7/30/2019 PRCTICA 3 FISIOLOGA DE LA NUTRICIN

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DEBIOTECNOLOGA

FISIOLOGA DE LA NUTRICIN

PRCTICA 3

DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDISPENSABLES(Mtodo Espectrofotomtrico para la determinacin deTriptfano segn Beaven y Holliday)

1. OBJETIVOS

a) El alumno evaluar la importancia de conocer el contenido deaminocidos indispensables en los alimentos naturales y procesados.

b) El alumno determinar el contenido de triptfano en algunos alimentosnaturales y procesados.

2. INTRODUCCIN

La mayora de los aminocidos constituyentes de protenas son prcticamentetransparentes en la regin 250-320 nm del espectro ultravioleta, y es sabido quefenil alanina, tirosina y triptfano son los responsables de la absorcin de la luzultravioleta en soluciones de protenas. La fenil alanina presenta una absorcin

muy dbil en este intervalo de longitud de onda y en soluciones acuosas deNaOH 0.1M presenta un mximo de absorcin a 258.5 nm, teniendo uncoeficiente de extincin molar de valor bajo.

La absorcin de la luz ultravioleta ejercida por tirosina (Tyr) y triptfano (Try) esmucho mayor que la absorcin presentada por fenil alanina en la misma regindel ultravioleta, por lo que puede despreciarse el valor de sta ltima, y por

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tanto, se puede considerar a la solucin de protena como un sistema de 2componentes para el anlisis espectrofotomtrico. Las solucionesequimoleculares de Tyr y Try presentan la misma absorcin a 294 nm seencuentran en solucin alcalina 0.1M.

El mtodo est basado en dos observaciones hechas sobre el espectro deabsorcin ultravioleta en la regin de 250 a 320 nm, de la mezcla de Tyr y Trypuros a concentraciones equimoleculares conocidas en solucin 0.1M de NaOH.El mximo de absorcin de Try se observa a 280 nm y a 294 nm para Tyr. Figura(3)

Este mtodo de mezclas es estrictamente aplicable cuando se mantiene la leyde Lambert-Beer. En los casos de aminocidos aromticos, la ley de Lambert-Beer es vlida slo para ciertos intervalos. Las mediciones de absorbancia deuna solucin de protenas en lcali N/10, determinadas para las longitudes deonda de 280 a 294 nm, a la vez referidas a los valores del contenido de

nitrgeno, se utilizan para calcular la cantidad de triptfano presente, porsustituciones desarrolladas por Beaven y Holliday (1).

M Try = (0.263 A280 0.170 A294) x 10-3M Tyr = (0.592 A294 0.263 A280) x 10-3

3. INVESTIGACIN PRELIMINAR

a) Explicar los fundamentos en los que se basa la tcnica para la

determinacin de triptfano.

b) Investigar el contenido de triptfano en los alimentos que se analizarnen la prctica.

c) Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminocidosindispensables en los alimentos.

4. MATERIALES Y REACTIVOS

Espectrofotmetro UV/VISParrilla de calentamientoMatraz aforado de 25 mlProbeta de 100 mlSolucin NaOH 0.1MTirosinaTriptfano

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5. DESARROLLO EXPERIMENTAL

El profesor responsable de la prctica indicar los alimentos que se analizarn.

Llevar a cabo la determinacin que se indica a continuacin:

Espectro de absorcin de la mezcla de las soluciones de triptfano y tirosina.

a) A una mezcla equimolecular de los aminocidos Try y Tyr (0.1 mM) se ledetermina el valor de absorcin en la regin ultravioleta del espectro de laluz entre 270 y 315 nm y para las regiones de mxima absorcin sedetermina la absorbancia a intervalos entre 5 a 1 nm de longitud de onda.Se construye una figura con los valores de absorbancia obtenidos paralongitud de onda. El valor mximo de absorcin para tirosina se obtuvo auna longitud de onda de 294 nm y para triptfano a 280 nm.

b) Las muestras de los diferentes alimentos fueron puestas en los matraces,a los cuales se les agregaron 20 ml de NaOH 0.1M, las suspensionesfueron calentadas a reflujo por 30 min.

c) Transcurrido este tiempo, se enfran los matraces y su contenido se filtrao centrfuga segn el caso, el sobrenadante obtenido se vacacuantitativamente en un matraz aforado de 25 ml, con la solucin deNaOH se lleva a un volumen final de 25ml. De cada una de estasdisoluciones se toma una alcuota en las celdas de cuarzo de 1cm depaso de luz y se leen en el espectrofotmero a ambas longitudes deonda.

d) Los valores obtenidos a esas longitudes de onda se substituyendirectamente en la ecuacin derivada por Beaven y Holliday (1), con locual se obtiene el contenido de Try de las muestras de los alimentos.

Duracin del mtodo: 35 minutos

6. INFORME DE RESULTADOS

a) Presentar la curva tipo de triptfano obtenida, as como lasdeterminaciones de los alimentos problema.

b) Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de lasdeterminaciones hechas a los alimentos, incluyendo en esta tabla losvalores establecidos en la bibliografa consultada.

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c) Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuentalos siguientes aspectos:

El contenido de triptfano en los diferentes alimentos con respectoa lo reportado para estos alimentos en la bibliografa.

Puntos crticos en las determinaciones.

Posibles fuentes de error en las determinaciones.

Importancia de conocer el contenido de aminocidosindispensables, como el triptfano, en los alimentos.

d) Elaborar sus conclusiones de la prctica en base al anlisis y discusin deresultados y a los objetivos planteados.

7. BIBLIOGRAFA

a) Beaven G.H. and Holliday E.R. Anlisis of the Absortion of Proteins inTerm of Tyrosine and Tryptophan Content. Adv. Protein Chem. 7, (1952),369.

b) Bencze W.L. and Schimd Karl. Determination of Tyrosine and Tryptophanin Protein. Anal. Chem. 29, (1957), 1193 1196.

c) Bender E. Arnold: Processing Damage to Protein Food. Pag. Bulletin 13,Winter 1971, Vol. 2, No. 1, (1972), pg.10.

d) Black S. Burn. Aminoacids Determination, Method an Techniques, 1968,20, 190-193.

e) Clarence E. May and Rose E.R. The Tryptophan Content some Proteins.L. Biol. Chem. August 7, (1922), 213 216.

f) Dahl O. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiprolinein Animal Tissues. Acta Chem. Scad. 14, (1960), 227.

g) Dahl O. Zur Analytik der Eiweissqualitt von Fleisch-Waren, DicFleischwirtschaft 48, (1968), 444.

h) Fischl Joseph. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. J.Biol. Chem. Vol. 235, (1960), 999 1001.

i) Graham C.E., Smith E.P., Hier S.W. and Klein D.J. Biol. Chem. 168(1947), 711.

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j) Goodwin T.W. and Morton R.A. The Spectrophotometric Determination ofTyrosine and Tryptophan in Proteins. Biochem Journal 40, (1946), 628.

k) Harper A. Harold. Manual de Qumica Fisiolgica 3. Ed. (1971), 392 397.

l) Howe Jean M., Yamura Y. And Clark E. Helen. American Asociation ofCereal Chemist. Inc. Sept.-October (1972), 566 570.

m) Spies J.R. and Chambers anal. Chem. 21 (1949), 1249.

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