pedro acosta

Bioingeniería Agrícola 2012

I. Hechos biotecnológicos vinculados a lo que nos ofrecen como apoyo para que aprovechemos mejor los recursos naturales de nuestro planeta.

La organización celular consiste en que cada célula se encarga de desempeñar una función determinada; pero cuando muchas células similares se ayudan unas a otras para realizar una función más complicada, se convierten en un tejido. Varios tejidos forman un órgano y la suma de órganos se convierten en el organismo que representa a una especie.

El tejido meristemático significa lo último que produce un vegetal; pero también es lo nuevo, esa paradoja de la vida que posibilita la multifuncionalidad celular, es decir que las células del meristemo se juntan y diversifican sus funciones para obtener una planta nueva. Esta totipotencia es la característica más importante del tejido meristemático, el cual se utiliza en la micropropagación de varias especies vegetales que nos comemos.

El contacto del corte de un ápice meristemático o yema terminal vegetal, con el medio de cultivo que le corresponde, produce un callo, raíces adventicias y una plántula con 2n cromosomas, pues tanto las raíces como las plántulas son formas de reproducción somática.

Estas raíces son aparentemente falsas, porque no provienen de semillas, ni de la tierra como sustrato. Son raíces de laboratorio y por ese motivo, hay que hacer el enraizamiento en el invernadero, para acercarlas a la tierra usando sphagnum y agrolita, cuya mezcla 1:2 se parece a la tierra.

Lo maravilloso de la inoculación de un meristemo en su medio de cultivo estéril, es que la vida del meristemo se resiste a morir y produce enzimas que lo ponen en movimiento y le permiten aprovechar los nutrientes de su medio de cultivo para crecer, producir brotes somáticos y continuar viviendo como una planta completa igual a la de donde obtuvimos el meristemo. En este contexto, aplicando este método biotecnológico podemos evitar la extinción de algunas especies en peligro.

El cultivo de tejidos se inició cuando a alguien se le ocurrió pensar que cultivando un tejido podía obtener una planta nueva, como se obtiene con una semilla. El individuo que pensó en esto, seguramente vio como la planta curalotodo, tiene la capacidad de reproducirse sola, sin semilla, pues es una especie que se sirve de su órgano llamado hoja, la cual produce raíces adventicias que, al encontrar suelo adecuado, se convierte en una planta nueva sin medio de cultivo algunos solo con pequeños cambios a su hábitat, tales como buena tierra, humedad y luz adecuada.

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Desde el punto de vista funcional, una célula es todo, por su capacidad de vivir como un organismo unicelular y también como parte del tejido de un organismo multicelular, desempeñando, con la colaboración de otras células parecidas, todas las funciones que demanda el tejido al que pertenecen, que puede ser el tejido conductor de los nutrientes que les llevan las células de la raíz a las hojas para que, con el aprovechamiento de la luz solar por estas, ocurra el proceso de la fotosíntesis, que les permite a los vegetales ser los únicos organismos capaces de producir lo que se comen; los animales herbívoros son incapaces de producir sus alimentos, por eso devoran a los vegetales y hay carnívoros que se parasitan entre si, formando las cadenas alimenticias.

Nosotros los seres humanos, somos lo máximo en depredación y competencia, parámetros dentro de los cuales, bien podemos ubicar la sonda de Campeche y el descontrol del pozo que para fines de explotación de yacimientos profundos de petróleo, le ocurrió a cierta compañía internacional que no tiene con qué pagarle al mundo el daño ecológico que le causó, ni siquiera a USA, que fue el país más dañado y el que menos ruido hizo al respecto, porque Estados Unidos tiene una manga muy ancha para pedirles cuentas a las compañías poderosas; lo vivimos nosotros con Cananea, una de las grandes empresas que contribuyeron sin quererlo, a que la Revolución Mexicana se hiciera realidad y que pasara lo mismo con la expropiación petrolera y la Reforma Agraria, llevadas a feliz término por el mejor presidente que ha tenido México: El General Lázaro Cárdenas Del Rio, el Hombre que mas ha hecho por el Pueblo Mexicano.

El crecimiento intususcepcional (que crece desde adentro) existe porque el protoplasma que gasta una célula, por el hecho de vivir, es reemplazado por protoplasma nuevo en menor, igual o mayor cantidad, haciendo que las células permanezcan igual o que crezcan, se dividan en dos, se agrupen, cumplan funcione similares o relacionadas, pomo parte del patrimonio de un organismo multicelular. El meristemo es un tejido con células totipotenciales que trabajan para producir e protoplasma y todos los demás tejidos y órganos de una planta completa. Son maravillosas estas células porque como milusos que son, crean todos los tejidos y órganos que le exige la yema terminal de un tallo principal o secundario para convertirse en una planta nueva, después de haberse cultivado in vitro.

Órgano es un cuerpo externamente diferenciado, integrado por un grupo de tejidos. Un buen ejemplo son la raíz, el tallo y las hojas de una angiosperma, órganos que siendo diferentes en su forma, juntan sus funciones para que la planta a la que pertenecen, sea igual al modelo que Dios le asignó al crearla e introducirla en la evolución.

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Protoplasto es una célula sin membrana o pared celular; pero a nosotros los seres humanos nos corresponde investigar para qué nos sirve una célula sin membrana protectora. La lógica nos dice que, dos células sin membrana, son más fáciles de fusionarse, para intercambiar su patrimonio genético y producir un híbrido somático que a lo mejor supera a un organismo resultante de la fusión de un grano de polen con el óvulo de una flor, que es la fecundación natural, en la que se fusionan el elemento masculino con el femenino de plantas angiospermas y gimnospermas.

Mejorar una planta implica hacerla más resistente a todas las causas que le impiden rendir mas cosecha por hectárea sembrada. Estoy convencido de que esa resistencia está en la planta misma y son los protoplastos de sus variedades, especies y géneros que, al fusionarlos y sembrarlos en un medio de cultivo adecuado, obtenemos plantas nuevas fitomejoradas.

El manejo de protoplastos, con el propósito de obtener a partir de ellos, una o más plantas nuevas mejoradas genéticamente, es el paso más importante en el cultivo de tejidos vegetales, pues aislar y fusionar protoplastos que provienen del mesófilo de la hoja de una especie, no es lo mismo que aislar y fusionar protoplastos que proceden del mesofilo de las hojas de especies, géneros, familias diferentes y menos es lo mismo si los protoplastos que se van a aislar y fusionar son del reino vegetal y animal, pues en este último caso, es donde el cultivo de tejidos se parece al de un organismo genéticamente modificado, lo cual es posible hacer gracias a la biotecnología.

OGMs: Organismos Genéticamente Modificados.

Organismos que a excepción de los seres humanos han adquirido una combinación genética nueva por medio de la aplicación de técnicas derivadas de la biotecnología moderna, como la transferencia de ADN del genoma de un organismo donador al genoma de otro organismo receptor, después de haber comprobado que dicho ADN beneficia al receptor y saber si proviene de un gene que le podemos hacer llegar al receptor vía física como la electroporacion de protoplastos, microinyección y biobalistica o por vía biológica infectando con Agrobacterium tumefaciens que incorpora la secuencia transgénica al receptor.

OGMs que se cultivan actualmente en el mundo y modificación genética conferida.

Soya: Tolerancia a herbicidas y alto contenido de ácido oleico.

Maíz: Tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos.

Algodón: Tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos.

Canola: Tolerancia a herbicidas, alto nivel de laurato y alto contenido de acido oleico.

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Papa: resistencia a insectos y virus.

Arroz: resistencia a herbicidas.

Melón: maduración retardada.

Papaya: resistencia a virus.

Tomate: tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos y maduración retardada.

Tabaco: tolerancia a herbicidas.

Trigo: tolerancia a herbicidas.

Betabel: tolerancia a herbicidas.

Linaza: tolerancia a herbicidas.

Calabaza: tolerancia a virus.

Los OGMs puede producirlos cualquier empresa privada, pública o de educación superior que se interese en potenciar la capacidad de producción por hectárea de cualquier cultivo de gran importancia para la alimentación humana y animal. Lo anterior requiere permiso para hacerlo y hay que cumplir las leyes al respecto, pues no basta producir un organismo genéticamente modificado, sino de que la liberación de ese organismo, no altere la ecología del lugar donde se libera y el de otros espacios vecinos o lejanos.

Ningún organismo es perfecto, pues dentro de su patrimonio genético hay genes que lo perjudican y vale la pena identificarlos y destruirlos para evitar el daño que le causan a la variedad o especie a la que pertenecen. El microscopio de gran potencia, que no lo destruya lo que se quiere ver, el mapa genómico, la destrucción de genes con rayos laser, la electroporación de protoplastos, la microinyección, biobalistica o por vía biológica infectando con Agrobacterium tumefaciens y la experimentación biotecnológica, es el camino que debemos de seguir para modificar genéticamente en nuestro beneficio, a las especies que cultivamos en la tierra para vivir. El hecho de que Dios nos haya permitido romper la barrera de la reproducción natural nos da la responsabilidad de manejar bien dicha ruptura, pues no se trata de usarla para dañarnos a nosotros mismos, ya que no conviene construir eslabones de modificación genética que con el tiempo se conviertan en cadenas.

Aislar, fusionar y cultivar protoplastos de variedades, especies, géneros, e incluso reinos distintos, es un modo ecológico no solo de mejorar, sino también de obtener especies nuevas sin modificarles nada a los progenitores. En la Naturaleza ocurrió un

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hecho que se aproxima a lo que digo aquí: plantas de la misma especie, que producen flores masculinas en un árbol y flores femeninas en otro árbol.

La reproducción de una variedad o especie por estaca, injerto, acodo, esqueje o estolón, es una buena auxiliar del mejoramiento genético, pues una vez que la planta fue mejorada, se toma un pedazo de ella, lo sembramos en suelo húmedo con buena iluminación y nutrientes y obtenemos una planta nueva mejorada.

En Fruticultura, cuando tenemos una planta rustica y una mejorada, usamos la primera como patrón y le injertamos una yema o una púa de la segunda. Luego cortamos el patrón y dejamos que crezca el injerto, el cual obtuvimos de una planta mejorada que ya existía o de una planta que logramos aislando, fusionando y cultivando in vitro protoplastos de dos variedades de la misma o de especies distintas, pero de muy buena calidad.

La adenina o su sulfato favorecen la formación de callo in vitro. Su concentración varía de 40 a 160 mg/L de agua.

Los ácidos citidilico y guanílico hacen que crezca el callo bajo cultivo in vitro, aplicando 100 mg/L en el medio que le sirve de sustrato.

Los ácidos cítrico y ascórbico se emplean para evitar la oxidación de inóculos como el de la papa.

El ácido málico 100 mg/L, se emplea en medios para el cultivo de embriones.

En medios de cultivo para plantas monocotiledóneas, conviene usar glucosa en lugar de sacarosa.

La L-Serina es muy importante en la inoculación e iniciación de embriones haploides en cultivo de anteras.

La L-Tirosina no debe faltar en un medio de cultivo para callos.

El Mioinositol en dosis de 100 mg/L estimula el crecimiento del inóculo; pero en dósis de 500 mg/L, favorece la producción de embriones haploides procedentes de granos de polen inmaduros, aislados o extraídos de su contenedor o cultivando la antera completa inmadura.

Cultivar un tejido in vitro, para obtener un tejido igual, es una repetición que se recomienda solo para fines de investigación, pues el objetivo de la reproducción vegetal in vitro es obtener millones de plantas completas capaces de competir en precio, con planta hijas de semilla. Por esta razón, integramos la química orgánica e inorgánica con la totipotencia de hojas, meristemos, callos, células en suspensión,

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anteras y polen, protoplastos y embriones de semilla y somáticos para lograr plantas completas y competitivas y como complemento a lo anterior, Dios nos permitió modificar su obra para nuestro beneficio y bajo nuestra responsabilidad; ojalá no equivoquemos el camino y la modificación genética sea nuestra mejor aliada en la producción de más y mejores alimentos de origen vegetal y animal.

El tejido, para convertirse en una planta nueva, necesita agrupar sus células y formar un órgano. Las células totipotenciales del tejido y el órgano, conjugan su capacidad de acción transformadora y hacen posible una nueva planta igual a la de donde obtuvimos la fracción del tejido que estamos cultivando in vitro, siempre que el medio de cultivo sea el adecuado, obtenido por experimentación de medios.

El tejido para convertirse en planta, está más lejos que el órgano; sin embargo, la alta totipotencia del tejido meristemático hace posible que de ese tejido se obtenga una planta nueva y además libre de algunas enfermedades. Las células totipotenciales del tejido meristematico, rompen el obstáculo que les impedía pasar a convertirse en una planta nueva. Lo maravilloso de esta evolución es que está dentro de la planta y lo que nosotros hacemos, es sembrar un pedacito de tejido en el medio de cultivo que le pertenece para que evolucione y nos ofrezca la maravilla de una planta nueva.

El órgano está más cerca de convertirse en planta, que el tejido. No obstante, para resolver el paso de órgano a planta, Dios nos dio el callo para obtener plantas nuevas. Lástima que no estemos usando el callo para obtener plantas nuevas. La Naturaleza nos ofrece en injertos, ramas golpeadas y en cortes de tejidos y órganos tiernos diversos.

Sustancias orgánicas solubles en agua: Piridoxina o vitamina B6, acido nicotínico, glicina, thiamina o vitamina B1. Esta información es valiosa para la preparación aséptica de un medio de cultivo, pues estos compuestos no necesitan codisolventes.

Sustancias orgánicas que se codisuelven con 0.3 c.c. de una solución de 8 gramos de NaOH y 192 c.c. de agua destilada estéril por cada 10 miligramos de los compuestos siguientes que se encuentren en un medio de cultivo:

Acido 3- indolacético (AIA).

Acido 3- indolbutírico (AIB)

Acido naftalenacético (ANA)

Acido 4- clorofenoxiacético (CPA)

Acido 2, 4- diclorofenoxiacético (2,4-D)

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Acido 4- amino-3, 5, 6- trcloropicolínico (Tordón)

Sulfato de adenina.

Kinetina

Caseína

Sustancias orgánicas que se codisuelven con 0.3 c. c. de una solución de 7.3 gramos de HCl y 192.7 c. c. de agua destilada estéril por cada 10 miligramos de los compuestos siguientes que se encuentren en un medio de cultivo:

6 bencil aminopurina (BA)

6 dimetil alil aminopurina (2iP)

6 furfuril amino purina (Kinetina)

6, 4- hidroxi, 3- metil, 2- buteniladenina (zeatina)

Mioinositol

Sustancias orgánicas que se disuelven en agua:

Ácido nicotínico

Glicina

Piridoxina o vitamina B6

Thiamina o vitamina B1

Germinación aséptica de una semilla.

Actividades en la sala de lavado, secado y esterilización del laboratorio.

1. Se lavan, desinfectan por dentro y por fuera 2 cubetas pequeñas y 2 vasos de precipitado de 2 litros cada uno.

2. A una de las cubetas le vacías 950 c.c. de agua limpia, 50 gramos de detergente extran, agitas con espátula para hacer la mezcla y lavas las semillas agitando de nuevo.

3. Escurres, enjuagas con agua limpia 2 veces y vacías la semilla de la cubeta a uno de los vasos de precipitado.

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4. A la otra cubeta le agregas un litro de agua y 6 gramos de agrimycin; depositas la semilla, agitas durante 40 segundos y vuelves a agitar cada 5 minutos, otras 10 veces.

5. Escurres, enjuagas con agua limpia hasta que la cubeta y la semilla pierdan el color azul del agrimycin; pasas la semilla de la cubeta al segundo vaso y tapas con papel estraza estéril y con una o dos ligas ajustas el vaso que contiene la semilla.

6. Lavas y esterilizas por dentro y por fuera las dos cubetas y el vaso vacio, mientras que al vaso con semilla solo lo esterilizas por fuera.

Actividades en la sala de siembra del laboratorio:

1. Desinfecto por dentro y por fuera una charola y la llevo a la cámara de flujo laminar de aire, acompañada de papel estraza estéril, de las dos cubetas, del vaso con semilla, del vaso sin semilla, de un matraz de 1.5 litros con 700 c. c. de alcohol etílico y 300 c. c. de agua, así como de otro matraz del mismo volumen con 900 c. c. de agua y 100 c. c. de hipoclorito de sodio y por último, un matraz de 4 litros de volumen con 3 litros de agua destilada estéril.

2. Cubro con papel estraza estéril el interior de la charola.3. Del matraz con alcohol y agua tomo un litro y lo vacio en una de las cubetas,

le agrego la semilla del vaso; agito 30 segundos con espátula, dejo que pasen 2 minutos y vuelvo a agitar otra vez 30 segundos y dejo que pasen 2 minutos, transcurridos los cuales escuro 3 veces con agua destilada estéril del matraz de 4 litros de capacidad y paso la semilla al segundo vaso.

4. Del matraz con agua e hipoclorito de sodio tomo un litro y lo coloco en la otra cubeta, le agrego la semilla del segundo vaso; agito con espátula 30 segundos , dejo que transcurran 2 minutos y vuelvo a agitar 30 segundos y dejo que pasen 2 minutos, transcurridos los cuales, escurro y enjuago 3 veces con agua destilada estéril del matraz de 4 litros de capacidad; humedezco el papel estraza estéril del interior de la charola con agua estilada estéril y acomodo las semillas en la charola, las cubro con papel estraza estéril y las asperjo con agua estilada estéril y las transfiero a la sala de incubación.

Actividades en la sala de incubación del laboratorio de tejidos vegetales para obtener una semilla germinada estéril.

De la sala de siembra llevo la charola con las semillas a la sala de incubación, la coloco en un anaquel de incubación, le aplico 1,000 lux de intensidad luminosa, 25oC,

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fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad por día; humedezco las semillas una vez en la mañana, otra en la tarde y después de 7 días las semillas tendrán raíces asépticas de buen tamaño sin necesidad de agroquímicos.

Respecto a la microreproducción por meristemo y por otras vías, muchas especies requieren de que antes de que termine la etapa W, haya uno o dos cambios del mismo medio de cultivo para darle vigor al meristemo inoculado y a su descendencia; normalmente los cambios se hacen cada 10 días, empezando el primer cambio10 días después de la incubación, que significa 2 cambios en 20 días. No hacer este u otros cambios, daría como resultado falta de alimentos al inoculo e incluso intoxicación por falta de oxígeno. En realidad, el cambio significa sacar de la cámara bioclimática los inoculos, sembrarlos en el medio nuevo en la cámara de flujo laminar de aire y regresarlos a la sala de incubación, haciendo tantos cambios como cambios de medio necesite la especie que estamos cultivando.

Regenerar una planta, significa obtener una planta nueva por algún medio biotecnológico que puede ser la manipulación de raíces carnosas como la zanahoria y otras especies con raíces semejantes; la hoja de café y tabaco, meristemo como el de la papa y pedazo de tejido que podemos obtener de todas las especies que hemos estado reproduciendo vegetativamente a través de la Historia y que al micropropagarlas por medio de una manipulación que no les da la Naturaleza, obtenemos plantas libres de enfermedades, gracias al aislamiento del meristemo y a su velocidad de reproducción.

Una solución con reacción alcalina, nos sirve para ajustar el pH ácido de un medio de cultivo o de sustancias menos importantes.

Una solución de reacción ácida, podemos utilizarla para ajustar el pH alcalino de cualquier medio de cultivo o de otra sustancia menos importante.

200 c.c. de la solución alcalina, se obtienen con 8 gramos de NaOH y 192 c.c. de agua destilada estéril; los conservo en un frasco ámbar y tomo 0.3 c.c. para codisolver 10 miligramos de AIA, AIB, ANA, CPA, 2-,4-D, Tordón, adenina, Kinetina y caseína; de modo que para codisolver 100 miligramos de AIA, tomo 3 c.c. de esta solución.

200 c.c. de una solución ácida, se obtienen con 7.3 gramos de HCl y 192.7 c.c. de agua destilada estéril; se conserva en un frasco ámbar y tomamos 0.3 c.c. para codisolver 10 miligramos de BA, 2ip, cinetina, zeatina, mioinositol. En estas condiciones, si quiero codisolver 150miligramos de BA, tomo 4.5 c.c. de esta solución.

Hay sustancias orgánicas que no necesitan codisolventes porque se disuelven en agua como el ácido nicotínico, glicina, thiamina y piridoxina o adermina, entre otras.

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La producción de plantas in vitro, se reduce a saber qué sustancias orgánicas e inorgánicas requiere la variedad prototipo de la especie que deseamos micropropagar, así como las actividades de las etapas que abarca la micropropagación vegetal que son la etapa W: Establecimiento del cultivo de papa; etapa X: Multiplicación de propágulos sanos de papa; etapa Y: Enraizamiento y aclimatación de plantas de papa del laboratorio en el invernadero y etapa Z: Trasplante de plantas de papa en suelo del invernadero y acondicionamiento de este suelo. En la etapa W se produce el material vegetativo que en la etapa X microreproducimos por medio de subcultivos sucesivos para producir grandes cantidades de plantas para que en la etapa Y las enraicemos y en la etapa Z las trasplantemos del invernadero y de allí obtener meristemos para repetir cuantas veces queramos, las 4 etapas de la propagación vegetal in vitro, así como obtener plantas comerciales para que los agricultores las adquieran y cultiven en sus tierras y nos beneficiemos todos con la producción lograda.

Las sales inorgánicas, la sacarosa y el agar o phytagel de un medio de cultivo, se disuelven en un vaso de precipitados, se vacían en el contenedor o contenedores que se van a introducir en la autoclave para que se esterilicen, dividiendo el contenido del vaso entre el número de contenedores, ajustando el pH de cada contenedor, al pH que le corresponde al medio de cultivo de que se trata, haciendo dicho ajuste antes de depositar el agar o el phytagel en el contenedor. Los siguientes pH aclaran este punto: 5.7= pH del cultivo de papa, del clavel, del crisantemo y protoplastos de tabaco; 5.6= pH del medio de cultivo de zanahoria; 5.8 pH del cultivo de anteras de tabaco; 4.8= pH del cultivo de raíces de tomate; 5.8 = pH del medio de cultivo de células en suspensión.

El complemento de las sales inorgánicas, sacarosa y agar o phytagel de un medio de cultivo, son compuestos orgánicos solubles e insolubles en agua y tanto los primeros como los segundos, se aplican a los contenedores después de que fueron extraídos de la autoclave, antes de que gelifique el agar, usando codisolventes para las sustancias insolubles en agua y filtro millipore, sean solubles o insolubles las sustancias.

Para esterilizar 3 litros de un medio de cultivo, necesitamos contenedores cuyo volumen sea más o menos el doble o sean 3 matraces de 2 litros cada uno. La esterilización de 50 litros de un medio de cultivo, requeriría 50 matraces de 2 litros cada uno que pondrían a trabajar a varias autoclaves al mismo tiempo o una que repitiera el trabajo en función de su capacidad para esterilizar.

El aislamiento celular, su cultivo en suspensión e inducción a protoplastos, siembra de protoplastos, fusión o cruzamiento de protoplastos para obtener células híbridas,

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cultivos de células híbridas para que se dupliquen, tripliquen y originen grupos, estos produzcan colonias de células, las cuales se inducen a callo y este a plántulas. Si a lo anterior le sumamos el análisis químico de los sobrenadantes, vamos a obtener productos bioquímicos secundarios, producidos por las células cultivadas en suspensión; por lo tanto, la regeneración vegetal y producción de sustancias químicas por biosíntesis, son las dos biotecnologías más importantes de la microreproducción vegetal.

Un bioreactor es un aparato fermentador para producir embriones somáticos de plantas como zanahoria y apio, que por ser anuales, las afecta menos la inestabilidad genética de los de los embriones somáticos.

Problemas de la reproducción in vitro de especies vegetales inducidas a formación de embriones somáticos para que a partir de ellos podamos obtener una planta nueva.

1. Inestabilidad genética de los embriones, cuyo efecto es menor en plantas anuales.

2. En especies perennes, la inestabilidad genética de los embriones somáticos se manifiesta de maneras diferentes, tales como: menos cosecha, mas susceptibilidad a plagas y enfermedades, menor respuesta a la aplicación de nutrientes, debilitamiento del sistema radicular y menos tiempo de vida, problemas que podemos resolver incorporándole células madre o totipotenciales al inóculo o a su producto recién obtenido.

3. El hecho de que un embrión somático joven, sea preferible a un embrión viejo, constituye un problema que debe resolverse con el uso de células totipotentes obtenidas de meristemos cultivados en suspensión e inducidas a protoplastos, fusionar estos y lograr plantas mejoradas.

Con biotecnología más sofisticada, podemos obtener líneas de embriones somáticos, capaces de dar origen a una descendencia sin variaciones genéticas perceptibles en el fenotipo a corto, mediano y largo plazo.

La producción de semillas artificiales , es un suceso biotecnológico que consiste en encapsular embriones somáticos de una línea, usando alginato de sodio, sembrándolos como una semilla en el invernadero, usando vermiculita o arena y comprobando el comportamiento de estas “semillas” a la humedad, temperatura del suelo y densidad de siembra comparados con el comportamiento de plántulas originarias de semilla.

Embriones somáticos directos: Brotes adventicios o yemas nuevas formadas en entrenudos e incluso en hojas; pero no en axilas foliares.

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Embriones somáticos indirectos: Brotes o yemas nuevas que nacen sobre un callo y más confiables que los directos, desde el punto de vista genético.

Bancos de genes biotecnológicos: Colección, multiplicación y distribución de genes de plantas de élite o de plantas en peligro de extinción, obtenidos del cultivo in vitro de sus células, tejidos u órganos y conservados por aletargamiento del crecimiento o por congelamiento (criopreservación).

