prÁctica riboflavina

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PRÁCTICA 1 COLORIMETRÍA: ANALISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE LA VITAMINA RIBOFLAVINA La colorimetría es una de las técnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de Bioquímica y otras disciplin as científicas. Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela monocromática a traés de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente. FNDAMENTO La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está relacionada con el paso óptico de la cubeta que contiene la solución y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos relaciones están combinadas en la l!y "! La#$!%t&B!!%: Log Io/I = A = ε · C · l en donde I' e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectiamente! l el paso óptico "cm#! C la concentración molar de la especie absorbente "moles$litro# y ε el coeficiente de absorción molar "%&'cm&'#. El término Log (o$( se denomina a$('%$ancia y se designa por A. )i*ando el paso óptico "habitual mente ' cm# resulta que la absorbancia + es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente. El coeficiente de absorción molar aría con la naturaleza del compuesto absorbente! el disolente! la longitud de onda y con el p,. La aplicación obia de la ley de Lambert&Beer es el uso del colorímetro para determinar la concentración de una gran ariedad de moléculas que absorben luz " p.e. carotenos! clorofila! hemoglo bina! etc#. La técnica se e-tiende a sustancias no coloreadas como azcares o aminoácidos después de alguna reacción capaz de conertir sustancias incoloras en deriados coloreado s. Los espectros de absorción! gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda! son frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e identificaci ón de biomoléculas. En esta práctica se realizará un sencillo análisis espectrofotométrico de la itamina %i$')lavina que consistirá en: obtención del espectro de absorción y construcción de una recta patrón para erificar la ley de Lambert&Beer! cálculo del coeficiente ε y determinación de la concentración de riboflaina de en una muestra /problema0. MATERIALES * REACTIVOS 1ampón fosfato potásico 23 m% p, 4.3 "25 ml# 6isolución de riboflaina 53 µ% en tampón fosfato 23 m% p, 4.3 "25 ml# 7olorímetro y cubetas desechables 8ipetas automáticas 97ómo se preparan estos reactios: 97ómo funcionan las micropipetas automáticas: ;ué son las cubetas desechables 7ómo funciona el colorímetro

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7/21/2019 PRÁCTICA Riboflavina

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7/21/2019 PRÁCTICA Riboflavina

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PROCEDIMIENTO

A+ O$t!nci,n "!l !(-!ct%' "! a$('%ci,n "! %i$')lavina:

1. <ealizar medidas de absorbancia de la disolución de riboflaina! tomando unaalicuota de 2 ml! en el interalo de longitudes de onda "/# comprendido entre =>3 y5'3nm a interalos de '3 nm.

1+BL+ '.&

/ "nm#  +bsorbancia / "nm#  +bsorbancia

=>3 >=3

=53 >>3

=?3 >53

=43 >?3

=@3 >43

=A3 >@3>33 >A3

>'3 533

>23 5'3

B+ C'n(t%ui% la %!cta !(t0n"a% ' %!cta -at%,n -a%a la Ri$')lavina1. + partir de la disolución madre de <iboflaina preparar en tubos desechables de '3ml una serie de ? disoluciones tal como se indica en la tabla siguiente y medir laabsorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda en la que se hayaobtenido el má-imo de absorción en el espectro del apartado anterior 

TABLA .&Tu$'n2#!%'

A$('%$ancia Ri$')lavina 345 6M+#L

Ta#-,n )'()at' 35 #M+7 #L

8Ri$')lavina96M

1 5 4 1 ; ; ; 4 1< 4 5= D!(c'n'ci"a

3Tu$' >+

RESLTADOS * ANÁLISIS DE LOS MISMOS

1. 6ibu*ar en papel milimetrado el espectro de absorción representando A frente a /.

. eñalar el má-imo de absorción a partir del espectro y calcular para ese alor.

 9,ay algn otro alor eleado: 97uál es el alor de C en ese caso:;. 7alcular las concentraciones D% de <iboflaina e incluirlas en la ltima columna dela 1abla 2.. 7onstruir la recta patrón representando los alores de +bsorbancia obtenidos a lalongitud de onda a la que aparece el má-imo de absorción frente a las concentracionesde <iboflaina incluidas en la 1abla 2.

4. 6eterminar por interpolación en la recta patrón la concentración de la disolución de<iboflaina contenida en el tubo .

7/21/2019 PRÁCTICA Riboflavina

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<. 7alcular a partir de la recta patrón de <iboflaina.