patologia e inmunologia

5/26/2018 Patologia e Inmunologia

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GUA TCNICA

PATOLOGA E INMUNOLOGADE CAMARONES PENAEIDOS

PROGRAMA CYTEDREA DE AGROALIMENTACIN

RED II-D: Red Vannamei

Editores:

Vielka Morales Q.

Jorge Cullar-Anjel

Autores:

Mara Jos Almanza Abud

Margherita Anna Barracco

Jorge Cullar-Anjel

Donald V. Lightner

Emiko Shinozaki Mendes

Alitiene Moura Lemos Pereira

Mara Soledad Morales Covarrubias

Carlos PantojaLuciane Mara Perazzolo

Rafael Diego Rosa

Agns Saborio Coze

Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira


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Gua Tcnica - Patologa e Inmunologa de Camarones Penaeidos

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La presentacin y disposicin en conjunto de:

GUA TCNICA - PATOLOGA E INMUNOLOGA DE

CAMARONES PENAEIDOSson propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obrapuede ser reproducida o transmitida, mediante ningnsistema o mtodo, electrnico o mecnico (incluyendofotocopiado, la grabacin o cualquier sistema de recuperaciny almacenamiento de informacin), sin consentimiento porescrito de los editores.

Derechos reservados:

2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cullar-Anjel(507) 6671-8936(507) 6616-0756email: [email protected]: [email protected]

Primera edicin en espaolHecho en PanamISBN: 978-9962-661-02-3

Esta obra se citar de la siguiente manera:

Todo el libro:

Morales, V. y J. Cullar-Anjel (eds.). 2008. Gua Tcnica - Patologa e Inmunologa de CamaronesPenaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panam, Rep. de Panam. 270 pp.

Ejemplo para citar un captulo:

Pantoja, C. y D.V. Lightner. 2008. Enfermedades virales pp. 55-114. En: Morales, V. y J. Cullar-Anjel (eds.). 2008. Gua Tcnica - Patologa e Inmunologa de Camarones Penaeidos. ProgramaCYTED Red II-D Vannamei, Panam, Rep. de Panam. 270 pp.

Diseo e impresin:New Concept Publications, Inc.(507) 226-7694Panam

Daniel Ho - Fotografas de portada, contraportada, pginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254


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AGRADECIMIENTOS

Los editores agradecen la colaboracin de Reinaldo Morales y Hugo PrezAthanasiadis, por la traduccin preliminar del portugus al espaol, de varios captulosdel libro, as como a Roberto Chamorro (Licencia de intrprete pblico autorizado delMinisterio de Gobierno y Justicia de Panam, Resolucin N 28, de 8 de marzo de 1984)por la revisin y perfeccionamiento de los documentos traducidos.

De igual manera por la revisin y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (MtodosMoleculares), Dra. Margherita Barracco (Parmetros Inmunolgicos), Dr. Carlos Pantoja

y Kenneth W. Hasson (Parsitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. Mara delPilar Moyano (Mtodos de Diagnsticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones detexto).


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IN MEMORIAM

ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura enla regin, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecer porsiempre en el corazn de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado.

El Grupo Tcnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de estaGua Tcnica - Patologa e Inmunologa de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarlaa nuestro amigo, hermano y compaero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en elGTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboracin desinteresada parael buen manejo y benecio de la actividad camaronera no slo en Brasil, su pas natal,sino tambin en el resto de los pases iberoamericanos que conforman esta importantefamilia CYTED.

Gracias por tu contribucin a una actividad que seguir dando respuestas en lageneracin de empleos y divisas a diferentes pases de iberoamerica.


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PRLOGO

La camaronicultura tiene sus inicios en la dcada del 60 incrementndoserpidamente en la del 70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos dedivisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y segn estudios de la FAO, anexisten 18 pases de Amrica Latina que se dedican a la actividad especcamente conespecies del gnero Penaeus(tambin llamado Litopenaeus).

Para la dcada del 90, la reduccin en el nmero de ncas de cultivo, se debia enfermedades que se reportaron desde la aparicin del Taura en los aos 93-94 yel Sndrome de la Mancha blanca en los aos 98-99, afectando grandemente lasproducciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, prdidas deempleos y por ende de ingresos.

La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnolgicas ymejoramiento en el manejo de los cultivos de camarn, observndose una lentarecuperacin en sus producciones y en la productividad.

Sin embargo, con la expansin territorial de esta actividad y el desarrollo de tcnicasde diagnstico de enfermedades, han sido identicados nuevos agentes patgenos. Espor ello que nos sentimos complacidos que un grupo de cientcos, preocupados por lasituacin actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientosy experiencias de muchos aos, a travs de esta importante Gua Tcnica de Patologa eInmunologa de Camarones Penaeidos, diseada para productores, tcnicos, estudiantesy cualquier otro entusiasta interesado en contar con un texto de apoyo que le signiqueuna herramienta til y prctica en su actividad diaria.

Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acucolasen la Repblica de Panam, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia deesta Gua que consideramos un aporte signicativo para el sector de la camaroniculturaen Iberoamrica.

GUILLERMO A. SALAZAR N.Ministro de Desarrollo AgropecuarioPanam, 2008


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INTRODUCCIN

El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED)es un programa internacional multilateral de cooperacin cientca y tecnolgica dembito iberoamericano y carcter horizontal.

En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentranlas Redes Temticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidadespblicas o privadas de al menos seis pases miembros del Programa y cuyas actividadescientcas o tecnolgicas estn relacionadas con el tema de la red.

En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIN DE

CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGAS SOBRE EL CULTIVO DEPENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI, realiz una serie de actividades en beneciode la industria camaronera de los pases iberoamericanos que se dedican a la actividad.

Entre los objetivos logrados por la Red, estn las siguientes: constitucin de un fororegional de convergencia para los grupos de investigacin, productores y sector estatal;fomento de la investigacin interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnolgicoen temas relativos al L. vannamei; la promocin en el intercambio de informacincientca y tcnica con miras a favorecer la innovacin y fomentar la sustentabilidad;el establecimiento de un sistema de informacin electrnico de divulgacin peridica,el cual facilit la transferencia de conocimientos; organizacin de actividades decapacitacin para benecio del personal cientco y tcnico vinculado a las actividadesde investigacin; la ayuda a la consolidacin de grupos de investigacin y desarrollo, lomismo que la interaccin con los diferentes grupos, a travs de redes o foros nacionalespara el anlisis integral de la camaronicultura y, propiciar la movilidad de los cientcosy miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinla red.

Entre los temas de mayor nfasis durante el desarrollo de las actividades de lared, estn los relacionados con la gentica, buenas prcticas de manejo y, patologa einmunologa de los camarones, resultados que se ven reejados en la hoja electrnica de

la red: www.mida.gob.pa/CYTEDVANNAMEI.Como ltima actividad de la red, estuvo la realizacin de un curso terico-prctico

internacional sobre la patologa e inmunologa del camarn L. vannamei, dondeparticiparon cientcos de reconocida trayectoria en estos campos. Como producto nalpara el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollode cada captulo a ellos asignados para la publicacin de esta gua, la cual servir deherramienta bsica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a lacamaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es unode los mejores aportes que quedar plasmado en las acciones que vienen desarrollndosea travs del CYTED y a quienes les agradecemos por haber depositado su conanza para

la coordinacin de la Red Vannamei. A los autores, amigos y compaeros les extendemosun cordial agradecimiento por toda su colaboracin.

VIELKA MORALES Q.

