Polimorfismos de los receptores adrenérgicos en la ICPolimorfismos de los receptores adrenérgicos en la IC

Miguel A. Torralba Cabeza

• Concepto de Gen y Polimorfismo.

• Los Receptores adrenérgicos.

• Los SNPs de los receptores

adrenérgicos.

• Métodos de estudio de la correlación

entre Genotipo/Fenotipo de los

receptores adrenérgicos.

Aspectos a tratar

Aspectos históricosAspectos históricosGregor Mendel:”leyes de la Herencia”

1910 1950 19531866 19751978

A. Kossel: “Ácidos Nucleicos”

Hershey y Chase: “ADN es material genético”

Watson y Crick: “estructura doble hélice”

<<aislamiento de 1º genes humanos>>

Science: 1ª secuenciación genoma(SV40)

Organización del Genoma Humano

1988

Genoma de Drosophila M.

2000 2001

COLLINS VENTERCOLLINS VENTER

KARY B. MULLIS: “PCR”

1986SECUENCIA GENOMASECUENCIA GENOMAHUMANOHUMANO

• Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos.

• Desde el punto de vista molecular, un gen es una

secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN,

que contiene la información necesaria para la síntesis

de una macromolécula con función celular específica:

– Proteinas.

– ARN.

Concepto de Gen

Al conjunto de Genes de una especie se le denomina Al conjunto de Genes de una especie se le denomina GenomaGenoma

El Genoma humano

• Sólo 1% del DNA se transcribe

• Organización en exones e intrones:– SNPs: 1/1250 bp

(2,1millones).– Microsatélites.– ESTs

Science: 16 February 2001 (291).Science: 16 February 2001 (291).

CAUSAS DE LA COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO:CAUSAS DE LA COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO:

• Un GEN es capaz de construir diferentes productos Un GEN es capaz de construir diferentes productos en un proceso que es llamado en un proceso que es llamado ayuste alternativoayuste alternativo

• Existen miles de modificaciones químicas para Existen miles de modificaciones químicas para fabricarfabricar proteínas así como del repertorio de proteínas así como del repertorio de

mecanismos que regulan este proceso.mecanismos que regulan este proceso.

El Genoma humano

Ajuste alternativoAjuste alternativo

Guttmacher A et al. N Engl J Med 2002; 34: 1512-20Guttmacher A et al. N Engl J Med 2002; 34: 1512-20

GenómicaGenómica: es el estudio de los genes:• estructura• función

Mecanismos por los que un Gen puede dar lugar a múltiples

productos génicos

Proteómica:Proteómica: es el estudio a gran escala de los productos génicos de un Genoma

De expresión

Estructural

Funcional

TRANSCRIPCIÓN PROCESAMIENTO TRADUCCIÓN TRANSLACIÓN

DNADNA RNARNA mRNAmRNA PROTEINAPROTEINA

Regulacióntranscripcional

•Procesamiento de Intrones.•Edición de mRNA•Poliadenilación

Regulacióntranduccional

Proteolisis

ModificaciónPost-transduccional

Compartimentalización

De cada gen, los humanos tenemos generalmente dos copias, una heredada de cada progenitor. Los científicos han encontrado cerca de

2.900 genes (más del 10% de los genes del genoma humano) que pueden sufrir 'variaciones en el número de copias' (CNV) de unas

regiones determinadas. Estos segmentos del genoma están formados por unos 1.000 pares de bases cada uno.

Hasta ahora se creía que cada persona difería de otra en un millón de los más de 3.000 millones de nucleótidos que componen el genoma

humano. Sin embargo, se ha demostrado que entre dos personas hay más de 20 millones de nucleótidos de diferencia, que se agrupan

en 1.400 regiones del genoma.

Gosden R et al.Gosden R et al.NEJM 2007; 356 (7)NEJM 2007; 356 (7)

El modelo epigenético sugiere que el epigenotipo modula la acción genética y éste a su vez es afectado por el ambiente, el

epigenotipo de los padres, la edad y la secuencia de los loci que regulan la metilación del DNA y la cromatina.

