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El premio Nobel de Química del 2003 fue otorgadoa Peter Agre de la Escuela de Medicina de la Univer-sidad Johns Hopkins en Baltimore, y a RoderickMacKinnon del Instituto Médico Howard Hughesde la Universidad Rockefeller en Nueva York. Agreidentificó el primer canal que transporta el agua enlas células en 1991. Mackinnon ha sido el únicoen poder cristalizar dos tipos de canales iónicos: depotasio y de cloruro, dos familias de canales de lasmembranas celulares. A continuación se describiránlos trabajos de investigación desarrollados por estosdos científicos, en el transcurso de la última década.

Canales para el aguaEn los seres humanos aproximadamente el 70% delpeso corporal es agua. El agua fluye a través de lasmembranas de las células por dos mecanismos dife-rentes: por difusión simple y por difusión facilitada.La difusión del agua a través de las bicapas (difusiónsimple) ocurre con una energía de activación alta(Ea > 10 kcal/mol). Sin embargo, por más de 40 añosse sabía que en los eritrocitos del humano el aguatiene un flujo rápido con una Ea < 5 kcal/mol, lo cualcondujo a la hipótesis de la existencia de poros parael agua (difusión facilitada; Sidel y Solomon, 1957).La difusión del agua por estos poros es muy especí-fica ya que ninguna otra molécula pequeña, iones oaun protones (H3O+) pueden difundirse por ellos(Finkelstein, 1987).

Hace dos décadas, la homeostasis de la lente delojo, el cristalino, se atribuyó a canales especiales enlas membranas celulares de las fibras de los lentes,pero su naturaleza fue controversial. Se observó una

proteína que formaba arreglos cuadrados por fractu-ra a bajas temperaturas, la cual resultó ser un canalpara el agua al que se le llamó acuaporina (AQP0),una proteína hidrofóbica de 26 kDa (Kistler y Bulli-vant, 1980). Con base en la secuencia de sus amino-ácidos, se predijo que AQP0 comprendía seis seg-mentos transmembranales y cinco asas de tamañovariable. El motivo de tres aminoácidos Asn-Pro-Ala(NPA) presentes en las dos asas más largas, y lahomología de la secuencia entre el amino y el car-boxilo terminales de la molécula, se reconocieroncomo características distintivas de esta proteína demembrana (Gorin y col., 1984). A pesar de estainformación, la función de la AQP0 no fue evidente.La identidad molecular de los canales para el aguapermaneció desconocida hasta principios de 1990.

El bloqueo de la difusión del agua en los eritro-citos por compuestos con mercurio sugirió la presen-cia de canales para el agua, cuyo poro tendría enton-ces un grupo sulfhidrilo (Macey y Farmer, 1970). Losensayos con las membranas del túbulo proximal dela nefrona del riñón sugirieron la presencia de unaacuaporina de 30 kDa (van Hoek y col., 1991). Almismo tiempo se descubrió una proteína de mem-brana muy abundante en las membranas de loseritrocitos de 28 kDa con gran homología con laAQP0, por lo que se sospechó que era el canal parael agua (Preston y Agre, 1991; Smith y Agre, 1991).

*Facultad de Medicina, UNAM.Correo electrónico: [email protected] artículo fue solicitado a Laura Escobar por el director dela revista. La doctora Laura Escobar realizó una estancia posdoctoralcon el doctor Roderick MacKinnon en el Departamento deNeurobiología de la Escuela de Medicina de la Universidadde Harvard, durante el periodo de 1991 a 1993. Actualmente,es profesora del Departamento de Fisiología de la Facultadde Medicina de la UNAM. La investigadora estudialos canalesiónicos de: los ovocito, la médula renal y el cerebro.

PREMIO NOBEL DE QUÍMICA 2003

Estructura y función de los canales que transportan alagua y al potasio en las célulasLaura Escobar*

Laura Escobar (a la derecha) en el laboratorio de Rod MacKinnon(a la izquierda) con algunos de sus colaboradores.

