PRACTICA N 3

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA LECHE DE VACA

Objetivo.

El objetivo de esta práctica es la separación de las principales proteínas de la leche de vaca, empleando para ello técnicas basadas en el punto isoeléctrico, precipitación por salado y desnaturalización por calor.

Introducción.

El conocimiento actual del comportamiento de las proteínas como solutos en los sistemas acuosos, se basa en estudios físico-químicos. Las proteínas son macromoléculas de peso molecular bien definido que forman verdaderas disoluciones moleculares y son electrólitos cuyo comportamiento se rige por los mismos principios físicos que los electrólitos pequeños.

Tras el parto, todas las hembras de cualquier especie de mamíferos segregan leche destinada a nutrir a su prole. El 5% del nitrógeno total de la leche está representado por substancias nitrogenadas no proteícas y el 95% por proteínas.

El contenido proteíco de la leche está constituido por un 78% de caseína; 22% de albúminas y 3.3% de globulinas, 4.0% de proteasas y peptonas del total de proteínas. Las proteínas de la leche se encuentran distribuidas en micelas de unas 10mu de diámetro. Forman un sistema coloidal de gran estabilidad, sensible solo a la disminución notable del pH y a determinadas enzimas que las precipitan y coagulan.

El pH del sistema tiene gran influencia sobre la solubilidad de las proteínas globulares, debido a que la superficie de las proteínas posee una carga eléctrica que depende del pH. Aquel pH al cual, una proteína muestra un mínimo de solubilidad, es su pH isoeléctrico, definido como aquel valor de pH al cual la molécula no posee carga eléctrica neta y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas vecinas y tienden a coalecer y precipitar, sin embargo, cuando los valores de pH están por encima o por debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de proteína poseen una carga eléctrica neta del mismo signo, de esa manera se repelen mutuamente y no precipitan.

Puesto que una proteína determinada posee un valor de pH isoeléctrico característico y propio de ella, y debido a que las proteínas difieren en el contenido de amino ácidos con grupos R ionizables, con frecuencia, pueden separarse unas de otras mediante la precipitación isoeléctrica: al ajustar el pH de una mezcla de proteínas al pH isoeléctrico del componente que nos interesa, éste, precipitará quedando en la disolución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico se hallen por encima o por debajo de aquel. La proteína isoeléctrica precipitada permanece en su conformación nativa y puede redisolverse en un medio de pH apropiado y concentración salina adecuada aunque hay también

proteínas que son virtualmente insolubles en sus pH isoeléctricos.

La solubilidad de los solutos ionizables como las proteínas, se modifica intensamente por la presencia de otros iones. Cada proteína (o electrólito) en solución se encuentra rodeado de una "atmósfera iónica" de iones de carga opuesta y esta atmósfera iónica puede modificar grandemente la solubilidad de otra sustancia iónica dada. Los efectos de las sales neutras sobre la solubilidad de las proteínas depende de la fuerza iónica de la solución.En general, la solubilidad de un electrólito o una proteína aumenta por la presencia de fuerzas iónicas relativamente bajas de sales neutras, en tanto que, las sales neutras con fuerzas iónicas muy altas, disminuyen la solubilidad de una sal o de una proteína. El efecto facilitador de las sales neutras sobre la solubilidad se llama: "solubilización salina" o "salting in", en tanto que la disminución de la solubilidad en caso de fuerzas iónicas elevadas constituye la "precipitación salina" o "salting out". Al aumentar la concentración de la sal, ésta desplaza al agua, que se transforma en agua de hidratación alrededor de los iones cargados de la sal. Esto provoca la formación de agregados proteínicos que precipitan.

Las proteínas globulares nativas experimentan desnaturalización y producen conformaciones desplegadas y al azar de sus cadenas polipeptídicas, cuando se someten a calefacción. Dentro de una fluctuación limitada entre los 0 y los 40C aproximadamente, la solubilidad de las proteínas globulares aumenta al aumentar la temperatura. Por encima de los 40 y 50C, la mayor parte de las proteínas aumentan en inestabilidad y comienzan a desnaturalizarse, generalmente con pérdida de solubilidad en la zona neutra del pH.

Material Reactivos- 500 ml de leche de - Acido clorhídrico al 2% descremada (PIL) - Eter sulfúrico- Papel celofan - Alcohol etílico al 95% - Nitrato de plata al 1% - Sulfato de amonio cristalizado - Buffer PBS pH 7.4 - Cloruro de bario al 10% - Acetona p.a.Procedimiento.

1 Sesión: Obtención de la caseína- Diluir 50 ml de leche de vaca descremada con 150 ml de agua de la pila.-Añadir lentamente, gota a gota y agitando constantemente entre 2 y 4 ml de ácido clorhídrico al 2%, hasta que el pH esté en 4.8 (midiendo con pH metro). Si se observa con cuidado se nota el punto en el cual empieza a precipitar la caseína. Obtener el máximo precipitado posible.- Agitar vigorosamente durante 10 minutos. Centrifugar durante 7 a 10 minutos a 3500 rpm.- Decantar y guardar el sobrenadante bien identificado y tapado en frío para la "Segunda Sesión" de la práctica.- Resuspender los precipitados de todos los tubos de la centrífuga utilizando agua destilada y filtrar a través de 2 capas de papel filtro.

