Pruebas de sensibilidad microbianaCristina Alexandra GuevaraLaboratorio de Microbiologa Industrial, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, Universidad Tcnica de Ambato.

ResumenEl antibiograma presenta un anlisis de los comportamientos de los antimicrobianos frentes agentes infecciosos como Escherichia Coli. Los aceites esenciales tienen compuestos antibacterianos los cuales han sido reconocidos y utilizados industria alimentaria. Por esta razn se identific la actividad antimicrobiana de dos aceites esenciales (Naranja y Jengibre) y el antibitico bactericida Sulfato de Estreptomicina frente a la bacteria E. coli, mediante el mtodo de difusin en disco. Los resultados del experimento demostraron que los aceites esenciales no presentaron propiedades bactericidas, por lo que no es recomendable su utilizacin frente a la bacteria E. coli, mientras que el antibitico present un porcentaje de inhibicin de 4,94%. Palabras clave: Actividad antibacteriana, aceite esencial,IntroduccinLos estudios de susceptibilidad de los microorganismos a un antibitico consisten en estudios in vitro en el laboratorio realizado para enfrentar bacterias con antimicrobianos, bajo un control de la cantidad de bacterias y la cantidad de antibitico, de tal manera que se usa un mismo nmero de bacterias a diferentes concentraciones de antibiticos, para obtener la concentracin mnima inhibitoria y la resistencia antimicrobiana (Romero, 2007). Generalmente en el laboratorio de microbiologa se utiliza diferentes mtodos o pruebas para el estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos, que se clasifican en funcin de la tcnica empleada. As en las tcnicas de difusin encontramos a la prueba de difusin con discos (Zaragoza et al, 2007). En la prueba de difusin con discos de Bauer, Kirby se siembran las placas de agar con una suspensin estandarizada de un microorganismo. Discos que contienen antibiticos o cualquier agente antimicrobiano como aceites esenciales se aplican a la superficie del agar. Despus de la inoculacin, se miden los dimetros de las zonas de inhibicin o aclaramiento alrededor de los discos. Los dimetros de las zonas se interpretan como sensibles, indeterminado o resistente (Bennington, 2000).El control microbiano mediante el uso de aceites esenciales se ha convertido en una de las reas de investigacin ms importantes con la finalidad de sustituir conservadores sintticos por naturales. Estudios resientes han demostrado que los vapores generados por aceites esenciales poseen efectos antimicrobianos, por lo que algunos investigadores proponen utilizarlos como una alternativa de su aplicacin como agentes antimicrobianos, ya que afectaran en menor grado las caractersticas sensoriales, asegurando as mismo la inocuidad del producto ( Reyes et al, 2012). Los acetites esenciales de ctricos contienen del 85 al 99% componentes voltiles y del 1 al 15% componentes no voltiles. Las sustancias voltiles son una mezcla de monoterpenos (limoneno), sesquiterpenos, hidrocarburos, y sus derivados oxigenados incluyendo: aldehdos (citral), cetonas, cidos alcoholes (linalol) y esteres. Siendo el -Terpineol, Citral y el linelol aquellos que presentan propiedades bactericidas (Soto, 2010).Por lo anteriormente expuesto, en el siguiente trabajo se evalu la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de Naranja y Jengibre adems del antibitico Sulfato de Estreptomicina sobre la bacteria E. Coli, mediante la elaboracin de un antibiograma basado en los halos de inhibicin de crecimiento de la bacteria.

Material y MtodosPara el experimento se requiri 8 discos de papel bond (celulosa) de 5mm con el objetivo de fijar el aceite esencial (AE) de naranja, jengibre y el antibitico Sulfato de Estreptomicina en el agar. Sobre el medio de cultivo se sembr 100ul de la cepa bacteriana de Escherichia Coli y se dispers en toda la caja Petri. Con una pinza estril se coloc los cuatro crculos en diferentes posiciones y se los rotulo con nmeros al revs de la caja Petri. Luego se coloc 20ul de cada aceite esencial y del antibitico, tomando en cuenta que el nmero 1 correspondi al control, el 2 al aceite esencial de naranja, el 3 al aceite esencial de jengibre y el 4 al antibitico. Posteriormente se dej secar por 5 minutos y se llev a la incubadora (Memmert, Alemania) a una temperatura de 25 -30C durante 24 horas y se midi el dimetro (mm) de los halos de inhibicin.