Coordinadora Red Vannamei


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NDICE DE CONTENIDO

Prlogo v

Introduccin vii

Reseas de los editores y autores xi

Captulo 1 Mtodos de Diagnstico de Enfermedades en Camarones Marinos deCultivo (Jorge Cullar-Anjel)

1

1.1 Anamnesis 2

1.2 Examen clnico 2

1.3 Microscopa Directa 5

1.4 Montajes en Fresco (Mara Soledad Morales-Covarrubias) 81.5 Bacteriologa 18

1.6 Histologa 22

1.7 Pruebas con anticuerpos 29

1.8 Mtodos moleculares 31

1.9 Parmetros inmunolgicos 39

1.10 Microscopa electrnica de transmisin 45

1.11 Bioensayos 47 1.12 Referencias bibliogrcas 52

Captulo 2 Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 55

2.1 Principales enfermedades y mtodos de diagnstico 58

2.2 Virus de la necrosis hipodrmica y hematopoitica infecciosa (Infectioushypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV)

62

2.3 Virus del Sndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus,WSSV)

70

2.4 Virus del Sndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) 792.5 Virus del sndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus,

YHV)87

2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) 92

2.7 Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en loscultivos de camarones brasileos (Alitiene Moura Lemos Pereira,Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira)

96

2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) 104

2.9 Referencias bibliogrcas 106Captulo 3 Enfermedades Bacterianas (Mara Soledad Morales-Covarrubias) 117

3.1 Vibriosis sistmica 120

3.2 Erosin bacteriana del caparazn 122

3.3 Sndrome de Zoea II 124


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3.4 Enfermedad de luminiscencia 126

3.5 (NHP-B) Necrosis del hepatopncreas bacteriana 126

3.6 Bacterias lamentosas (Leucothrix mucor) 130

3.7 Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 131

3.8 Referencias bibliogrcas 134

Captulo 4 Enfermedades por Parsitos (Jorge Cullar-Anjel) 135

4.1 Gregarinas 137

4.2 Microsporidios 142

4.3 Haplosporidios 147

4.4 Epicomensales 148

4.5 Metazoarios 154


Captulo 5 Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner) 159

5.1 Micosis 161

5.2 Fusariosis 164


Captulo 6 Inmunologa del Camarn (Margherita Anna Barracco, Luciane Mara

Perazzolo y Rafael Diego Rosa)

169

6.1 Sistema Inmune de los Crustceos 172

6.2 Inmunoestimulantes 202

6.3 Parametros hemato-inmunolgicos como indicadores de salud 204

6.4 Conclusiones y Perspectivas 209


Captulo 7 Buenas Prcticas De Manejo En La Camaronicultura (Agns Saboro Cozey Mara Jos Almanza)

225

7.1 Cdigo de Conducta para una camaronicultura responsable 229

7.2 Objetivos de un Cdigo de conducta 229

7.3 Buenas Prcticas de Manejo 230

7.4 Caractersticas de las Buenas Prcticas de Manejo 230

7.5 Buenas Prcticas de Manejo en Laboratorios de larvas 231

7.6 Buenas Prcticas de Manejo en granjas camaroneras 231

7.7 Buenas Prcticas de Manejo en plantas procesadoras 241


Glosario 243


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RESEAS DE LOS EDITORES

VIELKA MORALES Q.

Coordinadora Red [email protected]

Licenciada en Biologa. Experiencia de 14 aos en el tema de larvicultura, maduracin,zooplancton y toplancton en laboratorio de camarones. Responsable del diseo y construccin

de la Estacin de Maricultura del Pacco, Puerto Vacamonte en Panam. Desde 1996 coordinadora

tcnica de la Organizacin del Sector Pesquero y Acucola de Centroamrica. Consultorapara FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Haparticipado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos.

JORGE CULLAR-ANJELDirector del Departamento de Patologa e InvestigacinCamaronera de Cocl S.A. (CAMACO)Aguadulce, Cocl, Repblica de [email protected]

Mdico Veterinario, Mster en Microbiologa. Experiencia de 18 aos en las reas de cultivode camarn marino Litopenaeus vannamei; diseo y montaje de laboratorios de patologa decamarones (microbiologa, histopatologa y biologa molecular); docencia universitaria enpregrados y postgrados as como investigacin aplicada en Produccin, Patologa, Inmunologay Nutricin de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarn (larvicultura,

engorde y maduracin) mediante clnica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco,microbiologa, histopatologa y biologa molecular); conferencista en Congresos Internacionales;miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustceos para las Amricas. Ha tenido desempeolaboral en Ecuador, Colombia y Panam.

RESEA DE LOS AUTORES

MARA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS

Centro de Investigaciones en Alimentacin y Desarrollo, A.C.Unidad Mazatln en Acuicultura y Manejo AmbientalMxico,[email protected]

Maestra y Doctorado en Patologa de crustceos, Licenciatura en Biologa PesqueraInvestigadora en el rea de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajosde investigacin estn enfocados a histopatologa, virologa y siologa de crustceos; imparte

cursos en sanidad acucola y colabora en un programa de transferencia tecnolgica, capacitaciny consultora en histopatologa de crustceos, con diferentes pases de Amrica Latina.

JORGE CULLAR-ANJELDirector del Departamento de Patologa e InvestigacinCamaronera de Cocl S.A. (CAMACO)Aguadulce, Cocl, Repblica de [email protected]

La resea de este autor ha sido citada previamente en Resea de los Editores


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AGNS SABORIO COZEUniversidad Centroamericana (UCA)Centro de Investigacin de Ecosistemas AcuticosManagua, Nicaragua.

[email protected] en Acuicultura, Licenciatura en Ecologa y Recursos Naturales. Certicadora de

la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios.Cultivos marinos y de agua dulce, Nutricin de peces, calidad de agua. Planicacin y desarrollo

de reas costeras. Investigacin de tensiones ambientales en cuencas hidrogrcas. Investigadora

en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboracin y gestin de proyectos acucolas.Asistencia Tcnica, capacitacin y extensin a comunidades costeras. Docente universitaria.Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centrosde Investigacin como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de

Hawai, Universidad de Puerto Rico entre otras, Organizaciones sin nes de lucro Internacionalescomo ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de DesarrolloInteramericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora deCentro de Investigacin.

MARA JOS ALMANZA ABUDCentro de Investigacin de Ecosistemas AcuticosUniversidad Centroamericana (UCA)Managua, [email protected]

Mster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecologa y Recursos Naturales, curso dePostgrado en Sistema de Informacin Geogrca aplicada a los Recursos Naturales. Coordinador

tcnico del Proyecto SUCCESS, nanciado por USAID a travs del Centro de Recursos Costeros

de la Universidad Rhode Island y Centro de Recursos Costeros y Acuacultura del Pacco de

la Universidad Hawai Hilo. Responsable del rea de Fsico-qumica de agua del LaboratorioCIDEA. Coordinador del rea de Sistema de Informacin Geogrca. Coordinador del rea de

divulgacin y Coordinador de Investigaciones del CIDEA.

CARLOS PANTOJA

Departamento de Ciencias Veterinarias y MicrobiologaUniversidad de ArizonaTucson, Estados [email protected]

Ingeniero Bioqumico en Explotacin de Recursos Acuticos (Tec de Monterrey, CampusGuaymas, Mxico). Maestra en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, Mxico).Doctorado en Patobiologa (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigadorasociado en el laboratorio de patologa acucola de la Universidad de Arizona. Principalesreas de trabajo son patologa morfolgica, caracterizacin de nuevas enfermedades y agentes

infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de mtodos de deteccin de agentes infecciosos ydiagnstico de enfermedades. Provee servicios de consultora a la industria camaroncola en elrea de patologa y da entrenamiento tcnico en el rea de diagnstico de enfermedades a travsde talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.