-Después de 2 lavados con agua destilada, obtener 1 ml del líquido filtrado y colocar en un tubo de ensayo para la prueba de cloruros:Prueba de Cloruros:

- Colocar 1 ml del filtrado mas 1 ml de nitrato de plata al 1%. Agitar, si se observa un precipitado o una turbidez blanca, la prueba es (+). Si no se observa ningún cambio, la prueba es (-).- Se sigue con los lavados con agua destilada, hasta reacción negativa a los cloruros. No debe cambiarse el papel filtro, sólo remover cuidadosamente el precipitado con una varilla, teniendo la precaución de no romper el papel.- Una vez eliminados los cloruros del residuo, en el mismo papel: Lavar una vez con 20 ml de etanol 95%- Lavar una vez con 20 ml de acetona p.a.- Lavar una vez con 20 ml de éter etílico, teniendo cuidado.- Pasar el residuo del papel filtro a un vaso de precipitados de peso conocido utilizando una varilla y una mínima cantidad de alcohol, y secar a 40 C en una estufa.- El producto (polvo blanco) pesar en una balanza y anotar el dato para sacar el rendimiento.- Enseguida preparar una solución al 1% en acetato de sodio 0,1 M, guardar en un frasquito rotulado y en frío para la práctica N 5.

2 Sesión: Obtención de la b-lactoglobulina y alfa-lactoalbúmina, proteasas y peptonas.

NOTA. Todos los subgrupos deben reunir los sobrenadantes obtenidos.

a) Beta Lacto Globulina.

El sobrenadante obtenido en la precipitación isoeléctrica de la caseína sirve de base para esta práctica. Calcular la cantidad de sulfato de amonio necesario para precipitar las globulinas. Teniendo en cuenta que la B-lactoglobulina precipita a 45% de saturación. Realizar el siguiente cálculo:

533 (S2-S1) G = ------------ , donde: S2 = Saturación final 100 - 0,3 S2 S1 = Saturación inicial G = g de sulfato de amonio para 1 litro de solución.

- Medir 10 ml del sobrenadante obtenido del precipitado de las caseínas y agitando constantemente añadir la cantidad necesaria de sulfato de amonio. Dejar reposar unos 30 minutos, centrifugar (15 minutos a 3500 rpm), el sobrenadante guardar utilizar para la obtención de alfa lactoglobulinas. - Resuspender el precipitado en buffer PBS pH 7,4 con no más de 2 ml, dializar contra el mismo buffer cambiando el líquido de diálisis 2 veces al día, hasta reacción negativa para sulfatos:

Prueba de sulfatos:

1 ml del líquido de diálisis mas 1 gota de ácido clorhídrico 2% mas 1 gota de cloruro de bario al 10%. Si se observa turbidez blanca, la prueba es (+); si no se observa ningún cambio, la prueba es (-).

- Una vez eliminados los sulfatos, vaciar de la bolsita de diálisis la proteína precipitada a un tubo etiquetado con los datos necesarios y guardar en frío para la práctica N4

b) Alfa Lacto Albúminas.

El sobrenadante obtenido en la precipitación salina de la beta lacto globulina, sirve de base para esta práctica. Calcular la cantidad de sulfato de amonio necesario para precipitar las albúminas, teniendo en cuenta que la alfa-lactoalbúmina precipita a 60% de saturación. Realizar el siguiente cálculo:

533 (S2-S1) G = ------------ , donde: S2 = Saturación final 100 - 0,3 S2 S1 = Saturación inicial G = g de sulfato de amonio para 1 litro de solución.

- Medir el sobrenadante obtenido del precipitado de la beta lacto globulina, y agitando constantemente añadir la cantidad necesaria de sulfato de amonio. Dejar reposar unos 30 minutos, centrifugar (15 minutos a 3500 rpm), el sobrenadante guardar para su utilización en la obtención de proteasas y peptonas. - Resuspender el precipitado en buffer PBS pH 7,4 con no más de 2 ml, dializar contra el mismo buffer cambiando el líquido de diálisis 2 veces al día, hasta reacción negativa para sulfatos.

c) Proteasas y Peptonas.

El sobrenadante del paso b), colocar en tubos de ensayo y calentarlos en baño María a ebullición. Observar lo que ocurre. El precipitado contiene proteasa y peptonas.

Resultados.

Hallar el rendimiento de la purificación de la caseína en base a la siguiente fórmula:

gramos de caseína obtenida x 100 %R = ------------------------------------------ ml de leche

- Anotar las características organolépticas de la b-lactoalbúmina y b-lactoglobulinas, así como la cantidad aproximada que se ha obtenido.- Comparar con la bibliografía.

Temas de estudio