El CIMMYT en México, el Centro Internacional de la Papa en Lima, Perú y el Instituto de Agricultura Tropical en Ibadán, Nigeria, representan lo mejor que hay en el mundo en materia de bancos de genes Biotecnológicos.

La búsqueda moderna de la variación genética vegetal, se ha dirigido hacia caminos que se apartan de la célula reproductora y se acercan a la célula somática, porque esta, cuando se manipula bien, se comporta como la célula reproductora, con la ventaja de que tiene el doble de cromosomas que, con la inducción a Protoplasto y callo, bien manejados, originan plantas nuevas descendientes de plantas mejoradas genéticamente por el método tradicional.

Somatoclonalogía: Ciencia que estudia el comportamiento genético de células, tejidos y órganos cultivados in vitro para regenerar y mejorar genéticamente a una especie y sus variedades.

Variaciones somaclonales: Variaciones de un clon, en función de su origen y de su manejo.

Orígenes de un clon: Un clon puede ser hijo de un meristemo, de una hoja o de cualquier parte de un vegetal, siempre y cuando tenga un origen genotípico igual.

Si solo quedara una variedad de una especie vegetal cualquiera, la especie de donde provienen estaría en peligro de extinción; podemos evitar su muerte cultivando sus células en suspensión, aislarlas y conservarlas en tubos de ensayo en Nitrógeno liquido por tiempo indefinido y después manipularlas para regenerar una planta nueva.

Las células madre vegetales, se llaman totipotenciales y cumplen la misma función que la de las células madre de origen humano, es decir, son células que ayudan a otras a formar tejidos, los tejidos se juntan para formar órganos diferentes y el conjunto de órganos integran un organismo nuevo, por eso se llaman células madre. y si son capaces de regenerar a un organismo por etapas, pueden resolver la disfuncionalidad de un órgano como el páncreas, el hígado o de cualquier otro órgano que reciba células madre provenientes del organismo al que pertenece el

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órgano y de ese modo evitar el rechazo. La cura de enfermedades con células madre, puede darle un cambio de dirección a la producción de medicinas.

Especies fáciles de regenerar por medio del cultivo de anteras: Tabaco, chile pimiento, girasol, petunia, trigo, cebada, arroz, triticale, maíz, soya y calabaza.

Especies difíciles de regenerar por androgénesis (cultivo de anteras): Jitomate, leguminosas excepto soya, compuestas excepto girasol.

Especies fáciles de regenerar por ginogenesis (cultivo de óvulos): Gerbera, remolacha, betabel.

Irradiar los granos de polen, significa prepararlos para que se fusionen entre sí (autofecunden) y produzcan plantas diploides como ocurre en la reproducción natural (fusión de polen y ovulo).

Las plantas haploides de origen androgenésico y ginogenésico, cuando se tratan con colchicina al 60% producen líneas haploides dobles o híbridos que heredan las cualidades obtenidas con el tratamiento de colchicina; también se consiguen plántulas con material genético que se puede usar para modificar el mapa genómico de una especie y con la modificación potenciar su resistencia a fenómenos adversos y su capacidad de producción. En este contexto, la modificación del mapa genómico se convierte en un mecanismo de fitomejoramiento.

La esterilidad masculina tiene como progenitores a las mitocondrias del citoplasma, que son capaces de inducir a la esterilidad masculina, herencia que solo es posible, si enriquecemos las células progenitoras con mitocondrias. Un medio de cultivo, que induzca a células en suspensión a producir más mitocondrias de las que se producen en el medio de cultivo conocido, nos resuelven el problema al que debemos agregar, mecanismos de manipulación.

Cuando logremos que estas biotecnologías se materialicen en la obtención de una tuna sin semilla, la agricultura mexicana va a ser una de las agriculturas más biotecnológicas del mundo, porque la tuna es una de las maravillas que Dios nos dio para que, sin semilla, la hagamos llegar al mundo entero.

No podemos entender el comportamiento de la vida y su capacidad de reproducirse, sin estudiar a fondo el citoplasma, pues tiene la capacidad de heredar ciertas características como la esterilidad y que termina vinculándose a los cromosomas del núcleo, que, damos por hecho, son los responsables de las características genotípicas y fenotípicas de cualquier especie y sus variedades.

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Fusionar protoplastos de células hijas del meristemo de dos variedades de la misma especie o de especies distintas que se complementan, resulta interesante porque el meristemo es rico en células totipotenciales o células madre.

Esta biotecnología nos puede producir superplantas en producción, resistencia a enfermedades, plagas, factores climáticos adversos y crear condiciones para investigar necesidades de nutrición y potencial para cruzarse en forma natural con plantas de su misma especie o de otra u otras especies.

La combinación de la electricidad con la biología, comienza cuando conectamos la autoclave con la fuente eléctrica; pero es seguro que no tarda en inventarse un aparato que la vincule más directamente con el proceso reproductivo de vegetales y animales.

Cuando se conoce el medio de cultivo de la variedad de una especie determinada, solo queda aplicarlo para regenerara dicha variedad, si no se conoce, hay que hacer un experimento para encontrar el más conveniente.

En 1994 Calgene creó la primera planta transgénica comercial, un jitomate de larga vida de anaquel, al que le suprimió la función de la enzima poligalacturonasa, usando un gene antisentido que introdujo en el genoma del jitomate.

En 1960, Cocking demostró que se podían aislar y fusionar grandes cantidades de protoplastos por métodos enzimáticos, lo cual se sobreentiende si tomamos en cuenta que 1 c.c. tiene 0.5*2.5*105= 125,000 protoplastos.

La fusión de protoplastos de células meristematicas con células reproductoras de dos variedades de una misma especie o de especies distintas que se complementan, es una biotecnología que nos puede dar sorpresas en el área de fitomejoramiento.

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II. Nexos de la reproducción vegetal in vitro con la Química Orgánica e Inorgánica.

El vinculo más visible entre las partes de las plantas que se pueden cultivar in vitro y la Química Orgánica e Inorgánica, son los medios de cultivo y estos se materializan siguiendo dos caminos: El de las sales minerales inorgánicas y el de los compuestos orgánicos que las complementan. La tabla 1 se refiere a las sales inorgánicas del medio de cultivo de cultivo y contiene 15 propuestas, de las cuales la más popular es la de Murashige y Skoog, 1962. Estos dos investigadores, hicieron posible que las mezclas de sales inorgánicas no explotara al combinarlas y además que fuera muy exitosa; por esas causas su propuesta es la que más se usa. La tabla 2 (Capitulo V) contiene los reactivos para micropropagar 50 yemas terminales o ápices meristematicos de clavel y resulta interesante hablar del complemento a los 14 compuestos que propusieron Murashige, T. y Skoog, F. en 1962 y de otros compuestos que complementan a otros medios como el de la Tabla 5.

Vitamina B1 o Thiamina: Es un sólido cristalino de color blanco, soluble en agua, insoluble en las grasas, que funde a los 2450C, tiene reacción alcalina, es estable a la acción del aire y de los ácidos orgánicos diluidos. La destruyen los álcalis, sulfitos, radiación ultravioleta y el calor de la autoclave.

Su formula molecular es C12 H18 N4 OSCl2 y la estructura establecida por Andersag y Westphal es:

OH Cl

N C CH2 N C CH3

CH3 C C NH3Cl CH C CH2 CH2 OH

N S

Thiamina o Vitamina B1

Actúa como catalizador en la síntesis de proteínas, glúcidos, lípidos y otros alimentos que hacen posible el crecimiento, la reproducción y una serie compleja de procesos químicos conocidos colectivamente como metabolismo vegetal.

15


Piridoxina o Vitamina B6: Es soluble en agua, soporta medianamente el calor, es inestable a la luz, propicia la división celular y el metabolismo de las proteínas. Su formula molecular es: C8H11NO3.

El ácido nicotínico o Niacina, tan pronto llega a un organismo, se transforma rápido en la vitamina llamada nicotinamida y ambos se presentan en cristales incoloros solubles en agua, acetona y benzol. Al reaccionar con ácidos y bases forman sales. Son estables a los álcalis y al calor. Las formulas estructurales del ácido nicotínico y la nicotinamida son:

COOH CONH2

N N

Ácido nicotínico Nicotinamida

Las vitaminas son sustancias orgánicas de las cuales los tejidos requieren muy poca cantidad para sus funciones y crecer sin problemas.

La función de las vitaminas en los seres vivos consiste en controlar la participación de las proteínas, glúcidos, lípidos, minerales y agua en el proceso de desarrollo de las plantas y animales.

Las proteínas son sustancias de composición muy compleja, se forman con carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y otras veces por azufre, fósforo, hierro, cobre, yodo, etc. y se producen en el metabolismo de los organismos animales y vegetales. Son de gran peso molecular, muy inestables y por desintegración progresiva, producen varias sustancias, entre ellas los aminoácidos, de los cuales se caracterizan por contener en su molécula, además del carboxilo (-COOH), uno o más aminos (-NH2).

Glicina: Ácido monoamino-monocarboxilico, cuya fórmula estructural es: CH2-CO.OH. NH2

Se presenta en cristales incoloros muy solubles en agua.El Mioinositol es un compuesto orgánico que complementa la acción de los aminoácidos en el vegetal, que en este caso es el clavel (Tabla 2).El fosfato ácido de sodio hidratado, complementa al fosfato ácido de potasio y hacen más positiva la acción de los otros componentes del medio de cultivo de la Tabla 2.

16


La sacarosa se convierte en glucosa por la acción enzimática del meristemo y esto la hace comparable a la fotosíntesis, por eso la azúcar es muy importante para el medio de cultivo que necesita cada especie que se reproduce in vitro, debido a que es una fuente de carbono y energía, necesarios para los procesos bioquímicos del inoculo, cualquiera que sea este.El BA (6 Bencil aminopurina) es una hormona del grupo de las citocininas cuya fórmula estructural es:

NH

N N CH2

NH N

Y su función es la de hacer que ese pedacito de tejido llamado meristemo o yema terminal del clavel, se convierta en una planta nueva con la acción combinada de los demás compuestos del medio de cultivo(Tabla 2), para la especie mencionada.La cinetina es una citocinina sintética muy potente en su actividad citocinica que consiste en estimular la división celular y el crecimiento en numero de las células del inoculo y del inoculo mismo en tamaño.Su formula estructural es la siguiente: H N CH2

O

N N

N

N H

17


Cinetina (6 Furfuril adenina).

El phytagel es un material de soporte que le da humedad al meristemo y sostén para que este se adhiera al sembrarlo en el tubo de ensayo durante la etapa de establecimiento del cultivo aséptico de clavel o en los frascos durante la multiplicación de propágulos sanos.

Antes de aplicar el phytagel, ajusto a 5.7 el pH del medio de cultivo para clavel, pues mis comentarios sobre el complemento de las sales inorgánicas de Murashige, T. y Skoog, F. ya los expuse con anterioridad y aclaro que la Thiamina, Piridoxina, Ácido nicotínico, Glicina, Mioinositol y BA (6-Bencil-aminopurina), se incorporan al medio de cultivo después de que los demás componentes fueron esterilizados en la autoclave; esta incorporación la hacemos en la Cámara de Flujo Laminar de aire o en una área estéril creada con mecheros, pantalla y lámpara de luz ultravioleta.

El AIA (Ácido indol-3-acetico) es una auxina que favorece el crecimiento de brotes de meristemos cultivado en tubos de ensayo de 15 centímetros de largo y 2.5 centímetros de diámetro con 20 c.c. del medio de cultivo e inoculados durante 5 semanas a 200C, 16 horas luz, 8 de oscuridad, 3,000 lux de intensidad lumínica y 70 % de humedad relativa.

Esta auxina funciona como un ácido débil y su formula corresponde a la siguiente estructura:

CH2COOH

N H

AIA (Ácido indol-3-acetico).

18


El ácido Naftalenacético (ANA), es un ácido débil que forma parte de las auxinas y se considera un regulador del crecimiento celular, porque estimula la elongación o alargamiento de las células del inoculo; su formula estructural es:

Ácido Naftalenacético (ANA)

Reguladores de crecimiento.

Controlan el crecimiento vegetal haciendo que las células pasen de una posición a otra por estiramiento y alcancen su límite; otras células repiten lo que hicieron las primeras y así sucesivamente se va logrando el crecimiento armónico individual de cada célula y la diversificación de sus funciones, lo cual se manifiesta en la totipotencialidad o capacidad de producir cualquier tipo de célula, como ocurre con las células del parénquima y del meristemo, cuya totipotencialidad se ha comprobado en los protoplastos aislados y cultivados y en el meristemo, ya que tanto protoplastos como meristemos producen plantas nuevas.

Las auxinas y giberelinas propician la elongación celular y las citocininas la división de la célula cuya acción conjunta termina haciendo crecer a la pequeña fracción de tejido que se cultiva in vitro.

Grupos de sistemas químicos reguladores del crecimiento vegetal.

Grupo 1: Promotores del crecimiento

Auxinas.

CH2COOH

N

19

CH2COOH


H

Ácido indol-3-acetico (AIA)

CH2-CH2-CH2-COOH

N

. H

Ácido 3- indolbutírico (AIB)

CH2COOH

Ácido naftalenacético (ANA)

O CH2COOH

Cl

20

H

H H C H

C – H C

HO – C - H H - C


Cl

Ácido 2,4-Diclorofenoxiacetico (2,4-D)

Esta sustancia funciona como herbicida cuando se aplica en alta concentración a especies que compiten con los cultivos, a los que les produce un crecimiento desequilibrado que les provoca la muerte.

Giberelinas

Giberelina GA 1

Ácido giberélico (GA 3)

Se emplea en el medio de cultivo de meristemos de algunas especies, para obtener plantas libres de virus.

21

C

OHCH3

O

COOH

OH

CH2

O

C

H

H -- C -- H

C -- OH

H

C

H

H

C – H

H

H

C

H

C

C

C=0H

COOH

COOH

O C H2 C O O H CL

HN

HN

O


Giberelina GA 4

Giberelina GA 10

Antagonistas auxínicos o anti auxinas.

Son sustancias que aplicadas exógenamente estimulan el crecimiento radicular de las plantas que las reciben. Con ellas, con el raizone plus y el radix 1,500, se pueden hacer trabajos de investigación muy interesantes respecto al crecimiento de las raíces de las plantas en el invernadero.

Veamos como ejemplo las estructuras siguientes:

Ácido 2,6-diclorofenoxiacético

22

CH3CH2

=C0H

CH3

OHCH3

O

CL

O

CH3O – COOH CH3


Hidrácida maleica

2,4-dicloroanisol

Ácido 4-clorofenoxiisobutírico.

Citocininas.

Son sustancias de la química orgánica que favorecen la citocinesis o división celular de una pequeña fracción de planta cultivada in vitro, que puede ser un meristemo, ápice de raíz, primordio de hoja, parte inmadura de una flor, parte de un fruto inmaduro, fracción de un callo, pedazo o totalidad de un embrión maduro e inmaduro, ovario, ovulo, antera, grano de polen, fracción de un tallo joven con una

23

OCH3

CL

CL

CL


yema axilar, parte de una hoja, pedazo de diente de ajo, de papa, camote, yuca, plátano, maguey, henequén, protoplastos, etcétera.

Adenina

6 Isopentenil amino purina (IPA)

Zeatina

Grupo 2: Inhibidores del crecimiento vegetal.

24

N ―C ― NH2

HC C ― NH

CH

N ― C― N

H CH

H2 C = C

HN C CH3

C

N

HN

N

N

H CH2OH

H2 C = C

HN C CH3

N

NH

N

N


Son compuestos de la química del Carbono que obstaculizan la división y elongación de las células de la parte de un tejido vegetal sometido a cultivo in vitro, especialmente cuando investigamos los efectos de cada una de estas sustancias en el crecimiento del tejido bajo cultivo, pues no forman parte del medio, ya que las usamos solo para conocer su efecto en el inoculo.

Ácido abscísico o dormina.

La reducción del fotoperiodo a fines del verano y durante el otoño pueden estimular la formación de este ácido, el cual posibilita la latencia, vejez, y caída de la hoja antes de madurar y morir.

Cumarina

Esta lactona se encuentra en la semilla de los tréboles, de donde pasa al suelo, afectando la elongación de la semilla de otras plantas. Es un caso típico de alelopatía o sea que una planta por medios químicos, inhibe el crecimiento de otra o de otras.

25


Terpenos: Son excretas del metabolismo de las células vegetales, desechos que se transforman en esencias y resinas.

Geraniol.

Es un líquido de olor a rosa y está presente en las esencias de geranio, rosa, limón, citronela, etcétera.

Eucaliptol.

Es un líquido claro, insoluble en agua, huele a alcanfor y es el componente principal del aceite de eucalipto.

La guerra química entre diferentes especies de plantas, hace posible que cada especie produzca sustancias alelopáticas para competir con las demás y evitar su extinción; las sustancias que producen los olores en las plantas y los antibióticos que producen los hongos Penicillium notatum y P. chrisogenum, son lo máximo en materia de sustancias alelopáticas. Estudiar cada una de estas plantas olorosas en combinación con otra especie, nos permitirá conocer su capacidad alelopática en vegetales e insectos y después usarlas en lugar de herbicidas e insecticidas, beneficiando con ello al medio ambiente y a nosotros mismos.

Grupo 3 Eteno o etileno.

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H2=CH2

Eteno o etileno

Es un gas incoloro que se emplea para acelerar la maduración de frutas, como limones, manzanas, toronjas, plátanos, jocote, etc... También actúa como hormona al hacer crecer brotes de tubérculos como papa, yuca, camote.

Si carecemos de medio de cultivo, tampoco tenemos donde inocular o sembrar el meristemo, el embrión, el pedazo de callo o lo que sea que vayamos a cultivar in vitro y como resultado no se cumple el objetivo de la microreproducción vegetal, que es el de obtener muchas plantas nuevas a partir de una fracción de tejido u órgano de la planta madre.

En la actualidad ya se conocen los medios de cultivo de varias especies, de modo que solo hay que ponerlos en práctica para reproducir in vitro la especie cuyo medio se conoce.

La experimentación con medios de cultivo y sus contactos con la Bioestadística.

Cuando desconocemos el medio de cultivo de la especie que deseamos micropropagar, necesitamos hacer nuestro propio medio, valiéndonos de un experimento como el siguiente que abarca 4 medios diferentes con 5 repeticiones cada uno, para cuyo fin realizamos el siguiente guion:

1. De la Tabla 1, escogemos las sales inorgánicas de Murashige, T. y Skoog, F., quienes las propusieron en 1962.

2. Determinamos los compuestos orgánicos que complementan las sales inorgánicas del punto 1 y son: (Por cada litro de agua)

0.1 mg. de tiamina.

0.5 mg. de Piridoxina

0.5 mg de ácido nicotínico

2.0 mg de glicina

100.0 mg de Mioinositol

50 mg de NaH2PO4.H2O

30,000.0 mg de sacarosa

0.1 mg de BA

27


2,500.0 mg de phytagel.

pH=5.7

3. Tener a la mano 5 tubos de ensayo esterilizados o esterilizarlos si no disponemos de ellos para que reciban cada uno 20 c.c. del medio de cultivo anterior, al que llamaremos “A” y del que necesitamos 100 c.c. nada más, lo cual materializamos en la Tabla “A”; lo cierto es que la Tabla “A” se toma como testigo en este experimento.

4. El medio de cultivo ”B”, requiere lo mismo que el “A”, con la circunstancia de que los 100 c.c. de medio difieren en 0.5 miligramos de glicina por litro de agua, el mioinositol difiere en 20 miligramos, el fosfato ácido de sodio hidratado en 10 y la sacarosa en 5,000, como se observa en la Tabla “B”.

5. El medio “C”, difiere del “B” en 1 miligramo de glicina, 50 de mioinositol, 20 de NaH2PO4.H2O y 5,000 de sacarosa por litro de agua.

6. El medio “D”, no es igual al “C” porque el primero tiene 0.20 miligramos de glicina menos por litro de agua, 10 miligramos menos de mioinositol, 10 miligramos menos de NaH2PO4.H2O y 5,000 miligramos de sacarosa menos que “C”.

En el cuadro 1 distribuyo los medios acompañados de su producción de brotes en cada repetición.

En el cuadro 2 anoto el rendimiento en brotes de cada medio en cada repetición con su total y su media, así como el total por repetición y su media, continuando los cálculos hasta determinar cuál de los cuatro medios es el mejor.

Un experimento como este, nos ayuda a saber cuál de los cuatro medios de cultivo diferentes es el mejor, en este caso para el crisantemo.

Anexo las Tablas 1, “A”, “B”, “C”, “D”, y “E”; los cuadros 1 y 2; la suma de los cuadrados, el cuadro 3, E. T. D, factor de variación, tabla de F y tabla de t.

28


Tabla I. Mezcla de sales para medio de cultivo de vegetales (mg/l) (Parte A/1)

F o r m u l a c i ó n

Sales Gamborg, Miller y Ojima, 1968

Gautheret, 1942

Heller,1953

Hildebrandt, Ricker y Duggar,1946

Knudson, 1946

Margara, Rencillac y Bouniols, 1966

Morel y Muller, 1964

Cloruro de aluminio

- - 0.03 - - - -

Nitrato de amonio

- - - - - - -

Fosfato de amonio

- - - - - - -

29


Sulfato de amonio

134 - - - 500 - 1,000

Sulfato de berilio

- 0.1 - - - - -

Ácido bórico 3.0 0.05 1.0 0.375-3.0 - - -

Cloruro de calcio

150 - 75 - - - -

Nitrato de calcio

- 500 - 400-800 1,000 472 500

Fosfato de calcio

- - - - - - -

Cloruro de cobalto

0.025 0.05 - - - - -

Sulfato cúprico

0.025 0.05 0.03 - - - -

Cloruro férrico

- - 1.0 - - - -

Citrato férrico

- - - - - 10 -

Sulfato férrico

- 50 - - - - -

Tartrato férrico

- - - 40-5 - - -

Sulfato ferroso

27.8 - - - 25 - -

Sulfato de magnesio

250 125 250 180-720 250 738 125

Sulfato de manganeso

10 - - - - - -

Continúa Tabla I (Parte A/2)

Sales Gamborg, Miller y Ojima, 1968

Gautheret, 1942

Heller,1953

Hildebrandt, Ricker y Duggar,1946

Knudson, 1946

Margara, Rencillac y Bouniols, 1966

Morel y Muller, 1964


- 3 0.1 4.5 7.5 - -

Cloruro de níquel

- - 0.03 - - - -

30


Sulfato de níquel

- 0.05 - - - - -

Cloruro de potasio

- - 750 65-130 - - 1,000

Ioduro de potasio

0.75 0.4 0.01 2-0.274 - - -

Nitrato de potasio

2,500 125 - 80-160 - 2,020 -

Fosfato de potasio

- 125 - - - - -

Sal sódica de etilen dinitril tatracetato

37.3 - - - - - -

Molibdato de sodio

0.25 - - - - - -

Nitrato de sodio

- - 600 - - 2040 -

Fosfato de sodio

150 - 125 33-132 - - -

Sulfato de sodio

- - - 800-100 - - -

Ácido sulfúrico

- 0.001 - - - - -

Óxido de titanio

- 0.2 - - - - -

Sulfato de zinc

2.0 0.18 1.0 6 3 - -

Tabla I. Mezcla de sales para medio de cultivo de vegetales (mg/L) (Parte B/1)

F o r m u l a c i ó n

Sales Murashige y Skoog, 1962

Nitsch y Nitsch, 1969

Schenk y Hildebrandt, 1972

Torrey, 1964 Tripathi, 1968

Vacin y Went, 1949

White, 1963

31


Cloruro de aluminio

- - - - 0.006 - -

Nitrato de amonio

1,650 720 - - - - -

Fosfato de amonio

- - 300 - - - -

Sulfato de amonio

- - - - - 500 -

Sulfato de berilio

- - - - - - -

Ácido bórico 6.3 10 5.0 1.5 0.1 - 1.5

Cloruro de calcio

440 166 100 - 300 - -

Nitrato de calcio

- - - 242.0 - - 300.0

Fosfato de calcio

- - - - - 200 -

Cloruro de cobalto

0.025 - 0.1 - - - -

Sulfato cúprico

0.025 0.025 0.02 0.04 0.002 - -

Cloruro férrico

- - - 1.5 0.3 - -

Citrato férrico

- - - - - - -

Sulfato férrico

- - - - - - 2.5

Tartrato férrico

- - - - - 26 -

Sulfato ferroso

27.8 27.8 15 - - - -

Sulfato de magnesio

370 185 400 42.0 250 250 720.0


16.9(22.3)* 25 10.0 4.5 - - -

Continúa Tabla I (Parte B/2)

Sales Murashige y Skoog, 1962

Nitsch y Nitsch, 1969

Schenk y Hildebrandt, 1972

Torrey, 1964 Tripathi, 1968

Vacin y Went, 1949

White, 1963

32



- - - - 0.02 7.5 7.0

Cloruro de níquel

- - - - 0.06 - -

Sulfato de níquel

- - - - - - -

Cloruro de potasio

- - - 61.0 - - 65

Ioduro de potasio

0.83 - 1.0 - 0.01 - 0.75

Nitrato de potasio

1,900 950 2,500 85.0 - 525 80.0

Fosfato de potasio

170 68 - 20.0 - 250 -

Sal sódica de etilen dinitril tatracetato

37.3 37.3 20 - - - -

Molibdato de sodio

0.25 0.25 0.1 0.25 - - -

Nitrato de sodio

- - - - 1,200 - -

Fosfato de sodio

- - - - 250 - 16.5

Sulfato de sodio

- - - - - - 200

Ácido sulfúrico

- - - - - - -

Óxido de titanio

- - - - - - -

Sulfato de zinc

8.6 10 1.0 1.5 0.3 - 3.0

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 100cc(**)1- NH4 NO3 1650.000 165.00002- KNO3 1900.000 190.00003- MgSO4.7H2O 370.000 37.00004- MnSO4.4H2O 22.300 2.23005- ZnSO4.4H2O 8.600 0.86006- CuSO4.5H2O 0.025 0.0025

33


7- CaCl2.2H2O 440.000 44.00008- KI 0.830 0.08309- CaCl2.6H2O 0.025 0.002510- KH2PO4 170.000 17.000011- H3BO3 6.200 0.620012- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.025013- FeSO4.7H2O 27.810 2.781014- Na2EDTA

COMPLEMENTO15- Thiamina 0.100 0.010016- Piridoxina 0.500 0.050017- Ácido nicotínico 0.500 0.050018- Glicina 2.000 0.200019- Mioinositol 100.000 10.000020- NaH2PO4.H2O 50.000 5.000021- Sacarosa 30,000.000 3,000.000022- BA 0.100 0.010023- pH=5.7 0.000 0.000024- Phytagel 2,500.000 250.0000

Tabla “A”. 100 c.c. del medio de cultivo de esta Tabla, para el crisantemo, que se toma como testigo para aplicarlos en 5 meristemos de dicha especie (20 c.c. por meristemo y tubo de ensayo)

(*) Sales inorgánicas de Murashige, T. y Skoog, F.

