(

Ariadna Berenice Trejo Raya A01163207 María Alejandra García Alcaraz A01167481

María Elena Mendoza Acosta A01163564 Mario Alfonso Arenas García A01162581

Natalia Martínez Balderas A01163759

Dr. César García Díaz

2014

Tecnológico de Monterrey

Campus Estado de México

Laboratorio de

Bioprocesos

Práctica V

Cultivo por Lote

1. Resultados

El microorganismo empleado para la realización del cultivo en lote fue E. coli transformado con un plásmido que contiene GFP (Green Fluorescent Protein). Se dejó crecer la bacteria por 19 horas con la finalidad de poder obtener su cinética de crecimiento.

1.1 Crecimiento de la Biomasa Se registró la densidad óptica (O.D, por sus siglas en inglés) tomando muestras cada

dos horas (aproximadamente); cumpliendo con 9 tomas en total. La tabla 1.1 muestra

los datos del logaritmo natural de O.D con relación al tiempo.

Tabla 1.1 Datos de Ln [O.D] con relación al cambio en el tiempo.

Tiempo (min) Ln [Absorbancia]

0 -3.270169119

210 -2.103734234

330 -1.814005078

435 -1.127011763

555 -0.182721637

705 0.455524308

855 0.455524308

1005 0.393392527

1140 -3.270169119

De estos datos, se realizó la gráfica I; la cual establecida como el Ln [O.D] en el

eje y con respecto al tiempo (eje x). La tasa de crecimiento es el cambio en el número

de células por minuto, estimado como el cambio de O.D por minuto en este caso.

El cambio instantáneo es dado en función del número de células que están

presentes en cualquier momento, el cual es representado por la siguiente ecuación

(Ec. 1):

𝑑𝑁

𝑁= 𝜇𝑡

Donde N es la cantidad de células en el tiempo t, y μ es la constante de la tasa de

crecimiento (unidades en este caso de min-1). (Hall et al, 2013)

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

0 200 400 600 800 1000 1200

Ln [

O.D

]

Tiempo (min)

Ln[O.D] vs Tiempo

Gráfica I. Comportamiento de Ln [O.D] en relación al

tiempo (min).

Al integrar la previa ecuación mencionada, evaluando desde t =0 y t =T, la relación

es (Ec. 2):

ln [𝑁𝑇

𝑁0⁄ ] = 𝜇(𝑡 − 𝑡0)

De esto, la pendiente de la gráfica de Ln [N] en función de t es μ. En base a ello, se

utiliza la pendiente de Ln [O.D] en función de t para poder obtener μ, pero solo

empleando la parte lineal de la gráfica que corresponde a la fase exponencial del

crecimiento. (Ver gráfica II.)

De la regresión lineal realizada en la gráfica II, se obtiene la siguiente ecuación (Ec. 3):

𝑦 = 0.0053𝑥 − 3.3268

De ello, se calcula que 0.0053 min-1 corresponde a μ. Para la obtención del tiempo de duplicación (tD), se emplea (Ec. 4):

𝑡𝐷 = ln2𝜇⁄

Esto da un tiempo de duplicación de 130.78 minutos.

1.2 Efecto de la Concentración de Sustrato

El análisis de la concentración de sustrato (glucosa) se realizó mediante el uso de una

curva de fenol-ácido sulfúrico (gráfica III). En base a dicha curva, se obtuvo una

regresión lineal (Ec. 5) para la determinación de la concentración de glucosa a través

del tiempo para las muestras obtenidas durante el intervalo de 19 horas.

y = 0.0053x - 3.3268R² = 0.9766

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 100 200 300 400 500 600

Ln [

O.D

]

Tiempo [min]

Fase Exponencial del Crecimiento

Gráfica II. Regresión lineal del crecimiento en la fase

exponencial.

La ecuación obtenida a partir de la gráfica III es la siguiente (Ec. 5):

𝑦 = 0.0065𝑥 − 0.0238

Mediante el uso de la ecuación 5, se obtuvieron las concentraciones de glucosa

(ver tabla 2) y con ello se realizó una gráfica (IV) en la cual se puede observar la

relación de la concentración de sustrato con el paso del tiempo.

