UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Prcticas de Biologa Molecular Semestre 2015-II

PRACTICA N 3EXTRACCIN DEL ADN Para extraer el DNA y poder analizar su composicin qumica es necesario preservar hasta donde sea posible su estructura. Es conveniente entonces emplear mtodos que permitan en una primera etapa, la separacin de los numerosos componentes celulares y luego aislarlo de las protenas que principalmente en clulas eucariticas son sus acompaantes.

Con tal motivo, el mtodo de extraccin de DNA que utiliza cloroformo:alcohol isoamlico es el mas practico e idneo pues no solo permitir mantener la estructura de esta macromolcula sino que su obtencin ser observable mediante la aparicin de fibras tpicas al adicionarse etanol.

Teniendo en cuenta la practicidad del mtodo, es necesario indicar que el procedimiento requiere un cuidadoso manipuleo del material en estudio y adems la inhibicin de las nucleasas que pueden degradarlo rpidamente. Esto se consigue, en el primer caso, mediante mezclas suaves del extracto y en el segundo, agregando agente quelantes que bloqueen la actividad de estas enzimas.

Como se sabe el DNA es una doble hebra helicoidal constituida por bases nitrogenadas (ATGC), la pentosa denominada desoxirribosa y una molcula de cido fosfrico. Estos componentes pueden ser reconocidos utilizando reactivos qumicos especficos con la ayuda de la espectrofotometra.

Para ello se requiere efectuar una hidrlisis cida en la macromolcula o someterlo a la accin enzimtica de las nucleasas de acuerdo con los requerimientos analticos que se establezcan. Aunque no es un requisito indispensable para los ensayos antes propuestos, es conveniente averiguar previamente si el DNA que vamos a examinar se encuentra en estado nativo o denaturado. Adems es conveniente acercarse al conocimiento de su grado de pureza determinndose para ello su probable contaminacin con las protenas.

Se puede deducir entonces que el anlisis de DNA es un proceso cuidadoso que depende fundamentalmente del modo en que fue extrado del contenido celular.

OBJETIVOS

Extraer el DNA a partir de un extracto celular animal y vegetal

Determinar el contenido de los DNA extrados y su estado fisicoqumico.

Evaluar la accin de nucleasas

MATERIALES

- 25 g de Pisum sativum congelado - Embudos

0,5 g de tejido gonadal de Argopecten - Morteros

Tubos de 13x100 (3) y 16x150 (4) Sodio dodecil sulfato al 25% y 1% (SDS) - Erlenmeyer y beakers de 150ml

Cloroformo : Alcohol isoamlico (24:1) - Gasa estril ( 4 sobres)

Etanol fri isopropanol fro - Varilla de vidrio delgados (4)

NaOH 0,1 y 1 N - Pipetas pasteur

- Soluciones A (salina-EDTA), B (salina ) y C (salina-citratada)

- Bases nitrogenadas (0,05M) - Espectrofotmetro

- Solucin L (lisis) - Centrifuga- Plumon marcador - Papel toalla - Papel milimetrado-Gradilla de tubos

PROCEDIMIENTO

1. Extraccin del DNA de Gonadas de Argopecten

1- Colocar en un mortero en 5 ml de solucin A, 0,5 gr. de tejido gonadal, homogenizar la muestra y centrifugar a 2000 rpm/5min.

2- El precipitado resuspenderlo en 10 ml de solucin A y adicionar 0,5 ml de SDS, agitar durante 10 min Adicionar 2,5 ml de solucin B; continuar con la agitacin durante 10min.

3- Colocar sobre esta mezcla 13ml de cloroformo alcohol isoamlico (24:1), tapar el recipiente y agitar durante 30min retirando la tapa cada cierto tiempo para eliminar los vapores del solvente. Centrifugar a 6000 rpm/20min.

4- Separar la fase acuosa superior con ayuda de una pipeta y colocarla en un beaker, adicionar 2 volmenes de etanol fri e introducir la varilla de vidrio realizando con ella movimientos circulares para permitir la adhesin de fibras de DNA a la varilla.

5- Colocar la fibras en 5ml de solucin C (Tubo de16x150)para su disolucin a fin de ser utilizado en la siguiente sesin experimental.2 - Extraccin del DNA de Pisum sativum 1- Homogeneizar en el mortero 12 g de la muestra congelada en 25 ml de solucin

de lsis ( No ms de 5 minutos).

2- Trasvasar el homogenizado a un beaker e incubarlo a 58C por 15 min para lisar al mximo las membranas y liberar al DNA.

3- Colocar el beaker en fri por 10 min .

4- Filtrar la solucin utilizando gasa estril

5- Precipitar el DNA de la solucin recuperada empleando 2 volmenes de etanol isopropanol fro para ello la incorporacin del alcohol debe realizarse en forma lenta por las paredes del beaker. En la fase superior estar el alcohol y en la interfase con la solucin acuosa se observar el DNA en forma de filamentos los que sern recuperados con ayuda de una bagueta delgada girando en sentido horario.

6- La muestra presente en la bagueta resuspenderla en 5ml solucin C contenida en un tubo de 16x150 con el propsito de su solubilizacin para ser evaluado en al siguiente te sesin experimental.2. Determinacin del Espectro de Absorcin de Bases Nitrogenadas : Disponer en tubos 13x100 lo siguiente:

Muestra B 1 2 3

Adenina ---- 0,2 ---- ----

Citosina ---- ----- 0,2 ----

Guanina ---- ---- ---- 0,2

Agua destilada 3,0 2,8 2,8 2,8

Registrar absorbancias de cada una de las muestras en el rango de 235- 280nm. Graficar (papel milimetrado) el espectro de absorcin de cada base y determinar su mximo de absorcin..

PROBLEMAS:

1- En el DNA de ciertas clulas bacterianas, el 13% de los nuclesidos son adenosina. Cules son los porcentajes de los otros nuclesidos?

2- El DNA del bacterifago M13 tiene la siguiente composicin de bases: 23% A, 36% T, 21% G, 20% C. Qu puede deducir del DNA de este fago?

3- Calcular la longitud de un duplex de DNA cuyo peso molecular es de 3x10-7. Cual es el volumen ocupado por una molcula de ese DNA. Cuantas vueltas helicoidales contiene ese DNA.

4- El peso molecular del DNA del bacteriofago T4 de doble cadena es 1.3x108 a) cuantos aminocidos puede ser codificado por DNA de T4 b) Cuantas protenas diferentes de peso molecular 55,000 puede ser codificado por DNA T4.

5- Cmo podrn identificarse dos muestras de DNA, aisladas cuidadosamente a partir de E.coli y de erizo de mar (ver tabla), respectivamente, que estaban contenidas en sendos tubos de ensayo de los que se han perdido accidentalmente las etiquetas?

composicin de bases (fraccin molar %)

organismoAGCT

Homo sapiens30.919.919.829.4

oveja29.321.421.028.3

erizo de mar32.817.717.332.1

germen de trigo27.322.722.827.1

levadura31.318.717.132.9

E. coli24.726.025.723.6

fago lambda21.328.627.222.9

Mg. E. Rodrguez