(**) Miligramos que reciben los 100 c.c. de medio de cultivo.

Tabla “B”. 100 c.c. del medio de cultivo de esta Tabla, que difiere de “A” para comparar sus resultados de brotes, aplicados en 5 meristemos de crisantemo (20 c.c. por meristemo y tubo de ensayo

34


No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 100cc(**)1- NH4 NO3 1650.000 165.00002- KNO3 1900.000 190.00003- MgSO4.7H2O 370.000 37.00004- MnSO4.4H2O 22.300 2.23005- ZnSO4.4H2O 8.600 0.86006- CuSO4.5H2O 0.025 0.00257- CaCl2.2H2O 440.000 44.00008- KI 0.830 0.08309- CaCl2.6H2O 0.025 0.002510- KH2PO4 170.000 17.000011- H3BO3 6.200 0.620012- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.025013- FeSO4.7H2O 27.810 2.781014- Na2EDTA 37.310 3.7310

COMPLEMENTO15- Thiamina 0.100 0.010016- Piridoxina 0.100 0.010017- Ácido nicotínico 0.500 0.050018- Glicina 1.500 0.150019- Mioinositol 80.000 8.000020- NaH2PO4.H2O 40.000 4.000021- Sacarosa 25,000.000 2,500.000022- BA 0.100 0.010023- pH=5.7 N. A. N. A.24- Phytagel 2,500.000 250.0000



Tabla “C”. 100 c.c. del medio de cultivo de esta tabla, que difiere de “A” y “B” para comparar sus resultados de brotes, aplicados a 5 meristemos de crisantemo (20 c.c. por meristemo y tubo de ensayo.

35


No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 100cc(**)1- NH4 NO3 1650.000 165.00002- KNO3 1900.000 190.00003- MgSO4.7H2O 370.000 37.00004- MnSO4.4H2O 22.300 2.23005- ZnSO4.4H2O 8.600 0.86006- CuSO4.5H2O 0.025 0.00257- CaCl2.2H2O 440.000 44.00008- KI 0.830 0.08309- CaCl2.6H2O 0.025 0.002510- KH2PO4 170.000 17.000011- H3BO3 6.200 0.620012- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.025013- FeSO4.7H2O 27.810 2.781014- Na2EDTA 37.310 3.7310

COMPLEMENTO15- Thiamina 0.100 0.010016- Piridoxina 0.100 0.010017- Ácido nicotínico 0.500 0.050018- Glicina 0.500 0.050019- Mioinositol 30.000 3.000020- NaH2PO4 20.000 2.000021- Sacarosa 20,000.000 2,000.000022- BA 0.100 0.010023- pH =5.7 N. A. N. A.24- Phytagel 2,500.000 250.0000


(**) Miligramos que reciben los 100 c. c. de medio de cultivo.

C

No Sales inorgánicas *mg/L. M. S. ** mg/L para 100 c. c.1- NH4 NO3 1650.000 165.00002- KNO3 1900.000 190.00003- MgSO4

.7H2O 370.000 37.00004- MnSO4

.4H2O 22.300 2.23005- ZnSO4

.4H2O 8.600 0.86006- CuSO4

.5H2O 0.025 0.00257- CaCl2

.2H2O 440.000 44.00008- KI 0.830 0.0830

36


9- CaCl2.6H2O 0.025 0.0025

10- KH2PO4 170.000 17.000011- H3BO3 6.200 0.620012- Na2MoO4

.2H2O 0.250 0.025013- FeSO4

.7H2O 27.810 2.781014- Na2EDTA 37.310 3.7310

COMPLEMENTO15- Thiamina 0.100 0.010016- Piridoxina 0.500 0.050017- Ácido nicotínico 0.500 0.050018- Glicina 0.300 0.030019- Mioinositol 20.000 2.000020- NaH2PO4 10.000 1.000021- Sacarosa 15,000.000 1,500.000022- BA 0.100 0.010023- pH=5.7 N. A. N. A.24- Phytagel 2,500.000 250.0000

Tabla “D”. 100 c.c. del medio de cultivo de esta tabla, que difiere de “A” “B” y “C” para comparar su producción de brotes, aplicados a 5 meristemos de crisantemo (20 c.c. por meristemo y tubo de ensayo.

* Sales inorgánicas de Murashige, T. y Skoog, F.

** Miligramos que reciben los 100 c. c. de medio de cultivo.

D

Tabla “E”. Suma del peso de los reactivos de las tablas “A”,”B”,”C” y “D”, capitulo II.

No.

Sales inorgánicas mg/L. M. S. mg para “A”, “B”, “C”, y “D”

37


1- NH4NO3 660.00002- KNO3 760.00003- MgSO4. 7H2O 148.00004- MnSO4. 4H2O 8.92005- ZnSO4. 4H2O 3.44006- CuSO4. 5H2O 0.01007- CaCl2. 2H2O 176.00008- KI 0.33209- CaCl2. 6H2O 0.010010- KH2PO4 68.000011- H3BO3 2.480012- Na2Mo4.2H2O 0.100013- FeSO4. 7H2O 11.124014- Na2EDTA 14.9240

COMPLEMENTO15- Thiamina 0.040016- Piridoxina 0.120017- Ácido nicotínico 0.200018- Glicina 0.430019- Mioinositol 23.000020- NaH2PO4. H2O 12.000021- Sacarosa 9,000.000022- BA 0.040023- pH = 5.7 N. A.24- Phytagel 1,000.0000

Cuadro 1. Distribución de los medios de cultivo en bloques al azar, acompañados del rendimiento de su meristemo en número de brotes.

38


R e p e t i c i ó n M e d i o s d e c u l t i v o c o n s u s b r o t e sI A D B C

4 2 3 3

R e p e t i c i ó n M e d i o s d e c u l t i v o c o n s u s b r o t e sII B A C D

3 5 2 2

R e p e t i c i ó n M e d i o s d e c u l t i v o c o n s u s b r o t e sIII C B D A

2 3 0 4

R e p e t i c i ó n M e d i o s d e c u l t i v o c o n s u s b r o t e sIV A C B D

3 0 3 2

R e p e t i c i ó n M e d i o s d e c u l t i v o c o n s u s b r o t e sV D A C B

2 4 1 0

Cuadro 2. Colocación del rendimiento de brotes en brotes en la repetición y medio de cultivo que le corresponde.

Medios de R e p e t i c i o n e s Total por Media de cada

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cultivo medio medio, mxI II III IV VA 4 5 4 3 4 20 4.0B 3 3 3 3 0 12 2.4C 3 2 2 0 1 8 1.6D 2 2 0 2 2 8 1.6

Total por repetición

12 12 9 8 7 48

Media de cada repetición, mx

3 3 2.25 2 1.75 mx=2.4

El medio de cultivo “A” produjo más brotes. En los otros tres medios, un meristemo no pegó en cada caso. El medio “B” le sigue en producción de brotes al medio “A”.

Análisis de la variación.

Suma de cuadrados

∑❑(X-MX)2 = (42+52+42+32+42+32+32+32+32+32+22+22+12+22+22+22+22)=48 2 /20

= 152-115.2=36.8 (Total).

K*∑❑(mx−Mx ) 2= 20 2 + 12 2 +8 2 +8 2 /5-(48/20)= 134.4-115.2= 1902 (Entre medios).

n* ∑❑(m´ x−Mx ) 2=122+122+92+82+72 4-(482/20) = 120.5-115.2= 5.3 (Entre bloques).

G. I. =Grados de independencia.

G. I. Para la variabilidad total= N -1 = 20 – 1 = 19.

G. I. Para medios de cultivo = n – 1= 4 – 1 = 3.

K= Numero de bloques = 5.

G. I. Para bloques = k – 1= 5 – 1= 4.

E= Exp. = Error experimental

G. I. Para el error experimental.

G. I. Para el E. Exp. = 19 – ( 3 +4 )= 19 – 7= 12.

Con los datos anteriores, ya podemos hacer el Cuadro siguiente:

Cuadro 3. De Análisis de la Variación.

40


Factor de variación Suma de cuadrados

G. I. Cuadrado Medio

F Calculada

Entre medios 19.2 3 6.400 6.244Entre bloques 5.3 4 1.325 1.293Error Experimental 12.3 12 1.025Total o General 19

Suma de cuadrados / G. I. =Cuadrado Medio

19.2 / 3 = 6.400

F. de V. = Factor de Variación.

Cuadrado Medio para F. de V. entre medios/ Cuadrado Me-

dio del Error Experimental = F Calculada.

6.4/ 1.025 = 6.244 (Ver cuadro 3)

Tabla de F.

Valor de F en la Tabla para n 1 = 3, n 2 = 12 y

0.05 de probabilidad, F= 3.49 y F = 5.95 para 0.01 de

probabilidad. F calculada 6.244 > 3.49

6.244> 5.95.

Lo anterior nos obliga a afirmar que la variabilidad debida a los medios de cultivo es significativa o sea que los efectos de los diferentes medios de cultivo son significativamente distintos.

E. T. D. = Error típico de la diferencia entre dos medias de medio cultivo.

E. T. D. = Raíz cuadrada del cuadrado medio del error experimental X5 observaciones o repeticiones X 2 producciones que se comparan ( √5 X 1.025¿∗2¿=√10.25

E. T. D. = √ETp2+ETp2= √2.2642+2.2642 = 3.20

41


El calculo que sigue consiste en multiplicar el resultado anterior por el valor de t, encontrado en la Tabla t, Fila 12, Columna 0.05 = 2.179 X 3.20 = que es el límite de significación de una diferencia entre dos producciones globales.

Si una diferencia entre dos producciones globales es mayor que 6.97, se considera significativa.

Las producciones globales son:

Medio de cultivo A = 20

Medio de cultivo B = 12

Medio de cultivo C = 8

Medio de cultivo D = 8

Diferencia entre dos producciones globales:

A

B

C

D

A-B = 20- 12 = 8 > es significativa

A-C = 20-8 = 12 > 6.97 es significativa

A-D = 20-8 = 12 > 6.97 es significativa

B-C = 12 -8 = 4 < 6.97 no es significativa

B-D = 12- 8 = 4 < 6.97 no es significativa

C-D = 8 - 8 = 0 < 6.97 no es significativa

El mejor medio de cultivo es “A” y es el que debemos usar para el crisantemo, ya que sabemos corresponde al medio de cultivo de la Tabla 8 que tomamos como testigo y la llamamos “A” para fines de competencia con, los medios “B”, “C” y “D”, a fin de saber cuál de los cuatro medios es el mejor.

42

6.97


F. de V. = Factor de variación.

Cuadrado medio para F. de V. entre bloques/ Cuadrado medio del Error Experimental= F Calculada.

1.325/ 1.025 = 1.293 (Ver cuadro 3)

Tabla de F.

Valor de F en la Tabla para n1 = 4, n2 = 12 y 0.05 de probabilidad, F = 3.26 y F = 5.41 para 0.01 de probabilidad, F Calculada = 1.293 < 3.26

= 1.293 < 5.41

Por ser mayor el valor F de la Tabla que el valor de F Calculada, podemos decir que dicha variabilidad no es significativa y deja de importarnos.

Como la F Calculada para el Factor de variación entre medios (6.244), es mayor que la F de la Tabla para 0.05 de probabilidad (3.49) y también es mayor que la F de la Tabla para 0.01 de probabilidad (5.95), esto nos obliga a continuar el análisis comparando las producciones totales de brotes obtenidos con cada medio de cultivo, en cada tubo de ensayo destinado a dicho medio.

Empecemos por calcular el error típico de cada producción global de un medio de cultivo cualquiera (E. T. p).

E. T. p= Raíz cuadrada del cuadrado medio del error experimental (1.025) X 5 (Observaciones o Repeticiones).

E. T. p = √1.025 X 5 = √5.125 = 2.264

Nuestro segundo cálculo es el Error típico de la diferencia entre producciones globales de brotes por medio de cultivo.

43


Valor de n1, número de grados de independencia para la varianza mayor o del factor

P =1 2 3 4

0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01123456

16118.5110.137.716.615.99

T A B L A D E F


P =1 2 3 4

0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01123456

16118.5110.137.716.615.99

44


789

101112

131415161718

192021222324

252627282930

3234

3842

4650

6080

100200

1000

T A B L A D E F (Continuación)


45

Valores

d e

na,

numero

de

grados

de

independencia

para

el

error

experimental


P =5 6 7 8

0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01123456

46


789

101112

131415161718

192021222324

252627282930

3234

3842

4650

6080

100200

1000

T A B L A D E F (Continuación)


47

Valores

d e

na,

numero

de

grados

de

independencia

para

el

error

experimental


P =10 12 16 20

0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01123456

48


789

101112

131415161718

192021222324

252627282930

3234

3842

4650

6080

100200

1000

49

Valores

d e

na,

numero

de

grados

de

independencia

para

el

error

experimental


T A B L A D E F (Conclusión)

Valor de n1, número de grados de independencia para la varianza mayor o del factor (Conclusión)

P =30 50 100 I

0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01 0.05 0.01123456

789

101112

Valor de n1, número de grados de independencia para la varianza mayor o del factor131415161718

192021222324

50


252627282930

51

3234

3842

4650

6080

100200

1000


III. Datos relativos a la evolución del cultivo de tejidos, órganos y células vegetales.

En 1860 y 1861 respectivamente, Sacks y Knops prepararon una solución nutritiva a base de sustancias inorgánicas, que fueron el antecedente de los medios de cultivo modernos.

1878 fue el año en el que Vochting estudió la polaridad vegetal, habiendo demostrado que un pedazo de planta con una o más yemas axilares, pero sin raíz, es capaz de producir más yemas y la raíz que no tenía, si lo sembramos con la punta superior de las yemas, orientadas hacia arriba de la tierra o del medio de cultivo que contiene un frasco.

En 1898 le tocó estrenar el concepto de totipotencialidad celular introducido por Haberlandt, al lenguaje de cultivo de tejidos, dándonos a entender con este término, que las células totipotentes son capaces de intervenir en la formación de un tejido vegetal y cambiar de giro para formar todos los tejidos y órganos de una planta nueva a partir de una pequeña fracción somática o sexual de ella, siempre y cuando sepamos crear las condiciones de asepsia, climáticas y nutritivas de la especie que vamos a micropropagar.

En la Tabla 1, diferentes investigadores en años distintos, propusieron 15 grupos de sales inorgánicas para igual número de medios de cultivo in vitro de vegetales, siendo el más popular y de mayor uso el que propusieron Murashige, T. y Skoog F. en 1962.

1963 fue un año importante para la biotecnología, ya que White organizó el primer congreso internacional de cultivo de tejidos en la Universidad de Pennsylvania Estados Unidos de América. En este evento, se presentaron trabajos de los investigadores y hubo discusiones en las que se plantearon problemas y soluciones sobre el tema, lo cual significó un gran apoyo a la biotecnología aplicada al cultivo de tejidos vegetales, cuya meta es obtener millones de plantas nuevas a partir de ellos.

Los primeros investigadores que deseaban obtener plantas que no vinieran de semilla tuvieron muchos fracasos porque no sabían cómo controlar el clima, la asepsia y la nutrición de los tejidos que investigaban. Todos ellos le dieron a la Química Inorgánica una importancia enorme, que culminó en las 15 propuestas que, como medio cultivo para obtener plantas no hijas de semilla, resume la Tabla 1.

Poco tiempo después, el cultivo de tejidos, órganos y plantas completas, se vinculó a la Química Orgánica y pisamos un escalón más de la escalera biológica. Este nuevo espacio posibilitó que nuestro entendimiento llegara a la utilización de las proteínas, vitaminas y aminoácidos en la micropropagación vegetal.

Es tan grande el estudio de la vida, que no sabemos qué hacer, por eso estamos destruyendo en forma acelerada, a los organismos que pueden producir su alimento por medio de la fotosíntesis, sin los cuales cualquier otra forma de vida en la Tierra, sería imposible. Los vegetales son los únicos seres que producen lo que se comen y, por tal razón, originan las cadenas alimenticias.

La llegada de los reguladores de crecimiento al cultivo de células, tejidos, órganos y plantas completas, creó lo que es hoy la micropropagación vegetal moderna.

Lo que realmente importa del cultivo vegetal in vitro es lo que esperamos obtener de la parte vegetal que cultivamos; si estamos cultivando una antera y su polen y tenemos éxito, vamos a obtener una planta que solo va a producir flores masculinas, pero si por otro lado, cultivamos un óvulo de la flor de la misma planta, obtenemos un vegetal que nos produce solo flores femeninas; estos resultados interesan porque las plantas

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haploides resultantes tienen n cromosomas macho y n cromosomas hembra que no pierden su capacidad reproductora, pues una planta con flores macho puede fecundar a muchas flores hembra de la misma especie que solo tiene este tipo de flores, como ocurre en el esparrago, la espinaca, el lúpulo etc. etc., que tienen plantas separadas por sexos y el mundo no se acaba por eso, Dios sabe lo que hace y lo que nos permite hacer.

En 1970 se investigó la capacidad de las plantas con flores para producir embriones somáticos (no hijos de semilla); pero que cultivados in vitro, con el medio de cultivo que desarrolla toda su totipotencia, se obtuvieron plantas nuevas, iguales a las de la especie de donde provenía el embrión somático, hijo de esa especie, padre de los embriones somáticos, abuelo de las plantas nuevas que se obtuvieron a partir de tales embriones.

El mismo año se estudió el potencial de las angiospermas y gimnospermas para su organogénesis y se comprobó que esta, era parte de la planta nueva, ya que no hay tejido sin células, tampoco hay órganos sin tejidos, ni organismos sin órganos, expresiones que dan como resultado las siguientes ecuaciones biotecnológicas:

Organismo unicelular = célula que desempeña todas las funciones que la vida necesita para no desaparecer.

Organismo pluricelular = vida que empieza con la célula , sigue con los tejidos, continua con los órganos y la suma de estos hace posible los organismos que Dios creó y vinculó con la evolución para que dieran origen a otras formas de vida superiores a las que ya existían.

En este orden de ideas se inscribe el cultivo de tejidos vegetales, que es el tema del que estamos hablando y que tiene enormes posibilidades de investigación, empezando por los medios de cultivo y siguiendo con el material vegetal vinculándolo con la experimentación biológica, hasta crear una nueva especie, que puede resultar del aislamiento y fusión de protoplastos de jitomate y papa, especies que pertenecen a la familia Solanácea y que, de encontrar un medio de cultivo capaz de conjuntar la totipotencia de ambos protoplastos, lograríamos una nueva especie de tal manera que una misma planta sería capaz de darnos jitomate arriba de la tierra y papa debajo de ella; lo anterior traería una revolución en el manejo de nutrientes vegetales y entonces empezaríamos a investigar las posibilidades que tiene la papa y el jitomate de aprovechar el nitrógeno del aire, por métodos simbióticos, incluso valiéndonos de la contaminación química o biológica de las raíces de la especie obtenida siempre y cuando esto no nos perjudique.

La vida tiene secretos que debemos arrancarle para vivir mejor y en armonía con la Naturaleza.

Para que esto sea realidad, necesitamos información de la radio, televisión, internet, celulares y lectura de libros para entender mejor el Mundo en que vivimos. Si logramos que todas estas variables se concreten, vamos a ser una sociedad mejor informada y mas entendedora de lo que ocurre a nuestro alrededor en materia de producción de plantas in vitro y de muchos otros fenómenos naturales.

El estudio de la vida no se detendrá nunca, por eso salió de ella el termino hibridación, proceso de cruza de plantas o animales de constitución genética diferente y van a seguir apareciendo palabras para dar nombre a procesos biológicos y a sus partes.

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Si ordenamos bien las ideas y pensamos en la diferenciación celular, vamos a terminar hablando de la totipotencia del tejido meristematico, el cual tiene células “mil usos”, que ayudan a a construcción de un tejido y luego de todos los demás, hasta obtener una planta nueva.

La búsqueda de técnicas de manipulación y uso de sustancias para obtener plantas a partir de diferentes partes sexuales y asexuales de distintas especies vegetales, hizo posible muchos descubrimientos, entre ellos los siguientes:Las células del mesofilo de las hojas jóvenes que fueron despojadas de su pared celular, tienden a regenerarla y cuando lo consiguen, siguen viviendo si no les falta alimento.

Se han obtenido mediante cultivo protoplastos de soya en un medio de cultivo en suspensión (tabla 5).

Obtención de híbridos somáticos a partir del aislamiento, fusión y cultivo de protoplastos.

Logro de plantas haploides a partir del cultivo de anteras y polen inmaduro.

Descubrimiento de medios de cultivo que han servido para avanzar en el campo de la nutrición de cada especie que se cultiva in vitro.

El dominio del aislamiento, fusión y cultivo de protoplastos de plantas con plantas, animales con animales y de plantas con animales, le van a dar el mejoramiento genético y a la manipulación de sustancias y medios de cultivo correspondientes, un horizonte infinito, difícil de legislar. Solo Dios y las Leyes vinculadas a la Ecología, nos van a dar la orientación adecuada para manejar esta etapa del desarrollo biotecnológico sin dañar al medio ambiente bilógico, incluyéndonos a nosotros como parte de él.

La obtención de plantas nuevas vía aislamiento, fusión y cultivo de protoplastos de plantas, es una forma ecológica de mejorar genéticamente a una especie vegetal.

La obtención de animales nuevos vía aislamiento, fusión y cultivo de protoplastos de animales, también es una forma ecológica de mejorar genéticamente a una especie animal.

Dios permitió que del burro y la yegua y del caballo y la burra, apareciera el ganado mular sin quitarles nada a sus progenitores que eran de especies distintas; solo les dio heterosis producto de la cruza; pero les negó la capacidad de reproducirse indefinidamente; por lo tanto podemos manipular el material genético de especies vegetales y animales diferentes y liberar el resultado después de analizar los daños y beneficios que le produzcan al ser humano y a su entorno.

La obtención de seres nuevos vía aislamiento, fusión y cultivo de protoplastos de una especie vegetal con una especie animal afín por simbiosis, parasitosis u otra causa, el resultado no es necesariamente negativo, pues su análisis debe vincularse a las Ciencias Naturales para determinar su liberación a in de que lo cultiven los productores sin riesgos a la salud humana, animal y ecológica.

Para mejorar genéticamente un maíz, la biotecnología, igual que el método tradicional de fitomejoramiento, requiere de la selección de progenitores; pero las líneas puras, cruzas simples y dobles no son necesarias en el Método Biotecnológico; por lo tanto el fitomejoramiento por este medio, es más rápido que el tradicional.

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El avance biotecnológico es tan espectacular, que un error en su aplicación puede causarnos mucho daño económico y ecológico. Por ejemplo una especie que fue modificada genéticamente para tolerar herbicidas, si llega a cruzarse con otras especies o variedades y les transfiere esa resistencia, el primer impacto seria una dependencia mayor de los herbicidas, pues dse tendría que fabricar un herbicida nuevo capaz de impedir que nuestros ecosistemas afines se saturaran con la especie tolerante a herbicidas; pero este mismo fenómeno podría traernos otro muy importante: que algunos investigadores encausaran su actividad hacia los Bancos de Germoplasma para evitar la extinción de las especies no modificadas genéticamente.

La clonación de la borrega Dolly demostró que este prodigio de la biotecnología no es recomendable porque no hay heterosis, por eso Dolly se heredó sus propios defectos genéticos y al poco tiempo el reuma no le permitía caminar y finalmente murió antes de tiempo.

Los puntos de vista anteriores me obligan a manifestar que en materia de biotecnología no todo lo que brilla es oro; sin embargo, es un magnifico auxiliar en nuestra lucha para combatir el hambre y la desnutrición humana y animal.

La ingeniería genética consiste en introducir un gene extraño en el patrimonio genético (genoma) de un vegetal para crear una función nueva que puede ser buena o mala, depende de los resultados que nos reporte el gene introducido.

La polaridad es un hecho biotecnológico y por tal razón, lo ejemplificamos por medio de las siguientes figuras:

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1

2


IV- Planeación de un laboratorio de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales.

