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INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO CGPI-20060669

PEPTIDOS BIOACTIVOS OBTENIDOS MEDIANTE TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA

Director: M.C. ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ

RESUMEN

El suero lacteo es un subproducto que se obtiene de la producción del queso, y del cual

no se aprovechan sus propiedades nutricionales y funcionales (Pruneda, 2003). Por

otra parte, se conoce que la hidrólisis enzimática de las proteinas del suero lacteo es

una buena alternativa tecnológica para mejorar la funcionalidad de proteínas (Gauthier y

Pouliot, 2003). En este contexto, una nueva preparación enzimática que ha mostrado

propiedades fisicoquimicas de interes cientifico y práctico es la hemisfericina una

peptidasa cisteínica polimórfica obtenida de los frutos de la planta mexicana Bromelia

hemisphaerica (timbirichi). Su modo de accion en la hidrólisis y en la modificacion de

propiedades funcionales de proteinas, permite inferir su utilidad como enzima industrial

en usos alimentarios (Briones, 1994).

Por lo anterior el objetivo de la presente etapa de la investigación fue estudiar

las propiedades de la hemisfericina comparativamente con la enzima comercial

Alcalasa, en la modificacion enzimática de las proteinas del suero lácteo, así como

caracterizar la funcionalidad resultante de los hidrolizados y de las fracciones peptídicas

separadas por ultrafiltración. Experimentalmente el enfoque incluye la producción de

fracciones péptidicas a partir de proteínas de suero lácteo mediante proteólisis limitada

en condiciones pH-STAT y aislarlas mediante ultrafiltración. Interesa estudiar la

influencia de la especificidad enzimática, el grado de hidrólisis y la separación por

membrana, en las propiedades biológicas de péptidos y polipéptidos generados en la

modificación estructural controlada de las proteínas de suero lácteo. Especialmente, se

busca desarrollar conocimiento acerca del potencial de aplicación de la nueva

preparación proteolítica hemisfericina, para mejorar la funcionalidad de las proteínas

del suero lácteo, una fuente subutilizada de proteínas de alta calidad.

GENERALIDADES

En México la producción de leche y sus derivados es de gran importancia económica.

Anualmente se producen 25,000 toneladas de diversos tipos de quesos, proceso en el que

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se generan 225,000 toneladas de suero lácteo; subproducto que en su mayoría de los

casos es desechado (Murillo et al., 2005). El suero lácteo desechado resulta ser una

pérdida económica y un grave problema ambiental, ya que por cada 1000 L de suero

lácteo se generan aproximadamente 35 Kg. de DBO (Demanda Biológica de Oxigeno) y

cerca de 68 Kg. de DQO (Demanda Química de Oxigeno), lo cual es equivalente a la

fuerza contaminante de las aguas negras producidas por 450 personas en un día (Jelen,

1979). Las proteínas que se encuentran en el suero lácteo pueden ser utilizadas para

mejorar el sabor, la textura, la apariencia y en algunos casos el valor nutricional de

productos procesados (Guemes, 2005). Por lo anterior es necesario buscar posible

solución tecnológica para aprovechar las propiedades nutritivas y funcionales de los

componentes del suero lácteo. El suero lácteo se puede obtener mediante tres procesos

principales (Zinsly y col., 2001; Maubois y col., 2001): por el proceso de coagulación

enzimática (utilizando quimosina), dando por resultado el coágulo de caseínas, materia

prima para la producción de quesos, y el suero dulce; por precipitación ácida en el punto

isoeléctrico (pI), dando por resultado la precipitación isoeléctrica de la caseína, que se

transforma en caseinatos y suero ácido; y mediante la separación física de micelas de

caseína por microfiltración, consiguiendo un concentrado de micelas y de proteínas del

suero, en forma de concentrado o aislado proteínico.

El suero lácteo contiene una mezcla de proteínas (α-lactoalbúmina, β-

lactoglobulina, globulinas y proteosas peptona) con una amplio gama de propiedades

químicas, físicas y funcionales. Estas proteínas no sólo juegan un importante papel

nutricional sino que además, pueden mostrar diversas actividades biológicas. Por lo tanto,

ante la creciente demanda de proteínas alimentarias, farmacéuticas e industriales, que

requieren proteínas con propiedades funcionales especificas, el aprovechamiento de las

proteínas del suero lácteo se presenta como una buena alternativa.

La hidrólisis enzimática de las proteínas del suero puede ser una mejorar algunas

de sus propiedades y ofrece oportunidades interesantes para su uso (Gauthier y Pouliot,

2003). Es decir, es factible modificar las estructuras proteínicas y obtener preparaciones

con buenas propiedades funcionales empleando proteasas y combinando con la

proteólisis limitada. Existe una diversidad de proteasas industriales potencialmente útiles

para esos fines. Entre las proteinasas serínicas, es el caso de la subtilisina, de origen

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microbiano, cuyo presentación comercial más conocida es la Alcalasa (Subtilopeptidasa

A de Novozymes).