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DONALD V. LIGHTNERDepartamento de Ciencias Veterinarias y MicrobiologaUniversidad de ArizonaTucson, Estados Unidos

[email protected] en Patologa y Biologa Pesquera, Maestra en Biologa Pesquera y su Licenciatura en

Biologa Pesquera. Su experiencia est dirigida a la patologa y enfermedades de los cultivosde crustceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedadesinfecciosas, virologa, histologa, microscopio electrnico, desarrollo de mtodos de diagnsticos,nutricin de animales acuticos y toxicologa acutica. Provee servicios de consultora a la industriacamaronicola en el rea de patologa y da entrenamiento tcnico en el rea de diagnstico deenfermedades a travs de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

MARGHERITA ANNA BARRACCOUniversidad Federal de Santa Catarina (UFSC),Departamento de Biologa Celular, Embriologa y Gentica (BEG),Laboratorio de Inmunologa Aplicada la Acuicultura (LIAA),Florianpolis, SC, [email protected]

Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biolgicas. ProfesoraTitular de Biologa Celular, con participacin en los programas de Postgrado en Acuicultura yBiotecnologa. Investigadora en el rea de inmunologa de crustceos y moluscos de inters para

la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principalestrabajos de investigacin estn enfocados en el estudio de la respuesta inmunolgica a infecciones,el desarrollo de parmetros hemato-inmunolgicos para el monitoreo de condiciones de salud yel efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuticos, con nfasis en camaronesy bivalvos marinos.

LUCIANE MARA PERAZZOLOUniversidad Federal de Santa Catarina (UFSC),Departamento de Biologa Celular, Embriologa y Gentica (BEG),Laboratorio de Inmunologa Aplicada la Acuicultura (LIAA),

Florianpolis, SC, [email protected]

Maestra en Inmuloga de Crustceos y Doctorado en Vitelognesis de Peces. ProfesoraAsociada de Biologa Celular, con participacin en el programa de Postgrado en Acuicultura.Investigadora en el rea de inmunologia de crustceos de inters para la acuicultura, conimplicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigacin estn enfocados en elestudio de la respuesta inmunolgica a las infecciones, caracterizacin bioqumica y molecular deprotenas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parmetros hemato-inmunolgicospara el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en

camarones.


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RAFAEL DIEGO ROSAUniversidad Federal de Santa Catarina (UFSC),Departamento de Biologa Celular, Embriologa y Gentica (BEG),Laboratorio de Inmunologa Aplicada a la Acuicultura (LIAA),

Florianpolis, SC, [email protected]

Maestra en Biotecnologa aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biolgicas.Sus principales trabajos de investigacin estn enfocados en la inmunologa de crustceos ymoluscos bivalvos, en especial en los pptidos antimicrobianos producidos por estos animales.

ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRAEmbrapa Meio-Norte,Parnaba, PI, Brasil,

[email protected] en Acuicultura, con Maestra y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de

la Empresa Brasilea de Investigacin Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Ncleo deInvestigacin en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratoriode Patologa de Organismos Acuticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigacin enCamaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos enpatologa, diagnstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados.

EMIKO SHINOZAKI MENDES

Universidade Fed. Rural de Pernambuco,Recife, PE, [email protected]

Mdica Veterinaria, con Maestra en Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Doctorado enenfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinria, y enlos programas de ps-grado en Veterinria y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambosde la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Saludde los Animales Acuticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigacin enCamaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente enel rea de la microbiologa.

TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRAUniversidade Fed. do Cear,LABOMAR, CE, [email protected]

Biloga con maestra en Zoologa por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhDen Biologa por la Universidad de New Brunswick Canad. Trabaja en el rea de histologay en histopatologa de camarones penedos. Realiza investigaciones en el rea de patologasde crustceos marinos. Es responsable por la ctedra de Patologa de Organismos Marinos y

Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestra en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales.Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biologa y dela Asociacin Brasilea de Patologa de Organismos Acuticos (ABRAPOA).Participa de la Redde Camarones Marinos del Nordeste RECARCINE, subred Enfermedades.


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Captulo 1

Mtodos de Diagnstico de Enfermedades enCamarones Marinos de Cultivo


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Captulo 1

Mtodos de Diagnstico de Enfermedades en CamaronesMarinos de Cultivo

Jorge Cullar-AnjelDirector del Departamento de Patologa e InvestigacinCamaronera de Cocl S.A. (CAMACO)Cocl, Panam

Introduccin

Con base en las principales tcnicas utilizadas en la actualidad para determinarenfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos bsicos y mtodosque sirven como herramienta para realizar diagnsticos y detectar agentes etiolgicosen estos crustceos de gran importancia comercial en la economa mundial. Aunquealgunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores enlos laboratorios de maduracin y/o larvicultura o en las ncas camaroneras, la mayoradeben ser hechos por profesionales en sanidad acucola o por Mdicos Veterinariosespecialistas. Se debe recordar siempre que el diagnstico no consiste en una prueba de

laboratorio como tal, sino en la interpretacin que hace el especialista con base en susconocimientos y en la informacin recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio.Las citas bibliogrcas utilizadas para la preparacin de una parte de este Captulo, nosern mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. Acambio, sern incluidas al nal del Captulo en las Referencias bibliogrcas.

Pasos para el diagnstico:

Anamnesis (informacin histrica del caso, datos relacionados con el evento)

Examen clnico

Microscopa (anlisis con microscopio de luz directa, contraste de fase o campooscuro, con montajes en fresco de tejidos teidos o sin coloraciones, barridos omontajes en fresco de tiras fecales)

Bacteriologa (de tejidos de camarones o de sustratos relacionados como agua,sedimento y otros organismos acuticos)

Histologa de especmenes jados

Pruebas basadas en anticuerpos para la deteccin de patgenos utilizandoanticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en ingls) o anticuerpos monoclonales

(MAbs por sus siglas en ingls) Mtodos moleculares

- Sondas de ADN en pruebas de hibridacin dot blot directamente con muestrasfrescas de tejido o con ADN extrado

- Sondas de ADN o de ARN en pruebas de hibridacin in situ con corteshistolgicos de tejidos jados


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- PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real para pruebas directas con muestras de tejidofresco o con ADN o ARN extrado

Parmetros inmunolgicos (hemogramas y medicin de perles inmunes)

Microscopa electrnica de barrido o de transmisin Bioensayos con portadores sospechosos o subclnicos, utilizando hospederos

altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de lapresencia del patgeno

1.1 Anamnesis

En la medida de lo posible, el tcnico en sanidad responsable de realizar eldiagnstico de una enfermedad en una poblacin de camarones, debe incluir una visitaa la instalacin afectada (maduracin, larvicultura o nca de engorde).

Durante esta visita, el tcnico debe recopilar la informacin histrica previa ala aparicin del brote de la enfermedad. Esto puede incluir cambios en parmetrosambientales o sicoqumicos, trnsito inusual de personas o equipos por lasinstalaciones, presencia de animales forneos al sistema como perros, aves, roedores ovacas, alteraciones en el rgimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios enlos procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos qumicos o biolgicos enel cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa oen otras conocidas y, toda aquella informacin pasada o presente relacionada directa oindirectamente con la poblacin en cuestin.

Debe llevarse un registro de esta informacin obtenida en la empresa, para estudiosde correlacin con los hallazgos obtenidos en el examen clnico y en las pruebas delaboratorio complementarias que se harn luego de la visita de campo.