MODELO MODELO EPIGENÉTICOEPIGENÉTICO

• Son variantes alélicasvariantes alélicas que ocurren en la población con una frecuencia > 1%.

• El alelo más común o con actividad enzimática

mayor se denomina “wild type”.“wild type”.• Las variantes con actividad más baja o

inexistente son las

““mutaciones”mutaciones”

Los Polimorfismos

Guttmacher et al.NEJM 2002; 347 (19)

MUTACIONESMUTACIONES

MUTACION EXON NUCLEOTIDO cDNA AMINOACIDO

T134P 5 AC en 3101 508 ThrPro

G202R 6 GA en 3515 721 GlyArg

G325W 8 GT en 5306 1090 GlyTrp

E326K 8 GA en 5309 1093 GluLys

S364N 8 GA en 5424 1208 SerAsn

P391L 9 CT en 5904 1289 ProLeu

Los Polimorfismos TERMINOLOGÍA INTERNACIONAL

GEN “GBA”GEN “GBA”

La Insufiencia Cardiaca es un síndrome muy complejo, donde existen gran

cantidad de mecanismos implicados en la Transducción de Señales

Science; 5 Oct 2007: 510Science; 5 Oct 2007: 510

PROLIFERACIÓN CELULAR

•Angiotensina II• Catecolaminas• Endotelina• TNF-• GH• IGF• Cardiotropina-I• Estiramiento mecánico

FIBROSIS

• Angiotensina II• Endotelina• Aldosterona• TGF-

APOPTOSIS

•TNF-• Fas

FACTORES CONTRARREGULADORES

• ANP• Bradicinina• Óxido Nítrico• BNPAdaptado de Harrison: principios de Medicina Interna 16ª Edición

La transmisión de señales se lleva a cabo La transmisión de señales se lleva a cabo mediante mensajerosmediante mensajeros

La molécula fundamental en la transducción de señales

extracelulares es el RECEPTOR

Señalización asociada a RECEPTORES DE MEMBRANA

Hunter J et al. Hunter J et al. N Engl J Med 1999; 341: 1276-83N Engl J Med 1999; 341: 1276-83

RECEPTOR B1: aumenta contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa.

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G EN LA

INSUFICIENCIA CARDIACA: el Receptor B1

Respuesta rápidaRespuesta rápida

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G

VÍA VÍA ADENILATOADENILATO CICLASACICLASA

SÍNTESIS SÍNTESIS PROTEICAPROTEICA

Respuesta lentaRespuesta lenta

Receptores adrenérgicos alfa y Receptores adrenérgicos alfa y BetaBeta

Hayar RJ et al. Hayar RJ et al. N Engl J Med 2002; 347: 1196-N Engl J Med 2002; 347: 1196-11991199

• B1 y B2B1 y B2: aumentan contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa.

• B2B2: activa la protein kinasa mitógena y contrarregulación.

• B3B3: activa la NO sintasa.

postsinapsispostsinapsisactiva la protein kinasa mitógena->HVI.

presinapsispresinapsis: regulación de la liberación de Noradrenalina.

Barth A et al. JACC 2006; 48: 1610-17Barth A et al. JACC 2006; 48: 1610-17

¿CUÁLES SON LOS GENES QUE SE TRANSCRIBEN POR ESTOS

MECANISMOS?

• Pro-BNP, pro-ANP.• Codificantes estructuras sarcoméricas: MYH6,

MYH10.• Implicados en la Apoptosis: CCL2, PHLDA1,

SNCA.• Implicados en el Crecimiento celular: FRZB,

SFRP4, SPOCK, CTFG.• Implicados en el control del Ciclo celular: G0S2,

ETV5, RARRES1.• Genes implicados en la Respuesta Inmune:

CFHL3, FCN3, CCL2, S100A8.

EL RECEPTOR BETA ADRENÉRGICOEL RECEPTOR BETA ADRENÉRGICO

Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465

El Receptor adrenérgico de tipo Beta: “su vida”El Receptor adrenérgico de tipo Beta: “su vida”

Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465

Yin et al. Yin et al.

