Obtención de bacterias transgénicas mediante Ingeniería genética.

Autora: Martina Escorial García Tutoras: Mª Rosario Iglesias Álvaro y Teresa Martín Bayón. IES Andrés Laguna. Facultad de Ciencias. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología Universidad de Valladolid.

Índice

1. INTRODUCCIÓN 2. MARCO TEÓRICO 3. OBJETIVOS 4. MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. CONCLUSIONES

Introducción §  Nobel en Química 2008 (O. Shimomura, M. Chalfie, R.Y. Tsien)

v  LA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE “GFP”

APLICACIONES§  Biotecnología§  Medicina§  Biologíacelular

Aequorea victoria

v  LA INGENIERÍA GENÉTICA: CLONACIÓN DEL GEN DE LA GFP EN E. COLI TÉCNICAS BIOTECNOLÓGICAS q Lasendonucleasasderestricciónylosvectoresdeclonación:plásmidosq LatecnologíadelADNrecombinante.q Latransformaciónbacteriana.

Marco teórico

Objetivos •  TransformarlasbacteriasE.coliHB101conelplásmidorecombinantepGLOquecontieneelgendelaGFPydeterminarlaeficienciadetransformación.

•  SeleccionarunacoloniabacterianatransformadaypurificarelplásmidopGLOutilizandominicolumnasdegeldesílice.

•  Analizarelplásmidopurificadomedianteelectroforesisengeldeagarosaeidentificarlasconformacionessuperenrolladasyrelajadasdelosplásmidos.

•  DeterminareltamañodelgendelaGFPmediantedigestióndelplásmidopGLOconlaendonucleasaderestricciónHindIII.

•  InducirlaexpresiónlaproteínaGFPmediantelaactivaciónelpromotorpBADconarabinosaydeterminarlamasamoleculardelaGFPmedianteelectroforesisengeldepoliacrilamidaSDS.

•  Analizarelefectodeladesnaturalizaciónsobrelaestabilidaddelcromóforoysobrelamovilidadelectroforética.

Métodos

CULTIVODELASBACTERIASA37ºCdurante14h

Ø  Resistencia a Ampicilina Ø  Expresión de GFP: fluorescencia verde

v  TRANSFORMACIÓNDEE.COLICONPGLO

Métodos v PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO PGLO

� Lisisalcalina.

� Neutralización.

� Recuperacióndelsobrenadantefijadoalamembranadegeldesílice.

� Elución.

A = C x Ɛ x l

ü  Cuantificarü  AnalizarGenGFP

Métodos v DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DEL PLÁSMIDO

Métodos

v DIGESTIÓNDELPLÁSMIDOCONENZIMASDERESTRICCIÓNYANÁLISISELECTROFORÉTICOENGELDEAGAROSA

v  Tinción del ADN con un compuesto fluorescente (GelRed). Las bandas se observan con luz uv

Ø LasmuestrasdeADNsedepositanenlospocillosdelgel.

v EXPRESIÓNDELAPROTEÍNAGFP:ANÁLISISELECTROFORÉTICO ENGELDEPOLIACRILMIDA-SDS(SDS-PAGE)

E. coli-pGlO No inducida

(-Ara)

E. coli-pGlO Inducida

(+Ara)

Tinción Luz uv

+SDS / + DTT

TRANSFORMACIÓN CON PGLO

PREPARACIÓN DE MUESTRAS: SDS-PAGE

ANÁLISIS DEL RESULTADO

Métodos

Ø  TINCIÓNDELGELCONAZULCOOMASSIE

v ANÁLISIS DE LA TRANSFORMACIÓN DE E. COLI CON PGLO

Resultados

Bacteriassintransformar(-pGLO)

Bacteriastransformadas(+pGLO)

+amp-ara +amp+ara

Eficiencia de transformación =CFU ( nº total colonias)/ cantidad de pGLO (�g)

Luz ultravioleta 400nm

40X

v CÁLCULODELAEFICIENCIADETRANSFORMACIÓN

v COLONIASOBSERVADASALMICROSCOPIOÓPTICOINVERTIDO

µl sembrados en placa

µg de plásmido

Nº de colonias

Eficiencia (cfu/µg)

10 µl 0,15686 µg

73 4,65x103

Resultados

Resultados

• Concentración:(�g/ml)=(A260)50�g/mlxfactordedilución• Rendimiento:• (�g)=�pGLO�xVolumentotal

v ANÁLISIS DE LA PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO

Muestras

A260-A320

A280-A320 Concentració

n (mg/ml) Rendimiento

Rendimiento total

Tubo 1

Elución 1

0,0162

0,0155 0,155 16,2 21,3 µg Elución

2 0,005

1 0,0047 0,047 5,1

Tubo 2

Elución 1

0,0225

0,0211 0,211 22,5 31,5 µgElución

2 0,009 0,0071 0,071 9

v  ANÁLISIS DEL PLASMIDO PGLO MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

PGlo

/Hin

dIII

564 831 947

1375 1584 1904 2027

3520 4268 4973

Pb

Patr

ones

Patr

ones

PGlo

RLS

PGLOLineal

GenGFP

Relajado

Lineal

Superenrollado

Resultados

Resultados v  CÁLCULO DEL TAMAÑO DEL GEN DE LA GFP

pGLO

/Hin

dIII

pGLO lineal

Gen GFP

Electroforesis en gel de agarosa 0,8 %

y=-1,8938x+4,3443

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

LogPb

RF

cm banda RF log Pb Tamaño (Pb)

GFP 6,3 0,808 2,849 706

Resultados

1 2 3 4 P 1 2 3 4

KDa

66 54 37

29

20

- + - + Ara - + - + 22ºC 100ºC 22ºC 100ºC

A. Azul Coomassie B. Luz uv (400nm)

29 KDa

E.Coli+pGLO+ARA-ARA

ELECTROFORESISENGELDEPOLIACRILAMIDA-SDS

DESNATURALIZACIÓN

v DETERMINACIÓN DEL PM DE LA GFP

M P

66 54 37

29

20

KDa

y=-0,8486x+1,921

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

1,800

2,000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800

LogKDa

RF

ElectroforesisenSDS-PAGE

cmbanda RF logKdaPesomolecular

(KDa)

GFP 5,9 0,571 1,436 ≈27

Resultados

 

•  LabacteriaE.ColiHB101sehatransformadoconelplásmidopGLOconunaeficienciamuyaltaysehanobtenidocoloniasfluorescentes.

•  ElplásmidoPGLOsehapurificadoyanalizadomedianteelectroforesisengeldeagarosaysehanobtenidolasbandascaracterísticasdelasconformacionesrelajada,linealysupenrollada.

•  ElgendelaGFPsehacaracterizadomedianteladigestióndelplásmidopGLOconHindIIIyseobtenidounabandacuyotamañocorrespondea706pb

•  LaproteínaGFPexpresadaenpresenciadearabinosasehaanalizadomedianteelectroforesis,obteniéndoseunabandaquecorrespondeaunaMasamolecularde27kda.

•  SehainvestigadoelefectodeladesnaturalizaciónconDTTySDSsobrelaestabilidaddelcromóforoysehaobservadoquelafluorescenciadesaparececuandolaproteínasesometeadesnaturalizacióntérmicaa100ºC.

Conclusiones