1.2 Examen clnico

Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalacionesdeben evaluarse las unidades de produccin (tanques o estanques) que presentenproblemas. Se deben realizar capturas de camaronesin situy hacer una revisin individualde animales, para formarse una idea aproximada de la proporcin del problema: qu

tanta poblacin est afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afeccionesobservadas en los organismos enfermos y qu tipo de enfermedad puede estar causandoel brote.

El examen clnico debe incluir un recorrido manual y visual muy cuidadoso delos camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sinoseleccionados por presentar alguna manifestacin de enfermedad. Con base en loshallazgos de esta valoracin clnica, es factible en algunos casos hacer un diagnsticopresuntivo, el cual se debe conrmar con pruebas complementarias de laboratorio.

El nmero de animales que se debe tomar para realizar un estudio sobre la etiologa

de enfermedades, est afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermosen exmenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia delprofesional especialista en sanidad acucola. Cuando se eligen camarones que presentensignos clnicos, 5 a 10 por poblacin examinados individualmente, sern sucientes.

La captura o coleccin de camarones para realizar un examen que busca determinarla presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mnimo de estrs durante lamanipulacin de los animales.


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Jorge Cullar-Anjel Mtodos de Diagnstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

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Si el examen clnico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y loscamarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilizacin debe hacerse enrecipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), conadecuada aireacin y teniendo una densidad baja (para evitar el estrs). Si los camaronesvan a permanecer un perodo de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, debentener buena aireacin y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27C mediantela adicin de bolsas con hielo (selladas).

En estudios de camarones presumiblemente enfermos, se deben seleccionaranimales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presentenotras anormalidades macroscpicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Lasprincipales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante unavaloracin clnica, son las siguientes:

Color del animal Tamao del cuerpo comparado con el resto de la poblacin (enanismo) Expansin de cromatforos Deformidades en rostro, abdomen o apndices Flexin del msculo abdominal (calambre) Color de las branquias (amarillas, marrn o negras) Color de los apndices (pereipodos, plepodos y urpodos) Color de las antenas Edema (presencia anormal de lquido) en apndices u otras partes del cuerpo

Transparencia de los msculos del abdomen y del cefalotrax Replecin intestinal (porcentaje del intestino que se encuentra lleno) Textura del exoesqueleto (duro o blando) Tono del msculo abdominal (rme o cido) Presencia de moco sobre la cutcula (resbaloso o spero al tacto) Manchas, laceraciones, heridas, zonas oscuras u opacas, astillas clavadas Color del esfago y estmago (anaranjado sugiere canibalismo o mortalidad)

En cuanto a manifestaciones de enfermedad en condiciones naturales en los tanques

o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos: Nado errtico Letargia y debilidad Prdida del reejo de huida (permiten ser capturados sin ejercer resistencia) Vulnerabilidad a predadores (aves) Nado supercial (barbeo) Susceptibilidad a la hipoxia Disminucin en la alimentacin

Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalenciade una enfermedad en una poblacin, los camarones deben ser tomados al azar (noescogidos). El tamao de la muestra para estudios de enfermedades en camarones,ser revisado en detalle ms adelante (Captulo 2 Enfermedades virales) por CarlosPantoja.


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MTODO DE EXAMEN CLNICO

Figura 1.1 Captura de camarones en un estanquede cultivo mediante el uso de una atarraya, paraser sometidos a un examen clnico.

Figura 1.2 Muestra de camarones P. vannameisanos, enfermos y muertos observados en unrecipiente de fondo blanco, despus de sucaptura en un estanque de cultivo. Se observanalgunos camarones muertos sin apndices(pereipodos o plepodos), debido a que hansido canibalizados por otros camarones.

Figura 1.3 Camarones P. vannamei queestn siendo observados luego de haber sidocapturados en un estanque de cultivo, duranteun procedimiento de examen clnico. En elcaso de estos 5 camarones, no se observanmanifestaciones clnicas de enfermedad.


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1.3 Microscopa Directa (Anlisis en fresco)

Esta tcnica est basada en la observacin bajo el microscopio de tejidos opartes de camarones afectados, con el n de establecer en la medida de lo posible, un

diagnstico presuntivo. Las partes ms comnmente examinadas bajo el microscopio,son: hepatopncreas, branquias, contenido intestinal (heces), msculo esqueltico ycontenido gstrico.

Para una evaluacin sanitaria con microscopa directa, deben examinarse lasmuestras lo ms pronto posible despus del muestreo y despus de la preparacin delmontaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible,o usar muertos frescos que han sido mantenidos en fro (refrigerados o enhielados), oespecmenes jados en formalina 10% tamponada, cuando no sea posible trabajar concamarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarsepara procesar y examinar las muestras lo ms cerca del sitio de muestreo.

Una aplicacin importante del mtodo de microscopa, es el examen del contenidogstrico en camarones. Para ello, deben ser sacricados al menos 10 animales capturadosal azar en una poblacin determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente elestmago luego de hacer una diseccin del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeas.Se realiza una incisin por la lnea media con las tijeras y se extrae el equivalente a unagota de contenido gstrico. Se ubica sobre una lmina portaobjetos y se aade una gotade solucin salina. Se coloca luego una lmina cubreobjetos y se hace presin con lapinza cuidadosamente, con el n de separar los componentes gstricos.

Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X

y 10X, registrando la proporcin estimada de alimento articial (pellets), microalgas,zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian losporcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y seobtienen los valores para dicha poblacin. Este mtodo permite conocer factores que estnafectando el crecimiento, as como realizar correctivos en la dieta de los animales.

Los detalles relacionados con la tcnica de montajes en fresco, son estudiados msadelante (en este mismo Captulo) por Mara Soledad Morales (Montajes en Fresco).


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MTODO DE MICROSCOPA

(Montajes en fresco)

Figura 1.4 Camarones P. vannamei bajoobservacin durante un examen clnico. Ntesela presencia de una zona oscura en la partemedia del cefalotrax y superior de las branquias(echas). La opacidad generalizada del msculoabdominal puede deberse al tiempo que hanestado fuera del agua (estrs por hipoxia). Nose observan manifestaciones adicionales deenfermedad.

Figura 1.5 Camarn juvenil P. vannamei en elcual se est levantando la cutcula posteriordel cefalotrax, para extraer muestras delhepatopncreas, las branquias y heces del

intestino medio, a partir de las cuales se va apreparar un montaje en fresco.

Figura 1.6 Preparacin de un montaje en frescode un camarn P. vannamei en donde ya sehan colocado bajo el cubreobjetos muestras dehepatopncreas (izquierda) y branquias (centro).Las heces estn siendo extradas del intestinomedio con la ayuda del borde de unas tijeras.


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MTODOS DE MICROSCOPA

(Montajes en fresco)

Figura 1.7 Muestra de hepatopncreas de uncamarn subadulto P. vannamei preparadamediante un montaje en fresco. Se observa

gran cantidad de vacuolas lipdicas (reservas degrasa) de colores amarillo y gris y con tamaosvariados (todas normales). En el centro hay unproceso de melanizacin (color marrn) de untbulo del hepatopncreas, el cual est rodeadopor varias capas de hemocitos (halo blancoalrededor del tbulo melanizado) y presentauna forma alargada siendo ms ancho hacia laizquierda. Sin tincin. Amplicacin 100X.

Figura 1.8 Muestra de branquias de un juvenilP. vannamei preparada mediante un montajeen fresco. Se observan 2 lamelas branquialesbifurcadas en su extremo (superior), las cuales

presentan melanizacin de origen txico. Sintincin. Amplicacin 100X.

