PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

“GFP”

COLMENERO, E. , MARTÍN, C.M, MARTÍN, M.CMUPES 2015/16

Metodología de la práctica

• Flipped Classroom: se realiza siguiendo el modelo de clase invertida.

• Primero se realiza la práctica con los alumnos y al día siguiente se observan los resultados y se explica la teoría asociada y el objetivo de la práctica.

Material necesario Placa de cultivo sembrada con

E.Coli Un par de asas de siembra Un par de turundas Un vaso con hielo y una

esponja para colocar los micro tubos

Un vaso cubierto por papel de cocina para verter los desechos

Dos microtubos con solución de transformación (CaCl2)

Dos microtubos con el caldo LB

Un micro tubo con el plásmido pGLO

3 placas de cultivo con: agar , agar + ampicilina y agar+ arabinosa +ampicilina

Protocolo• Resuspender las bacterias en

solución de transformación. ( Empleando el asa de siembra AZUL a partir de la placa con colonias aisladas de E.Coli HB101, coger 2-3 colonias para cada tubo marcado con “+” y “-” que contiene 250 µl de solución de transformación)

• Mantener los tubos en hielo

• Añadir plásmido pGLO a las bacterias resuspendidas en el tubo “+”. (Con ayuda del asa de siembra amarilla y de la solución del plásmido proporcionado por el profesor)

• Poner los tubos en hielo durante 10´-15´

Protocolo• 5. Choque térmico a 42ºC durante 50´´ y

retornar al hielo durante 2´.

• 6. Añadir LB e incubar a 37º. Añadir 250µl de LB líquido desde los tubos marcados como “LB” e incubar a 37º durante 10´´ con agitación.

• 7. Sembrar las placas empleando las 2 turundas y sembrar desde cada tubo marcado con “+” y “-” a las placas LB, LBA, LBAA e incubar a 37º O/N.

• 8. Al día siguiente observar los resultados

Resultados observados• Se observan las 3 placas que sembramos

con el “+” y el “-” en el agar que contenía caldo LB, LB y ampicilina y LB con ampicilina y arabinosa

• En la placa marcada en negro que contenia LB han proliferado libremente colonias de la bacteria por toda la placa.

• En la placa marcada en rojo que contenía LB y ampicilina como antibiotico solo han crecido colonias aisladas en la parte “+” debido a la barrera de selección que permite solo que crezcan aquellas bacterias que han incorporado el pGLO y su resistencia a la ampicilina.

Resultados observados• En la placa marcada en

azul que contenía LB con ampicilina y arabinosa se observan algunas colonias aisladas en la parte “+”.

• Estas colonias presentan fluorescencia verde al iluminarlas con una fuente de luz UV debido a la expresión del ADN del plásmido inducida por la arabinosa.

Objetivo de la práctica

• Transformación genética de la bacteria E.Coli en una bacteria fluorescente al incorporar en su ADN un gen que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP) utilizando como transmisor del gen un plásmido pGLO.

Teoría que queremos trabajar con la práctica

• Bacterias• Plásmidos• ADN• OMG• Transformación bacteriana