Planear y poner en marcha un laboratorio como el que le da título a este capítulo, implica dividir el espacio que ocupa en áreas de control aséptico en las que se realizan actividades tan propias de cada uno de estos lugares, que reducen los riesgos de que gérmenes infecciosos se instalen en los medios de cultivo y en las células, tejidos y órganos vegetales que se inoculan y siembran en dichos medios, lo cuales, dicho sea de paso, se prestan al contagio debido a su riqueza en nutrientes orgánicos e inorgánicos.

(1). Croquis de un laboratorio de tejidos vegetales (pág. 27).

Sala de lavado, secado y esterilización .

Aquí se lava la cristalería y el primer lavado con detergente del material vegetativo. Se instala la autoclave y la estufa u horno; la primera para esterilizar contenedores de medio de cultivo, medios de cultivo, contenedores de tejidos, sustancias diversas, recipientes contaminados y la segunda para secar la cristalería y esterilizar pinzas, bisturíes, agujas de disección, tijeras y otros instrumentos de fierro. O de cualquier material?.

Aparatos y utensilios propios de este espacio, son:

1. Cristalería.2. Estufa u horno de secado para cristalería (página 14)3. Autoclave (pág. 15)4. Destilador (pág. 16) 5. Desionizador (pag.16)6. Fregadero profundo de doble tarja.

Además las siguientes instalaciones:

1. Instalación de agua caliente y fría.2. Instalación eléctrica de 110 y 120 voltios.

Sala de preparación de medios y material vegetativo.

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En esta área se preparan los medios de cultivo que serán utilizados en las diferentes etapas de desarrollo de los inoculos vegetales. También se prepara el material vegetativo de la especie que se seleccionó para cultivarse in vitro.

Equipo, materiales e instalaciones de esta área:

(7) Gabinetes para guardar los reactivos (pág. 17)

(¿) Gabinete para almacenar cristalería.

(¿) Gabinete para guardar tapones de tubos de ensayo, tapas de matraces y frascos Gerber.

(¿) Cánulas para esterilizar cajas de Petri.

(¿) Cánulas para esterilizar pipetas.

(¿) Charolas de plástico para transportar soluciones madre y medio preparado.

(¿) Gradillas de metal para colocar los tubos con medio de cultivo; 40 tubos por gradilla.

(13) Agitadores magnéticos con calentamiento (pág. 21)

(12) Dosificador automático de medios de cultivo (pág. 21)

(¿) Reloj de alarma de 120 minutos.

(9) Balanza granataria (pág. 15)

(10) Balanza analítica (pág. 15)

(11) Potenciómetro (pág. 21)

(¿) Refrigerador y congelador

(¿) Gabinete para lavado (pag.17)

Instalaciones.

(¿) Instalación de gas.

(¿) Instalación eléctrica 110 y 120 voltios.

(¿) Instalación de vacío.

Sala de siembra y disección.

En esta sala se deben cumplir todas las medidas de asepsia para evitar que los medios e cultivo, células, tejidos y órganos que vayamos a microreproducir, no se contaminen con bacterias, hongos o virus que nos impidan obtener plantas nuevas, abundantes y sanas. Para que lo anterior sea posible, el personal que entre a esta lugar, debe hacerlo llevando encima: gorra cubrepelo, tapaboca, ropa limpia con las bolsa vacías, bata limpia color blanco, zapatos aislados en bolsas de plástico con amarre, manos y brazos sin relojes, anillos u otras alhajas y guantes libres de microbios. Los utensilios que entren deben

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ser estériles y los que por su naturaleza no se puedan esterilizar en horno o autoclave, desinfectarlos con benzal y baño con rayos ultravioleta.

Utensilios, aparatos e instalaciones propios de esta sala:

(¿) Instalación eléctrica de 110 y 220 voltios.

(¿) Instalación de gas.

(¿) Aire acondicionado y filtración.

(¿) Vacío para la esterilización por filtrado.

(15) Cámara de flujo laminar de aire (pág. 23)

(16) Microscopio estereoscópico (pág. 24)

(¿) Lupa con lámpara

(¿) Instrumentos de disección

(¿) Lámpara de luz ultravioleta

Sala de incubación.

Las instalaciones eléctricas y aparatos que funcionan con electricidad son los más importante de este espacio, pues las diferentes fases del crecimiento de los inoculos que recibe cada medio de cultivo, requieren fotoperiodos, temperaturas, intensidad lumínica y humedades relativas diferentes.

Instalaciones, aparatos y objetos que debe haber en esta área:

(¿). Aire acondicionado y filtrado.

(57) Controladores de temperatura (pág. 26)

(25). Anaqueles para incubación tipo recinto (pág. 20)

(¿) .Colocación de balastros fuera de la sala.

(¿) . Un reloj por cada nivel de incubación,

(29). Termostatos separados para temperatura de día y noche (página 18)

(¿). Apagador automático de temperatura, de emergencia para cada sala.

(¿). Lámparas de 2.4 metros.

(27). Lámparas Gro Lux de 1,000 y 3,000 lux (pág. 19)

(¿). Lámparas Power Groove de 10,000 y 30,000 lux.

(¿). Probadores de fotoperiodo.

58


(¿). Ventiladores.

Almacén.

Depósito de aparatos, accesorios, enseres y sustancias diversas, bajo condiciones de baja humedad relativa, temperatura fresca y a oscuras.

(¿). Repisas con divisiones.

Antesala.

Aquí esperan a ser recibidas las personas que desean solicitarle al Jefe de laboratorio, alguno de los bienes y servicios que ofrece o a sugerirle alguna innovación.

Mobiliario de este lugar:

(¿). Sofá.

(¿). Mesa de centro.

(¿). Revistas.

Oficina del Jefe del laboratorio.

La persona responsable de esta área, debe actuar de acuerdo a los intereses de los productores chiapanecos que desean usar material vegetativo reproducido in vitro para sus procesos productivos; reconocer como instancia inmediata superior a la Dirección de Agricultura de la Secretaría del Campo; hacer un Programa Anual de Trabajo que refleje las necesidades de personal, infraestructura, aparatos, accesorios, enseres y sustancias diversas; descripción física de cada actividad, tiempo que requiere, valor bruto de los productos del laboratorio, costos variables, costos fijos, relación beneficio/costo, punto de equilibrio= CF/1-(CV/VBP).

PE= Punto de Equilibrio.

Costos fijos.

CV= Costos variables.

VBP= Valor Bruto de Productos.

COSTO TOTAL= CT=CF+CV.

Relación Beneficio/Costo= RBC=VBP/CT.

Debe darle un nombre al laboratorio, hacer un croquis de ubicación, definir objetivos generales y específicos, fijar metas, coordinar las acciones propias del laboratorio, hacer el organismo correspondiente e informar mensualmente sobre avance físico-financiero en porciento respecto al total (Metas).

Mobiliario y Equipo de la oficina del Jefe de laboratorio.

(¿). Escritorio ejecutivo.

59


(¿). Computadora con sus accesorios.

(¿). Teléfonos alambrico y celular.

(¿). Calculadora profesional.

(¿). Aire acondicionado.

(¿). Ventilador.

(¿). Mesa de trabajo

(¿). Sillas.

(¿). Archiveros.

(¿). Tarjetas.

(¿). Papelería.

(¿). Cafetera.

(¿). Tasas.

(¿). Vasos.

(¿). Cucharas.

(¿). Café.

(¿). Azúcar.

(¿). Refrescos.

(¿). Refrigerador.

Invernadero.

El acondicionamiento del invernadero es su requisito más valioso, ya que va a recibir las plantas que provienen del laboratorio y es aquí en donde también se pueden enfermar o recibir daños causados por insectos, roedores e incluso pájaros.

Instalaciones, aparatos, materiales, sustratos, vegetales e implementos de este espacio:

(56). Programadores de fotoperiodo analógicos y digitales (pág. 28)

(¿). Lámparas para controlar la intensidad luminosa.

(58). Medidor de humedad relativa fijo y móvil (pág. 32).

(¿). Pasillos de concreto.

60


(¿). Aire filtrado.

(62). Mosquiteros (pág. 29).

(60). Sistema de nebulización (pág. 30).

(¿). Sistema de fertiirrigacion.

(¿). Almacén de herramientas e implementos.

(¿). Mezclas de suelos estériles.

(¿). Bancales para macetas.

(¿). Charolas germinadoras y enraizadoras.

(¿). Camas para trasplantar.

(¿). Estructuras de fierro para enraizamiento.

Otros instrumentos, aparatos, sustancias y materiales del laboratorio.

(¿). Lavadora de cristalería.

(¿). Lavadora de pipetas.

(37). Espátulas y micro espátulas (pág. 31).

(¿). Frascos ámbar para guardar soluciones madre.

(34). Buretas (págs. 13 y 36).

(48). Soporte universal (pág. 13).

(49). Anillos de fierro (pág. 13).

(50). Pinzas de Mohr (pág. 37).

(¿). Pinzas largas de disección.

(51). Filtros millipore (pág. 35).

(55). Termómetros: -10o a 120o (pág. 36).

(¿). Guantes de asbesto.

(¿). Tapones para tubos de ensayo.

(¿). Tapones para frascos Gerber.

61


(¿). Frascos Gerber.

(35). Matraz Erlenmeyer y aforado (págs. 34 y 36).

(40). Matraz Kitasatos (pág. 34).

(41). Matraz fondo plano (pág. 34).

(¿). Desecador.

(42). Pisetas (pág. 36).

(¿). Aspersores ¿capacidad?.

(38). Pipetas graduadas (pág. 36).

(¿). Pipetas volumétricas.

(¿). Goteros.

(33). Probetas (pág. 36).

(36). Vasos de precipitados (pág. 37)

(¿). Estuches de disección.

(¿). Bisturíes, navajas, tijeras, pinzas.

(39). Mecheros Bunsen (págs. 13 y 37)

(14). Bomba de vacío (pág. 22).

(32). Cajas de Petri (pág. 35).

(¿). Tubería de plástico.

(¿). Papel filtro.

(¿). Cinta parafilm.

(¿) Gasa.

(¿). Algodón.

(¿). Toallas de papel.

(¿). Detergente.

(¿). Cloralex.

(¿). Escalera de tijera.

(¿). Tambor giratorio para cultivo de células en suspensión.

(¿). Plataforma de agitación para cultivo de células en suspensión.

62


(¿). Agitador para matraces Erlenmeyer.

(¿). Timer (Reloj con alarma).

Espacio amplio en blanco porqué?

(52). Gradillas para tubos de ensayo (pág. 13)

(31). Tubos de ensayo (págs. 13 y 37).

(¿). Microscopio de inmersión.

(¿). Cubreobjetos.

(¿). Portaobjetos.

(¿). Lámpara de alcohol.

(¿). Alcohol etílico.

(¿). Benzal.

(¿). Papel estraza estéril.

(¿). Agrimycin

(¿). Agua destilada estéril.

(¿). Hipoclorito de sodio.

* Solución antioxidante de esquejes de papa.

150 mg/L de ácido cítrico.

100 mg/L de ácido ascórbico.

100 mg/L de cisteína.

* Subactividad 10.1, capítulo XII, pagina 9.

(53). Pinzas para tubo de ensayo (pág. 13).

(54). Escobillas para tubos de ensayo (pág. 13)

(59). Embudo Buchner para filtrar con vacío (pág. 31).

(43). Matraz fondo redondo (pág. 34)

(44). Matraz de destilación (pág. 34).

(¿). Tubos de centrifugar.

(¿). Aparato centrifugador.

63


Sorbitol

CaH4(PO4)2 (anotar el nombre del compuesto)

Malla de nailon con poro de 40 micras.

Diacetato de fluoresceína.

Macerozima.

Onozuca.

Manitol.

Celulasa.

(¿). Hemocitómetro.

(47). Frasco (pág. 34).

(6). Embudo (págs. 34 y 36).

(63). Tipos diferentes de bioreactores (pág. 3).

Los números que están entre paréntesis en la sala de lavado, preparación de medios y material vegetativo, de siembra y disección, de incubación, en el almacén, en la oficina del jefe de laboratorio y en el invernadero, corresponden a los números de las fotocopias que anexo para que se vea cómo es el laboratorio y como son los aparatos, instrumentos, objetos y herramientas de cada una de sus áreas y del invernadero.

El paréntesis que tiene signo de interrogación en las salas y áreas a que se refiere la nota anterior, carecen de figuras que los respalden. En el paréntesis de la derecha, está el número de la pagina donde se encuentra la figura.

Por lo que se refiere a reactivos, la tabla “E”, capítulo II, suma las necesidades en miligramos de las tablas “A”, “B”, “C” y “D” del mismo capítulo, que se refieren a un experimento que busca cual de los medios “A”, “B”, “C” o “D” es el mejor para meristemos de crisantemo.

La tabla 2.E, capitulo V, cubre las necesidades de las tablas 2, 2.A., 2.B, 2.C y 2.D del mismo capítulo, relacionadas al cultivo y xxxxx subcultivo de 50 meristemos de clavel.

La tabla , , capítulo VI, satisface los requerimientos de las tablas A B C D E F G y H del mismo capítulo, relativas a un experimento que busca la mejor combinación entre 4 medios de cultivo y 3 ápices radiculares, habiendo comprobado que la combinación más conveniente es C Z; sigue la inducción a engrosamiento de 5 fracciones de raíz; continúa con la inducción de la bacteria Rhizobium a que produzca nódulos en charolas germinadoras; se vincula la propuesta de experimento con protoplastos de maíz, frijol y bacteria Rhizobium y concluye en la tabla (I), que resume las necesidades de reactivos de las actividades anteriores.

La tabla 3.C., suma el peso de los reactivos de las tablas 3, 3.A, y 3.B. del capítulo VII, pagina 25.

La tabla 4.B., reúne el peso de los reactivos de las tablas 4., 4.A. del capítulo VIII, pagina 17.

64

I


La tabla 5., contiene el peso de los reactivos que necesitan 300 c. c. de dicho medio para depositar 30 c. c. en cada uno de los 10 matraces, a los que les inoculamos 5 pedazos de callo de zanahoria por matraz, (capitulo, pagina 1).

La tabla 6, capitulo X, contiene el peso de los reactivos que requiere el cultivo de anteras de tabaco, con la finalidad de producir, primero embriones y después plantas haploides masculinas.

La tabla 8, capitulo XI, pagina 12, representa el peso de los reactivos de las tablas 7 y 4 para aislar, fusionar y cultivar protoplastos del mesofilo de una hoja (ver página 13, capitulo XI).

La tabla 1.6., capitulo XII, pagina 31, agrupa el peso de los reactivos de las tablas 1.B., 1.C., 1.D., 1.E., y 1.F. del mismo capítulo.

Anexo las figuras más importantes de las áreas del laboratorio y del invernadero, asignándole un número a cada figura y el número de la página en la que se encuentra para que la vea el lector y la identifique.

DESDE AQUÍ (PAG. 62) HASTA NO SE SABE QUÉ PÁGINA, VAN LAS FIGURAS MENCIONADAS ANTERIORMENTE.

65


Lista de

reactivos derivada de las tablas: “E, 2.E, I ., 3.C., 4.B., 5., 6., 8., y 1.G

66

No. Formula o nombre del reactivo Peso del reactivo en kilogramos1- NH4 NO3 0.8992- KNO3 1.0563- MgSO4

.7H2O 0.5674- MnSO4

.4H2O 0.0125- ZnSO4

.4H2O 0.0056- CuSO4

.5H2O 0.0017- CaCl2

.2H2O 0.2408- KI 0.0019- CaCl2

.6H2O 0.00110- KH2PO4 0.09311- H3Bo3 0.00412- Na2MoO4

.2H2O 0.00113- FeSO4

.7H2O 0.01514- Na2EDTA 0.02015- (NH4)2SO4 0.00716- NaNO3 0.01417- KCl 0.00518- Na2SO4.10H2O 0.12919- NaH2PO4 0.06520- MnCl2.4H2O 0.00121- H2MoO4 0.00122- FeCl3.6H2O 0.00123- Ca(NO3)2 0.07824- Inositol 0.04625- Kinetina 0.00126- Ácido nicotínico 0.00127- Piridoxina 0.00128- Thiamina 0.00129- Sacarosa 37.40330- Adenina 0.08631- Caseína 0.08632- Agar o Phytagel 3.56933- Glicina 0.00134- 2,4-D 0.00135- AIA 0.00336- Sorbitol 0.00137- Cinetina 0.00138- Na2SO4.10H2O 0.129

Pedro A. F: Aclarar y/o

comentar


Lista de reactivos derivada de las tablas: “E”, 2. E, I ,3.C., 4.B, 5., 8., y 1G.

(Conclusión)

Con las instalaciones, aparatos, herramientas, sustancias químicas, sustratos….

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No. Fórmula o nombre del reactivo Peso del reactivo en kilogramos39- Sulfato de adenina 0.00240- Tecto 1.00041- BA 0.00142- Hipoclorito de sodio 0.00143- Macerozima 0.00144- Onozuca 0.00145- Manitol 0.00146- Esphagno 0.6 M3

47- Agrolita 1.2 M3

48- Suelo franco o migajón 3.0 M3

49- Tierra de monte cernida 2.0 M3

50- Cloro al 10 % 10 litros


NOTA:

FALTA HASTA EL FINAL DEL CAPÍTULO

68


69


)

IV. Medio de cultivo.

Medio de cultivo es una mezcla de nutrientes vegetales orgánicos e inorgánicos que se miden en miligramos por litro de agua destilada estéril, se depositan en frascos y dosis de 20 c. c. en la etapa W: establecimiento del cultivo aséptico, donde se siembra en ellos el tejido o el órgano vegetal que vamos a reproducir in vitro y lo incubamos bajo condiciones de clima controlado.

Un medio de cultivo especifico es aquel que mediante experimentación, demostró ser el mejor para la variedad prototipo de una especie determinada y aunque puede servir para la variedad prototipo de otra especie, no lo va a hacer con la misma eficiencia, esto yo lo comprobé en el laboratorio de tejidos de la Secretaría del Campo, del Gobierno del estado de Chiapas, reproduciendo in vitro fracciones de ajo en el medio de cultivo para clavel y aclaro que no fueron malos los resultados. Un experimento con 4 medios de cultivo diferentes al del clavel, con 5 repeticiones y tomando al medio del clavel como testigo, nos permitirá encontrar el mejor medio de cultivo para el ajo, especie que se puede micropropagar y cultivarse en las tierras de los altos de Chiapas, cuyo clima le favorece.

Clasificación de los ingredientes de un medio de cultivo de tejidos, órganos y células vegetales en suspensión.

1. Mezcla de sales inorgánicas.2. Compuestos orgánicos.3. Complejos naturales.4. Materiales inertes de soporte.

1) Mezcla de sales inorgánicas.

Se ha investigado mucho este tema y se va a seguir investigando, porque satisfacer las necesidades nutricionales de los tejidos, órganos y células en suspensión vegetales, así lo exigen.

La tabla 1, exhibe 15 muestras de sales inorgánicas, la más famosa de todas es la de Murashige, T. y Skoog, F., por tener aplicación más generalizada en los órdenes químico y biológico.

2) Compuestos orgánicos.

Hablar de esto, significa hacer referencia a los carbohidratos, hormonas, vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas, hexitoles, ácidos orgánicos, glucosa para medios de monocotiledoneas; sacarosa, fructuosa y almidones para otras especies.

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Relación de aminoácidos y amidas benéficas a la microreproducción vegetal.

1. Arginina2. Acido L- aspartico3. L asparagina4. Acido L- glutamico5. L- glutamina6. *L-serina7. **L-tirosina

*La serina es muy importante en la iniciación de embriones haploides en cultivo de anteras.

** La L-tirosina debe estar presente en un cultivo de callos, sin embargo, David V. Hurtado y Maria Eugenia Merino M. no la consideran en su medio de cultivo para inducir a la raíz de zanahoria a producir callo y a través de este, obtener plantas completas. Son tantas las variables de un medio de cultivo para tejidos, órganos y células en suspensión vegetales, que justifican la Tabla 1 y las discreapncias que hay en los protocolos de diferentes laboratorios de tejidos vegetales, respecto a una variedad prototipo de una especie cualquiera.

Otros criterios útiles a la integración de un medio de cultivo de tejidos, órganos y células vegetales.

El mioinositol en dosis de 100 mg/L estimula a la parte vegetal a la que se le aplica in vitro, vía medio de cultivo.

El mismo mioinositol incorporado al medio de cultivo en dosis de 500 mg/L favorece la producción de embriones haploides procedentes de microsporas aisladas.

La adenina o su sulfato favorecen la formación de tallo in vitro, a una concentración de 40-160 mg/L.

Las bases nitrogenadas de los ácidos citidilico y guanílico, en dosis de 100 mg/L, promueven el crecimiento del cultivo de callos in vitro.

El acido cítrico, favorece el crecimiento de callos de algunas especies.

Solución antioxidante de inoculos.

150 mg/L de acido cítrico

100 mg/L de acido ascórbico

100 mg/L de cisteína

El acido málico en una concentración de 100 mg/L, se recomienda para el cultivo de polen y anteras inmaduros para que produzcan embriones.

71


1. Complejos naturales

Cuando el medio de cultivo con sus miligramos de sales inorgánicas, compuestos orgánicos, relación de aminoácidos, amidas benéficas y otras sustancias importantes, se juntan a un complejo natural, el medio de cultivo se vuelve espeso, ya que el complejo natural ocupa un promedio de 78,145.75 mg/L, pero le va a dar al medio al que pertenece, caminos impredecibles y resultados que no se pudieron obtener antes. Por esto son importantes los complejos naturales.

Relación de complejos naturales.

Ingredientes Concentración en mg/LPulpa de plátano 150,000Endospermo de coco 100,000Emulsión de pescado 1,000Extracto de malta 500Jugo de naranja 333,333Hidrolizado proteico 2,000Jugo de tomate 33,333Extracto de levadura 5,000Total 625,166 mg/L

2. Materiales inertes de soporte.

El agar es un material de soporte porque no modifica químicamente al medio de cultivo, pero si físicamente, pues lo convierte en un gel húmedo que le sirve de soporte al inoculo. Fisiológicamente el agar no es inerte, ya que contiene cantidades variables de sustancias inhibidoras o estimulantes del crecimiento.

La poliacrilamida, el silicagel y el Phytagel, son agentes gelificantes que se usan en lugar del gel, como parte de un medio de cultivo. Si el medio es liquido, el papel filtro le sirve de soporte al inoculo y la fibra de vidrio hace lo mismo.

El carbón muy fino, en baja concentración, adsorbe desechos que se forman en algunos medios de cultivo, como a los que se agrega uno o dos complejos naturales.

Para ampliar un poco el inciso anterior, relativo a compuestos orgánicos de un medio de cultivo, anexo la tabla 1.A: Vitaminas empleadas en diferentes medios de cultivo.

El cultivo in vitro consta de las etapas siguientes: W, X, Y, Z, cada una con sus actividades y subactividades que varían de acuerdo a la naturaleza de la parte del vegetal que se microreproduce, pues no es lo mismo cultivar in vitro un meristemo, que una fracción de ajo.

Para familiarizarnos con esta metodología, expongo el ejemplo que sigue:

72


Microreproducción de 50 meristemos de clavel ( Dianthus caryophyllus L. ), cumpliendo las exigencias da cada una de las cuatro etapas de la reproducción vegetal in vitro.

Etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico de clavel.

Actividades de la etapa W.

A c t i v i d a d

1. Determinación de las sustancias del medio de cultivo.

Subactividad.

1.1. Ver y analizar la tabla 2.

A c t i v i d a d.

2. Esterilización de 50 tubos de ensayo.

Subactividades

2.1 Acopio de gradillas y tubos de ensayo.

2.2 Lavado de tubos.

2.3 Enjuagado de tubos.

2.4 Secado, taponado, desinfección de gradillas, colocación de tubos en las gradillas y ubicación de estas en la mesa de trabajo o en un gabinete de recepción.

2.5 Transferencia de tubos de las gradillas a la autoclave para esterilizarlos.

2.6. Le ponemos agua a la autoclave hasta una altura de 5 centímetros.

2.7. Conectamos la autoclave con la electricidad, la cerramos. La encendemos, marcamos 120o C, le damos vuelta al botón hasta llegar al sector que marca máxima e in mediatamente abrimos la válvula de vapor.

2.8. Cuando empiece a salir vapor por la válvula, la cerramos.

2.9. El manómetro empieza a moverse y lo dejamos hasta que marque 15 libras/pulgada cuadrada o 1 kg/centímetro cuadrado de presión.

2.10. Giramos el botón hasta el sector que señala mínimo y dejamos que pasen 15 minutos.

73


2.11. Apagamos la autoclave moviendo el botón hasta que se deje de ver la luz roja próxima a él.

2.12. Desconectamos el cable de electricidad.

2.13. Regresa a 0 la aguja del manómetro.

2.14. Abrimos la válvula para eliminar vapor y presión.

2.15. Se abre la autoclave con cuidado para no recibir una descarga da vapor.

2.16. Extraemos de la autoclave los 50 tubos de ensayo esterilizados, los ponemos en las gradillas desinfectadas y a estas las ubicamos en la mesa de trabajo.

2.17. Desinfectamos un gabinete por dentro y por fuera para ubicar en el las gradillas desinfectadas por fuera, pues serán desinfectadas otra vez, cuando se lleven a la cámara de flujo laminar de aire o a la área estéril creada en la mesa de trabajo, donde se colocaran sobre papel estraza estéril y se depositaron en cada tubo 20 c. c. del medio de la tabla 2 cuando dividamos el medio esterilizado entre los 50 tubos igualmente esterilizados.