Tabla 1.2 Datos de concentración de glucosa con respecto al tiempo

Tiempo (min)

Concentración (μg/ml)

Concentración Real (ug/ml)

0 239.9692308 10000

210 388.2769231 9706.923077

330 302.8923077 7572.307692

435 218.2769231 2182.769231

555 217.5076923 2175.076923

705 230.5846154 2305.846154

855 194.7384615 1947.384615

1005 131.3538462 1313.538462

1140 101.4307692 1014.307692

y = 0.0065x - 0.0238R² = 0.9975

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 100 200 300 400 500

Ab

sorb

anci

a

Concentración (μg/ml)

Curva Tipo Fenol-Ácido Sulfúrico

Gráfica III. Curva fenol-ácido sulfúrico con regresión

lineal.

La pendiente de la gráfica de concentración la cual está en función de t es la

velocidad de consumo de sustrato. En este caso, se usa solamente la parte lineal de la

gráfica IV para poder calcular la velocidad de consumo de sustrato; asimismo, este

segmento corresponde a la fase exponencial del microorganismo. (Ver gráfica V.)

En la Gráfica V, se realizó una regresión lineal donde se obtuvo que la velocidad de consumo es de 1984.2 μg·ml-1·h-1 (1.984 mg·ml-1·h-1); y la ecuación que explica dicho comportamiento corresponde a la ecuación 6 (Ec. 6):

𝑦 = −1984.2𝑥 + 17235

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 200 400 600 800 1000 1200

Co

nce

ntr

ació

n [μ

g/m

l]

Tiempo [min]

Concentración vs Tiempo

Gráfica IV. Relación de concentración de glucosa al

paso del tiempo.

y = -1984.2x + 17235R² = 0.9219

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Co

nce

ntr

ació

n [μ

g/m

l]

Tiempo [h]

Velocidad de consumo

Gráfica V. Velocidad de consumo de glucosa de E.

coli con GFP.

Aunque la velocidad de consumo tiene un signo negativo, esto corresponde a que

denota que la concentración va disminuyendo.

2. Discusión

El cultivo en lote (o batch) se caracteriza por el crecimiento de microorganismos en un

volumen fijo de nutrientes inicial. Dicha cantidad es alterada conforme es usado por el

microorganismo hasta que es agotado. Por otro lado, dicho método de cultivo no

presenta intercambio de materia con su alrededor. (Quiroga, 2010)

Cabe mencionar que en este tipo de cultivo las condiciones irán cambiando a

medida que proceda la reacción; normalmente a medida que las condiciones

nutricionales cambian, la velocidad de crecimiento disminuye.

Las ventajas del uso de un cultivo batch es que se tiene un mejor control sobre el

riesgo de contaminación al igual que sobre el crecimiento del microorganismo. Sin

embargo, puede existir una inhibición por altas concentraciones de sustrato y puede

haber improductividad en la operación del fermentador. Por otro lado, el crecimiento no

restringido puede desencadenar una serie de cambios en el medio de cultivo como la

limitación de oxígeno y cambios de pH, al igual de que las vías metabólicas se saturan

generando acumulación de productos inhibitorios en el medio. (Menzella, 2013)

Considerando el microorganismo utilizado (E. coli que genera GFP), se estipula

que el tiempo de duplicación para la gran mayoría de las cepas de E. coli es de entre

20 y 30 minutos. (Expression Technologies, 2003) Sin embargo, de acuerdo a un

estudio realizado por Siak-Wei, Morin y colaboradores (2005); reportan que las tasas

de crecimiento (entre ellas el tiempo de duplicación) es mayor en microorganismos

que tienen plásmidos que aquellos que no los tienen (se usó E. coli cepa DH5α, con y

sin el plásmido NS3).

El tiempo de duplicación se estimó en 130 minutos, el cual está por encima del

rango de 20-30 minutos que ocurre a una temperatura de 37°C (Srivastava, 2003).

Esto puede ser debido a que, como previamente mencionado, se deba a que este

modificado para poder generar GFP; ya que su tasa de crecimiento es menor. Otras

consideraciones a tomar son (Microbial Physiology, s.f.):

Concentraciones de nutrientes

Temperatura y pH del sistema

Efecto de O2 en el sistema

En todos los casos, el biorreactor no pasaba de los parámetros óptimos de

operación para poder tener un crecimiento óptimo de la bacteria; los cuales fueron de

500 RPM, 1 vvm de aireación, temperatura a 37°C a un pH de 7. Puede ser que el

elevado tiempo de duplicación se deba a que se trate de un microorganismo

modificado; como explica Siak-Wei y colaboradores (2005).