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Inicialmente Agre y su grupo intentaban la purifica-ción de los antígenos del grupo sanguíneo Rh de loseritrocitos, cuando observaron que siempre aparecíauna proteína de 28 kDa que contaminaba sus mues-tras. Primero le llamaron CHIP28 en referencia alparentesco de su modelo topológico con las proteí-nas de membrana llamadas canales iónicos. Agre y sugrupo encontraron que esta proteína de 28 kDa seexpresaba abundantemente en los eritrocitos y en losepitelios de los túbulos renales, células con la per-meabilidad al agua más alta conocida (Denker y col.,1988). La secuencia del amino terminal de la proteí-na CHIP28 les sirvió para clonar el ADNc que codi-ficaba la proteína de 268 aminoácidos a partir de unalibrería de eritrocitos (Preston y Agree, 1991). Elanálisis de los genes en las bases de datos mostróvarios genes homólogos a CHIP28 en especies muydiversas como las plantas y bacterias, sin conocersesu función. Agre sospechó que CHIP28 podría re-gular el flujo del agua, por lo que llevó a cabo unexperimento crucial. El 9 de octubre de 1991 expre-só esta proteína en las células que se han utilizadoextensamente en el estudio de la función de clonasde proteínas de membrana: los ovocitos de la ranaafricana Xenopus laevis. En contraste con los ovocitoscontrol que no sufrieron cambios en una soluciónhipotónica (osmolaridad menor a la fisiológica),Agre observó con un microscopio el hinchamientoy la explosión eventual de los ovocitos inyectadoscon el ARNm de CHIP28 en tan sólo tres minutos.Lo anterior demostró que CHIP28 formaba porospor los que se transportaba al agua: había clonado laprimer acuaporina, la AQP1. La difusión del agua através de AQP1 fue sensible al mercurio (Preston ycol., 1992). Para poder medir la velocidad con la que

fluye el agua a través de la AQP1, ésta se reconstituyóen liposomas para medir la dispersión de la luz enmedios con osmolaridad variable (Zeidel y col.,1992, 1994). Esta técnica permitió calcular que laAQP1 transporta 2,000 millones de moléculas deagua por segundo por subunidad. Lo sorprendentees que a pesar de este gran flujo de agua, no se detectael transporte de otros solutos como son el glicerol, laurea o incluso de protones.

El descubrimiento de las acuaporinas contestóuna pregunta fundamental de la biofísica de cómo elagua atraviesa las membranas biológicas.

La familia de las acuaporinas (AQPs)La familia de las AQPs comprende estrictamentecanales para el agua y canales que transportan ade-más solutos como la urea y el glicerol (acuaglicero-porinas, GLPs) y hasta algunos gases como el CO2

(Cooper y Boron, 1998). Es importante señalar quelas AQPs al no permitir el paso de iones no disipanel potencial de membrana. Esto contrasta con losporos de los canales no selectivos como es el delantibiótico gramicidina (Pomès y Roux, 1996). LasAQPs que sólo permiten el paso del agua presentanun arreglo de aminoácidos único en la región delporo, los cuales participan en la selección exclusivade estas moléculas (filtro de selectividad).

De las 11 acuaporinas identificadas en los mamí-feros hasta el 2002, al menos siete se encuentran enel riñón en sitios diferentes a lo largo de la nefrona,la unidad básica funcional del riñón. La AQP1 esmuy abundante en el túbulo proximal y en la porcióndelgada descendente del asa de Henle.

A la fecha se han identificado más de 200 acua-porinas distribuidas ampliamente en todos los orga-nismos vivos: plantas, bacterias, vertebrados e inver-tebrados.

La AQP1 es un homotetrámero y cada subuni-dad tiene un poro para el transporte del agua (Smithy Agre, 1991). La estructura tridimensional de laAQP1 se determinó por primera vez por microsco-pía electrónica a bajas temperaturas. Cada monóme-ro de AQP1 tiene seis alfa hélices que atraviesan labicapa (Li y col., 1997). La mutagénesis de sitiodirigida en las asas que tienen el motivo NPA predijoque estos segmentos formaban el poro ( Jung y col.,1994). De ahí surgió el modelo de ‘‘reloj de arena’’en el cual una asa intracelular y otra extracelularcon el motivo NPA, se proyectan dentro de la bicapaen donde su intersección da lugar a una aperturamuy estrecha (figura 1; Jung y col., 1994).