Resultados y DiscusinDespus de 24 horas de incubacin se observ la actividad antibacteriana del antibitico Sulfato de Estreptomicina y los aceites esenciales frente a la cepa de E.coli, mediante la presencia de halos de inhibicin, observando solo en el disco de papel de celulosa que contena el antibitico bactericida, el cual fue de 20 mm de dimetro, mientras que los aceites esenciales de naranja y jengibre no fueron eficaces en inhibir el crecimiento bacteriano de E.coli como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Dimetro (mm) de los halos de inhibicin cuando se exponen los aceites esenciales y el antibitico bactericida (Sulfato de Estreptomicina) frente a la cepa E. coli.MicroorganismoControl (mm)Aceite esencial de Naranja (mm)Aceite esencial de Jengibre (mm)Bactericida Sulfato de Estreptomicina (mm)

E. coli00020

00020

En la tabla 2 se muestra el porcentaje de inhibicin que present los aceites esenciales y el bactericida frente a la cepa E.coli tomando en cuenta rea de los halos y la caja Petri (90mm), siendo el rea de la caja Petri el 100%, obteniendo como resultado que el bactericida tuvo un porcentaje de 4,94% con respecto al rea de la caja Petri, mientras que los aceites esenciales fue de 0%, identificando que la bacteria al ser Gram-negativa no present susceptibilidad con respecto a los aceites esenciales, esto puede estar relacionado con la membrana externa que poseen este tipo de bacterias, ya que la hidrofobicidad de la membrana la hace impermeable. Sin embargo, Fisher y Phillips (2008) mencionaban que ser requiere de un mayor periodo de exposicin frente a los aceites esenciales. Estudios anteriores demuestran que la actividad antimicrobiana depende de la composicin de los aceites esenciales, siendo aquellos que contienen un alto porcentaje de compuestos fenolticos como el carvacrol, el timol y el eugenol, los que poseen notables propiedades antimicrobianas frente a E. coli. Siendo el carvacrol (organo) y el eugenol (tomillo) los que causan la desintegracin de la membrana de E.coli (Zekaria, 2011). Fisher y Fillips (2008) reportan que el carvacrol aumenta la fluidez de la membrana y causa fuga de protones e iones de potasio, lo que resulta en un colapso del potencial de membrana y la inhibicin de la sntesis de ATP.

Tabla 2. Porcentaje de inhibicin que present los aceites esenciales de naranja, jengibre y el bactericida sulfato de Estreptomicina con respecto a la bacteria E. coli considerando el rea de la placa del agar (90mm) y el rea de los halos.Microorganismorea (mm2)Porcentaje de Inhibicin %

ControlE. coli00

Aceite Esencial de NaranjaE. coli00

Aceite Esencial de JengibreE. coli00

Bactericida Sulfato de EstreptomicinaE. coli3,14E24,94%

Figura1. Antibiograma. Formacin de halos de inhibicin segn la accin antimicrobiana que present los aceites esenciales y el antibitico. 1 control, 2 AE de naranja, 3 AE de jengibre y 4 Sulfato de estreptomicina.Como se muestra en la figura 1 los aceites esenciales de naranja y jengibre no tenan accin antibacteriana, Soto (2010) & Fisher y CA Phillips (2006) indica que el aceite esencial de naranja no tienen ningn efecto inhibitorio sobre E. coli debido a que no posee en alto porcentaje de Citral y Terpineol siendo estos compuestos aquellos que presentan actividad bactericida en los aceites esenciales ctricos debido a que alteran y penetran en la estructura lipdica de la pared celular perturbando las estructuras celulares, lo que lleva a la desnaturalizacin de protenas y a la destruccin de la membrana celular, hacindolas ms permeables, lo que conduce a rupturas o fugas citoplasmticas, lisis celular y eventualmente la muerte del microorganismos (Soto, 2010).

ConclusionesSe evalu la actividad antimicrobiana mediante la tcnica de difusin por discos, de los dos aceites esenciales (Naranja y Jengibre) identificando que no presentaron los componentes que inhiben el crecimiento de la bacteria E.coli, debido a que no presentaron un halo de inhibicin. Mientras que el antibitico bactericida Sulfato de Estreptomicina presento un halo de inhibicin de 20 mm y un porcentaje de inhibicin de 4,94% ya que este inhibi la sntesis proteica de la bacteria.