Por otro lado; Soria, Flores y colaboradores (2009) reportan una velocidad de

consumo de glucosa (en este caso el sustrato) de 4.91 g·l-1·h-1 para E. coli MG1655 o

4.69 g·l-1·h-1 en la cepa JM101. Esto al reportarse en base a las unidades presentadas

en el segmento de resultados, sería de 4.91 mg·ml-1·h-1 y 4.69 mg·ml-1·h-1

respectivamente. Al contrastarlo con el valor obtenido, se observa que es

aproximadamente tres veces menor el valor de la práctica en contraste con el

reportado por la literatura. Esto en parte podría explicar el tiempo de duplicación

elevado en contraste con el que se reporta ampliamente (20-30 minutos), ya que

consume poca glucosa.

Es importante destacar que las velocidades de consumo de sustrato pueden variar

de acuerdo a la cepa empleada al igual que las operaciones del sistema; sin embargo,

los resultados de Soria y colaboradores (2009) fueron hechos en un proceso tipo lote y

en condiciones óptimas; por lo que se asemejan a las condiciones de la práctica.

3. Conclusión

Ariadna Berenice Trejo Raya

Durante la realización del presento ensayo de cultivo en lote utilizando E. coli cepa

DH5α, bajo las condiciones que establece el protocolo de la práctica presente, se

pudo observar la obtención de tiempos de duplicación mayores a los esperados;

resultado que probablemente sea gracias a la naturaleza de la cepa y condiciones de

operación propias del ensayo. Para determinar la relación entre el tipo de cepa y los

tiempos de duplicación elevados, es necesaria la realización de más estudios.

Para la determinación de la consumo de sustrato se realizó una curva de

calibración para Fenol-sulfúrico, la cual ayudó a la determinación de las

concentraciones; el uso y correcta realización de la misma determina en gran medida

la sensibilidad del ensayo realizado.

La correcta elección y uso de los método analíticos durante la caracterización de

un ensayo es de gran importancia, y determina la sensibilidad, reproductibilidad y

exactitud de los resultados obtenidos.

María Alejandra García Alcaraz

En esta práctica se obtuvieron valores lejanos a lo esperado, debido a que durante el

ensayo no se hizo uso de los parámetros adecuados y sobre todo las muestras se

estuvieron congelando y descongelando durante un largo periodo. Este factor también,

alteró la curva de crecimiento ya que el microorganismo de las diferentes muestras no

se eliminó por completo y siguió creciendo, cabe mencionar que las etapas o fases de

la curva de crecimiento dependen del tipo de microorganismo que sea utilizado.

Finalmente, este tipo de ensayo debe realizarse en un mismo día, pues el hecho

de estar congelando y descongelando las muestras altera los valores tanto de la curva

de calibración con fenol-sulfúrico y DNS, en otras palabras la sensibilidad del ensayo

se ve afectada. Además, el cultivo en batch al no poder controlar ciertos parámetros

del reactor se crea una inhibición en el proceso por acumulación de producto.

María Elena Mendoza Acosta

En un cultivo tipo lote el crecimiento celular se auto limita debido a la no adición de

nuevo medio de cultivo; lo cual permite un buen manejo de esterilidad y he ahí su

aplicación en diversas industrias.

Los valores encontrados indican que, en general, E. coli cepa DH5α, bajo las

condiciones ideales es más sensible que una cepa no transformada. Esto se definió a

partir de la obtención de un tiempo de duplicación más grande y por lo tanto una

velocidad de consumo de sustrato más lento que el de E.coli no transformada.

Tanto el buen manejo del ensayo, en cuanto a buenas prácticas de laboratorio

refiere, como la utilización correcta de los métodos analíticos es imprescindible; ya que

estos últimos permiten generar información que posteriormente será interpretada.

Se recomienda realizar una prueba de peso seco para la obtención de nuevos

valores de velocidad de crecimiento y así corroborar los datos obtenidos.

Mario Alfonso Arenas García

La significante diferencia entre los resultados obtenidos y los reportados por la

literatura puede ser debida en parte a que se trata de una cepa genéticamente

modificada (ya que genera GFP). Sin embargo, otra causa puede ser a la edad del

cultivo de E. coli, ya que si lleva mucho tiempo guardado esto también puede afectar el

desarrollo del mismo.