Figura 1. Representación esquemática de la difusión facilitada delagua por una acuaporina.

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El alineamiento y el análisis filogenético de 164secuencias diferentes de la familia de AQPs revelódos agregados distintos, el agregado de AQPs y el deGLPs (Heymann y Engel, 1999). Las hélices 1 y 4tienen la secuencia conservada ExxxTxxL/F en suamino terminal, mientras que las hélices 3 y 6 mues-tran una periodicidad diferente. Además de los mo-tivos NPA, hay otros residuos que están conservadosen las asas funcionales.

En tanto que las AQPs se encuentran presentesen cualquier organismo vivo, los homólogos de ma-míferos han recibido mayor atención debido a lagran relevancia que tienen estas proteínas en elorigen de ciertas enfermedades. A continuación sedan algunos ejemplos.

Al menos tres AQPs de mamíferos están regula-das por pH, lo cual sugiere la presencia de sensoresde pH en la proteína. Las mutantes naturales de laAQP0 tienen como consecuencia la presencia decataratas congénitas en los ratones (Shiels y Bassnet,1996). La AQP0 se regula por pH: el agua no difundea pH 6.5.

La AQP2 se expresa en las células principalesde los túbulos colectores del riñón. La fosforilaciónpor la proteína cinasa A de la AQP2 regula el tráficode esta proteína. En respuesta a la hormona vasopre-sina, la AQP2 que se encuentra endocitada en ve-sículas, migra hacia la membrana apical para aumen-tar la permeabilidad al agua (Nielsen y col., 1995).

Por último, en las glándulas lagrimales se encuen-tra la AQP5, la cual se ha podido bloquear con ciertospéptidos agonistas, lo que sugiere una estrategia molecu-lar para regular la producción de las lágrimas.

En conclusión, en un lapso de diez años se logróel entendimiento a nivel atómico del funcionamien-to de los canales para el agua, el papel fisiológicode estos canales en los organismos eucariontes yprocariontes, así como su participación en algunasenfermedades. El descubrimiento inesperado de Agrerevolucionó el estudio del transporte del agua y sentólas bases bioquímicas de un área muy importante dela fisiología y la medicina.

Canales de potasioEn 1996 Roderick MacKinnon tomó una decisióntrascendental: se trasladó de la Universidad de Har-vard a la Universidad Rockefeller para intentarcristalizar canales de potasio, a fin de poder obser-var su estructura atómica. A muchos les pareció unalocura; varios de sus colegas trataron de disuadirlo,pero él no lo dudó.

Las membranas celulares de todos los seres vi-vos, desde las bacterias hasta los seres humanos,contienen proteínas especializadas para transportaruna gran cantidad de iones, hasta 10 millones porsegundo. Estas proteínas se denominan canales ióni-

Figura 3. Las acuaporinas forman tetrámeros; por consiguiente, uncanal tiene cuatro poros para el agua. Sólo una de las subunidadestiene un glicosaminoglicano de gran tamaño.

Figura 2. (a) Modelo de la topología de la acuaporina AQP1; (b) Modelode ‘‘reloj de arena’’. Las asas que presentan los motivos conservadosNPA forman el poro selectivo para el transporte del agua en cadasubunidad.

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cos y se agrupan en familias que transportan exclu-sivamente un solo tipo de ión. En el ambiente celu-lar, los únicos iones que se transportan a través deestos canales son el sodio, el potasio, el calcio y elcloruro (denominado cloro por los fisiólogos).

En particular, los canales de potasio controlan elpotencial de membrana en el reposo y la fase de la

repolarización del potencial de acción en las célulasexcitables, y la secreción y reciclaje de potasio en lascélulas no excitables.

Los canales de potasio utilizan mecanismos degating (el mecanismo por el cual se abre y cierra elporo) diferentes. Todos los canales de potasio presen-tan una preferencia o selectividad por los cationesmonovalentes: K+ ≅ Rb+ > Cs+, mientras que el Na+

y Li+ no difunden. El K+ es al menos 10,000 vecesmás permeable que el Na+.