Cuestionario1. Cul es la importancia de los ensayos antimicrobianos?Es importante debido a que evala la resistencia de un microorganismo frente a diferentes agentes antimicrobianos, observando la susceptibilidad que presenta en un antibiograma. Una vez que se conoce la resistencia del organismo se puede observar el mejor mtodo para inhibir su crecimiento o realizar una nueva tcnica.2. Qu ventajas presenta la tcnica de difusin de disco frente a otros mtodos?Es un mtodo sencillo, barato y de fcil control y estandarizacin. Se puede realizar modificaciones del medio en cuanto a los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan ms nutrientes que los que este medio les puede ofrecer (Taroco, Seija, & Vignoli, 2008)3. Cul es el mecanismo de accin antimicrobiano de los aceites esenciales y del antibitico utilizado?Los aceites esenciales de naranja y jengibre no presentaron ningn mecanismo de accin antimicrobiano frente a la bacteria E.coli. Segn Jeangmonk, Maurice & Cheng (1995), los mecanismos por los cuales el aceite esencial ejerce un efecto antibacterial son muy diversos, estos incluyen: interferencia en la membrana celular, provocando una mayor prdida de la permeabilidad y disminucin de los constituyentes celulares; deterioro del sistema enzimtico, incluyendo los que participan en la produccin de energa celular y sntesis de componentes estructurales y destruccin o inactivacin del material gentico. Con respecto el antibitico bactericida sulfato de Estreptomicina su mecanismo es evitar la sntesis de protenas, el inicio de las cadenas peptdicas y el reconocimiento de tripletes normales (Agrios, 1988).4. Qu compuestos presentes en los aceites esenciales utilizados son responsable de la actividad antimicrobiana? Citral Linalol - Terpineol Estos compuestos presentan actividad antimicrobiana en altas concentraciones (Soto, 2010).

5. Indique otros mtodos o tcnicas que pueden ser utilizados para evaluar la actividad antimicrobiana de un compuestoPrueba de E-testUsa una gradiente de concentraciones de cada antimicrobiano absorbida en una tira de plstico inerte, a partir de la cual ocurre la difusin. Tiene la ventaja de indicar la concentracin mnima inhibitoria CMI en el punto donde se cruza la zona de inhibicin con la escala de la tira.Sistemas automticos y semiautomticosFacilitan la estandarizacin y automatizacin del estudio de sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos. La CMI se realiza de forma automtica por turbidez, nefelometra u otro sistema ptico, generalmente acoplado a un sistema informtico que almacena la informacin e interpreta los resultados de acuerdo con los puntos crticos de sensibilidad.Mtodos bioqumicos Consisten en la determinacin del mecanismo por el cual una bacteria es resistente aun antimicrobiano determinado. Los ms utilizados son la deteccin de -lactamasa en Hemophilus influenzae o en Staphylococcus aureus mediante discos de nitrocefina (cefalosporina cromogenica que cambia de color cuando es hidrolizada por estas enzimas) (Zaragoza et al, 2007).

Referencias BibliogrficasAgrios, G.N. (1988). Plant Pathology. Recuperado de http://books.google.com.ecBennington, J.L. (2000). Diccionario Enciclopdico del laboratorio clnico. Recuperado de http://books.google.com.ecFisher, K. & Phillips, C. (2008). Potential antimicrobial uses of essential oils in food: is citrus the answer? Food Science and Technology. 19 (3):156-164Jeongmonk, K., Maurice, R. & Cheng, I. W. (1995). Antibacterial activity of some essential oil components against ive foodborne pathogens. Journal Agriculture Food Chemistry, 43:2839-2845.Reyes, F.J; Palou, E & Lpez, M. (2012). Vapores de aceites esenciales: alternativa de antimicrobianos naturales. 6(1) 29-39.Romero, R. (2007). Microbiology and Human Parasitology. Recuperado de http://books.google.com.ecSoto, L.R (2010).Composicin y Actividad Microbiana del Aceite Esencial de Toronja (Citrus Paradisi). Universidad de Zulia. MaracaiboTacoro R, Sejia V, & Vignoli.R. (2008). Mtodos de estudio de la sensibilidad antibitica. Instituto de Higiene. Recuperado el 9 de 11 de 2014, de Mtodos de estudio: ttp://www.higiene.edu.uyZaragoza, R; Gimeno, C; Pemn, J; Salavert, M. (2007). Microbiologa aplicada al Paciente Crtico. Recuperado de http://books.google.com.ecZekaria, D. (2006). Los aceites esenciales: una alternativa a los antimicrobianos.Los aceites esenciales: una alternativa a los antimicrobianos.