A c t i v i d a d

3. Preparación aséptica del medio de cultivo de la tabla 2 para 50 tubos de ensayo con 20 c. c. de medio por tubo, etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico del clavel.

Subactividades.

3.1. Conectar con la electricidad un agitador magnético, capaz de agitar con calor y sin calor.

3.2. Coloco en la parrilla del aparato un vaso de precipitado esterilizado de 500 c. c. de capacidad, al que le pongo agua destilada estéril hasta 150 c. c.

3.3. Enciendo el aparato.3.4. Peso en la balanza granataria los miligramos que del 1 al 14

nos indica la tabla 2 en su columna IV y los deposito en el vaso, dejando de agitar cada que agregue una sal (Subactividad 3.2.).

3.5. Se pesan 30,000 miligramos de sacarosa, tabla 2, columna IV y los depositamos en el vaso receptor (Subactividad 3.2.).

3.6. Retiro del vaso de precipitados el mecanismo agitador y deposito su contenido en una probeta esterilizad de 500 c. c.

74


3.7. En un matraz estéril de 1.0 litro de volumen le deposito 100 c. c. de agua destilada estéril.

3.8. Vacio el contenido de la probeta (Subactividad 3.6) en el matraz (Subactividad 3.7).

3.9. Introduzco en el matraz el mecanismo agitador del aparato para que agite durante 3 minutos, transcurridos estos, retiro el agitador y con el potenciómetro y dos soluciones, una de NaOH y otra de HCl, ajusto el pH del matraz, agregando la solución de HCl si el pH es mayor de 5.7 o agregándoles solución de NaOH si el pH es menor de 5.7, hasta que el potenciómetro marque 5.7. (Subactividades 3.16 y 3.17).

3.10. Peso 6,500 miligramos de phytagel y los deposito en el matraz, le introduzco el mecanismo agitador y dejo que funcione 5 minutos sin calentar el contenido del matraz, terminado el tiempo, retiro el mecanismo agitador .

3.11. Tapo el matraz, lo introduzco a la autoclave, deposito agua en esta hasta un nivel de 5 centímetros; conecto la autoclave con la electricidad, la cierro, enciendo, marco 120º C, doy vuelta al botón hasta que llegue hasta el sector que marca máximo e inmediatamente abro la válvula de vapor.

3.12. Cuando empiece a salir vapor de agua por la válvula, la cierro.

3.13. El manómetro empieza a moverse y lo dejo libre hasta que marque 15 libras por pulgada cuadrada o 1 kilogramo por centímetro cuadrado de presión.

3.14. Giro el botón hasta el sector que indica mínimo y dejamos que pasen 15 minutos, tiempo suficiente para una buena esterilización de un volumen pequeño de medio en un contenedor como en este caso en el que no se corre el riesgo de una diversidad mayor de microbios, por eso les damos 15 minutos de esterilización en la autoclave, que son suficientes para una buena esterilización.

3.15. Antes de poner a funcionar la autoclave, en la mesa de trabajo de la sala de preparación de medios de cultivo y tejidos, del laboratorio, se crea una área estéril cuyo piso es la mesa, el cual se desinfecta con benzal, se barre con rayos ultravioleta hasta una altura de 1.20 metros hacia arriba del piso de la mesa y a esa altura se dejan circulando dichos rayos horizontales para que choquen en una pantalla y así evitar que dañen a una persona; finalmente se colocan 2 mecheros en la periferia del área estéril.

3.16. Dos días antes de la preparación del medio de la tabla 2 para 1 litro de medio, en un frasco ámbar estéril de 250 c. c.,

75


guardé 200 c. c. de una solución para usar una parte de ella en este medio, habiendo obtenido tal solución del medio siguiente: 7.3 gramos o c. c. de HCl diluidos en 192.7 c. c. de agua destilada estéril de la que debo tomar 0.3 c. c. por cada 10 miligramos de inositol, cinetina y BA, de los 100, 1 y 0.6, que de estos compuestos contiene la tabla 2.

3.17. En otro frasco igual al de la Subactividad 3.16, hice otra solución y la guardé para usar una parte de ella en el medio que la requiera, habiendo usado 8 gramos de NaOH y 192 c. c. de agua destilada estéril, solución de la que debo tomar 0.3 c. c. por cada 10 miligramos de la sustancia de un medio que necesité para codisolverse o cambiar su pH.

3.18. En el área estéril creada (Subactividad 3.15) y usando un vaso de precipitado de 200 c. c. esterilizado, le vacio 5 c. c. de agua destilada estéril y le agrego 0.4 mg de thiamina, que corresponde al número 15 de la tabla 2, sustancia soluble en agua y por eso se vacía directamente al vaso de precipitados receptor de los reactivos orgánicos complementarios, sensibles al calor como la tiamina correspondiente a la tabla 2, siendo dicho vaso receptor, el de este inciso (200 c. c.).

3.19. En un vaso de 25 c. c. agrego 3 c. c. de agua destilada estéril y lo dejo en espera.

3.20. En un minivaso de 15 c. c. pongo 2 c. c. de agua destilada estéril, 100 miligramos de inositol, 1 mg de cinetina, 0.6 mg de BA+ 3 c. c. de la solución que se cita en la Subactividad 3.16; agitamos con espátula y vaciamos en el vaso de la subactividad 3.19.

3.21. En un vaso mas, de 15 c. c. deposito 4 c. c. de agua destilada estéril, 0.3 mg de AIA+ 0.009 c. c. de la solución (Subactividad 3.17); agitamos con espátula y vaciamos en el vaso de la subactividad 3.19.

3.22. Con espátula agito el contenido del vaso de la subactividad 3.19 y lo vacio en el vaso de la subactividad 3.18.

3.23. Terminados los 15 minutos de la esterilización del matraz que contiene las 14 sales inorgánicas, la sacarosa y el agar o phytagel del medio de cultivo de la tabla 2; lo extraigo de la autoclave, lo llevo a la área estéril creada, dejo que enfríe un poco, lo destapo y le vacio el contenido del vaso que corresponde a la subactividad 3.18; usando filtro millipore.

3.24. Aforo el matraz con agua destilada estéril hasta un litro, lo tapo y agito para que se mezclen los reactivos del medio de cultivo de la tabla 2, para el establecimiento de 50 meristemos de clavel.

76


3.25. Se desmantela el área estéril creada, porque a partir de este momento, todo lo que se haga, los lugares van a ser la cámara de flujo laminar de aire y la cámara bioclimática.

Actividad.

4. Distribución del medio de cultivo de la tabla 2 para clavel en 50 tubos de ensayo.

Subactividades

4.1. Antes de aforar el matraz receptor de los reactivos de la tabla 2, lleve a la cámara de flujo laminar de aire, cuya área exterior fuera desinfectada y su interior desinfectado y tratado con rayos ultravioleta, 3 gradillas desinfectadas y tratadas con rayos ultravioleta, 2 con 20 y una con 10 tubos de ensayo esterilizados (subactividad 2.16); las coloco sobre papel estraza estéril y a un lado ubico el dosificador automático de medios de cultivo, desinfectado y esterilizado con rayos ultravioleta.

4.2. Antes de aforar, tapar y agitar el matraz (subactividad 3.24), lleve a la cámara de flujo laminar de aire, un mechero y un vaso de alcohol con el bisturí y las pinzas en su interior, habiéndolos puesto a un lado de las gradillas.

4.3. Del área estéril creada en la mesa de trabajo, traslado el matraz a la cámara de flujo laminar de aire; pero antes lo desinfecto por fuera con benzal, lo pongo sobre papel estraza esteril, en la cámara, lo agito, vacio el contenido en una probeta de 1,000 c. c. y regreso el matraz al lugar que ocupaba antes de vaciar su contenido en la probeta.

4.4. El contenido de la probeta pasa al dosificador automático de medios de cultivo y de este pasan 20 c. c. a cada tubo de ensayo; se tapan los tubos con tapones de polipropileno esterilizados, se pasan las gradillas a la cámara de incubación hasta 10 días como máximo, antes de inocularles el meristemo de clavel al medio que contienen los tubos.

Actividad

5. Selección de la mejor variedad de clavel.

Subactividad.

5.1. Se elige una variedad que sea genéticamente estable y por eso, fiel a su genotipo y fenotipo; vigorosa y hasta donde es posible, estar libre de enfermedades y plagas; la selección se hace en el campo a partir de plantas hijas de meristemo o de

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minituberculos cultivados in vitro; pero también se pueden comprar esquejes de 8 centímetros de longitud procedentes de plantas madre, a algún laboratorio para microreproducir y subcultivar los meristemos y obtener enormes cantidades de plantas para resolver nuestras necesidades de material vegetativo 2n que es muy costoso.

Actividad

6. Preparar la solución de agrimycin y agua para desinfectar los esquejes.

Subactividad.

6.1. Se estima el volumen de agua que requieren los 50 esquejes y se prepara la solución tomando 6 c. c. de agrimycin por litro de agua, en la cual se sumergen los esquejes durante una hora.

Actividad

7. Enjuague de esquejes con agua limpia o destilada estéril, hasta retirar los residuos de agrimycin.

Subactividad

7.1. Enjuago bien los esquejes hasta retirar los residuos de agrimycin (en qué %).

Actividad

8. Eliminación de las hojas y lavado de los esquejes con agua y detergente extran.

Subactividad.

8.1 Les quito las hojas a los esquejes y los lavo durante 3 minutos en una solución de 950 c. c. de agua, 50 gramos de detergente extran y enjuago dos veces con agua limpia.

Actividad.

9. Lavado de los esquejes en agua y alcohol etílico al 70 %.

Subactividad

9.1. Preparo una solución de 300 c. c. de agua limpia o destilada estéril con 700 c. c. de alcohol etílico, extraigo los esquejes de la solución a la que se refiere la subactividad 8.1 y los sumerjo

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en esta nueva solución de alcohol y agua durante 5 minutos y enjuago 3 veces con agua destilada estéril.

Actividad.

10. Sumersión de los esquejes en hipoclorito de sodio y agua al 10 %.

Subactividad

10.1 Con 900 c. c. de agua y 100 gramos de hipoclorito de sodio, preparo una solución y sumerjo en ella los esquejes durante 5 minutos, enjuago3 veces con agua destilada y los vuelvo a sumergir en otra solución de 1,000 c. c. de agua destilada estéril con 150 miligramos de ácido cítrico, 100 de ácido ascórbico y 100 de cisteína durante 2 minutos.

Actividad.

11. Extracción y siembra del meristemo en el medio de cultivo.

Subactividades

11.1 Tomo las pinzas del vaso con alcohol (subactividad 4.2), las flameo en el mechero, capturo un esqueje de la subactividad 10.1, lo transfiero a una caja de Petri esterilizada, regreso las pinzas al vaso de alcohol; extraigo las pinzas y el bisturí del vaso de alcohol, los flameo, retengo con las pinzas el esqueje, con el bisturí le quito los foliolos al meristemo, menos uno y haciendo un corte transversal extraigo del esqueje el meristemo.

11.2 La inoculación del meristemo en el tubo de ensayo se hace destapándolo y con pinzas muy finas inoculamos el meristemo, poniendo su corte en contacto con el medio de cultivo del tubo, el cual se flamea, tapa, sella con cinta parafilm en la cámara de flujo laminar de aire.

Actividad.

12. Transferencia de los tubos de ensayo inoculados con el meristemo de clavel de la cámara de flujo laminar de aire, a la cámara bioclimática.

Subactividades.

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12.1. Llevo las gradillas con sus tubos de ensayo inoculados, de la cámara de flujo laminar de aire a la sala de incubación y hago un lote al que le pongo un letrero con la etapa, semana, mes, variedad, especie inoculada y les aplico 20o C, 16 horas luz y 8 sin luz por día, 60-70 % de humedad relativa y 3,000 lux de intensidad lumínica.

Las Subactividades 12.2 y 12.3 de la papa, no se dan en el clavel porque este no cambia a medio fresco (ver el capítulo XII)

12.4. Cinco semanas después de la incubación, aparece una plántula con 3 yemas por cada uno de 45 meristemos inoculados, pues en 5 tubos los meristemos no pegaron y por lo tanto el logro es de 135 yemas, con los cuales le damos fin a la etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico de clavel.

Etapa X: Multiplicación de propágulos sanos de clavel.

Actividades de la etapa X, cuyo número de su primera actividad, sigue al de la última actividad de la etapa W anterior para que el proceso sea continuo.

Actividades de la etapa X.

Determinación de las sustancias del medio de cultivo para la etapa X (tabla 2.A.).

Subactividad.

13.1. Son las mismas sustancias que en la etapa anterior (W) o sea que las del medio de cultivo de la etapa 2, son iguales a las de la tabla 2.A; excepto en volumen.

Actividad.

13. Esterilización de 27 frascos (135/5).

Subactividades.

14.1. Acopio de charolas y frascos.

14.2. Lavado de frascos.

14.3. Enjuagado de frascos.

14.4. Secado, taponado, desinfección de charolas, colocación de frascos en las charolas y ubicación de estas en la mesa de trabajo.

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14.5. Transferencia de frascos de las charolas a la autoclave.

14.6. Le pongo agua a la autoclave hasta 5 centímetros de altura.

14.7. Conecto la autoclave con la electricidad, cierro la autoclave, la enciendo, marco 1200 C, le doy vuelta al botón hasta llegar al sector que marca máximo e inmediatamente abro la válvula de vapor.

14.8. Cuando empiece a salir vapor por la válvula, la cierro.

14.9. El manómetro empieza a moverse y lo dejo que marque 15 libras por pulgada cuadrada o 1 kilogramo por centímetro cuadrado de presión.

14.10. Giro el botón hasta el sector que señala mínimo y dejo que pasen 15 minutos.

14.11. Apagamos la autoclave moviendo el botón hasta que se deje ver la luz roja próxima a él.

14.12 Desconectamos de la electricidad a la autoclave.

14.13. Regresa a cero la aguja del manómetro.

14.14. Abro la válvula para eliminar vapor y presión.

14.15. Se abre la autoclave con cuidado par no recibir una descarga de vapor.

14.16. Extraemos de la autoclave los 27 frascos esterilizados, los ponemos en la mesa de trabajo, desinfectamos por dentro y por fuera las charolas y cajas y ponemos en ellas los frascos.

14.17. Desinfectamos un gabinete por dentro y por fuera para poner en el los frascos en cajas desinfectadas por fuera y por dentro, pues se desinfectaran de nuevo cuando se lleven a la cámara de flujo laminar de aire o a la área estéril creada en la mesa de trabajo, donde se colocan sobre papel estraza estéril y se le vacía a cada frasco 30 c. c. del medio de cultivo de la tabla 2.A. cuando dividamos este medio esterilizado.

Actividad.

15. Preparación aséptica del medio de cultivo para la etapa X (tabla 2.A) para 27 frascos.

Subactividades.

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15.1. Conectar con la electricidad un agitador magnético capaz de agitar con calor y sin calor.

15.2. Coloco en la parrilla del agitador sin calor, un vaso de precipitados estéril de 200 c. c. de capacidad, al que le vacío 50 c. c. de agua destilada estéril.

15.3. Enciendo el agitador para que agite sin calentar el agua del vaso que puse en su parrilla.

15.4. Peso en la balanza granataria o en la analítica, los miligramos que del 1 al 14, nos exige la tabla 2.A., en su columna IV, depositando en el vaso receptor cada sal, después de haberlas pesado hasta terminar con las 14 de la tabla 2.A., dejando de agitar cada que se agrega una sal al vaso receptor (subactividad 15.2) y hago lo mismo con la sal numero 20 de la misma tabla.

15.5. Se pesan 24,300 miligramos de sacarosa, tabla 2.4., columna IV y los depositamos en el vaso receptor (subactividad 15.2).

15.6. Retiro del vaso de precipitados el mecanismo agitador y deposito su contenido en una probeta esterilizada de 200 c. c.

15.7. En un matraz estéril de 2,000 c. c. deposito 200 c. c. de agua destilada estéril.

15.8. Vacio el contenido de la probeta (subactividad 15.6) en el matraz (subactividad 15.7).

15.9. Introduzco en el matraz el mecanismo agitador del aparato para que agite durante 3 minutos, transcurridos estos, retiro el agitador y con el potenciómetro y dos soluciones, una de NaOH y otra de HCl, ajusto a 5.7 el pH del matraz agregándole solución de HCl si el pH es mayor de 5.7 o agregándole solución de NaOH si el pH es menor de 5.7, hasta que el potenciómetro marque 5.7 (subactividad 3.16 y 3.17).

15.10. Peso 5,265 miligramos de phytagel y los deposito en el matraz, le introduzco el mecanismo agitador y dejo que funcione 5 minutos sin calentar el contenido del matraz y terminado el tiempo, retiro el mecanismo agitador.

15.11. Tapo el matraz, lo introduzco a la autoclave, deposito agua en esta hasta 5 centímetros de altura; lo meto a al autoclave con la electricidad, la cierro, la enciendo, marco 120º C, le doy vuelta al botón hasta que llegue al sector que marca mínimo y de inmediato abro la válvula de vapor.

15.12. Cuando empiece a salir vapor por la válvula, la cierro.15.13. El manómetro empieza a moverse y lo dejo libre hasta que

marque 15 libras por pulgada cuadrada o 1 kilogramo por centímetro cuadrado de presión.

15.14. Giro el botón hasta el sector que marca mínimo y dejo que pasen 15 minutos, tiempo suficiente para una buena

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esterilización de un volumen pequeño depositado en un contenedor, que por ocupar menos espacio que 3 o 4, está expuesto a un menor riesgo de infección, por eso le damos 15 minutos solamente sin que corra el riesgo de que algún componente del medio se degrade, como puede ser la caramelización de la sacarosa por decir algo. Sabemos que para volúmenes grandes de medio, el tiempo de esterilización normal son 18 minutos.

15.15. Antes de encender al autoclave, en la mesa de trabajo de la sala de preparación de medios de cultivo y tejidos del laboratorio, de crea una área estéril, cuyo piso es la mesa, mismo que se desinfecta con benzal, se barre con rayos ultravioleta hasta una altura de 1.20 metros hacia arriba del piso de la mesa y a esa altura se dejan circulando horizontalmente para que choquen en una pantalla y así evitar que dañen a alguna persona; finalmente se colocan 2 mecheros en la periferia del área esterilizada creada.

15.16. Dos días antes de la preparación del medio de la tabla 2.A. para 0.810 litros de medio, llevo al área estéril los 2 frascos ámbar a que se refieren las Subactividades 3.16 y 3.17.

15.17. En el área estéril creada (subactividad 15.15)y usando un vaso de 50 c. c. esterilizado receptor, le vacío 5 c. c. de agua destilada estéril y le agrego 0.324 mg de thiamina, que corresponde al número 15 de la tabla 2.A., que es una sustancia soluble en agua.

15.18. En un minivaso de 25 c. c. deposito 81 miligramos de inositol (tabla 2.A.), columna IV, mas 81 miligramos de cinetina, mas 0.486 mg de BA y 2.468 c. c. de la solución que menciona la subactividad 3.16; agito con espátula y vacío en el vaso de la subactividad 15.17.

15.19. En un vaso más de 10 c. c. deposito 2 c. c. de agua destilada estéril, mas 0.243 mg de AIA, mas 0.007 c. c. de la solución (subactividad 3.17); agito y vacío en el vaso de la subactividad 15.17.

15.20. Terminados los 15 minutos de la esterilización del matraz que contiene las 15 sales inorgánicas, la sacarosa y el agar o phytagel del medio de cultivo de la tabla 2.A; lo extraigo de la autoclave, lo levo a la área estéril creada, dejo que enfríe un poco, lo destapo y vacio en él, el contenido del vaso correspondiente a la subactividad 15.17.

15.21. Aforo el matraz con agua destilada estéril hasta 810 c. c., lo tapo y agito para que se mezclen los reactivos del medio de

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cultivo de la tabla 2.A. para la multiplicación de propágulos sanos de clavel.

15.22. Se desmantela el área estéril creada, pues a partir de este inciso en adelante, todo lo que se haga va a ser en la cámara de flujo laminar de aire, en la sala de incubación y en el invernadero.

Actividad.

16. Distribución del medio de cultivo de la tabla 2.A., para la multiplicación de 135 propágulos sanos de clavel.

Subactividades

16.1. Antes de aforar el matraz receptor de los reactivos de la tabla 2.A., lleve a la cámara de flujo laminar de aire, cuya área exterior fue desinfectada y su interior desinfectado y tratado con rayos ultravioleta, 27 frascos esterilizados (subactividad 14.17), los coloco sobre papel estraza estéril y a un lado ubico el dosificador automático de medios de cultivo, desinfectado con benzal y barrido con rayos ultravioleta.

16.2. Antes de aforar, tapar y agitar el matraz (subactividad 15.21), llevé a la cámara de flujo laminar de aire, un plato de arcilla plano esterilizado, el cual puse a un lado de los frascos, acompañado de un mechero, de un vaso de alcohol con el bisturí y las pinzas en su interior.

16.3. Del area estéril creada en la mesa de trabajo, traslado el matraz desinfectado por fuera, a la cámara de flujo laminar de aire, lo pongo sobre papel estraza estéril, lo agito, vacío el contenido del matraz en una probeta de 825 c. c. y regreso el matraz al lugar que ocupaba antes de vaciar su contenido en la probeta.

16.4. El contenido de la probeta paso al dosificador automático de medios de cultivo y de este pasan 30 c. c. a cada frasco; se tapan los frascos con tapones esterilizados, se pasan a la cámara de incubación o a un gabinete con filtración para almacenar reactivos hasta 10 días como máximo o a un gabinete sin filtración hasta 3 días, antes de inocularles 5 yemas de clavel a cada uno de los 27 frascos que integran el lote ya que vamos a manipular 5X27=135 yemas y 27X30=810 c. c. del medio de la tabla 2.A.

Actividad

17. Extracción de las 135 yemas producto de las 45 plantas con 3 yemas cada una, desarrollada en 45 tubos de ensayo en la etapa W, hijas de los meristemos que

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prendieron en dicha etapa en los 50 tubos de ensayo, menos 5 meristemos que fallaron.

Subactividades

17.1. De la cámara bioclimática extraigo 3 gradillas, con 20 tubos de ensayo inoculados y uno con 5 tubos igualmente inoculados; de

los 45 tubos, cada uno contiene una planta con 3 yemas y 20 c. c. del medio de cultivo de la tabla 2., que totalizan 135 yemas y 900

c. c., ya que los 5 tubos en los que no pagaron 5 meristemos, consumieron 100 c. c. de medio, de modo que: 900+100=1,000 c.

c. del medio de la tabla 2.

17.2. De la cámara bioclimática o del anaquel de un gabinete con o sin filtración, extraigo 27 frascos, cada uno con 30 c. c. del medio de la tabla 2. A. sin inoculo y desinfectados por fuera; los transfiero a la cámara de flujo laminar de aire y los acomodo sin desperdiciar espacio.

17.3. Junto a los frascos, ubico 2 cajas de Petri esterilizadas.

17.4. Abro un tubo de ensayo procedente de la cámara bioclimática con 20 c. c. del medio de cultivo de la tabla 2., con su producto, que es una plántula con 3 yemas; también abro un frasco con 30 c. c. del medio de la tabla 2.A. sin inoculo; tomo las pinzas y el bisturí del vaso de alcohol, los flameo en el mechero, introduzco las pinzas en el tubo de ensayo inoculado, extraigo la plántula hija del meristemo, la coloco en una de las cajas de Petri; con las pinzas fijo la plántula, mientras que con el bisturí le quito las hojas, falsas raíces, vestigios de callo, estolones y solo dejo el tallo, el cual corto o repico en 3 pedazos con una yema cada uno y siembro 5 yemas en cada uno de los 27 frascos que tienen 30 c. c. del medio de cultivo de la tabla 2.A. sin inocular. Los residuos de la plántula, a raíz de esta manipulación, los pongo en la segunda caja de Petri y regreso el bisturí y las pinzas al vaso de alcohol; flameo, cierro, sello con cinta parafilm los frascos, los pongo en uno o más contenedores y los llevo a la sala de incubación donde los someto a 23O C, 16 horas luz y 8 sin luz por día, 4,500 lux de intensidad luminosa y 67 % de humedad relativa. Esta manipulación corresponde a la etapa X y esperamos obtener 4 yemas por cada yema inoculada de la etapa W; es decir 135 X 4 = 540 yemas nuevas producto del primer subcultivo de 50 meristemos de clavel con 5 fallas de microreproducción meristematicas en su etapa inicial (W).

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17.5. Si quisiéramos realizar el segundo subcultivo, necesitaríamos 540/5= 108 frascos y 108X30=3,240 c. c. de medio de cultivo (tabla 2.B.), pues esperamos obtener 540 plántulas y 2,160 yemas.

17.6. El tercer subcultivo requiere 2.160/5= 432 frascos y 12,960 c. c. del medio de cultivo de la tabla 2. C., ya que esperamos obtener 2,160 plántulas y 8,640 yemas.

17.7. El cuarto subcultivo necesita 8,640/5 = 1,718 frascos y 51,840 c. c. de medio de cultivo (tabla 2.D.), para lograr 8,640 plántulas y 34,560 yemas.

17.8. Los c. c. del medio de cultivo que se necesitaron, fueron los 1,000 del establecimiento, 810 del primer subcultivo, 3,240 del segundo, 12,960 del tercero y 51,860 c. c. del cuarto subcultivo.