La intuición de la existencia de los canales surgióen los años cincuenta, pero la evidencia experimen-tal al respecto era indirecta y limitada. En los sesenta,se descubrió que la tetrodotoxina, una toxina aisladadel pez globo, bloqueaba a los canales de sodio, loque evidenció la presencia tanto de los canales desodio como los de potasio en las membranas delaxón del calamar. En esa época también, Bertil Hillemidió la permeabilidad de los canales a iones dedistintos tamaños para poder estimar las dimensio-nes del poro (Hille, 1971). Erwin Neher y Bert Sak-man introdujeron en 1976 la técnica de patch-clamp(miden la actividad eléctrica de un solo canal enparches de membrana) para poder estudiar la activi-dad de un solo canal iónico, lo que les valió el premioNobel en Fisiología y Medicina en 1991 (Neher ySakmann, 1976).

Las técnicas de biología molecular posibilitaronimportantes avances en el conocimiento de los cana-les iónicos; entre 1982 y 1984 se obtuvo la secuenciade los aminoácidos de los canales sensibles a acetil-colina y de un canal de sodio.

En 1988 se conocían sólo algunas toxinas quebloqueaban los canales de potasio: la noxiustoxina(NTX) fue la primera toxina aislada por LourivalPossani en 1981, en el Instituto de InvestigacionesBiomédicas de la UNAM (Carbone y col., 1982), y lacaribdotoxina (ChTx), aislada por Chris Miller enla Universidad de Brandeis (Miller y col., 1985).

MacKinnon realizó su posdoctorado con Milleren el estudio de los canales de potasio del músculoesquelético. Estos canales no habían podido purifi-carse por técnicas bioquímicas, como era el casopara los canales de sodio, calcio y el receptor a laacetilcolina.

A finales de los ochenta en el laboratorio de LilyJan de la Universidad de California, se encontró unamutación en el locus Shaker del cromosoma X de lamosca de la fruta (Drosophila). Esta mutación produ-cía moscas con una gran excitabilidad: sus patas sesacudían bajo el efecto de la anestesia con éter. En

Figura 5. Un canal de potasio facilita el paso de un ión K+ en lamembrana ya que lo puede estabilizar en su cavidad acuosa, ygracias a que las α-hélices orientan sus carboxilo terminales haciaesta cavidad.

Figura 4. El canal de potasio KcsA es un tetrámero con cuatro ejesde simetría alrededor del poro. Cada subunidad tiene dos α-hélicestransmembranales conectadas por cerca de 30 aminoácidos, co-rrespondientes a la región del poro.


1987 varios laboratorios obtuvieron fragmentos deADN de este locus, que a su vez sirvieron para poderclonar los primeros canales de potasio (Papazian ycol. 1987). Se comprobó la función de estos canalesclonados, a través del registro de las corrientes en losovocitos de la rana Xenopus laevis. De esta manerasurge el modelo de un canal de potasio, el cualabarcaba seis segmentos transmembranales (S1-S6).Un hallazgo sorprendente fue que el tamaño delcanal de potasio equivalía a una cuarta parte de los otroscanales de sodio y calcio previamente identificados.

La clonación de estos canales en el cerebro dela rata y el ratón se aceleró en varios laboratorios y,en 1989, Walter Stühmer en el Instituto Max-Planckreportó la expresión y la caracterización funcional yfarmacológica de varios de estos canales (Stühmery col., 1989).

En 1988 trabajé con la NTX en el laboratorio deldoctor Lourival Possani en el Instituto de Biotecno-logía de la UNAM.