Figura 1.9 Montaje en fresco preparado a partir deuna muestra de heces de un camarn subadultoP. vannamei. Se observan dos trofozoitos degregarina Nematopsis sp., uno de ellos con elextremo posterior bifurcado. Estos protozoariosestn formados por 3 clulas (arriba) y por 2clulas (centro), respectivamente. Se puedediferenciar la clula anterior (protomerito) yla clula posterior (deutomerito). Sin tincin.Amplicacin 200X.


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MTODO DE MICROSCOPA DIRECTA

1.4 Montajes en fresco (Mara Soledad Morales-Covarrubias)

Introduccin

El diagnstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, unconocimiento de los factores contribuyentes signicativos que inuyan en la aparicinde la enfermedad.

Con el diagnstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando sedetermina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sinembargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad vara endiferentes animales acuticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaronerasy laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situacin particular, laprecisin esperada y la calidad de un diagnstico pueden ser directamente afectadas por

el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamientoy experiencia de la persona encargada de realizar el diagnstico, as como por lasprcticas de manejo en los sistemas de cultivo.

Uno de los objetivos principales en el diagnstico de una enfermedad de un animalen produccin, es la determinacin de la causa (etiologa). La identicacin de los agentesetiolgicos de la enfermedad se realiza (o debera realizarse) mediante la aplicacin demtodos cientcos de investigacin. La observacin de muestras de rganos y tejidosde camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusionesde rickettsias y virus) a travs de microscopa de luz e histopatologa (respuesta del

hospedero-patologa), son mtodos comnmente empleados para establecer los agentesetiolgicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones.

Los agentes patgenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medioacutico no es la excepcin. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientraslos camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parmetros de cultivo nose alteren, los patgenos no atacan. Este es un dato muy importante, pues el hecho detener patgenos presentes en una granja o laboratorio no signica precisamente que los

Figura 1.10. Montaje en fresco preparado apartir de heces de una postlarva (pl-10) de P.vannamei, en la que se observan trofozoitos dela gregarina Paraophioidina sp. (probablemente

P. scolecoides). Cada trofozoito est compuestopor una nica clula con el ncleo visible. Esteparsito tiene la particularidad de formar gruposen los cuales varios organismos se adhieren auno. Sin tincin. Amplicacin: 100X. Foto:Cullar-Anjel et al., 1998.


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organismos se encuentren enfermos. La gravedad depender del nivel de incidencia, dela prevalencia, tipo de patgeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especiecultivada, de la gentica de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrs de loscamarones al momento de estar expuestos al patgeno.

El estrs es determinado por calidad del agua, tipo de alimentacin, variacin drsticaen los parmetros como oxgeno disuelto, temperatura, salinidad, pH, etc., as como porlas prcticas de manejo principalmente. El escenario anterior se complica con el trasladode organismos vivos, que se realiza de manera frecuente entre zonas y an entre pases.Esto ha propiciado la introduccin y propagacin de agentes patgenos exticos a lugaresdonde no existan y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres.

Anlisis en fresco

El anlisis en fresco, es la tcnica que se utiliza para monitorear el estado de salud delos organismos y realizar diagnsticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en ladiseccin del camarn en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patgenosque presenten sus rganos y tejidos. La capacitacin para este tipo de anlisis consta deun corto entrenamiento bsico que profesionales (bilogos, ingenieros en acuicultura,mdicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio.

Para realizar el diagnstico del estado de salud de una poblacin se requiere de laseleccin y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de saludde los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo(nmero de muestreos en el tiempo hasta la cosecha) depender de la necesidad de la

informacin, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad deorganismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena seleccin se tiene quetomar en cuenta lo siguiente:

Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o parabuscar la prevalencia de patgenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cualdebe realizarse de cuatro reas diferentes del estanque (Figura 1.11).

El tamao mnimo de muestra o submuestra debe garantizar un 95% de conanzaque de existir una infeccin, sta se incluir en la muestra y para la prevalencia sumuestreo depender de la prevalencia estimada del patgeno y del nivel de conanza

elegido (Tabla 1). Los camarones seleccionados se depositan en contenedores conaireacin, procurando crearles el menor estrs posible y se trasladan de inmediato allaboratorio para su posterior anlisis.

Muestreo no aleatorio. Muestra que contiene solamente organismos enfermos. Este tipo demuestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de algunaenfermedad o sndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presentenseales clnicas tales como: decoloracin, melanizacin y necrosis en la cutcula, ascomo anorexia (falta de apetito), letargia (reduccin de la actividad normal), coloracinrojiza de los plepodos y telson o cualquier otra alteracin que se observe en ellos. Losorganismos con estas caractersticas generalmente se encuentran en la compuerta de

salida de los estanques (Figura 1.12).Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o

procedimientos que se hayan elegido para la deteccin del agente causal de la enfermedad.Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnstico.


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Tabla 1. Seleccin del tamao de muestra y clculo del porcentaje de prevalencia de un patgenoen una poblacin determinada (Tomada de Lightner, 1996 y modicada de Amos, 1985).

Tamao dela poblacin Tamao de la muestra necesaria para obtener el porcentaje de prevalencia**2% 5% 10% 20% 30% 40% 50%

50 50 35 20 10 7 5 2

100 75 45 23 11 9 7 6

250 110 50 25 10 9 8 7

500 130 55 26 10 9 8 7

1,000 140 55 27 10 9 9 8

1,500 140 55 27 10 9 9 82,000 145 60 27 10 9 9 8

4,000 145 60 27 10 9 9 8

10,000 145 60 27 10 9 9 8

>/= 10,000 150 60 30 10 9 9 8

* *Prevalencia= Nmero de individuos de una especie de hospedero infectada con una especie particular de parsito/nmero dehospederos examinados (Margolis et al., 1982)

Figura 1.11. Estanque de cultivo de camarndonde se observan las cuatro reas diferentespara la toma de organismos en muestreo al

azar.

Figura 1.12. Estanque de cultivo de camarndonde se observa la compuerta de salida para latoma de organismos en muestreo no aleatorio.


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Para la realizacin del anlisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio endonde se tenga el siguiente material:

Microscopio compuesto con objetivos de 4, 20, 40, 60 y 100 X

PortaobjetosCubreobjetosBisturNavajas de diseccinPinzas de diseccinTijeras nas de diseccinTabla de diseccinCajas de petriPizetasGuantes

Agua de mar estril o ltradaResinaJeringas desechables de varias medidas (1 mL, 3 mL y 5 mL)HematoxilinaEosina YSolucin de Davidson (AFA, Alcohol-Formaldehdo-cido actico)Solucin de Davidson modicada (AFA, Alcohol-Formaldehdo-cido clorhdrico)Etanol absolutoEtanol al 70%Xileno

Contenedores para muestrasHoja de reporteManuales

Desarrollo de la tcnica:

Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamao promedio. Se analiza tanto la supercie del organismo para detectar deformaciones en el rostro

y en el sexto segmento abdominal, como cutcula delgada (o suave), epicomensales,decoloracin, coloracin rojiza, melanizacin, ampollas y necrosis de cutcula(Figura 1.13); plepodos, pereipodos y antenas.

Se selecciona una pequea porcin de cada tejido u rgano (Figura 1.14). Lasporciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones),se les adiciona unas gotas de agua de mar estril y se pone el cubreobjetos; debeprocurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ellohay que realizar una leve presin sobre el cubreobjetos con la pinza de diseccin).

Las muestras que se tomarn son:

Branquias: con las tijeras nas se elimina el exoesqueleto que cubre las branquias.Se toma una pequea porcin y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios

en la coloracin de los lamentos branquiales (como melanizacin, necrosis, reasblanquecinas bien denidas), presencia de protozoarios (Zoothamniumsp (Figura 1.15),Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo sp), bacterias lamentosas (Leucothrixmucor yFlexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos,bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusin viral enlas branquias por improntas, es necesario jarlas en solucin de Davidson modicada(AFA, Alcohol-Formaldehdo-cido clorhdrico), si van a ser procesadas de manera


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inmediata; si este no es el caso, pueden jarse en la solucin de Davidson (AFA, Alcohol-Formaldehdo-cido actico), que se utiliza para jar organismos para histologa.

Hepatopncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotrax para descubrir el

hepatopncreas (Figura 1.16) y el estmago. Se observa la coloracin, el tamaodel hepatopncreas para decidir si hay atroa (reduccin de tamao) o hipertroa(aumento de tamao) del rgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre

Figura 1.14. Pequea porcin de hepatopncreaslista para ser analizada.

Figura 1.13. Camarn con melanizacin multifocal.

Figura 1.15 Muestra de branquias dondese aprecian las formas bien denidas deZoothamniumsp.


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el hepatopncreas y con un bistur se parte por la mitad para observar la coloracindel uido, textura, melanizacin y necrosis tubular. Se toma una pequea muestra yse coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus,gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformacin tubular, ndulos hemocticos,melanizacin y necrosis de los tbulos (Figura 1.17).

Tambin debe observarse la cantidad de lpidos presentes, desprendimiento declulas del epitelio de los tbulos del hepatopncreas y acumulacin dentro de vacuolascitoplasmticas de los hepatocitos de una sustancia de color verde oscuro bolitasnegras. Para la realizacin de improntas e histologa, es necesario jar los rganos y/otejidos del organismo seleccionado en el jador adecuado para el diagnstico elegido.

Intestino: el abdomen, se separa del cefalotrax, del telson y de los urpodos parafacilitar la extraccin del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (quepuede o no contener hilo fecal); con ayuda de una pinza na, se extrae con cuidado y secoloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de aguade mar y se presiona ligeramente al depositar el cubreobjetos (Figura 1.18). Al observarla muestra en el microscopio, se buscarn: gregarinas con sus diferentes estadios (Figura1.19), distribucin y porcentaje de adherencia en el intestino, inamacin, nemtodos,cuerpos de oclusin de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus.

Msculo y gnadas: se toma una pequea muestra de msculo y de las gnadas(especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en unportaobjetos y se presiona para facilitar la bsqueda de microsporidios (Figura 1.20), siestos rganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamao

y forma uniformes.Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo

de menor aumento y nalizando con el de mayor. Debido a su rpida descomposicin, laprimera muestra que se analiza es la del hepatopncreas; despus se estudia la muestrade branquias, posteriormente el intestino y por ltimo la muestra de msculo y gnadas.En la hoja de reporte (Tabla 2), se anota todo lo que se observa con cada objetivo. Luegose calcula el porcentaje de prevalencia y se determina el grado de severidad (Tablas3, 4, 5 y 6) que presenten los organismos de la muestra analizada. Se naliza con eldiagnstico y el reporte nal.

Figura 1.16. Organismo con hepatopn-creas expuesto para tomar pequea porcinpara su anlisis.


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Figura 1.19. Muestra en fresco de intestino medio, dondese aprecian las sicigias de gregarinas de 2, 3, y 4 divisionesadheridas al epitelio y en el lumen del intestino.

Figura 1.20. Muestra en fresco de msculo donde seobservan las cpsulas deAmeson nelsoni.

Figura 1.17. Muestra en fresco de hepatopncreas conmelanizacin y necrosis de las clulas y de los tbulos.

Figura 1.18. Muestra en fresco de intestino.


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Tabla 2. Formato de reporte para el anlisis en fresco.

No ________________________ Fecha._____________________________________________

Procedecia. ____________________________________________________________________

Especie.________________________________________________________________________

Estanque No. _______________ Tamao de la muestra.______________________________

No. de muertos. _____________ No. de examinados. ________________________________

Estado de vida.______________ Peso promedio. __________ Tamao promedio.________

CARACTERSTICAS EXTERNAS OBSERVACIONESCARACTERSTICAS

INTERNASOBSERVACIONES

Actividad de los camarones HEPATOPNCREAS

Contenido del intestino Atroa

Presencia de heces en forma decadena o discontinua

coloracin

Presencia de epibiontes, bacte-rias y hongos en el camarn

Presencia de los virus: BPy MBV.

Deformidades en el rostrum,antenas abdomen, telson,urpodos y plepodos

Deformacin de los tbulos

Apndices rotos Color del uido.

Melanizacin (color caf claro)Presencia de gregarinas entodos sus estados

Coloracin anormal Tbulos melanizados

Caractersticas de la cutculaPresencia de masa de bac-terias y cantidad de lpidos

BRANQUIAS INTESTINO

ColoracinPresencia de gregarinas entodos sus estados.

Presencia de epibiontes Masas melanizadas dehemocitos

Ndulos de bacterias en laslmelas branquiales

Cuerpos de oclusin de BP

Micosis (hifas, conidios) MSCULO

Cuerpos de inclusin de WSSV Textura

Materia orgnica Color

Presencia de melanizacin ynecrosis

Microsporidios

Sndrome delencalambramiento


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Tabla 3. Gua general para dar un valor numrico cualitativo de grado de severidada la infeccin, infestacin y sndrome (Lightner, 1996).

GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLNICOS

0No presentan signos de infeccin por el agente patgeno, parsitoo epicomensal. No presentan lesiones caractersticas de sn-dromes.

1

Presencia muy baja del patgeno, parsito o epicomensal. Enaquellos donde se tiene un nmero estndar permitido, ste seencuentra justo arriba del lmite normal. Se observan muy pocaslesiones caractersticas del sndrome.

2

Se observa la presencia baja y moderada del patgeno, parsito oepicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, car-

actersticas del sndrome. Incremento en la mortalidad si no seaplica tratamiento (cuando existe tratamiento).

3

Se observa la presencia moderada del patgeno, parsito o epico-mensal. Se observan lesiones moderadas a severas, caractersticasdel sndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento(cuando existe tratamiento).

4Se observa gran cantidad del patgeno, parsito o epicomensal.Se observan severas lesiones caractersticas del sndrome. Muyletal con altas mortalidades.

Tabla 4. Gua para dar un valor numrico cualitativo de grado de severidad a ladeformacin tubular en hepatopncreas con anlisis en fresco (Morales-Covarrubias,2004).


0No presentan signos de deformacin tubular (0). No presentanlesiones caractersticas de sndromes.

1Presencia muy baja de deformacin tubular (1-5/campo/organ-ismo). Se observan muy poco desprendimiento celular.

2Se observa la presencia moderada de deformacin tubular (6-10/campo/organismo). Presencia de hemocitos y formacin de ndu-los hemocticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.

3

Se observa la presencia alta de deformacin tubular (11-20/campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas,como melanizacin, desprendimiento celular, atroa tubular yformacin de ndulos hemocticos. Potencialmente letal si no seaplica tratamiento.

4

Se observa gran cantidad de tbulos deformes (mas de 20/campo/organismo). Se observan severas lesiones como melanizacin,necrosis, atroa tubular, tbulos vacos, formacin de nduloshemolticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mor-talidades.


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Tabla 5. Gua para dar un valor numrico cualitativo de grado de severidad a lainfestacin por gregarinas utilizando anlisis en fresco.


0No presentan signos de infeccin por el parsito (0). No presen-tan lesiones causadas por el parasitismo.

1Presencia muy baja del parsito (1-15/intestino/organismo). Seobservan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo comoinltracin hemoctica.

2

Se observa la presencia moderada del parsito (16-50/intestino/or-ganismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas porel parasitismo como inltracin hemoctica y formacin de ndu-los hemoctico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.