Como ya no queremos seguir subcultivando o micropropagando yemas, debemos decidir qué hacer con las 8,640 plántulas que obtuvimos en el cuarto subcultivo a que ese refiere la subactividad 17.7.; habiendo optado por producir esquejes con 1,000 plántulas y comercializar las 7,640 restantes con productores interesados, cuando las raíces alcancen el crecimiento adecuado (5 centímetros), a condición de que primero las enraicemos.

Etapa Y: Enraizamiento y aclimatación de plantas de clavel, del laboratorio en el invernadero.

Actividad.

18. Enraizamiento de plántulas de clavel en el invernadero.

Subactividades.

18.1. Le eliminamos a las plántulas el vestigio de callo basal y las hojas, excepto las ultimas 2 que acompañan a la yema terminal, así como raíces mal ubicadas y hacemos conjuntos de 100 plántulas; los sumergimos en una solución de 2 gramos de captan por un litro de agua destilada estéril durante 10 segundos.

18.2. Sumergimos los cortes de los conjuntos durante 3 segundos en una solución de 1.5 c. c. de ADH por litro de agua para que se adhiera el promotor de raíz.

18.3. Ponemos en contacto los cortes de los conjuntos de plántulas con polvo Raizone Plus, que es el promotor de raíz.

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18.4. Trasplantamos en 20 charolas fertiirrigadas, que tienen 50 cavidades cada una, que contienen un sustrato formado por esphagno y dos de agrolita (20X50=1,000).

18.5. Se riegan mañana y tarde por nebulización o con regadera manual de salida fina, procurando darles una aplicación semanal de fertilizante foliar mezclado con 2 c. c. de tecto por litro de agua, usando el sistema de nebulización o aspersor manual.

18.6. Las plántulas recibirán temperatura media ligeramente inferior a la del lugar donde se van a cultivar a nivel de campo, el fotoperiodo también es ligeramente inferior y por lo que respecta a la humedad relativa, esta es de 75% en la primera semana, 65% para la segunda y a partir de la tercera semana se mantiene en 55%.

18.7. Veinte días después del trasplante en las charolas, obtenemos raíces nuevas de 2 centímetros de longitud, que crecieron en el sphagno y la agrolita, cuya mezcla imita a la tierra.

Etapa Z: Trasplante de plántulas de clavel en suelo del invernadero y acondicionamiento de este suelo.

Actividad

19. Transferencia de plántulas de las charolas a camas que se preparan en el invernadero.

Subactividades.

19.1. Diecinueve días después del trasplante en las charolas, escojo el lugar y delimito el espacio de cada cama.

19.2. Las camas se hacen inmediatamente después del trazo, una junto a otra, con un pasillo de 35 centímetros entre ambas, trabajando el suelo con zapapico y azadón.

19.3. Las camas miden 20 metros de longitud y un metro de ancho. Tienen 5 hileras de plántulas de 20 centímetros entre hileras y 20 centímetros entre plántulas o sea 100 plántulas por hilera y 500 por cama; es decir, necesitamos 2 camas para las 1,000 plántulas. Las camas tienen 6 centímetros de espesor de tierra traída de otra parte y las limita una faja de lamina de 44.50 metros de largo incluyendo traslapes y 18 centímetros de espesor, clavando estacas para que detengan la lamina y el suelo de la cama.

19.4. El 1.2 metros cúbicos de volumen de tierra traída de otra parte para cada cama, lo llenamos con suelo franco o con cualquier migajón cribado y desinfectado.

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19.5. Se nivela la cama y se riega para que reciba las plántulas de las charolas irrigadas, para extraer plántulas con raíces de 2 centímetros, miasmas que se trasplantan a 2 centímetros de profundidad en las camas y se les dan un poco menos de las condiciones de temperatura, fotoperiodo y humedad relativa, que en el campo donde se va a a cultivar el clavel a nivel comercialicen tierras de los floricultores. Con un radio de 5 centímetros y un palo con punta, se hace una circunferencia alrededor de cada planta y se le aplican 5 gramos de urea y 5 grs. de 18-46-00/planta; se riegan ligeramente mañana y tarde por nebulización o con regadera manual de salida fina; hacer una aplicación semanal de fertilizante foliar (Cual?) mezclado con 2 c. c. de captan por litro de agua.

19.6. Ocho días después del trasplante en las camas del invernadero, se despunta la yema terminal dl tallo principal de cada una de las 1,000 plantas, para favorecer la formación de ramas laterales y sublaterales con sus respectivas yemas terminales, dando origen a la primera generación de esquejes y como consecuencia a la primera generación de meristemos. 25 días después del despunte, obtenemos esquejes a los que le podemos dar 2 usos: el esqueje inducido a enraizamiento para producir plantas nuevas y el meristemo de sus yemas terminales para microreproducirlo, obtener yemas terminales para microreproducirlo, obtener yemas, subcultivarlas y hacer competitiva la producción de plantas biotecnológicamente adquiridas, con la reproducción de plantas logradas por semilla, sobre todo si se trata de plantas mejoradas genéticamente por medios biotecnológicos, los cuales tienen un espectro más amplio que el mejoramiento por métodos naturales o tradicionales; el método biotecnológico incluye la destrucción de genes negativos con rayos láser, la electroporacion de protoplastos, la microinyeccion, la biobalistica, la infección con Agrobacterium tumefaciens y la experimentación biotecnológica para saber cómo se comporta un organismo al que se le eliminó un gene o al que se le introdujo u virus o una bacteria con su carga de genes.

19.7. Los esquejes de clavel y de otras especies herbáceas y las plántulas enraizadas en charolas, se pueden convertir en plantas nuevas si los ubicamos en un invernadero con control climático o en una o en varias estructuras de fierro con 3 pares de patas de 1.10 metros de alto separadas por 3.00 + 3.00 metros en su longitud entre los tres pares de patas y en su anchura las patas están separadas por un metro; las patas están soldadas a 90

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centímetros del suelo, a un rectángulo de mallalac de 6X1 metros ; sobre el mallalac hay malla de alambre y sobre esta hay una malla de plástico más fina; su longitud izquierda tiene 2 tablas de 3 metros cada una y 15 centímetros de alto e igual su longitud derecha; su primer frente tiene una tabla de un metro de largo y 15 centímetros de alto e igual sucede con el segundo frente; del cajón que se forma: 2.00X 1.00x0.15 M3, vamos a tomar 7 centímetros de altura; por lo tanto, el volumen de sustrato es 6X1X0.07=0.42M3 o sea 0.28M3 de agrolita y 0.14 de esphagno, los cuales se mezclan, se depositan uniformemente en el cajón de la estructura, previa desinfección de esta con una solución de 10 c. c. de cloro por litro de agua y regarse antes del trasplante de los esquejes de 8 centímetros, mismos que habían sido agrupados en conjuntos de 100. INCLUIR UN DIBUJO ESQUEMATICO DE LA(S) ESTRUCTURA(S), TOMANDO EN CUENTA LAS DIMENSIONES (MEDIDAS, FORMAS, OBJETOS, MATERIALES, ETC.)

19.8. Con 196 c. c. de agua, 100 gramos de Raizone plus,(Nombre comercial) 2 c. c. de AIA y 2 c. c. de ANA, hacemos una especie de lechada, con la cual ponemos en contacto el corte de los conjuntos de esquejes, los cuales trasplantamos en la estructura de fierro a 2 centímetros de profundidad, 5 centímetros entre esquejes y 5 centímetros entre hileras de esquejes, que nos dan 120X20=2,400 esquejes por estructura.

19.9. Se riega una vez en la mañana y otra en la tarde con sistema de nebulización o con regadera manual de salida fina.

19.10. Se fertiliza una vez por semana con fertilizante foliar (¿Cuál?), mezclado con 2 c. c. de captan o de tecto por litro de agua, utilizando el sistema de nebulización o aspersor manual.

19.11. Cuando la raíz tiene 5 centímetros, se extraen las plantas cuidadosamente y se venden a los productores interesados para que las cultiven en sus tierras a cielo abierto o en aéreas protegidas. También se puede trasplantar una planta por maceta y venderse como una planta de ornato de lujo. Las 7,640 plantas necesitaron 3.18 estructuras de fierro (7,640/2,400)

Anexo las tablas: 2, 2.A., 2.B., 2.C., 2.D., 2.E. y 1.A.

El capitulo V, Medios de Cultivo, en su tabla 2.E, totaliza el peso de los reactivos de dichas tablas, por eso la tabla 2.E, resume lo que se requiere en materia de reactivos (ver tabla 2. E.)

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Tabla 2. 1,000 c.c. de este medio para micropropagar 50 meristemos de clavel (Dianthus caryophyllus, L.) y obtener 45 plántulas con 3 yemas cada una (135 en total)

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 1,000cc (**)1- NH4 NO3 1650.000 165.0002- KNO3 1900.000 190.0003- MgSO4

.7H2O 370.000 370.0004- MnSO4

.4H2O 22.300 22.3005- ZnSO4

.4H2O 8.600 8.6006- CuSO4

.5H2O 0.025 0.0257- CaCl2

.2H2O 440.000 440.0008- KI 0.830 0.8309- CaCl2

.6H2O 0.025 0.02510- KH2PO4 170.000 170.00011- H3Bo3 6.200 6.200

90


12- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.250

13- FeSO4.7H2O 27.810 27.810

14- Na2EDTA 37.310 37.310 COMPLEMENTO

15- Tiamina 0.400 0.40016- Mioinositol 100.000 100.00017- Sacarosa 30,000.000 30,000.00018- Cinetina 1.000 1.00019- AIA 0.300 0.30020- NaH2PO4

.H2O 0.170 0.17021- BA 0.600 0.60022- pH= 5.7 0.000 0.00023- Agar o Phytagel 6.500.000 6.500.000


(**) Miligramos que reciben los 1,000 c.c. de medio de cultivo.

VERIFICAR RELACION: VOLUMEN DE LOS MdC/ CANTIDADES DE PLANTULAS.

Tabla 2.A. 810 c.c. de este medio para el primer subcultivo de 135 yemas de clavel (Dianthus caryophyllus, L.), que caben en 27 frascos con 5 yemas cada uno y lograr 135 plántulas con 4 yemas por plántula (540 en total).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 810 c.c. (**)1- NH4 NO3 1,650.000 1,336.5002- KNO3 1,400.000 1,539.0003- MgSO4

.7H2O 370.000 299.7004- MnSO4

.4H2O 22.300 18.0635- ZnSO4

.4H2O 8.600 6.9666- CuSO4.5H2O 0.025 0.0207- CaCl2

.2H2O 440.000 356.4008- KI 0.830 0.6729- CaCl2

.6H2O 0.025 0.02010- KH2PO4 170.000 137.70011- H3Bo3 6.200 5.022

91


12- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.202

13- FeSO4.7H2O 27.810 22.526



.H2O 0.170 0.13721- BA 0.600 0.48622- pH= 5.7 0.000 0.00023- Agar o Phytagel 6,500.000 5,265.000



Tabla 2.B. 3,240 c.c. para el segundo subcultivo de 540 yemas de clavel (Dianthus caryophyllus, L.), que caben en 108 frascos con 5 yemas cada para obtener 540 plántulas con 4 yemas por plántula (2,160 en total).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 3,140 c.c. (**)1- NH4 NO3 1,650.000 5,346.0002- KNO3 1,400.000 6,156.0003- MgSO4.7H2O 370.000 1,198.8004- MnSO4

.4H2O 22.300 72.2525- ZnSO4

.4H2O 8.600 27.8646- CuSO4

.5H2O 0.025 0.0817- CaCl2

.2H2O 440.000 1,425.6008- KI 0.830 2.6899- CaCl2

.6H2O 0.025 0.08110- KH2PO4 170.000 550.80011- H3BO3 6.200 20.088

92


12- Na2MoO4.2H2O 0.250 0.810

13- FeSO4.7H2O 27.810 90.104






Tabla 2.C. 12,960 c.c. para el tercer subcultivo de 2,160 yemas de clavel (Dianthus caryophyllus, L.), que necesitan 432 frascos con 5 yemas cada para obtener 2,160 plántulas con 4 yemas por plántula (8,640 en total).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 12,960 c.c. (**)1- NH4 NO3 1,650.000 21,384.0002- KNO3 1,400.000 24,624.0003- MgSO4

.7H2O 370.000 4,795.2004- MnSO4

.4H2O 22.300 289.0085- ZnSO4

.4H2O 8.600 111.4566- CuSO4

.5H2O 0.025 0.3247- CaCl2

.2H2O 440.000 5,702.4008- KI 0.830 10.7569- CaCl2

.6H2O 0.025 0.32410- KH2PO4 170.000 2,203.200

93


11- H3Bo3 6.200 80.35212- Na2MoO4

.2H2O 0.250 3.24013- FeSO4

.7H2O 27.810 360.41714- Na2EDTA 37.310 483.537

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.400 5.18416- Mioinositol 100.000 1296.00017- Sacarosa 30,000.000 388,800.00018- Cinetina 1.000 12.96019- AIA 0.300 3.88820- NaH2PO4




Tabla 2.D. 51,840 c.c. para el cuarto subcultivo de 8,640 yemas de clavel (Dianthus caryophyllus, L), que caben en 1,728 frascos con 5 yemas cada para obtener 8,640 plántulas con 4 yemas por plántula (34,560 en total).


.7H2O 370.000 19,180.8004- MnSO4

.4H2O 22.300 1,156.0325- ZnSO4

.4H2O 8.600 445.8246- CuSO4

.5H2O 0.025 1.2967- CaCl2

.2H2O 440.000 22,809.6008- KI 0.830 43.0279- CaCl2.6H2O 0.025 1.296

94


10- KH2PO4 170.000 8,812.80011- H3BO3 6.200 321.40812- Na2MoO4

.2H2O 0.250 12.96013- FeSO4

.7H2O 27.810 241.67014- Na2EDTA 37.310 1,934.150

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.400 20.73616- Mioinositol 100.000 5,184.00017- Sacarosa 30,000.000 1,555,200.00018- Cinetina 1.000 51.84019- AIA 0.300 15.55220- NaH2PO4




Tabla 2.E. Suma del peso de los reactivos de las tablas 2, 2.A., 2.B., 2.C. y 2.D., capitulo V.


.7H2O 370.000 25,844.50004- MnSO4

.4H2O 22.300 1,557.65505- ZnSO4

.4H2O 8.600 600.71006- CuSO4

.5H2O 0.025 1.74627- CaCl2

.2H2O 440.000 30,734.00008- KI 0.830 57.97559- CaCl2

.6H2O 0.025 1.7462

95


10- KH2PO4 170.000 11,874.500011- H3BO3 6.200 433.070012- Na2MoO4

.2H2O 0.250 17.462513- FeSO4

.7H2O 27.810 1,942.528514- Na2EDTA 37.310 2,606.1035

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.400 27.940016- Mioinositol 100.000 6,985.000017- Sacarosa 30,000.000 2,095,500.000018- Cinetina 1.000 69.850019- AIA 0.300 20.955020- NaH2PO4




Tabla 1.A. Vitaminas empleadas en diferentes medios de cultivo (mg/l).

96


VI. Microreproducción del órgano vegetal llamado raíz.

Kotte y Robins reportaron en 1922, el crecimiento de ápices radiculares descendientes de raíces de semillas de trigo germinadas asépticamente (ver germinación aséptica de una semilla, capítulo I) y cultivadas en un medio de sales inorgánicas y glucosa, habiendo observado que el crecimiento de la raíz disminuía, no importa que la raíz se ubicara en un medio de cultivo fresco. En 1934, White cultivó en un medio

97

Compuesto Constabel, 1958

Gamborg 1963

Menderson, Durell y Bonner, 1952

Morel y Wetmer, 1952

Nickell y Maretaki1969

Paris y Dumamet,1953

Reinert y White,1956

White1963

Ácido p amino benzoico

0.2 0.05

Ácido ascorbico

10 0.4 0.1

Biotina 0.1 0.00025 0.005 0.01 0.002 0.002 0.01Cloruro de colina

10 0.2 0.1 10

Cianocobala-lamina

0.0015

Ácido fólico 1 0.015 0.1 0.0003Ácido nicotínico

0.5 0.5 0.5 1 2.8 0.06 0.5 0.5

Pantotenato de calcio

10 0.4 0.8 1.0 5.0 0.1

Cloruro de Piridoxina

0.5 0.1 1.0 0.2 0.001 0.1 0.1

Riboflavina 0.1 0.015 0.05 0.2 0.001 0.1Cloruro de tiamina

0.1 0.5 0.1 1.0 0.03 0.005 0.1 0.1


de cultivo líquido, integrado por sales inorgánicas, sacarosa y extracto de levadura, ápices obtenidos de raíz de jitomate, que se transformaban en una raíz que crecía, se ramificaba y no moría si un ápice nuevo o una fracción de raíz se inoculaban en un medio de cultivo fresco.

El éxito de un cultivo de raíz, depende de la calidad de la parte que vamos a cultivar y del medio de cultivo que utilicemos.

Las respuestas de las raíces de las especies que se han cultivado in vitro, les sirvió de base a Butcher e Ingram en 1976, para agruparlas del modo siguiente:

1. Especies cuyas raíces se pueden desarrollar indefinidamente en cultivo y subcultivo (medio fresco), como el jitomate, clavo y toloache (*) Usar Ns. Cs.

2. Las que pueden crecer en el medio de cultivo periodos largos., pero no indefinidamente, como el chícharo y el trigo; esta falla probablemente se debe a una presencia limitada de células totipotenciales en sus raíces y a la formación exagerada de raíces laterales.

3. Raíces de especies leñosas que crecen con dificultad, pues requieren factores de crecimiento que hasta la fecha no han sido identificados; quizá con la experimentación de medios de cultivo en combinación de ápices radiculares, como el que sigue, nos puedan ayudar a resolver este problema.

Medios de cultivo Ápices radiculares de 3 especies * A, B, C, D * X, Y, Z

Diseño experimental: Bloques al azar con cuatro repeticiones.

Tabla VI.

Repeticiones Combinaciones de 4 medios de cultivo con 3 ápices radiculares diferentes y IV repeticiones Total

I BZ BY CZ DY AZ DX CY DZ BX CX AY AX = 14.281.32 1.05 1.33 1.05 1.32 1.28 1.06 1.29 1.04 1.30 1.07 1.17

II AY BX CY CZ BY DY AX DX AZ DZ BZ CX = 14.031.02 1.07 1.19 1.18 1.05 1.20 1.29 1.06 1.20 1.15 1.32 1.30

III DZ DY AY DX BZ AX CZ CX BX CY AZ BY = 14.541.27 1.01 1.01 1.16 1.33 1.17 1.30 1.33 1.30 1.35 1.29 1.02

IV DX DZ BZ BY AX DY BX AZ AY CX CZ CY = 14.331.19 1.26 1.32 1.00 1.09 1.18 1.29 1.30 0.99 1.31 1.25 1.15 =

Total 4.80 4.39 4.85 4.39 4.79 4.83 4.94 4.98 4.53 5.11 4.93 4.64 57.18

(*) El peso de las raíces producto de las combinaciones de medios con ápices radiculares se da en gramos, pues mi objetivo es demostrar cómo hacer el análisis estadístico y encontrar la mejor combinación entre un medio de cultivo y el ápice radicular de una especie.

Tabla VI.1. (¿Algún encabezado?

Repet.

Peso de las combinaciones de A con X, Y, Z.

Peso de lascombinaciones de Bcon X, Y, Z.

Peso de lasCombinaciones de Ccon X, Y, Z.

Peso de lasCombinaciones de Dcon X, Y, Z.

98


AX AY AZ BX BY BZ CX CY CZ DX DY DZ Total/Rep

I 1.17 1.07 1.32 1.04 1.05 1.32 1.30 1.06 1.33 1.28 1.05 1.29 14.28

II 1.29 1.02 1.10 1.07 1.05 1.32 1.30 1.19 1.18 1.06 1.20 1.15 14.03

III 1.17 1.01 1.29 1.30 1.02 1.33 1.33 1.35 1.30 1.16 1.01 1.27 14.54

IV 1.09 0.99 1.30 1.29 1.00 1.32 1.31 1.15 1.25 1.19 1.18 1.26 14.33Total(*)

4.72 4.09 5.11 4.70 4.12 5.29 5.24 4.75 5.06 4.69 4.44 4.97 57.18

(*) Se refiere al total por combinaciones.

Tabla VI.2. Producción de medios y ápices radiculares de 3 especies.

X Y Z Total por medioMedio de cultivo A: AX AY AZ = 13.92Medio de cultivo B: BX BY BZ = 14.11Medio de cultivo C: CX CY CZ = 15.05Medio de cultivo D: DX DY DZ = 14.10Total por ápice: 19.35 17.40 20.4

3= 57.18

Tabla VI.3. Producción por ápice de 3 especies y medios.

A B C D Total/especieEspecie X: AX BX CX DX = 19.35Especie Y: AY BY CY DY = 17.40Especie Z: AZ BZ CZ DZ = 20.43Total por medios 13.92 14.11 15.0

514.10 = 57.18

Suma general de cuadrados (S. G. C.).

S. G. C.

AX2+ AY2+ AZ2+ BX2+ BY2+ BZ2+ CX2+ CY2+ CZ2+ DX2 DY2+ DZ2+AX2+ AY2+ AZ2+ BX2+ BY2+ BZ2+ CX2+ CY2+ CZ2+ DX2 DY2+ DZ2+AX2+ AY2+ AZ2+ BX2+ BY2+ BZ2+ CX2+ CY2+ CZ2+ DX2 DY2+ DZ2+AX2+ AY2+ AZ2+ BX2+ BY2+ BZ2+ CX2+ CY2+ CZ2+ DX2 DY2+ DZ2+ = 57.182/48

99

1


S.G.C= 1.322+ 1.052+ 1.332+ 1.052+ 1.322+ 1.282+ 1.062+ 1.292+ 1.042+1.302+ 1.072+ 1.172+ 1.022+ 1.072+ 1.192+ 1.182+ 1.052+ 01.202+ 1.292+ 1.062+ 1.202+ 1.152+ 1.322+ 1.302+ 1.272+ 01.012+ 1.012+ 1.162+ 1.332+ 1.172+ 1.302+ 1.332+ 1.302+ 01.352+ 1.292+ 1.022+ 1.192+ 1.262+ 1.322+ 1.002+ 1.092+ 01.182+ 1.292+ 1.302+ 0.992+ 1.312+ 1.252+ 1.152+ =57.182/ 48

S.G.C.= 68.7634-

68.115675 =0.6477 0 0 0 0 0 0

Suma de cuadrados relativos a los medios de cultivo (S. C. M).

AX + BX + CX + DX = 19.35AY + BY + CY + DY = 17.40AZ + BZ + CZ + DZ = 20.4313.92 + 14.11 + 15.05 + 14.10 = 57.18

S. C. M. = 193.7664 + 199.0921 + 226.5025 + 198.8100 = 57.182

12 48

S. C. M. = 68.1809 - 68.1156

S. C. M. = 0.0653.

Suma de cuadrados relativos a especies (S. C. E.).

Suma de las combinaciones (AX+ BX+ CX+ DX)2 / 16; mas

(AY+ BY+ CY+ DY) / 16; mas (AZ+ BZ+ CZ+ DZ)2 /16; menos 57.182/48.

100

2

3


S. C. E.= 374.4225+ 302.7600+ 417.3849/16 = 57.182/48 = 68.4104 - 68.1156.

S. C. E.= 0.2948

Suma de cuadrados correspondientes a bloques (S. C. B.).

Suma de las combinaciones al cuadrado del bloque I; mas el de las combinaciones al cuadrado del bloque II; mas las del bloque III2; mas las del bloque IV2; menos 57.182/48.

S. C. B. = 203.9184 + 196.8409 + 211.4116 + 205.3489 / 12 - 57.182/48.

S. C. B. = 68.1266- 68.1156.

S. C. B. = 0.0110.

Suma de cuadrados correspondientes a la interacción entre medios de cultivo y ápices de raíz de tres especies (S. C. M. E.)

Se suman los valores de AX2+ AY2+ AZ2 de la tabla VI.1 y el resultado se divide entre 4; aplicamos el mismo método a las combinaciones BX2+ BY2+ BZ2/4; luego CX2+CY2+CZ2/4; seguimos con DX2+ DY2+ DZ2/4; menos la suma de los 4 bloques2 entre 48 menos S. C. M. menos S. C. E.

S. C. M. E. = AX2+AY2+AZ2+BX2+BY2+BZ2+CX2+CY2+CZ2+DX2+DY2+DZ2/4-57.182/48-0.0653-0.2948.

S. C. M. E. = 22.2784+16.7281+26.1121+22.0900+

16.9744+27.9841+27.4576+22.5625+

25.6036+21.9961+19.7136+24.7009/4=

68.5503-68.1156 – 0.0653- 0.2948.

S. C. M. E. = 0.0746.

Cuadrado de Análisis de Variación.

Factor de variación

Suma de cuadrados

G. de ind. Cuadrado medio

F calculada F de la tabla 0.05

Medios de cultivo (4)

0.0653 3 0.0217 3.56 2.90

Ápices de especies (3)

0.2948 2 0.1474 24.16 3.30

101

4

5


Bloques (IV) 0.0110 3 0.0036 0.59 2.90Interacción medios y esp.

0.07446 6 0.0124 2.03 2.40

Error exptal. 0.2020 33 0.0061Total general 0.6477 47

F calculada > F de la tabla = valor significativo.

F calculada < F de la tabla= valor no significativo.