En el presente informe se analizan los resultados de la etapa de la investigación

que comprende el estudio comparativo entre la proteinasa comercial Alcalasa y la

proteinasa cisteínica de origen vegetal, obtenida de la bromeliacea mexicana Bromelia

hemisphaerica: la hemisfericina, en la proteólisis limitada de proteínas de suero lácteo.

MÉTODOS Y MATERIALES. Hidrólisis enzimática de las proteínas de suero lácteo.

La modificación de las proteínas vía enzimática se realizó mediante experimentos de

hidrólisis por lote en un vaso de reacción, con doble pared para control de la temperatura,

acoplado a un titulador automático pH-stat con registro del consumo de NaOH. Las

proteínas del suero se hidrolizaron enzimáticamente a pH 8.0 y temperatura de 45 °C. Se

realizó un seguimiento de las reacciones enzimáticas por medio de titulación automática

y continua de los protones liberados a pH constante.

Fraccionamiento de los hidrolizados obtenidos mediante ultrafiltración.

El proceso de ultrafiltración se realizó utilizando el ultrafiltro Lab-Scale de Millipore.

Determinación de la actividad proteolítica. La actividad proteolítica de las preparaciones

enzimáticas se determió mediante el método de Ortega y del Castillo (1966), empleando

como sustrato caseína al 1%. La cual se prepara disolviendo 2 g de caseína en regulador

de fosfatos 0.05 M pH 7.6 y sometiéndola a ebullición en baño maría durante 20 min para

lograr su desnaturalización; se deja enfriar y se lleva a un volumen de 190 él. con

regulador. Al preparar la mezcla enzima–sustrato la concentración final de caseína será de

1%. Para realizar la medición de la actividad proteolítica de una enzima se realizó lo

siguiente; en un baño a temperatura de 35 ºC, se colocaron los tubos de ensayo

conteniendo 1.9 ml de caseína para su incubación durante 10 min, y posteriormente se

agregaron 0.1 ml de la preparación enzimática y se dejó actuar durante 10 min. La

reacción fue detenida adicionando 3 ml de ácido tricloroácetico (ATC) al 5%.

Simultáneamente se corrió un testigo al que se le adiciona primero el ATC y al final la

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preparación enzimática. Al término de la reacción se centrifugaron los tubos a 2,800 x g.

Finalmente, los productos de la hidrólisis enzimática que se encuentran en el

sobrenadante, aminoácidos libres y péptidos pequeños, se leyeron en un

espectrofotómetro a 280 nm, ajustando el aparato con una mezcla de 2 ml de regulador de

fosfatos 0.05 M pH 7.6 y 3 ml de ATC al 5%.

Método de Bradford. El método consiste en la reacción de las proteínas y el reactivo de

Bradford (1976) preparado de la siguiente manera. Primero, se obtiene una solución

concentrada que incluye 100 mg de azul de Coomasie G-250 (sigma) con 50 ml de etanol

al 95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza al 85%, se homogeniza y se afora

posteriormente a 1 L con agua desionizada. El procedimiento de método consiste en

hacer reaccionar 100 µL del sobrenadante de las dispersiones de las enzimas con 2 ml del

reactivo de Bradford, agitar brevemente en un vortex, dejar reposar durante 5 min y leer a

595 nm, en un espectrofotómetro. La curva tipo utilizada para calcular el contenido de

proteína se preparó utilizando albúmina de suero de bovino (2.5 mg/10 ml de agua).

Propiedades Funcionales

Determinación de proteína soluble. Se empleó el método de Kabirullah y Wills (1982),

que consiste en preparar 10 ml de una dispersión al 1% de proteína en agua destilada y

ajustar el pH seleccionado, en este caso se manejaran muestras a pH 3, 5, 7, 9 y 11, agitar

durante 30 min, centrifugar a 10,000 x g por 25 min y analizar el contenido de proteína

soluble en el sobrenadante mediante el método de Bradford (1976).

Determinación del índice de actividad emulsionante. Las propiedades emulsionantes de

las dispersiones se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella (1978). Las

dispersiones se prepararon al 0.1% (p/v) de proteína en regulador de fosfatos 0.1 M pH

7.4. La proteína fue dispersada en una batidora de cocina philips a velocidad 4 durante 1

min. Para obtener las emulsiones propiamente dichas se prepararon mezclas de aceite de

maíz y dispersión proteínica en una proporción de 1:3 y se sometieron a agitación durante

1 min en la batidora. Inmediatamente después de la homogeneización se tomaron

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cuidadosamente del fondo del recipiente, alícuotas de 0.1 ml y se diluyeron con 5 ml de

una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos pH 7.4 0.1

M. Finalmente se midió la absorbancia de las emulsiones diluidas contra un blanco de

regulador a 500 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-160). Las lecturas de

absorbancia fueron utilizadas para calcular el índice de Actividad Emulsionante

utilizando la fórmula definida por Pearce y Kinsella (1978). Los análisis fueron

realizados por triplicado.

