Vm = volumen de la alícuota de la muestra a diluir (ml)
Vs= volumen de la alícuota de metanol para diluir (ml)
d = factor de dilución, siendo d= (Vm+Vs)/Vm
Ej: si se diluye 1 ml del extracto de la muestra por agregado de 4 ml de metanol, el
factor de dilución es 5.
NOTA 1: Debido a que los valores de clorofila-a se expresan como µg/L (= mg/m3), es necesario
multiplicar el resultado de los cálculos por 1000. Esto se hace mediante el uso del volumen de metanol
utilizado para la extracción (Ve) en ml (generalmente 8), y el (Vf) volumen de agua de mar filtrada en
litros; puede parecer confuso pero es correcto.
Bibliografía consultada.
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Chlorophyll. J. Cons.perm.int Explor. Mer. 30: 3-15
11
Turner Designs comenta en su newsletter (Vol. 20, 2010) que una deriva mayor de un 5% indica la necesidad de una nueva calibración. 12
El factor de calibración k es específico para cada fluorómetro, y cambia con el tiempo, así como cuando se cambian o se limpian la lámpara o los filtros. Este factor debe ser determinado a intervalos regulares por calibración con clorofila-a pura.
Holm-Hansen, O., and B. Riemann. (1978). Chlorophyll a determination: improvements in
methodology. Oikos, 30: 438-447.
Jeffrey, S.W.; Welschmeyer, N.A. (1997). “Spectrophotometric and fluorometric equations in common
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Errors Associated with Chloropyll b and Pheopigments: (Without Acidification - Using 13 mm Test
Tubes) 998-9000. Revision A. 6 p.
Turner Designs Technical Note: 10-AU Solid Secondary Standard Use with Discrete Sampling S-0138
Revision A 6 p.(http://www.turnerdesigns.com/component/content/article/116-10au-faqs/418-10au-
sold-secondary-standard)
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13p.
Varela R . (2011).Método 13. Determinación de Clorofila-a y Feopigmentos. Manual de Métodos para
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Welschmeyer, N. 1994. Fluorometric analysis of Chlorophyll a in the presence of Chlorophyll b and
pheopigments. Limnol. Oceanogr. 39:1985-1992.
Anexo 1. Modelo de planilla de toma de datos abordo de clorofila-a.
CLOROFILA-a
OBSERVACIONES:………………………………………………………………………...……………………………………………………
…………………………………………………….…………………………………………………………………………...………………………
CAMPAÑA PROYECTO ESTACIÓN GRAL. ESTACIÓN PROYECTO
FECHA
LOCAL
FECHA
GMT HORA LOCAL HORA GMT LATITUD LONGITUD
Etiqueta PROF.
(m) Replica
VOL. FILTR.
(ml)
…………………………………………………….…………………………………………………………………………...………………………
…………………………………………………….…………………………………………………………………………...………………………
Anexo 2. Modelo de planilla para determinación de la concentración de clorofila-a con el fluorómetro
Turner Designs 10-AU.
CUANTIFICACIÓN FLUOROMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE CLOROFILA-a
Campaña: _________ Blanco: Hoja: ___
Operador: _________
Referencia Sólida INICIO: L: _________
Referencia Sólida INICIO: H: _________
Fecha: _________
Referencia Sólida FINAL: L: _________
Referencia Sólida FINAL: H: _________
NRO MUESTRA
ETIQUETA F0 TURNER Dilución
(ml muestra: ml metanol)
OBSERVACIONES