Prueba de “F”

Esta prueba consiste en comparar los valores de la “F” calculada, con los valores de la tabla de “F”, última columna del cuadro de análisis de variación anterior, considerando que si la “F” calculada es mayor que la “F” de la tabla, la variabilidad del factor de variación correspondiente es significativa; pero si el valor de “F” de la tabla es mayor que el de “F” calculada, la variabilidad del factor de variación correspondiente no es significativa. Veamos el cuadro anterior:

Factor de variación “F” calculada de la tabla ResultadoMedios de cultivo (4) 3.56<4.46 No significativoÁpices de especies (3) 24.16>5.34 SignificativoBloques 0.59<4.46 No significativoInteracción Medios/Esp. 2.03<3.42 No significativoObservando los factores de variación anteriores vemos que: Medios de cultivo (4) y ápices de especies (3), son los únicos significativos y eso nos dice que les debemos hacer la prueba de “t”.

Error típico de la variabilidad entre medios de cultivo (4).

E TD = √0.0061 x12x 2 =√0.1464

E TD= 0.3826.

Valor de “t” en la tabla para 33 grados de independencia del error experimental, que es 3 unidades mayor que 30; por lo tanto, “t” de la tabla igual a 2.

Prueba de “t”= E TD x t= 0.3826x2.

Prueba de “t”= 0.7652.

Medio de cultivo A = 13.92 C = 15.05Medio de cultivo B = 14.11 B = 14.11Medio de cultivo C = 15.05 D = 14.10Medio de cultivo D = 14.10 A = 13.92

102


Se demuestra que el medio de cultivo C es el más recomendable, le sigue B, luego D y por último A.

Error típico de la variabilidad entre ápices de especies (3).

E. T. D =√0.0061∗16∗2 =√0.1952

E. T. D = 0.4418.

Valor de t en la tabla = 2.

Prueba de t= E. T.D= E. T. D X t

Prueba de t= 0.4418 X 2.

Prueba de t = 0.8836.

Ápice X = 19.35 Z= 20.43Ápice Y = 17.40 X= 19.35Ápice Z = 20.43 Y= 17.40

Z-X = 1.08 >0.8836 SignificativoZ-X = 3.03 >0.8836 SignificativoX-Z = 1.95 >0.8836 Significativo

Lo cual evidencia que el ápice Z es el mejor, el segundo lugar le corresponde a X y el tercero a Y.

Podemos aceptar que lo significativo en relación con cualquier factor de variación, como el de medios de cultivo (4) y el de ápices de especies (3) nos dice que hay un factor que ocupa el primer lugar y los demás el que les corresponda según el valor de f calculada en el cuadro de análisis de variación.

Este experimento busca la mejor combinación entre 4 medios de cultivo y ápices radiculares de 3 especies vegetales y esta combinación es el medio de cultivo con el ápice radicular Z ( Z).

103

CC

C-B= 0.94>0.7652 Significativo C-D= 0.95>0.7652 Significativo C-A= 1.13>0.7652 Significativo B-D= 0.01<0.7652 No significativo B-A= 1.19<0.7652 No significativo D-A= 0.18<0.7652 No significativo


Lo anterior nos sirve de base para crear otra línea de investigación que consiste en conocer la mejor combinación entre 4 medios de cultivo y 3 ápices meristematicos del mismo número de variedades de una especie o de 3 especies distintas, tomando como testigo el medio de cultivo para papa (tabla 1.B., capitulo XII para 48 combinaciones en 4 repeticiones y 20 c. c. de medio por combinación (960c .c. /4 =240 c. c. por medio de cultivo).

Saber qué nutrientes requiere el ápice radicular de la variedad representativa de una especie que nos interese reproducir in vitro, significa maravillarnos de lo que es capaz de hacer esa pequeña fracción de vida para sobrevivir y reproducirse en el medio de cultivo que le corresponde.

Se ha concluido que las raíces de las plantas resuelven su necesidad de vitaminas con la acción de sus hojas; pero la tiamina ayuda a que esta necesidad quede mejor satisfecha y que la piridoxina y el ácido nicotínico, aportan radicales amino y carboxilo que hacen más eficientes las acciones bioquímicas de la raíz, pues ayudan a producir las sustancias nuevas que necesita para su desarrollo normal.

Producir plantas por medio de semilla es lo natural, porque la semilla tiene los genes y las sustancias que la nutren y regulan su crecimiento hasta convertirla en una planta nueva igual a la de donde proviene la semilla; pero esto no es todo, pues si en un momento dado no hay en su cuerpo un compuesto que necesita, lo produce mediante una o dos reacciones químicas tomando como materia prima los compuestos que si existen en su cuerpo y sus enzimas como catalizadoras (biosíntesis).

La obtención de plantas nuevas, descendientes de células en suspensión, protoplastos, anteras y óvulos inmaduros, meristemos, hojas, peciolos, pedazos de embriones, papa, ajo, cebolla, maguey, henequén, callos, etc., son biotecnologías que los seres humanos han creado e imitan con éxito a la Naturaleza; por eso cada inoculo requiere de un medio de cultivo especifico y de las enzimas que el mismo produce para, mediante subcultivos, regenerar gran cantidad de plantas capaces de competir con las que provienen de semilla.

Las raicillas, cuando son más gruesas, es mayor su capacidad osmótica y su potencial de tras- locación; por ende, cortar a una raíz en la base inferior de una ramificación y en la base superior de dicha ramificación y a tal fracción la nutrimos in vitro con 20 c. c. de una solución de 80 gramos de sacarosa, 20 miligramos de AIA, 5 mg. de cinetina y 15 mg. de mioinositol por litro de agua, la estamos induciendo a un mayor grosor, a una mayor capacidad de intercambio con su entorno, a un flujo más rápido de las sustancias que extrae del espacio que la rodea, a una mejor nutrición y a un mayor desarrollo del pedazo de raíz; pero como esta inducción no se hereda, la vamos a tener que hacer en germinadores cuyas cavidades tienen esphagno y agrolita 1 a 2, partes, en las que se trasplantan plantas con raíces de un centímetro de longitud y se nutren con la solución que se cita al principio de este párrafo, hasta que la raíz tiene 5 cm; se vexzxy (no se entiende)la planta y se trasplanta en el lugar definitivo por los productores, quienes lograran mayor rendimiento por hectárea, a partir de un mecanismo sencillo de biotecnología, como el que se ha descrito.

Para mí, el volumen que se logra con la inducción de las raicillas a que engrosen, equivale al volumen de los nódulos que se forman en las leguminosas debido a la simbiosis con la bacteria Rhizobium: ¿Cómo lograr el equilibrio entre volúmenes?. Si se indujo a la raíz de la planta y sus

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ramificaciones, a engrosar, también podemos hacer que las líneas con números pares de las 100 charolas germinadoras no produzcan nódulos o produzcan muy pocos; tales charolas cuya primera línea de cavidades germinadoras contiene esfagno (definir cual termino usar) y agrolita en la proporción de una a dos partes, pero no tiene plantas; las cavidades de la segunda línea tienen también esfagno y agrolita, pero después de humedecerlas reciben una planta leguminosa con raíces de un centímetro e inmediatamente se riegan con una solución de 50 gramos de sacarosa, 10 mg. de AIA, 3 mg. de AIA, 3 mg. de cinetina, 8 mg. de mioinositol, 300 mg. de nitrato de calcio, 2 c. c. de tecto y 80 mg. de nitrato de potasio por litro de agua, regando a diario mañana y tarde con agua potable y aplicando 5 riegos, uno cada 6 días, con 250 litros del medio de cultivo de la tabla , solo para las líneas 1, 4, 6, 8, 10, 12 (ver charola germinadora).

Tres días después del trasplante en las líneas par, se dan 5 riegos , 1 cada 6 días, con 250 litros del medio de cultivo de la tabla ,obtenido con 1 gramo de sulfato de magnesio, medio gramo de sulfato de sodio, un cuarto de gramo de fosfato ácido de sodio, 20 gramos de sacarosa y 500 mg. de agar por litro de agua.

Las plantas de la segunda línea de cavidades, van a llegar a la primera y tercera línea y es donde las bacterias van a producir sus nódulos inducidos.

Figura 1. Charola germinadora.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Líneas de cavidades.

Líneas de cavidades sin plantas: 1, 3, 5, 7, 9 que reciben el medio de cultivo mínimamente agarizado y sin nitratos.

Líneas de cavidades con plantas: 2, 4, 6, 8, 10 receptoras de medio de cultivo con nitratos y reguladores de crecimiento.

Cavidad.

105

6


Para dejar en claro este tema de la raíz vegetal, propongo el siguiente experimento:

Poner en una caja de Petri invertida, 0.1 c. c. de protoplastos de la bacteria del genero Rhizobium, mas 2 c. c. de protoplastos de una variedad de maíz, mas 2 c. c. de protoplastos de otra variedad de maíz, mas 8.5 c. c. de la siguiente solución: 1 gramo de sulfato de magnesio, medio gramo de sulfato de sodio, un cuarto de gramo de fosfato ácido de sodio, 25 gramos de sacarosa por litro de agua e incubar 4 semanas a 280 C. 2,000 lux, 75 % de humedad relativa y lo que resulte, llevarlo hasta enraizamiento y cultivo de primera generación para ver si la fusión completa de protoplastos de los dos maíces y de la bacteria Rhizobium, producen un descendiente capaz de fijar nitrógeno atmosférico.

Finalmente se trata de que la raíz vegetal sea mas totipotente; es decir que tenga más células madre para lograr una planta nueva a partir de una raíz, lo cual hasta hoy no se ha logrado en plantas con raíz vigorosa y por tal razón, no hemos aprovechado las ventajas que nos puede dar la obtención de una planta nueva a partir de su raíz, excepto las plantas con raíces carnosas como la zanahoria y otras que se han regenerado a partir de sus raíces.

La fusión de protoplastos de dos variedades de maíz, con protoplastos de la bacteria fijadora de nitrógeno, se pretende obtener un maíz que produzca nódulos fijadores de nitrógeno atmosférico, es decir, hacer leguminosa a una especie que no es tal.

La primera revolución verde, basada en “n” cromosomas, nos dio un mensaje: Hacer la segunda Revolución Verde genéticamente con “2 n” cromosomas y vamos, no solamente a mejorar lo que “n” produjo, sino que podemos crear especies nuevas mediante la fusión de protoplastos inducidos a calo productor de plántulas mejoradas (ver la secuencia del método enzimático para aislar, fusionar y cultivar protoplastos, a fin de regenerar plantas de tabaco, capitulo XI).

Anexo las tablas , , , , , , , , e .

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A B C D FE G H I


Tabla A. 240 c. c. de este medio para 12 frascos con 20 c. c. cada uno, pues se trata de 3 combinaciones de A por 4 repeticiones (ver la tabla VI del capítulo con igual número romano).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 240 c.c. (**)1- KCl 64.2000 15.40802- KNO3 80.0000 19.20003- MgSO4.7H2O 720.0000 172.80004- MnCl2

.4H2O 5.5000 1.32005- ZnSO4

.7H2O 2.5000 0.60006- CuSO4

.5H2O 0.1300 0.03127- Ca(NO3)2

.4H2O 285.0000 68.40008- KI 0.7300 0.18009- H2Mo4 0.0015 0.000410- NaH2PO4

.2H2O 21.0000 5.040011- H3BO3 1.5000 0.360012- Na2SO4

.10H2O 450.5000 108.120013- FeCl3 3.0000 0.720014- Na2EDTA 8.0000 1.9200

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.0700 0.016816- Piridoxina 0.0700 0.016817- Ácido nicotínico 0.4500 0.108018- Glicina 2.5000 0.600019- Sacarosa 17000.0000 4080.000020- pH.=4.8 0.0000 0.0000

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Tabla B. 240 c. c. de este medio para 12 frascos con 20 c. c. cada uno , ya que son 3 combinaciones de B por 4 repeticiones (ver la tabla VI del capítulo con igual número romano).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 240 c.c. (**)1- KCl 64.2000 15.40802- KNO3 80.0000 19.20003- MgSO4.7H2O 722.0000 173.28004- MnCl2.4H2O 5.6000 1.34405- ZnSO4.7H2O 2.5500 0.61206- CuSO4.5H2O 0.1000 0.02407- Ca(NO3)2.4H2O 286.0000 68.64008- KI 0.7200 0.17289- H2Mo4 0.0012 0.000310- NaH2PO4

.2H2O 21.2000 5.088011- H3BO3 1.4000 0.336012- Na2SO4.10H2O 451.0000 108.240013- FeCl3 3.0000 0.720014- Na2EDTA 7.8000 1.8720


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Tabla C. 240 c. c. del medio de esta tabla para 12 frascos con 20 c. c. cada uno, como resultado de las 3 combinaciones de C por 4 repeticiones (ver la tabla VI del capítulo con igual número romano).




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(*) Medio de cultivo para raíz de jitomate, propuesto por White en 1943, modificado por Sheat, 1959.

Este medio nos sirvió de base para formular los de las tablas A, B, D.

Tabla . 240 c. c. del medio de esta tabla para 12 frascos con 20 c. c. cada uno, ya que son 3 combinaciones de D por 4 repeticiones (ver la tabla VI del capítulo con igual número romano).



COMPLEMENTO15- Tiamina 0.1500 0.036016- Piridoxina 0.1500 0.036017- Ácido nicotínico 0.5900 0.141618- Glicina 3.8000 0.912019- Sacarosa 25000.0000 6000.0000

110

DD


20- Ph.=4.8 0.0000 0.0000

Tabla . Inducción a engrosamiento in vitro de 5 fracciones de raíz, con 20 c. c. por fracción, de este medio (100 c. c.)

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 100 c.c. (**)

COMPLEMENTO1- Sacarosa 80,000.000 8,000.002- AIA 20.000 2.003- Cinetina 5.000 0.504- Mioinositol 15.000 1.50

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E


5- Ph.=4.8 0.0000 0.0000

Tabla . Para que la bacteria Rhizobium produzca pocos nódulos o no produzca, en 100 charolas germinadoras que reciben 250 litros de este medio en 5 riegos, uno cada 6 días, en las líneas con numero par en las charolas que recibieron una planta leguminosa con raíz de 1 centímetro de longitud por cavidad, complementadas con 2 riegos por día

.

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 250 litros. (**)1- Ca(NO3)2 300.000 75,000.0002- KNO3 80.000 20,000.000

112

F


COMPLEMENTO3- Sacarosa 50,000.000 1250,0000.0004- AIA 10.000 2,500.005- Cinetina 3.000 750.0006- Mioinositol 8.000 2,000.0007- Tecto 2,000.000 500,000.0008- Agar 500.000 125,000.0009- pH.=4.8 0.0000 0.0000

Tabla . Para que las raíces de las plantas que se trasplantaron en las líneas con numero par, invadan a las líneas con numero non y produzcan muchos nódulos, debido a que estas líneas recibieron 250 litros de este medio, en 5 riegos , uno cada 6 días y que por carecer de nitratos, favorece la acción de la bacteria Rhizobium, productora de nódulos y fijadora de nitrógeno atmosférico, complementadas con dos riegos ligeros por día.

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 250 litros. (**)1- MgSO4 1,000.00 250,000.002- Na2SO4 500.00 125,000.003- NaH2PO4 250.00 62,500.00

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G


COMPLEMENTO4- Sacarosa 20,000.000 5,000,000.005- Agar 500.00 125,000.006- Tecto 60 2,000.00 500,000.00

Tabla . .Experimento con 2 c. c. de protoplastos de un maíz, mas 2 c. c. de protoplastos de otro maíz, mas 0.1 c. c. de protoplastos de células de la bacteria Rhizobium, sembrados en una caja de Petri invertida que tiene 8.5 c. c. del medio de esta tabla.

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 8.5 c. c. (**)1- MgSO4 1,000.00 8.5002- Na2SO4 500.00 4.2503- NaH2PO4 250.00 2.125

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H


COMPLEMENTO4- Sacarosa 25,000.000 212.500

Tabla . .Suma del peso de los reactivos de las tablas , ,

, , , y , del capítulo VI.

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para las 8 tablas(**)1- NH4NO3 62.40002- KNO3 20,076.80003- MgSO4

.7H2O 250,710.26004- MnSO4

.4H2O 5.76005- ZnSO4.4H2O 2.54406- CuSO4.5H2O 0.12487- CaCl2

.2H2O 276.480

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I A B C

D E GF H


8- KI 0.72009- CaCl2

.6H2O 0.001710- KH2PO4 15.188011- H3BO3 1.440012- Na2MoO4.H2O 434.880013- FeSO4.7H2O 2.976014- Na2 EDTA 7.680015- Ca(NO3)2 75,000.000016- Na2SO4 125,439.130017- NaH2PO4 62,520.6400

COMPLEMENTO18- Thiamina 0.09619- Piridoxina 0.09620- Ácido nicotínico 0.48021- Glicina 2.88022- Sacarosa 17,527,412.5023- pH=4.8 0.00024- AIA 2,502.00025- Cinetina 750.5026- Mioinositol 2,001.5027- Tecto 60 1,000,000.0028- Agar 250,000.00

116


I- Regeneración de violeta africana a partir de su hoja inducida a la producción de brotes.

Tejido de una planta pluricelular: es un conjunto de células que desempeñan funciones similares o relacionadas.

Órgano vegetal: Tejido o grupo de tejidos que morfológica y fisiológicamente distinguen al órgano al que pertenecen, de los otros órganos de la planta, por ejemplo la hoja.

Hoja: Órgano primario de muchas plantas vasculares, principal responsable de la fotosíntesis.

Estructura: Distribución y orden de las partes de una cosa o de un ser vivo.

Proceso: Conjunto de las fases de un fenómeno.

Fisiología vegetal: Estudio de los procesos que suceden en los vegetales y de las funciones de los diferentes órganos de la planta, responsable de tales procesos.

La estructura de una hoja, por ser un órgano, es mas complicada que la de un meristemo, pues este es un tejido, por eso el manejo de órganos y tejidos con fines de micropropagación, difieren en algún componente del proceso.

El cultivo de una fracción de órgano, tiene por objeto alcanzar, a partir de su estructura, la morfología y fisiología que lo identifican con el órgano del vegetal de donde proviene, incluso lograr que se convierta en una planta nueva, que es el objetivo general de la microreproducción vegetal.

Embrión: Esporofito joven o planta en miniatura, antes de empezar a tomar su forma madura.

White y Hanning, demostraron que el cultivo de órganos y embriones in vitro; tuvieron primero éxito que el cultivo de tejidos y células pues el primero cultiva y subcultiva raíces de jitomate que no morían debido al cambio de medio que recibían en cada subcultivo; en cambio Hanning, logró plántulas de crucíferas micro reproduciendo embriones extraídos de frutos inmaduros.

El estudio de las hojas para su reproducción masiva por micropropagación, demanda una selección de prototipos de especies cuyas hojas sirven para curar enfermedades o para otro objetivo; se sigue con la experimentación de medios

117


para identificar el mejor para la variedad prototipo de la especie que nos interesa cultivar utilizando medios de cultivo muy simples o complejos y usando como inoculo primordios foliares, de los que esperamos hojas directamente, que provienen de los primordios más viejos, sin inducción a cualquier otra forma de

sustitutos reproductivos; seguimos con la experimentación de medios a fin de encontrar el más adecuado para reproducir in vitro secciones de hoja e inducirlas a que produzcan brotes que al enraizarlos en el invernadero, nos den plantas o clones nuevos, capaces de competir en habilidad reproductiva, con las plantas procedentes de semilla.

Las células del mesofilo de hojas jóvenes y las células de otros órganos vegetales inmaduros e incluso maduros son las dos mejores fuentes de protoplastos, cuyo aislamiento, fusión y cultivo, produce colonias celulares con células que formaron sus citoplasmas y sus núcleos. Otras que solo unieron sus citoplasmas y las que solo regeneran la membrana que se les había destruido; el callo que resulta de estas colonias celulares tiene plántulas hibridas mejoradas, plántulas con células de dos o más núcleos que son poco mejoradas genéticamente y plantas iguales a las de cuya hoja se extrajo el Protoplasto que le da origen. Lo importante es que también a partir de células podemos lograr plantas nuevas.

Las fracciones de hojas de café, se micro reproducen al inducirlas a producir callos y de estos obtenemos embriones somáticos que, al subcultivarse en un medio producto de la investigación de medios de cultivo, nos da plantas nuevas en grandes cantidades mediante los subcultivos y el enraizamiento.

Cultivo in vitro de secciones de hoja de violeta africana ( Saintpaulia ionantha Wendel).

Etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico de hoja de violeta africana.

Descripción de las actividades de la micropropagación vegetal para la etapa W.

A c t i v i d a d

1. Determinación y uso de los reactivos del medio de cultivo de hoja de violeta americana (Tabla 3, que se anexa al capítulo).

S u b a c t i v i d a d.

118


1.1. Los reactivos se obtienen de la tabla 3, porque se conocen, si no se conocieran, acudiríamos a un experimento con medios de cultivo y fracciones de hoja.

A c t i v i d a d

2. Esterilización de frascos Gerber y uso de 5, para que reciban 30 c. c. del medio de la tabla 3 y 5 fracciones de 1 cm2 hoja de violeta africana cada uno o 5 fracciones de peciolo de 3 mm. De largo.

S u b a c t i v i d a d e s.

2.1. Acopio de los 5 frascos (Tabla 3)2.2. Lavado de los frascos con una solución de 1 litro de agua

y 10 gramos de detergente en la sala de lavado, secado y esterilización del laboratorio.

2.3. Enjuague de los frascos con agua limpia en la misma sala.

2.4. Secado, tapado y colocado de los frascos en cajas desinfectadas y ubicación de estas en nuestra mesa de trabajo o en un gabinete de recepción.

2.5. Le ponemos agua a la autoclave hasta un nivel de 5 centímetros que les permita a los frascos tener una fracción por encima del nivel del agua de la autoclave.

2.6. Pasamos los frascos de las cajas a la autoclave.2.7. Cierro la autoclave, la conecto con la electricidad, la

enciendo, marco 1200C, le doy vuelta al botón hasta que llegue al sector que indica máximo y de inmediato abro la válvula de vapor.

2.8. Cuando empiece a salir vapor de agua por la válvula, la cierro.

2.9. El manómetro comienza a moverse y lo dejamos libre hasta que marque 15 libras por pulgada cuadrada o 1 kilogramo por centímetro cuadrado de presión.

2.10.Giramos el botón hasta el sector que señala mínimo y dejamos que pasen 15 minutos.

2.11.Apago la autoclave moviendo el botón hasta dejar ver la luz roja próxima el.

2.12.Desconectamos la autoclave de la electricidad.2.13.Regresa a 0 la aguja del manómetro.

119


2.14.Abrimos la válvula de vapor para anular presión y vapor.2.15.Se abre la autoclave cuidadosamente para no recibir una

descarga de vapor.2.16.Extraemos de la autoclave los 5 frascos que nos

demanda la tabla 3, los colocamos en la mesa de trabajo y los demás se almacenan en un gabinete con o sin filtración de aire, para usarlos cuando se necesiten en otra actividad, pues se trata de aprovechar bien la autoclave.

2.17.Si el gabinete no tiene filtración de aire, se desinfecta por fuera y por dentro con benzal o con alcohol y agua y se depositan en el, las cajas con frascos esterilizados en la autoclave, procurando desinfectarlos externamente otra vez, cuando los vayamos a utilizar en la cámara de flujo laminar de aire, misma que debió estar acondicionada para recibirlos; es decir, desinfectada por dentro y por fuera con sustancias químicas o con rayos ultravioleta por dentro y fuera.

El cultivo de primordios foliares de hoja de violeta africana, necesita 20 c. c. del medio de cultivo de la Tabla 3 y un primordio por frasco o tubo de ensayo. El cultivo de 5 fracciones de hoja de 1 cm 2 cada una, requiere de 30 c. c. del medio de cultivo de la tabla 3 y lo mismo para 5 fracciones de peciolo de hoja de 3 milímetros de longitud, si decidimos micro reproducir por medio de pedazos de peciolo.

Actividad

3. Preparación aséptica de150 c. c. del medio, Tabla 3 para 5 fracciones de violeta africana (observe que no estamos usando primordios foliares).

Subactividades.

3.1. Conectar un agitador magnético con la electricidad, el cual tiene parrilla con control para agitar con calor y sin calor.

3.2. Coloco en la parrilla del agitador, un vaso de precipitados esterilizado, con 25 c. c. de agua destilada estéril y le introduzco el electrodo.

3.3. Enciendo el aparato para que agite sin calentar el agua del vaso que está en la parrilla.

120


3.4. Busco en la tabla 3, los nutrientes inorgánicos y orgánicos que necesita el cultivo de 5 fracciones de hoja de violeta africana por frasco y conociéndolos, peso y deposito en el vaso de precipitados con 25 c. c. d agua destilada estéril, los compuestos inorgánicos del 1 al 14, de dicha tabla.

3.5. Peso 0.025 miligramos de la sal inorgánica complementaria correspondiente al número 20, columna I, tabla 3, columna IV y los deposito en el vaso receptor a que se refiere el inciso anterior 3.4.

3.6. Se pesan los 4.500 miligramos de sacarosa del numero 2.1., columna I, tabla 3, columna IV y se depositan en el vaso receptor de los reactivos a que se refiere el inciso 3.4.

3.7. Retiro el mecanismo agitador del vaso de precipitados receptor de los reactivos inorgánicos y azúcar para cultivo de 25 fracciones de hoja de violeta africana de 1 c.2 cada una y vacío el contenido del vaso en un matraz desinfectado, por fuera y esterilizado por dentro con capacidad de 300 c. c. al que le deposito 70 c. c. de agua destilada estéril y lo ubico en la parrilla del agitador magnético sin calor.