3

Se observa la presencia alta del parsito (51-100/intestino/organ-ismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas porel parasitismo, como inltracin hemoctica y reas multifocalesmecanizadas y formacin de ndulos hemocticos. Potencial-mente letal si no se aplica tratamiento.

4

Se observa gran cantidad del parsito (mas de 100/intestino/organ-ismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismocomo inltracin hemoctica, melanizacin multifocal y necrosis.Muy letal con altas mortalidades.

Tabla 6. Gua para dar un valor numrico cualitativo de grado de severidad a lainfestacin por epicomensales en lamelas branquiales.


0No presentan signos de infeccin por protozoario (0). No presen-tan lesiones causadas por epicomensales.

1Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lmela/organismo). Seobservan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales,

como inltracin hemoctica.

2

Se observa la presencia moderada de protozoarios (6-10/lmela/organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadaspor los epicomensales, como inltracin hemoctica y formacinde nodulos hemocticos. Se observa mortalidad si no se toman lasmedidas de correccin.

3

Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lmela/organ-ismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por losepicomensales, como inltracin hemoctica y reas multifocalesmecanizadas y formacin de ndulos hemocticos. Potencial-

mente letal si no se toman medidas de correccin

4

Se observa gran cantidad del parsito (mas de 20). Se observanseveras lesiones causadas por los epicomensales, como inl-tracin hemoctica, melanizacin multifocal y necrosis. Muy letalcon altas mortalidades.


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1.5 Bacteriologa

Objetivo. El objetivo de la bacteriologa en camarones, es cuanticar la cantidad y el

tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, ascomo en agua para / de cultivo.

Descripcin. La bacteriologa es un conjunto de mtodos que se utiliza como apoyo enel diagnstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de laenfermedad est relacionada con presencia de bacterias patgenas en el agua de cultivoo dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentesmedios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmentepatgenas.

Metodologa. Despus de denir qu poblaciones afectadas se van a examinar, se debedeterminar el tipo de muestreo con base en el objetivo del estudio. El tamao de muestradepender de si la captura es aleatoria o, de si se escogen slo animales enfermos parala evaluacin (ver el Captulo 2 Enfermedades virales para ms detalles sobre tcnicasde muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriologa, debenestar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriolgica con camaronesmuertos, debido a que los resultados estarn sesgados por los cambios autolticos (post-mortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos,as como su crecimiento.

Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriolgico, se deben tener previamenteesterilizados todos estos elementos. El material de vidrio se envuelve en papel kraft y se

esteriliza por la tcnica de calor seco mediante un horno a una temperatura de 180oCdurante un lapso de dos horas. El agua destilada y los medios lquidos de cultivo comoel agua peptonada deben ser esterilizados por vapor hmedo mediante un autoclave a15 libras de presin (121C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizandirectamente por calor seco mediante la llama del mechero. El momento en el cual elasa se encuentra estril sucede cuando sta se torna de un color rojo incandescente. Elcolador con ojo de malla no se debe desinfectar dejndolo inmerso en una solucin dehipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estrilhasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito.

La toma de muestra para anlisis bacteriolgico tanto de agua de transporte denauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momentode recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma demuestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: laentrada del tanque y en el centro del mismo.

En el caso de larvas o postlarvas, se debe tomar una cantidad conocida o estimada(lo ms conable posible) de animales, con el n de emitir los resultados en funcin deunidades formadoras de colonia (UFC) por animal o por gramo de larvas/postlarvas.La muestra debe ser lavada con agua de mar estril utilizando una malla na o uncolador pequeo de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol

70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregandouna cantidad conocida (en mL) de agua de mar estril o solucin salina estril para ladilucin del macerado.

En el caso de camarones juveniles, subadultos o reproductores, se recomiendadesinfectar el rea de puncin (seno cardaco dorsal o seno hemolinftico ventral)con trozos de algodn impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL)nueva y estril que tenga aguja hipodrmica (muy delgada), se extraen al menos 100 L


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de hemolinfa. Es importante que si las posibilidades del laboratorio lo permiten, se utilicealgn anticoagulante (ej.: citrato de sodio 10% en relacin 1:1), cuyo volumen dentrode la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianosen UFC.

Tanto en el caso de macerado de larvas/postlarvas, hemolinfa de camarones mayores(anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100L en un medio slido para el aislamiento de bacterias (cultivo primario). Esta siembrapuede hacerse en agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sal sacarosa), el cual es un medioselectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (gneroVibrio), aunque tambin crecen especies bacterianas de los gneros Pseudomonas,Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivosprimarios existen medios no selectivos en los cuales crecen bacterias totales (la mayorparte de las bacterias presentes en agua o en los camarones), tales como TSA (agar

tripticasa soya) y Agar Marino.Una vez se inoculan los 100 L de muestra sobre el agar elegido y en condiciones

aspticas (ambiente estril con mecheros y/o en una cmara de ujo laminar), seextiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipostick de hockey). De esta manera, se obtiene una distribucin homognea del inculo.Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperaturade 30oC por 24-48 horas. Para determinar la morfologa de las bacterias que han crecido,se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lmina portaobjetos,habindola diluido antes en solucin salina estril hasta obtener un grado de 0.5 en laescala de McFarland. Luego se deja secar y se colorea con tincin de Gram. Las bacteriasdel gnero Vibriose observarn como bacilos Gram negativos bipolares.

En caso de que haya crecimiento de bacterias, se deben contar las colonias para locual existen mtodos de observacin directa (a trasluz) o utilizando un equipo especialpara conteo de colonias. Los valores se dan en UFC; en el caso de larvas o postlarvasser UFC/g o por cada X nmero de animales. En el caso de hemolinfa o de agua, elresultado se da en UFC/mL.

Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones(bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibiticos (antibiogramas), paraestablecer qu productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas

bacterias aisladas. Una vez determinado el antibitico ms efectivo, se puede realizaruna prueba para medir la concentracin mnima inhibitoria (MIC) de dicho antibitico,capaz de matar la mayor parte de las bacterias. El resultado del MIC ser utilizado comoreferencia para la medicacin de la poblacin afectada de camarones.


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MTODO DE BACTERIOLOGA

Figura 1.21 Cabina de ujo laminar,utilizada durante la siembra de mues-

tras de camarones, agua o sedimentoen medios de cultivo, para evitar lacontaminacin con bacterias presentesen el ambiente. En su parte superior, lacabina posee un sistema que ltra elaire que ingresa al rea de trabajo. Es-tos equipos estn dotados con entradasde agua, gas y sistemas de vaco, ascomo luz blanca y luz ultravioleta.

Figura 1.22 Autoclave horizontalutilizado para esterilizar elementos,materiales y reactivos que se utilizanen bacteriologa. Funciona con altapresin producida por vapor de agua,lo que eleva la temperatura a 121C, ala cual se exponen los materiales por15 minutos.


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MTODO DE BACTERIOLOGA

Figura 1.23 Siembra (inoculacin) de hemolinfaanticoagulada de un camarn P. vannamei enagar TCBS. Se est utilizando un mechero dealcohol cerca del medio de cultivo, para procurartener un ambiente estril alrededor de la zonade siembra. El inculo de 100 L aplicado conuna micropipeta graduada volumtricamente,ser esparcido por todo el medio utilizando unabarra metlica especial para tal n.

Figura 1.24 Plato Petri con agar TCBS enel cual se observa crecimiento de bacteriasSucrosa positiva (colonias amarillas). Lamuestra pertenece a hemolinfa de un camarnP. vannameiy fue incubada durante 24 horas a30C. El amarillo del medio (y no verde que esel original del agar TCBS) se debe al cambio depH producido por el uso de la Sucrosa por parte

de las bacterias predominantes.