MolPharm 2004; 65 (6): 1323MolPharm 2004; 65 (6): 1323

Representación 2D del Receptor Representación 2D del Receptor Beta 1Beta 1

Ralf Jockers et al. Ralf Jockers et al. The Journal of Biological Chemistry 1996. Vol. 271,pp. 9355–9362The Journal of Biological Chemistry 1996. Vol. 271,pp. 9355–9362

Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:29171-29177Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:29171-29177

Representación 2D del Receptor Beta Representación 2D del Receptor Beta 22

Visión extracelular

Visión extracelular + AgonistaCentro activo (“perfil”)

Esquema 2D transmembrana

Swaminath G Swaminath G et al. et al. The Journal of Biological Chemistry 2005. Vol. 280, No. 23, 22165–22171The Journal of Biological Chemistry 2005. Vol. 280, No. 23, 22165–22171

Estructura 3D del Estructura 3D del Receptor Beta-1Receptor Beta-1

Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12622-12627Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12622-12627

El centro activo 3DEl centro activo 3D

Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12622-12627Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12622-12627

Polimorfismos de Polimorfismos de - - ReceptoresReceptores

• ADRA1AADRA1A: (8p21) con 3 isoformas; se expresa en el corazón, cerebro, hígado y próstata, pero no está implicado en la insuficiencia cardiaca (IC).

• ADRA1BADRA1B: (5q33) implicado en la aterosclerosis, contractilidad de la arteria aorta y en el control de la presión arterial sistólica.

• ADRA1DADRA1D: (20p13) se considera un subtipo del 1A

• ADRA2AADRA2A: (10q24-q26) se expresa fundamentalmente en las plaquetas. Cuando se estudian ratones con ausencia de este gen y del ADRA2C, se observa que desarrollan IC.

• ADRA2BADRA2B: (cromosoma 2) no está implicado en la IC pero determinados polimorfismos se han relacionado con alteraciones del sistema nervioso autónomo y en el desarrollo de obesidad.

• ADRA2CADRA2C: (4p16.1) la delecióndeleción de 4 pares de bases situada en los nucleótidos 322-325322-325 se ha asociado a un aumento del riesgo de 5,6 veces5,6 veces para desarrollar IC en la población de origen africano. Si junto a esta deleción se encuentra el polimorfismo Arg 389 (R389GR389G) en el gen del receptor B1receptor B1, el riesgo se multiplica por 10por 10.

OMIMOMIM

Polimorfismos de Polimorfismos de - - ReceptoresReceptores

• ADRB1ADRB1: (10q24-q26) se trata de un péptido de 477 aminoácidos que tiene una homología del 54% con el receptor B2. Se han descrito algunos polimorfismos con importancia en la IC como:– R389GR389G:

• Disminuye el riesgo de taquicardia ventriculartaquicardia ventricular (TV) (OR 0,3).

• Implicado en la obesidad y en la regulación de la termogénesis.

• Su presencia en homocigosishomocigosis aumenta la fibrosis miocárdicafibrosis miocárdica y la existencia de ICIC. Así mismo es predictor de mejor respuesta a tratamiento con b-bloqueantespredictor de mejor respuesta a tratamiento con b-bloqueantes (carvedilol y/o bucindolol).

– S49GS49G: su presencia condiciona una disminución de la frecuencia cardiacadisminución de la frecuencia cardiaca media del 40 + 7%, con sus impicaciones.

• ADRB2ADRB2: (5q32-q34) se trata de un péptido de 413 aminoácidos con algunos polimorfismos estudiados:– R16GR16G: aumenta el riesgo de padecer asmaasma nocturno en 3,8

– Q27EQ27E: relacionado con el riesgo de padecer obesidadobesidad.

– T164IT164I: su presencia hace que disminuya la supervivencia por insuficienciasupervivencia por insuficiencia cardiaca.

• ADRB3ADRB3: se trata de un péptido de 402 aác que parece estar implicado en la regulación de la termogénesis.

