pcr edc 2008
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biología celularTRANSCRIPT
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Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)UAI-Estructura y Dinmica Celular2008
Dr. Juan Jos Valdez Alarcn
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Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR)
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Amplificacin exponencial en la PCRSi en cada ciclo la cantidad de ADN se duplica, entonces la multiplicacin de la molcula molde se puede calcular como 2n
Entonces en 30 ciclos y suponiendo 100% de eficiencia de la reaccin: 230 = 1.07 X 109
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Requerimientos para la PCRcido nuclico molde (ADN o ARN; total, nuclear, de plstido)Un par de oligonucletidos complementarios a una secuencia blancoADN polimerasa termoestable, dNTPsTermociclador
INGENIO !!!
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Componentes de la reaccinAmortiguador (Tris-HCl 10 mM pH 8.0)KCl 10-50 mMMgCl2 1-4 mMdNTPs 200-500 MADN molde 0.1-100 ngOligonucletidos 100-500 nMADN polimerasa (Taq) 2.5 unidadesAditivos
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Condiciones en el termociclador2-5 minutos, 95C; desnaturalizacin inicial
45 segundos, 95C; desnaturalizacin45 segundos, 60C; alineamiento1 minuto, 72C; extensin
7 minutos a 72C; extensin final
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Marcadores molecularesMetodologas basadas en la PCR
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Metodologas basadas en la PCRRAPD aislados Staphylococcus spp.
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Metodologas basadas en la PCROligos especficos Staphylococcus spp.
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Cuando no se conoce la secuencia blancoSe conocen protenas o secuencias de cidos nuclicos homlogosDiseo de oligonucletidosATG-GCT-GGT-AAT-GAA-TGG-ATT-AAT-GGT-TAT GCC GGC AAC GAG ATC AAC GGC GCA GGA ATA GGA GCG GGG GGG M A G N E W I N G YATG-GCI-GGI-AAY-GAR-TGG-ATH- AAY- GGI-TATI=inosina Y=pirimidina R=purina K=keto M=methylW=weak S=strong B=no A D=no C H=no G V=no T
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