Cultivo de Pleurotus ostreatus.

Graciela ColmanMariana SanabiaÁlvaro Soto3º BiologíaCeRP del Sur

Asesoramiento técnico: Prof. Ricardo Indarte.

Objetivo:

• Cultivar hongos pertenecientes a la especie Pleurotus ostreatus utilizando el instrumental con que cuenta el laboratorio de nuestra institución educativa.

• Aprender a utilizar técnicas de laboratorio, vinculando tres asignaturas: Taller de laboratorio, Botánica y Microbiología.

Un poco de información…

Los hongos son organismos eucariotas pertenecientes al reino Fungi.

Inicialmente se los consideró como plantas, pero presentan algunas características importantes que los diferencian de ellas:

• La pared celular de los hongos no está compuesta de celulosa, como las plantas, sino de quitina. La quitina es un polisacárido que también forma el exoesqueleto de los artrópodos.

• No poseen pigmentos fotosintéticos, como clorofilas, entre otros. Por ende, no son capaces de realizar fotosíntesis.

No forman verdaderos tejidos. Sus células están juntas y muy relacionadas, pero no cumplen una función en conjunto.

Las células de los hongos se denominan hifas y el conjunto de todas las hifas de un hongo se conoce como micelio.

El cultivo del Pleurotus, es simple y requiere de poca inversión inicial.

El sistema más común de siembra es en bolsas.

Como sustrato se puede usar casi cualquier elemento que contenga celulosa: pajas, aserrines, hojas, marlos molidos, subproductos de los cultivos de café, algodón, arroz, etc.

Autoclave

• Para la esterilización del material y medios de cultivo utilizamos un autoclave. El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro, fue inventado por el microbiólogo francés Charles Chamberland, en 1879.

•El proceso de esterilización en autoclave se compone de 3 fases:

• Fase de purgado: La resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire que comienza a salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.

•Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización. Este proceso toma entre 15-20 minutos.

•Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor. La presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a poco.

Estufa de cultivoLa estufa de cultivo es el aparato donde se incuban bacterias y hongos a una

temperatura adecuada y constante, para realizar luego diversos análisis en el laboratorio. 

•Tienen una cámara interior de acero inoxidable con soporte para estantes desmontables y posee dos puertas. La temperatura se calibra digitalmente y se controla mediante un termómetro incorporado. La temperatura fue 28ºC.

Materiales:

• De vidrio:- Cajas de Petri.- Matraces.- Tubos de ensayo.- Vaso de bohemia.- Probeta

• Otro instrumental:- Horno microondas.- Balanza.- Mechero Bunsen.- Ansas.- Tapabocas.- Guantes de látex y de amianto.- Autoclave.- Estufa de cultivo.

• Medios de cultivo:- Czapek.- Plate count agar.- Antibiótico.- Paja.- Agua destilada.

• Cuerpos fructíferos del hongo Pleurotus ostreatus.

Procedimiento:1º Etapa:

1) Preparación de los medios de cultivo:

- Dilución del medio en agua destilada.

- Esterilización del medio y de las cajas de Petri.

- Añadidura de antibiótico.

- Llenado de cajas de petri al calor del mechero.

1) Extracción e inoculación de micelio:

- Extracción de trozos de micelio con bisturí y pinzas.

- Colocación de los trozos en las cajas de Petri con el medio solidificado.

- Se llevan las cajas inoculadas a estufa de cultivo a 28ºC.

3) Multiplicación del micelio:

Una vez que el micelio primario prolifera en las cajas de los pasos anteriores, se multiplica para obtener más cantidad.

-Se preparan más cajas con medio de cultivo.

-Se recortan trozos de medio sólido con micelio primario y se inoculan en las nuevas cajas.

-Las nuevas cajas inoculadas se llevan a estufa de cultivo a 28ºC.

2º Etapa:

1) Preparación del medio donde se hará fructificar el micelio primario de Pleurotus ostreatus:

-Se arman paquetes de paja envueltos en diario y se esterilizan en autoclave.

-Humidificación de la paja con agua destilada para favorecer la fructificación.

2) Inculación del micelio primario en la paja:

-En una bolsa de nylon, se colocan capas alternadas de paja y de micelio primario.

- La bolsa se mantiene cerrada y en condiciones de humedad y luz moderada.

Pleurotus ostreatus demora aproximadamente tres meses en fructificar.

Procedimiento alternativo: Esporada.

- En un vaso de bohemia se coloca círculo de papel blanco con un orificio en el centro.

- Sobre él, se coloca un cuerpo fructífero de Pleurotus ostreatus (el estípite se sostiene en el agujero de la hoja).

- Sobre el vaso de bohemia se coloca una campana de vidrio, que puede ser un vaso de bohemia más grande dado vuelta.

Se espera que, dos o tres días después, la hoja contenga las esporas que cayeron de las láminas del sombrero. Esas esporas se inoculan en cajas de Petri con medio de cultivo.

Resultados:

Nos enfrentamos a nuevas limitaciones: Ventajas y desventajas del laboratorio.

Descartamos uno de los medios de cultivo, y nos quedamos con Czapek.

De cada generación de placas con micelio primario se contaminó el 50%: Las condiciones no eran del todo favorables para lograr esterilidad absoluta.

Luego de inocular la paja, descubrimos que el hongo que habíamos cultivado no era Pleurotus ostreatus:

- Al microscopio descubrimos que era un Deuteromycota.

- Compitió con Pleurotus ostreatus, colonizando el medio de cultivo.

Nos vimos obligados a repetir la experiencia desde cero.

La repetición fue exitosa: Logramos obtener micelio primario de Pleurotus ostreatus.

La repetición retrasó los tiempos:

- Pleurotus ostreatus demora tres meses en fructificar, y la inoculación en la paja se hizo hace seis semanas.

Aún no podemos saber si obtendremos micelio secundario de Pleurotus ostreatus.

Modificaciones para la repetición: A la paja le agregamos aserrín, que ayuda a mantener la humedad y provee una fuente de lignina (Pleurotus ostreatus es un hongo ligninolítico: degrada lignina).

Conclusiones finales:

• Aprendimos técnicas de laboratorio esenciales en la enseñanza y el aprendizaje de la Biología.

• Comprendimos las limitaciones y las ventajas de un laboratorio de Biología de formación docente.

• Comprobamos que toda práctica experimental está inmersa en un contexto determinado, y que éste determina en buena medida los resultados de la misma.

FIN.

¡Muchas gracias!