En 1991 inicié una estancia posdoctoral en ellaboratorio de Roderick MacKinnon, que en eseentonces tenía apenas dos años como investigadorindependiente en el Departamento de Neurobiolo-gía de la Escuela de Medicina de la Universidad deHarvard. Me interesaba entrenarme en electrofisio-logía, a fin de poder estudiar la cinética del bloqueode los canales por las toxinas. Rod acababa dedemostrar en el canal de potasio Shaker que el poroestaba entre los segmentos de membrana S5 y S6. Surazonamiento era simple: si la toxina era un péptidocon residuos de aminoácidos cargados positivamen-te, debía interactuar con residuos del canal cargadosnegativamente. Mutó todos aquellos aminoácidosnegativos que estuvieran en las asas extracelularesen el modelo de la topología del canal para poderubicar la región del poro (MacKinnon y col., 1990).Por otra parte, utilizó de manera ingeniosa mutantesen la región del poro para demostrar, a través de subloqueo diferente con la ChTx, que el canal Shakercomprendía cuatro subunidades homólogas (Mac-Kinnon, 1991).

Rod MacKinnon y Gary Gellen lograron deli-mitar más la región del poro a través del bloqueo conaminas cuaternarias. Rod y Lise Heginbotham, unaestudiante de Doctorado, encontraron que la secuen-cia del poro comprendía treinta aminoácidos ya queésta se encontraba conservada en todas las secuen-cias de canales de potasio hasta entonces reportadas(Heginbotham y col. 1992). Mutaciones en este seg-mento (H5) identificaron a tres aminoácidos (GYG)

que le conferían al canal su selectividad (transporta10,000 veces más potasio que sodio). Este hallazgoexperimental fue la evidencia de la existencia delllamado filtro de selectividad de los canales, previa-mente propuesto por Hodgkin y Keynes en 1955, ypor Bertil Hille y Clay Armstrong a finales de lossesenta.

MacKinnon desarrolló numerosos trabajos ensu laboratorio para identificar los sitios de unión delas toxinas en el vestíbulo del poro extracelular y enlas regiones que modificaban la apertura y cierre(gating) de los canales de potasio (Escobar y col,1993; Gross y col., 1994; Hidalgo y MacKinnon,1995; Ranganathan y col., 1996; Swartz y MacKin-non, 1997). Entre otras contribuciones, propuso unmodelo de la arquitectura del poro y de la localiza-ción espacial del filtro de selectividad, con base enla interacción entre las mutantes de una toxina y lasmutantes del canal Shaker. Una conclusión interesan-te fue que las cadenas laterales en la región del poro,aún los residuos hidrofílicos, influían poco en laselectividad. Lo anterior condujo al postulado de queeran los grupos carbonilo los que participarían en-tonces en la selectividad de los iones.

La identificación del poro del canal facilitó laclonación de numerosos canales de potasio por va-rios laboratorios, incluyendo los de otras familiascomo son los canales de potasio de dos segmentosen la membrana. En 1995 se clonó el canal de potasiode Streptomyces lividans (KcsA). Aunque el KcsA tienesólo dos segmentos de membrana, tiene una granhomología con los canales de potasio de seis segmen-


Figura 6. Arquitectura de un canal de potasio sensible al voltaje(Kv). Imagen espacial de un tetrámero.

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tos de membrana que se activan por el voltaje (Kvs).Varios laboratorios iniciaron la carrera hacia la cris-talización de los canales KcsA.

La técnica actual más eficaz para elucidar laestructura molecular de las proteínas es la difracciónde rayos X. Sin embargo, existen grandes dificul-tades para obtener cristales de proteínas de membra-na suficientemente grandes y de buena calidad. Enparticular, las proteínas de membrana de organis-mos eucariontes parecen ser más difíciles de cristali-zar que la proteínas respectivas de los procariontes.

En un tiempo récord MacKinnon publicó porprimera vez, en marzo de 1998, la estructura tridi-mensional del canal KcsA. La estructura revelócómo las cuatro subunidades idénticas formaban uncono invertido con el filtro de selectividad hacia elexterior con tan sólo 12 Å de longitud. La parteinferior del poro contenía una cavidad llena de agua.En efecto, son los oxígenos del carbonilo los quealinean al filtro de selectividad para coordinar dosiones potasio y otro ión se alberga en la cavidadacuosa (Doyle y col., 1998). La comunidad científicaquedó simplemente maravillada.