OMIMOMIM

Small et al. N Engl J Med 2002;347:1135-43Small et al. N Engl J Med 2002;347:1135-43

Polimorfismos de Receptores Polimorfismos de Receptores adrenérgicosadrenérgicos

Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:29171-29177Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:29171-29177

Representación Molecular “3D” de la interacción TM3 /TM6 y diferentes mutaciones en el interior citoplasmático

(nucleótido 6.300)

Implicaciones clínicas de los Polimorfismos: métodos de estudio

1.1. Estudios en HumanosEstudios en Humanos:

• Estudios de AsociaciónEstudios de Asociación: establece la diferencia entre sujetos y controles en referencia a un marcador o rasgo.

– Estudios de LigamientoEstudios de Ligamiento: • En árboles familiares se usan diferentes modelos de

herencia para encontrar el más probable.• En pares de hermanos: “concordancia entre gemelos”.

2. 2. Estudios en animales de ExperimentaciónEstudios en animales de Experimentación

Implicaciones clínicas de los Polimorfismos: métodos de estudio

3. 3. Estudios “In Vitro”Estudios “In Vitro”:• Se introducen Genes con diferentes

mutaciones en células con alto coeficiente de replicación celular y se compara la expresión del Gen con su “wild type”.

– Células procedentes de mamíferos: CHO, COS, etc.Células procedentes de mamíferos: CHO, COS, etc. – Células procedentes del aparato reproductor femenino

de determinados insectosinsectos: sf9, HELASsf9, HELAS, etc.

– Se mide:• Acumulación AMPc.• Efecto de Agonistas/Antagonistas.

PASOS I, II y III

Digestión XmnI

+

Plásmido mutante Plásmido lineal original

PASO IV Transformación en las célulascompetentesXL muts y crecimientoen medio de cultivo.

PASO V

+ Digestión XmnI

PASO VI + Transformación en las células XL1-Blue.

Protocolo de Protocolo de Mutagénesis DirigidaMutagénesis Dirigida

Transfección del DNA mutado en células especiales

Ag T

COS -7

cDNA

Shiina et al. JBC 2000; 275 (37): 29082-91Shiina et al. JBC 2000; 275 (37): 29082-91

Estudios de expresión Estudios de expresión del nº de Receptores del nº de Receptores

celularescelulares

Sugimoto et al. JPET 2002; 301(1): 51-9Sugimoto et al. JPET 2002; 301(1): 51-9

Estudios de expresión de la respuesta Estudios de expresión de la respuesta al Agonistaal Agonista

Los “microarrays”

Sauter, G. et al. N Engl J Med Sauter, G. et al. N Engl J Med 2002;347:1995-19962002;347:1995-1996

Edison T. et al. N Engl J Med 2004;350:1595-Edison T. et al. N Engl J Med 2004;350:1595-15961596

Gullans SR. N Engl J Med 2006;November 9: 2042-44

MICROARRAYS FUNCIONALESMICROARRAYS FUNCIONALES

Se comprueba mediante microarrays el valor de un fármaco parainhibir o expresar un gen enuna determinada enfermedad

Lowes et al. NEJM 2002; 346 (18)

Estudios de la expresión de RNAmEstudios de la expresión de RNAm

..otros muchos mecanismos ..otros muchos mecanismos implicados…implicados…

Science; 5 Oct 2007: 510Science; 5 Oct 2007: 510

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• Rol Polimorfismos del Receptor adrenérgico debe ser precisado.

• La regulación postranslacional del Receptor es extremadamente compleja y a diferentes niveles.

• ¿Pueden explicar estos Polimorfismos la respuesta al tratamiento y la mortalidad por IC?

““Lo importante es no Lo importante es no dejar de hacerse dejar de hacerse

preguntas”preguntas”Albert EinsteinAlbert Einstein

““He disfrutado mucho He disfrutado mucho con esta obra de con esta obra de

teatro, especialmente teatro, especialmente en el descanso”en el descanso”

Groucho MarxGroucho Marx