No obstante, no se le puede atribuir estas diferencias a un control indebido a las

condiciones de operación, ya que no se observó en ningún momento que hubiese

problemas significantes y se encontraban dentro de los rangos óptimos de crecimiento

para E. coli. Esto, sin embargo, no impidió observar el comportamiento generalizado

visto en un cultivo tipo lote; ya que de todas formas se podía observar la tendencia de

consumo de glucosa y el crecimiento de E. coli.

Finalmente, es importante destacar que hubo problemas para poder obtener los

pesos secos de las muestras; por lo que impide realizar un mayor análisis sobre los

datos. Cabe mencionar que se tiene que mejorar las prácticas de laboratorio para

poder evitar dichos problemas a futuro.

Natalia Martínez Balderas

La realización de esta práctica permitió conocer el procedimiento a seguir para lograr

una fermentación por lote, desde la preparación del equipo y del medio para su

esterilización como del inóculo. Así mismo, permitió observar los efectos de los

parámetros utilizados para el cultivo, en este caso E. coli, a trabajar.

Con respecto a los resultados obtenidos, donde el tiempo de duplicación de 130

minutos es mucho mayor que el reportado por la literatura de 20-30 minutos se puede

atribuir al hecho de que se trabajó con una cepa modificada (DH5α), lo cual ocasionó

que su comportamiento de crecimiento fura diferente al de una cepa no mutada.

La velocidad de consumo se vio afectada por el factor antes mencionado, pues al

crecer de una forma lenta, el sustrato se consume lentamente, esto se hace evidente

al comparar el tiempo de duplicación obtenido experimentalmente, en el orden de

microgramos, contra la información reportada en la literatura que se encuentra en el

gramos.

Por lo tanto, se puede concluir que a pesar de que las condiciones se mantengan

en un rango óptimo para la especie con la que se trabaja, el tiempo de crecimiento y la

velocidad de consumo de sustrato depende de que si la cepa está modificada o no,

pues el microorganismo se encuentra afectado por las características ajenas a sí

mismo.

4. Fuentes de Información

Expression Technologies Inc. (2003). “Bacterial E. coli Growth Media.” Obtenido el 17

de marzo de 2014 de:

http://www.exptec.com/Expression%20Technologies/Bacteria%20growth%20media.ht

m

Hall, B. G.; Acar, H.; Nandipati, A. y Barlow, M. (2013). “Growth Rates Made Easy.”

Molecular biology Evolution. DOI: 10.1093/molbev/mst187

Menzellas, H. (2013). “Tipos de cultivos Producción de proteínas recombinantes en E.

coli”. Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:

http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/103635/mod_resource/content/1/Cla

se%2011.pdf

Microbial Physiology. (s.f.) “Bacterial Growth, Environmental Effects and Strategies.”

Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:

http://trishul.sci.gu.edu.au/courses/bbs2710/Module2.pdf

Quiroga, A. (2010). “Optimización del Cultuvo de Escherichia coli para la Producción

de Cutinasas Recombinantes.” Obtenido el 19 de marzo de 2014 de:

http://tesis.uchile.cl/bitstream/handle/2250/111529/cf-quiroga_ac.pdf?sequence=1

Siak-Wei O., D.; Morin N., P.; Philp, R.; Kah-Weng Oh, S. y Gek-Sim Y., M. (2006).

“Global transcriptional analysis of metabolic burden due to plasmid maintenance

in Escherichia coli DH5α during batch fermentation.” Elsevier - Enzyme and Microbial

Technology. Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022906001086

Soria, S.; Flores, N.; Castillo-España, P.; Gosset, G.; Bolivar, F. y Báez-Viveros, J. L.

(2009). “El Efecto de la Inactivación de la ATP Sintasa sobre las Velocidades

Esecíficas de Crecimiento y de Consumo de Glucosa en Escherichia coli.” XIII

Congreso Nacional de Biotecnolgía y Bioingeniería. Obtenido el 18 de marzo de 2014

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http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/AREA_VI/CVI-

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Srivastava, S. (2003). “Chapter 5 Bacteria and Life Processes - I Growth and

Multiplication. 5.1 Population Growth.” Understanding Bacteria. (pp. 97-98). Paises

Bajos: Kluwer Academic Publishers. Obtenido el 17 de marzo de 2014 de:

http://books.google.com.mx/books?id=7bFdrHln8FwC&printsec=frontcover#v=onepage

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