Ya que la estructura del KcsA correspondía a uncanal con el poro cerrado, en 2002 MacKinnondescribió la estructura cristalina de un canal de po-tasio de otra bacteria (el canal MthK), pero ahora enuna conformación abierta ( Jiang y col., 2002).

Otra familia de canales de potasio (Kir) puedeconducir a los iones sólo en una dirección (ac-

túan como diodos). Estos canales rectificadores en-trantes se bloquean por iones magnesio y por polia-minas que entran al canal desde el citoplasma cuan-do ocurre una despolarización de la membrana.MacKinnon estudió sólo los dominios intracelularesde un canal Kir que se activa por proteínas G y queparticipa de manera muy importante en la disminu-ción de la frecuencia cardíaca. Demostró a partir desu estructura cristalina que estas proteínas unidasforman un poro en el citoplasma (Nishida y MacKin-non, 2002).

Los canales de potasio hasta ahora descritos notienen el sensor de voltaje: el dominio hidrofóbicoen el segmento S4 con cuatro y hasta siete residuosde arginina con cargas positivas, que se mueve conlos cambios de voltaje en la membrana. Después decinco años de intentos fallidos, MacKinnon y sugrupo decidieron utilizar fragmentos de anticuerpospara ayudar a la cristalización de un canal de potasio,el KvAP, de la arqueobacteria Aeropyrum pernix, quecrece a temperaturas cercanas al punto de ebulliciónde las aguas termales. La estructura de rayos X delcanal KvAP muestra los segmentos de membranaque forman el canal. En contra del modelo vigente,donde el sensor de voltaje se localizaba dentro de laparte interna de la proteína, la estructura del sensorde voltaje S4 junto con una sección del segmento S3forman una α-hélice, una especie de palanca muyflexible que sale del interior del canal hacia la mem-brana ( Jiang y col., 2003). Esto explica cómo peque-ñas moléculas solubles en lípidos pueden unirse a lossensores de voltaje de varios canales iónicos. Estasmoléculas pueden ser anestésicos locales, alcaloidese insecticidas como el DDT.

Además de todos estos trabajos impresionantessobre la estructura y funcionamiento de los canalesde potasio, MacKinnon y su grupo lograron cristali-zar dos canales de cloro también de bacterias. Con-firmaron trabajos previos de otros investigadoresque sugerían que este canal tenía dos subunidades,cada una con su propio poro (Dutzler y col., 2002).Aún se desconoce el papel biológico de estos cana-les, pero en los vertebrados se han establecido variasfunciones importantes. En el músculo los canales deCl-- estabilizan el potencial de membrana en el repo-so y regulan su excitabilidad. En el riñón, los canalesde Cl-- se acoplan al funcionamiento de transporta-dores de Na+, K+ y Cl-- y con canales de K+ en el flujoy transporte a través de los epitelios.

La comunidad científica ha quedado extasiadano sólo con los resultados de la estructura de los

Figura 7. Con la estructura de rayos X del canal KvAP se actualiza el modelopreviamente propuesto. Un Kv presenta un sensor que responde a las diferencias delvoltaje en las membranas celulares para abrir el poro.


canales iónicos, sino con la genialidad de MacKinnon.Sus aportaciones abren nuevas posibilidades para elestudio de estas proteínas de membrana, además deque sientan las bases para la comprensión de muchasenfermedades neurológicas, musculares, cardiacas yrenales, y para el diseño de nuevos fármacos.

A la fecha nadie más ha podido cristalizar estoscanales. Cuando se le pregunta a qué se debe suéxito, simplemente contesta: ‘‘determinación y pa-sión. Cuando se está apasionado por lo que haces,es fácil poner atención en todos los detalles’’. Pero eléxito requiere de mucha paciencia y cuidados. Loscanales iónicos necesitan extraerse de las membra-nas biológicas junto con sus lípidos y cristalizarseantes de que se separen. Por fortuna, su experienciacomo electrofisiólogo le ha dado las herramien-tas, como es el conocimiento de cómo se unen lastoxinas a sitios específicos de los canales.

Hay muchos factores que han llevado a MacKinnonal éxito. Pero principalmente su valor para aprendery aplicar de manera magistral técnicas nuevas. ?

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