3.8. Introduzco en el matraz el mecanismo agitador y agito 3 minutos, transcurridos los cuales, retiro el agitador y con el potenciómetro y HCl (subactividad 3.15.) y NaOH (subactividad 3.16.), diluidos en agua estéril, capitulo XII, ajusto a 5.7 el pH del matraz, agregándole solución de NaOH si el pH es menor de 5.7 o sumándole solución de HCl si el pH es mayor de 5.7 hasta que el potenciómetro marque 5.7.

3.9. Peso 1,200 miligramos de agar o phytagel y los deposito en el matraz, le introduzco el mecanismo agitador, dejo que agite 5 minutos sin calentar el contenido del matraz y retiro el electrodo agitador.

3.10.Tapo el matraz, lo introduzco a la autoclave, deposito agua en esta hasta un nivel de 5 centímetros, pues no se trata de que quede sumergido el matraz; conecto la autoclave con la electricidad, la cierro, la enciendo, marco 1200 . C de temperatura, doy vuelta al botón hasta que llegue al sector que marca máximo e inmediatamente abro la válvula de vapor.

121


3.11.Cuando empiece a salir vapor de agua por la válvula, la cierro.

3.12.El manómetro empieza a moverse y lo dejo libre hasta que marque 15 libras por pulgada cuadrada o un kilogramo por centímetro cuadrado de presión,

3.13.Giro el botón hasta el sector que señala mínimo y dejo que pasen 15 minutos, tiempo empleado para una buena esterilización, excepto cuando se esteriliza un volumen grande de medio en varios contenedores, ya que en este caso se corre el riesgo de una diversidad mayor de microbios, a los cuales hay que darles 18 minutos de esterilización en la autoclave que equivalen a 3 minutos más de lo normal, sin que esto provoque a degradación de algún componente del medio, como puede ser la caramelización de la sacarosa, por ejemplo.

3.14. Antes de poner a funcionar la autoclave en la mesa de trabajo de la sala de preparación de medios de cultivo y tejidos, del laboratorio, se crea una area estéril cuyo piso se desinfecta con benzal, se barre con rayos ultravioleta hasta una altura de 1.20 metros por encima del piso de la mesa de trabajo y a esa altura se dejan circulando horizontalmente para que choquen en una pantalla y así evitar que dañen a alguna persona, mientras en dos de las esquinas del area estéril, colocamos dos mecheros.

3.15.Dos días antes de la preparación del medio de cultivo para los 25 pedazos de hoja de violeta africana de un cm2 cada uno, en un frasco ámbar de 250 c. c. guarde para uso posterior como ahora, 200 c. c. de una solución que obtuve del siguiente modo: Tomé 7.3 gramos de HCl diluidos en 192.7 c. c. de agua destilada estéril, de la que debo tomar 0.3 c. c. por cada 10 miligramos de BA, cinetina, mioinositol, etc. que demande cualquier medio de cultivo.

3.16.En otro frasco ámbar igual al de la subactividad 3.15., hice otra solución y la guardé para usarla ahora, habiendo tomado 8 gramos de NaOH y 192 c. c. de agua destilada estéril, de la que voy a extraer 0.3 c. c. por cada 10 miligramos de AIA y sulfato de adenina que tomé de la tabla 3. Los 0.015 y 12.0 miligramos de la columna IV, números 16 y 18, columna I, tabla 3, los deposito en un

122


vaso de precipitados desinfectado por fuera y esterilizado por dentro, de 10 c. c., le agrego 0.160 c. c. de esta solución, agito y transfiero a otro vaso receptor del complemento orgánico insoluble en agua de la tabla 3, cuyo volumen son 15 c. c.

3.17. En el area estéril creada (subactividad 3.14.) y usando un vaso de precipitados desinfectado por fuera y esterilizado por dentro, de 10 c. c., le vacío 1.5 miligramos de cinetina, mas 15 miligramos de mioinositol, mas 0.495 c. c. de la solución (subactividad 3.15.), capítulo VII, Tabla 3, agito y transfiero al vaso receptor del complemento orgánico insoluble en agua de la tabla 3, capítulo VII, cuyo volumen es de 15. C. c.

3.18.Al terminar los 15 minutos d esterilización de las sales inorgánicas, la sacarosa y el agar o el phytagel que contiene el matraz, extraigo a este de la autoclave, lo llevo al area estéril (subactividad 3.14), dejo que se enfríe un poco, lo destapo y vacio en le, utilizando filtro millipore, el contenido del vaso receptor del complemento orgánico insoluble en agua de l tabla 3, capítulo VIII. Los 0.060 miligramos de thiamina de la tabla 3, por ser soluble en agua, en un minivaso de 3 c. c. con 1.5 c. c. de agua al que agregamos la thiamina, agitamos y transferimos directo al matraz usando filtro millipore.

3.19. Aforo el matraz con agua destilada estéril hasta 150 c. c., lo tapo y agito para que se mezclen los reactivos del medio de cultivo de la tabla 3, para 5 frascos con 30 c. c. de dicho medio por frasco.

3.20.Se desmantela el area estéril creada, pues no se va a utilizar para distribuir el medio de cultivo en los 5 frascos con 30 c. c. de medio por frasco por haber decidido hacer la distribución en la cámara de flujo laminar de aire, aclarando que esta es mas se gura para esta distribución que el area estéril creada,(subactividad 3.14)

Actividad

4. Distribución del medio de cultivo para hoja de violeta africana, en 5 frascos que se recibirán, en la cámara de flujo

123


laminar de aire, 30 c. c. del medio de cultivo de la tabla 3, por frasco.

4.1. Ubico los frascos en un lugar estratégico de la cámara de flujo laminar de aire, junto al dosificador automático de medios, que ya había sido ubicado en dicha cámara.

4.2. Los transfiero a la plataforma del dosificador de medios de cultivo, esterilizado con benzal, incluso bañado con rayos ultravioleta.

4.3. Les aplico una dosis de 30 c. .c del medio de cultivo de la tabla 3, por frasco.

4.4. Se tapan los frascos si no se van a inocular en la cámara de flujo laminar de aire.

4.5. Se ubican en un contenedor esterilizado y acorde al número de frascos, si estos no van a ser inoculados en la cámara de flujo laminar de aire.

4.6. Llevamos el contenedor a la cámara de flujo laminar de aire si decidimos inocular, o a un gabinete para almacenamiento de reactivos sin o con filtración, si decidimos no inocularlos en la cámara de flujo laminar de aire después de su enfriamiento en el area estéril creada (subactividad 3.14.).

Actividad

5. Selección de la mejor variedad prototipo de la especie de violeta africana, para extraer de ella las hojas jóvenes mas valiosas.

Subactividad.

5.1 La variedad elegida debe ser vigorosa, libre de plagas y enfermedades y genéticamente estable, a fin de garantizar el buen genotipo y fenotipo de sus hojas jóvenes.

Actividad

6 Desinfestación y limpia de hojas.

6.1 Lavar las hojas en una solución de 10 gramos de jabon con 990 c. c. de agua común y corriente.

6.2 Enjuagar bien con agua de la llave.

124


Actividad

7 Desinfección de hojas.7.1. Inmersión de hojas en una solución de 700 c. c. de alcohol

etílico y 300 c. c. de agua común, durante 10 segundos y enjuagar con agua limpia.

7.2. Se sumergen la hojas en una solución de 980 c. c. de agua y 20 gramos de hipoclorito de calcio, durante 15 minutos y enjuagar bien,

7.3. Inmersión de hojas en una solución de 5 gramos de hipoclorito de sodio y 995 c. c. de agua durante 15 minutos.

7.4. Cinco enjuagues con agua destilada estéril para desaparecer el hipoclorito residual.

Actividad.

8. Preparación del inoculo de hoja.

Subactividades.

8.1. Se coloca la hoja en una caja de Petri esterilizada.8.2. Se elimina todo el margen de la hoja junto con el peciolo;

pero en esta zona se corta una sección triangular de tejidos de hoja y peciolo.

8.3. Se elimina la nervadura central y de los dos pedazos de hoja que quedan, se cortan cuadrados de 1 centímetro por lado.

Actividad.

9. Preparación del inoculo de peciolo, si se desea usar este material.

Subactividades.

9.1. Eliminación de partes dañadas.9.2. Corte de cilindros de 3 mm de altura.

Actividad

10. Siembra de los inoculos de hoja de violeta africana en sus frascos con medio de cultivo en la cámara de flujo laminar de aire.

Subactividades.

125


10.1. Se llevan a la cámara de flujo laminar de aire dos mecheros y se colocan en lugares estratégicos, así como los frascos con medio sin inoculo.

10.2. También llevamos un vaso con alcohol que tiene el bisturí y las pinzas en su interior y lo ponemos frente al técnico inoculador.

10.3. El inoculador le quita la tapa a uno de los frescos y la pone sobre un pedazo de papel estraza esterilizado.

10.4. Extrae las pinzas y el bisturí del vaso con alcohol, los flamea en el mechero y con ayuda de ambos, saca de la caja de Petri una fracción de hoja, la siembra en el frasco destapado, procurando que el haz del pedazo de hoja quede en contacto con los 30 c. c. del medio de cultivo que contiene el frasco, haciendo lo mismo con las 4 fracciones de hojas faltantes, sumergiendo en el vaso de alcohol y flameando en el mechero, el bisturí y las pinzas, cada vez que sembremos una fracción de hoja en el frasco. La siembra termina cuando se hayan sembrado los 25 pedazos de hoja en los 5 frascos con 30 c. c. del medio de cultivo de la tabla 3, cada uno.

10.5. La boca de cada frasco y su tapa, se flamean en el mechero y se cierran con la tapa.

10.6. Se sellan las tapas de los frascos con cinta parafilm y los acomodamos en un contenedor apropiado y esterilizado, en el que ponemos un letrero que especifique la etapa del cultivo, semana, mes, variedad prototipo de la especie que estamos cultivando.

Actividad.

11. Transferencia del contenedor de frascos, de la cámara de flujo laminar de aire o del area estéril creada, a la sala de incubación.

Subactividades.

11.1. De la cámara de flujo laminar de aire se lleva el contenedor de frascos inoculados a la sala de incubación, donde se colocan en un anaquel para incubación y le suministramos:

Intensidad luminosa: 1,000 a 2,000 lux.

Temperatura: 250 C.

Fotoperiodo: 16 horas de luz y 8 sin luz.

Húmeda relativa: 80 a 90 %

Periodo de incubación: 6 a 8 semanas.

126


11.2. Vigilar que se cumpla el periodo de incubación y se realice lo que queríamos obtener, que son brotes para enraizar y producir clones a partir de cada brote. Hecho lo anterior, damos fin a la primera etapa de microreproducción vegetal, etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico de hoja joven de violeta africana (Saintpaulia ionanta Wendl.)

Como la etapa W, no nos produjo plantas sino 4 brotes por pedazo de hoja o sea 100 brotes, con ellos vamos a hacer la multiplicación por la vía de subcultivos.

Etapa X: Multiplicación de propágulos de brotes sanos de violeta africana.

Actividades de la etapa X, cuyo número de su primera actividad, sigue al de la última actividad de la etapa anterior (W), para que el proceso sea continuo.

Actividades de la etapa X.

12. Determinación de los reactivos del medio de cultivo para la etapa X.

Etapa X.

Subactividad.

12.1. Determinamos que son los mismos que los de la etapa anterior (tabla 3) pero de volumen diferente (tabla 3.A.

Actividad.

13. Primer subcultivo de los 100 brotes de 25 fracciones de hoja de violeta africana sembrados en 20 frascos con 5 brotes y 30 c. c. del medio de la tabla 3, habiendo logrado 25 brotes por frasco, 500 brotes en total y haber gastado 30*20=600 c. c. del medio de la tabla 3 de la tabla 3.A, pues son iguales, excepto en volumen.

Actividad.

14. Segundo subcultivo de 500 brotes, para lo cual necesitamos 100 frascos y 3,000 c. c. del medio de la tabla 3, para lograr 2,500 brotes.

Actividad.

15. Tercer subcultivo de 2,500 brotes, que necesitan 500 frascos y 15,000 c. c. del medio de la tabla 3, para lograr 12,500 brotes e igual

127


número de plántulas al llevarlos a la tercera etapa, ya que solo deseamos producir 12,500 plantas de violeta africana.

Imaginemos lo que hubiéramos obtenido en el tercer subcultivo, de haber manipulado 500 brotes en el primero y no 100. En realidad quiero dejar en claro la dinámica de los subcultivos.

Etapa Y: Enraizamiento y aclimatación de plantas del laboratorio en el invernadero.

Esta etapa comienza cuando con la multiplicación de los brotes que obtuvimos al finalizar la etapa W: Establecimiento del cultivo aséptico de hoja de violeta africana, subcultivados 3 veces, nos dan el número de plantas (12,500) de violeta africana que deseamos regenerar vías fracciones de hoja joven y brotes de tercer subcultivo llevados a enraizamiento (etapa Y).

Actividad.

16. Determinación y uso de los reactivos de la etapa Y (tabla 3.B.)

Subactividades.

16.1. Identificación de reactivos (tabla 3. B.), que son la mitad de los miligramos por litro de las 14 sales inorgánicas de la tabla 3, complementados con 0.170 mg. de NaH2PO4, 30,000 mg. de sacarosa, 8,000 mg. de agar por litro de agua y pH=5.7.

16.2. Los reactivos se obtienen de la tabla 3.B.

Actividad.

17. Manejo de reactivos y brotes de violeta africana en la etapa Y: Enraizamiento y aclimatación de brotes de hoja de violeta africana del laboratorio, en el invernadero.

Subactividades.

17.1. Hay 3 modos de enraizar: En charolas germinadoras, en estructuras de fierro bien diseñadas y en cilindros de plástico. En este caso optamos por enraizar en 250 charolas de 50 cavidades cada una (50*250=12,500).

128


17.2. Preparación de 225 litros del medio de cultivo de la tabla 3.B., para regar 250 charolas que recibirán 12,500 brotes de hojas de violeta africana, a fin de que se conviertan en plantas nuevas.

17.3. Acopio, desinfección y llenado de las cavidades de las charolas con una parte de esphagno y 2 de agrolita en el area estéril creada (subactividad 3.14).

Actividad.

18. Traslado de las charolas germinadoras de 50 cavidades cada una con una parte de esfagno y 2 de agrolita, al invernadero.

Subactividades.

18.1. Se obtienen las charolas que se pueden atender por día, trasladamos al invernadero, donde se les trasplantará un brote por cavidad.

18.2. De la cámara bioclimática se extraen 2 frascos con 50 brotes por charola germinadora y se ubican junto a esta.

18.3. También se llevan junto a las charolas, 2 cajas de Petri estériles, un vaso de alcohol estéril, con el bisturí y las pinzas en su interior, 2 mecheros y frascos con brotes, en la cantidad que podamos atender en un día de trabajo, así como hojas de papel estraza estériles.

Actividad.

19. Trasplante de brotes en las charolas germinadoras.

Subactividades.

19.1. Abro un frasco con 5 brotes, padres de 5 hijos cada uno (25 brotes por frasco).

19.2. Preparo la charola enraizadora de 30*15=450 centímetros cuadrados con sus 50 cavidades llenas de esfagno y agrolita 1:2 y le doy un riego ligero con 900 c. c. del medio de la tabla 3.B. por charola.

19.3. Se abre un frasco de 50 brotes con 5 hijos cada uno, colocamos la tapa sobre papel estraza estéril, extraemos del vaso con alcohol el bisturí y las pinzas, los flameamos en el mechero, con las pinzas se extrae del frasco inoculado un brote con 5 hijos, lo colocamos en la caja de Petri estéril, con las pinzas y el bisturí flameados, tomamos un brote y lo sembramos en una cavidad de la charola enraizadora en otra cavidad de la charola y así seguimos

129


trabajando hasta sembrar las 50 oquedades de la charola, con los brotes de los 2 frascos.

Actividad.

20. Transferencia de charolas a clima controlado en el invernadero.

Subactividades.

20.1. Charola trasplantada, charola que se lleva a un espacio en el que recibe 8,000 a 10,000 lux de intensidad lumínica, 250 C. de temperatura, 16 horas de luz y 8 sin luz, humedad relativa de 80 a 90% y un periodo de enraizamiento de 20 a 30 días, habiendo logrado plantas con raíces de 5 centímetros.

20.2. Se riegan las charolas diariamente mañana y tarde con el sistema de nebulización o con regadera manual de salida fina.

20.3. Semanalmente les aplicamos fertilizante foliar mezclado con 2 c. c. de tecto por litro de agua, mediante nebulización o con aspersora manual.

Actividad.

21. Venta de plantas enraizadas.

Subactividad.

21.1. Veinte o treinta días después del trasplante de los brotes en las charolas, tendremos plantas con raíces de 5 centímetros de longitud, lo cual nos indica que debemos extraer las plantas con cuidado y venderlas a los interesados, excepto las 200 que vamos a llevar a la etapa siguiente.

Etapa Z: Trasplante en suelo del invernadero y acondicionamiento de este suelo.

Actividad.

22. Preparación de camas en el invernadero, para que reciban los brotes enraizados en las charolas.

Subactividades.

22.1. Veinticinco días después de haber sembrado los brotes en las charolas, escojo el lugar para las camas y mido el espacio de cada una.

130


22.2. Las camas se construyen una junto a otra, con un pasillo de 35 centímetros entre ambas.

22.3. El suelo de la cama se afloja y desmenuza con pico, zapapico y azadón, colocándole 6 centímetros de espesor de migajón o suelo franco cribado y desinfestado, traído de otro lugar. Las camas miden 12.50 metros de largo y 1de nacho y col necesitamos una, pues vamos a traspalntar200 plantas enraizadas, ya sea directamente en suelo de la cama o en cilindros de plástico de 8 centímetros de diámetro y 14 de altura, en hileras de 25 centímetros y de 25 centímetros entre plantas. A la cama la limita una lamina de 27.50 metros de largo, incluyendo traslapes y 25 centímetros de alto con 6 estacas para que inmovilicen la lamina y la tierra de la cama. La tierra traída de otra parte es igual a 0.75 metros cúbicos por cama. Si decidimos usar bolsas de 8 centímetros de diámetros y 14 de alto para llenarlas hasta 10 centímetros con una parte de cualquier migajón y 3 partes de tierra de monte, necesitaríamos:

X(0.04)2 X 0.10 X 200= 0.10053 metros cúbicos o sean 0.025 m3 de migajón y 0.0753 m3 de tierra de monte.

22.4. La cama se nivela, apisona un poco, se riega; se riega la charola, se extraen los brotes de las 4 charolas y se trasplantan a la profundidad de la raíz, ya sea en la cama o en la bolsa y se riegan mañana y tarde con sistema de nebulización o con regadera manual de salida fina.

22.5. Una vez por semana, se asperjaran las plantas de la cama o de las bolsas con fertilizante foliar mezclado con 2 c. c. de captan por litro de agua.

Actividad.

23. Despunte de la yema terminal de cada una de las plantas (200) re trasplantadas directamente en la cama o en las bolsas de plástico.

Subactividades.

23.1. Diez o veinte días después del retrasplante en las camas o en los cilindros de plástico se despunta la yema terminal del tallo principal de todas las plantas para inducirlas a producir ramas laterales y sublaterales, de las cuales podemos obtener plantas nuevas de 3 modos diferentes: Primero, por medio de las hojas como ya se describió el método; segundo, usando esquejes de 8 centímetros de longitud, quitarles las hojas, menos las ultimas 2 que acompañan a la yema terminal y se manejan como lo indican las Subactividades 19.7, 19.8, 19.9, 19.10, y 19.11 del capitulo XII;

131


tercero, usando el meristemo de cada esqueje (ver todo el capitulo XII).

23.2. Cuando la raíz tiene de 4 a 6 centímetros, se extraen de las charolas las plantas con cuidado para no dañar sus raíces y se venden a los productores interesados en cultivarlas.

Otro método de manejar los brotes para lograr plantas nuevas, hubiera sido: Sumergirlos en una solución de 2 gramos de captan por litro de agua destilada estéril durante 10 segundos ; bañar el corte de los brotes en una solución de ADH por litro de agua destilada estéril durante 3 segundos; ponemos en contacto el corte de los brotes con polco de Raizone plus y sembramos cada brote en la cavidad de una charola para enraizar que tiene esfagno y agrolita o en la estructura de fierro a que se refiere la subactividad 19.7 del capítulo XII.

Anexo las tablas 3, 3.A, 3.B; 3C.

Tabla 3. 150 c.c. de las sales de Murashige y Skoog y su complemento, para 5 frascos con 30 c. c. de dicho medio y 5 fracciones de hoja de violeta africana por frasco, que producen 4 brotes por pedazo de hoja (capitulo XII).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 0.150 lt. (**)1- NH4 NO3 1,650.000 247.5002- KNO3 1,900.000 285.000

132


3- MgSO4.7H2O 370.000 55.500

4- MnSO4.4H2O 22.300 3.345

5- ZnSO4.4H2O 8.600 1.290

6- CuSO4.5H2O 0.025 0.040

7- CaCl2.2H2O 440.000 66.000

8- KI 0.830 0.1259- CaCl2

.6H2O 0.025 0.00410- KH2PO4 170.000 25.50011- H3Bo3 6.200 0.93012- Na2MoO4

.2H2O 0.250 0.03813- FeSO4

.7H2O 27.810 4.17114- Na2EDTA 37.310 5.596

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.400 0.06016- AIA 0.100 0.01517- Cinetina 10.000 0.50018- Sulfato de adenina 80.000 12.00019- Mioinositol 100.000 15.00020- NaH2PO4

.H2O 0.170 0.02521- Sacarosa 30,000.000 4,500.00022- pH ajustado a 5.7 0.000 0.00023- Agar 8,000.000 1,200.000

(*) Sales de Murashige y Skoog.


Tabla 3.A. 15 lts.de las sales de Murashige y Skoog y su complemento, para 500 frascos Gerber con 30 c. c. de dicho medio y 5 brotes de violeta africana por

133


cada frasco, para lograr 5 brotes de cada brote inoculado o sean 12,500 en el tercer subcultivo (capítulo VII).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 15 L (**)1- NH4 NO3 825.0000 12,375.00002- KNO3 950.0000 14,250.00003- MgSO4

.7H2O 185.0000 2,775.00004- MnSO4

.4H2O 11.1500 167.25005- ZnSO4

.4H2O 4.3000 54.50006- CuSO4.5H2O 0.0125 0.18757- CaCl2

.2H2O 220.000 3,300.00008- KI 0.41500 6.22509- CaCl2

.6H2O 0.0125 0.187510- KH2PO4 85.000 1,275.000011- H3Bo3 3.1000 46.500012- Na2MoO4.2H2O 0.1250 1.875013- FeSO4

.7H2O 13.9050 208.575014- Na2EDTA 18.6550 279.8250

COMPLEMENTO15- Tiamina 0.4000 6.000016- AIA 0.1000 1.500017- Cinetina 10.0000 150.000018- Sulfato de adenina 80.0000 1,200.000019- Mioinositol 100.0000 1,500.000020- NaH2PO4

.H2O 0.1700 2.550021- Sacarosa 30,000.0000 450,000.000022- pH ajustado a 5.7 0.0000 0.000023- Agar 8,000.0000 12,000.0000


(**) Miligramos que reciben los 15 litros de medio de cultivo.

134


Tabla 3.B. 22.5 litros para regar 250 charolas para que reciban 50 brotes de hoja de violeta africana por cada charola de enraizamiento (capítulo VII).

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 22.5 L (**)1- NH4 NO3 825.0000 185,625.00002- KNO3 950.0000 213,750.00003- MgSO4

.7H2O 185.0000 41,625.00004- MnSO4

.4H2O 11.1500 2,508.75005- ZnSO4

.4H2O 4.3000 967.50006- CuSO4

.5H2O 0.0125 2.81257- CaCl2

.2H2O 220.000 49,500.00008- KI 0.41500 93.37509- CaCl2

.6H2O 0.0125 2.812510- KH2PO4 85.000 19,125.000011- H3Bo3 3.1000 697.500012- Na2MoO4

.2H2O 0.1250 28.125013- FeSO4

.7H2O 13.9050 3,128.625014- Na2EDTA 18.6550 4,197.3750

COMPLEMENTO15- NaH2PO4

.H2O 0.1700 38.250016- Sacarosa 30,000.0000 6,750,000.000017- pH = 5.7 0.0000 0.000018- Agar 8,000.0000 1,800,000.0000


(**) Miligramos que reciben los 22.5 litros.

135


Tabla 3.C. Suma del peso de los reactivos de las tablas 3, 3.A y 3.B, del capítulo VII.

No. Sales inorgánicas mg/L M. S. (*) mg para 240.15 L (**)1- NH4 NO3 198,247.50002- KNO3 228,285.00003- MgSO4

.7H2O 44,455.50004- MnSO4

.4H2O 2,679.34505- ZnSO4

.4H2O 1,033.29006- CuSO4

.5H2O 3.00407- CaCl2

.2H2O 52,866.00008- KI 49.72509- CaCl2

.6H2O 3.004010- KH2PO4 20,425.500011- H3Bo3 744.930012- Na2MoO4

.2H2O 30.038013- FeSO4

.7H2O 3,341.371014- Na2EDTA 4,482.7960

COMPLEMENTO15- Thiamina 6.060016- AIA 1.650017- Cinetina 151.500018- Sulfato de adenina 1,212.000019- Mioinositol 1,515.000020- NaH2PO4 40.825021- Sacarosa 7,204,500.000022- pH=5.7 0.000023 Agar 1,921,200.0000


(**) Miligramos que reciben los 22.5 litros.

136

pedro acosta

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