Determinación de la estabilidad emulsionante. La estabilidad relativa de las emulsiones

preparadas en este estudio se siguió en emulsiones preparada mediante el método de

Pearce y Kinsella (1978), de las cuales se tomaron alícuotas de 0.1 ml a tiempos de 0, 1, 2

y 3 min después de la homogeneización, se diluyeron en dodecil sulfato de sodio (SDS)

2% y se leyeron las absorbancias a 500 nm Los análisis fueron realizados por triplicado

Determinación de la capacidad y estabilidad de formación de espuma

Se empleó el método de Venktesh y Prakash (1993) que consiste en adicionar 3 g de

preparación proteínica desgrasada en 100 ml de agua destilada, ajustar a pH 7,

homogenizar a 3000 g durante 5 min en un homogeneizador virtis a 35 °C y transferir a

una probeta graduada. Se calculó el volumen de espuma después de 30 seg y el

incremento de volumen se expreso como la capacidad de formación de espuma en

porcentaje. La estabilidad de la espuma se determinó midiendo la disminución de

volumen de espuma en función del tiempo en un periodo de hasta 30 min la densidad de

espuma se calcula dividiendo el volumen de espuma entre el peso correspondiente.

Actividad antioxidante. La evaluación de la actividad antioxidante de las muestras se

realizó a través del método DPPH con algunas modificaciones al método descrito por Von

Gadow et al (1997) con el fin de ajustarlo a este trabajo experimental. Se preparó una

solución 1 mM de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidracilo) en metanol al 100% y una

dispersión proteínica al 2 %. La reacción se efectúa agregando 1 ml de DPPH y 3 ml de

la dispersión proteínica, la mezcla es agitada vigorosamente y posteriormente se mantiene

en reposo durante 30 min en la oscuridad; al finalizar el tiempo de reposo, se lleva a

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centrifugación a 10, 000 g durante 30 min y se lee el sobrenadante a 517 nm. Se utiliza

metanol como blanco y la solución de DPPH como testigo

RESULTADOS

Curvas de hidrólisis.

En la Figura 1 se muestran comparativamente los cursos de la reacción de hidrólisis,

durante 180 min, de las proteínas de suero lácteo obtenidas con la Alcalasa y con la

hemisfericina. El mayor grado de hidrólisis (mayor consumo de base) se obtuvo con la

proteasa serínica comercial microbiana Alcalasa (subtilisina grado alimentario de

Novozymes). Con la cisteínica hemisfericina el grado de hidrólisis fue menor; es decir,

aparentemente, hubo una proteólisis más limitada con dicha enzima.

Evolución del contenido de proteína hidrolizada.

En la Figura 2 se presentan los valores del contenido de proteína soluble, determinados

mediante el método de Bradford, de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo

obtenidos a dieferentes grados de hidrólisis: 30, 60 y 180 min. En ambos casos

enzimáticos se observó una disminución del contenido de proteína soluble, como

indicativo de la acción enzimática. En particular, la Alcalasa presenta una mayor

actividad enzimática sobre las proteínas solubles, con aumento en función del grado de

hidrólisis o tiempo de reacción. Con hemisfericina, en cambio, la hidrólisis de las

proteínas solubles fue más moderado, mostrando también un incremento conforme

avanza el tiempo de reacción.

Propiedades funcionales

Los hidrolizados se prepararon analizando comparativamente dos tipos de preparaciones

proteínicas: una comercial de Sigma y otra preparada en el laboratorio a partir de suero

fresco obtenido de una planta que elabora quesos. Los hidrolizados obtenidos con las

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enzimas en estudio, fueron separados por ultrafiltración con membrana de 5 kDa. Los

hidrolizados y las fracciones separadas por ultrafiltración fueron posteriormente

sometidos a análisis del índice de actividad emulsionante (IAE) y de la actividad

antioxidante (AOX) del radical DPPH. Los resultados se muestran a continuación.

Índice de actividad emulsionante.

En las Figuras 3 y 4 se presentan los valores de IAE determinados a los hidrolizados

totales de las proteínas de suero lácteo comercial, con Alcalasa y hemisfericina, a 1 h y 3

h de reacción, respectivamente. La hemisfericina en ambos tiempos de reacción generó

hidrolizados que presentaron una mejora importante del IAE y de la estabilidad de la

emulsión, que originalmente tienen las proteínas no tratadas enzimáticamente. Con

Alcalasa, en cambio, hubo una disminución del IAE y de la estabilidad de la emulsión

conforme aumentó el grado de hidrólisis. Este efecto es consistente con la mayor

actividad o proteólisis más extensiva, que muestra la Alcalasa en las curvas de hidrólisis

y en la digestión de las proteínas solubles. Aparentemente, la hemisfericina, por efecto de

su modo de acción más moderado, causa una proteólisis limitada que induce cambios

estructurales más favorables para características más hidrofóbicas que resultan en una

mejoría importante de la actividad emulsionante.

En las Figuras 5, 6 y 7 se muestran los valores de IAE obtenidos con los hidrolizados a

dieferentes tiempos de reacción, utilizando como sustrato las proteínas de suero lácteo

preparadas en el laboratorio. Es importante observar que dicha preparación de laboratorio

sin tratamiento enzimático mostró muy buena actividad emulsionante y estabilidad de

emulsión, significativamente mejor que la mostrada por la preparación comercial. Con

estas proteínas el efecto de la hemisfericina solo mostró mantener la funcionalidad, no la

mejoró pero tampoco la destruyó. Se infiere que el método de laboratorio permitió un

mejor control de las condiciones desnaturalizantes de la estructura proteínica. La

Alcalasa, por el contrario, mostró una destrucción de las propiedades estructurales que

favorecen la actividad emulsionante.

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Actividad antioxidante del DPPH.

En las Figuras 8, 9 y 10 se muestran los resultados de actividad antioxidante obtenidos

con: el hidrolizado total de proteínas de suero lácteo comercial, y de los permeados y

retenidos de ultrafiltración (5 kDa) separados de los hidrolizados de 1 y 3 horas de

reacción, respectivamente. Las preparaciones modificadas con hemisfericina feron las

que mostraron las mejoras más importantes en la actividad antioxidante: tanto el

hidrolizado total (Figura 8), el retenido de las proteínas digeridas por 60 min (Figura 9),

como el permeado de las proteínas hidrolizadas por 180 min (Figura 10, no mostrada en

este documento por razones de espacio límite del archivo electrónico a enviar), fueron las

especies proteínicas y peptídicas que mostraron los valores más altos de actividad

antioxidante.

En las figuras 11, 12 y 13 (no mostradas en este documento por razones de espacio límite

del archivo electrónico a enviar) representan los valores de AOX de los hidrolizados,

retenidos y permeados de ultrafiltración obtenidos con las proteínas de suero preparadas

en el laboratorio a tres diferentes tiempos de reacción: 30, 60 y 180 min, respectivamente.

La acción de las proteasas en estudio sobre las proteínas de la preparación de laboratorio

no modifico la actividad antioxidante. La modificación enzimática, aparentemente, no

generó especies con las características químicas que tienen efecto para atrapar radicales

libres.

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Figura 1. Curvas de hidrólisis pH-stat. Comparativo de la hidrólisis de proteínas de

suero lácteo con Alcalasa y hemisfericina. Tiempo máximo de reacción: 180 min.

Figura 2. Contenido de proteína soluble (Bradford) de los hidrolizados de proteínas

de suero con Alcalasa y hemisfericina a 30, 60 y 180 min de reacción.

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Figura 3. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero

comercial con Alcalasa y hemisfericina; 1 h de reacción.

Figura 4. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero

comercial; 3 h de reacción.

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Figura 5. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero

laboratorio; 30 min de reacción.

Figura 6. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero

laboratorio; 60 min de reacción.

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Figura 7. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero

laboratorio; |80 min de reacción.

Figura 8. Actividad antioxidante del radical DPPH de los hidrolizados de proteínas

de suero comercial con Hemisfericina a dos grados de hidrólisis.

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Figura 9. Actividad antioxidante del radical DPPH. Comparativo de los permeados

y retenidos de ultrafiltración, separados de los hidrolizados de proteínas de suero

comercial con Alcalasa y hemisfericina; 60 min de reacción.

IMPACTO

Los resultados muestran la importancia del tipo de tratamiento que sufren las proteínas

lácteas en su preparación industrial. Asimismo, se pudo demostrar en la presente etapa de

la investigación, que la hemisfericina, por su modo de acción más limitado y selectivo en

la hidrólisis de proteínas, es una buena alternativa para la modificación y/o mejora de las

propiedades funcionales de proteínas alimentarias subutilizadas (como son las que genera

la producción de quesos) y/o materiales proteínicos de alta calidad que por razones de ser

un subproducto que fue sometido a un procesamiento desnaturalizante han perdido su

funcionalidad y por lo tanto su aplicabilidad en formulas alimentarias. En suma, la

investigación en curso aporta información que demuestra la factibilidad de aplicación de

una preparación industrial de hemisfericina, obtenida de un recurso florístico mexicano

con potencial agroindustrial.

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