Figura 1.25 Contador de colonias con pantalladigital, utilizado para la cuanticacin de lascolonias en los platos Petri donde se presentancrecimientos bacterianos. Cada colonia procedede una bacteria, la cual constituye una unidadformadora de colonia (UFC).


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1.6 Histologa

Objetivo. La histologa es la rama del saber cientco que se ocupa del estudio delos rasgos morfolgicos de los tejidos, por medio de instrumentos amplicantes. La

histopatologa es entonces la ciencia que estudia las modicaciones patolgicas de lasclulas y tejidos. En camarones, es una herramienta de diagnstico que permite identicarcambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos fsicosy tinciones rutinarias o especiales. Esta tcnica permite detectar factores de mortalidad,bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivoen laboratorios de larvicultura, ncas de engorde e instalaciones de maduracin dereproductores.

Descripcin. La histopatologa permite identicar en la mayora de los casos, la etiologade la enfermedad de la poblacin de camarones bajo estudio; se logra generalmentehacer el diagnstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por

ejemplo las causadas por IHHNV, TSV, WSSV, HPV, YHV, BP, IMNV y PvNV), necrosishepatopancretica (NHP), bacteriosis crnicas, gregarinas, protozoarios epicomensales,nemtodos, enteritis hemoctica y necrosis muscular idioptica, entre otras enfermedades.Para esto, se requiere que las lminas histolgicas sean perfectamente preparadas yexaminadas bajo el microscopio por el ojo de un patlogo entrenado.

La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustceosextremadamente rpido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas ycomponentes celulares, prdida de la arquitectura de los tejidos y destruccin de losrganos. Por esta razn, los camarones deben morir por efecto de la inyeccin del jador

y por la inmersin en el mismo, el cual debe ofrecer una rpida penetracin en lostejidos. El hepatopncreas es el rgano ms susceptible a la autolisis. Durante la jacin,la solucin debe penetrar el rgano rpidamente o los cambios post-mortem conducirna la prdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para eldiagnstico.

Si existe inters en estudiar problemas de morfologa externa en camarones comoes el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales)adheridos a las branquias, tambin se obtienen buenos resultados si los animales sonjados vivos por inmersin en una solucin de formalina al 10%.

Metodologa. El jador de Davidson (Humason, 1979) es el ms utilizado y sugeridopara los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camaronespara anlisis histopatolgico. Adems de ofrecer buen nivel de detalle en el ncleo delas clulas, el cido actico del jador descalcica la cutcula, evitndose as pasosadicionales de descalcicacin del exoesqueleto durante el proceso histolgico. Lapreparacin del jador de Davidson debe realizarse con base en la siguiente frmula:

Para 1 litro de jador de Davidson:

Etanol 95%: 330 mLFormaldehdo 39%: 220 mL

cido actico glacial: 115 mL

Agua (corriente): 335 mL


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Para la realizacin de un estudio histolgico en camarones, se requiere de unproceso sistemtico que incluye jacin, deshidratacin, inclusin en parana, cortede segmentos ultradelgados (3 micras de espesor) y tincin. Cada etapa de stas tienesus propios pasos y tiempos cuya nalidad es preservar el tejido lo ms intacto posible yobtener lminas de ptima calidad, las cuales permitan nitidez ptica en la organizacincelular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio.

Fijacin. Corresponde a la preservacin de los tejidos en las mismas condicionesestructurales y morfolgicas del momento de la muerte del camarn, lo cual como ya semencion, debe ser a causa de la inyeccin del jador (Davidson). Los camarones debenser jados vivos o moribundos, nunca muertos. La jacin pretende desnaturalizar loscomponentes proteicos de las clulas. Durante la jacin, se debe inyectar abundantejador de Davidson en el hepatopncreas, resto del cefalotrax y en el msculo. Luego,el camarn se debe sumergir en el mismo jador en relacin 1:10 (10 veces el volumen

del jador respecto al de la muestra). En el caso de pls, se deben sumergir directamente enel jador. Camarones con ms de 12 g se deben someter a un corte lateral y longitudinalde la cutcula para facilitar el ingreso del jador. El tiempo ptimo de jacin dependedel tamao del camarn, requirindose 12-24 horas para postlarvas y juveniles, 48 horaspara pre-adultos y 72 horas para reproductores. Luego de estos tiempos, el jador debeser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deber reemplazarse a los 15 dassi los camarones an no han sido procesados.

Deshidratacin e inclusin en parana. Consiste en eliminar la mayor parte del aguatisular y reemplazara con parana lquida. Se realiza con un equipo automtico yprogramable llamado procesador de tejidos. Durante el proceso, los tejidos pasan por12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol80% (2), etanol 95% (2), etanol 100% (2), aclarante (2) (Xilol o Hemo-De) y nalmenteparana lquida a temperatura controlada (2).

Bloqueo.Terminada la inclusin en parana, los tejidos son ubicados en moldes (metlicoso plsticos) para formar un bloque el cual al enfriarse se solidica, conteniendo el tejidoen su interior. En la actualidad, existen unidades de bloqueo que consisten en equiposque manejan simultneamente supercies con varias temperaturas diferentes, las cualespermiten tener parana lquida, supercies de trabajo calientes y planchas con escarcha(hielo pulverizado) para el enfriamiento nal de la parana al terminar de hacerse el

bloque. Los moldes plsticos disponibles para bloqueo, permiten adems servir comobase para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrtomo).

Corte.Esta es la parte del proceso histolgico en la cual se utiliza un equipo altamenteespecializado llamado micrtomo, nombre dado debido a que permite realizar cortesde tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en esteequipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le dauna vuelta, el bloque de parana avanza la cantidad de micras programada, hacia unacuchilla con un lo y calidad especial para histotecnia.

Recuperacin del corte. Las tiras de parana que contienen el tejido cortado, son

puestas sobre un equipo llamado bao de recuperacin de tejidos, el cual contieneagua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50C aprox.), la cualpuede contener una pequea concentracin de gelatina neutra. Las tiras se expandenal entrar en contacto con el agua caliente y as se elige la que presente una estructurams completa del tejido en cuestin. Separada de los segmentos no deseados medianteel uso de un pincel delgado, la porcin seleccionada es recuperada con una lmina


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portaobjetos, en la cual quedar adherida de manera permanente y sobre la cual se harla tincin nal.

Tincin.En camarones, el mtodo de tincin ms frecuente es el de Hematoxilina de

Mayer-Bennett y Floxina/Eosina (H&E). Esta tincin involucra las siguientes soluciones yreactivos: Hemo De, etanol, agua destilada, hematoxilina, agua corriente, Floxina/Eosinay medio de montaje. Una vez teidas las lminas histolgicas, se sellan utilizando unagota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestrapermanentemente. Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner,1996.

Los colorantes (o tinciones) son sustancias qumicas complejas, a menudo decomportamiento variable. Pueden ser de uso general para teir tanto ncleo comocitoplasma, o ms especcos respecto a algn componente particular. Son sales neutrascon radicales tanto cidos como bsicos. El colorante es bsico cuando la propiedad detincin est en el radical bsico y las estructuras que tie se denominan Baslas. Lasestructuras baslas son qumicamente cidas; tal es el caso de los cidos nucleicos delncleo (ADN) y los componentes cidos del citoplasma (ARN). El colorante es cidocuando la propiedad de tincin est en el radical cido de la sal neutra; tal es el casodel citoplasma y en este caso las estructuras teidas con colorante cido son llamadasAcidlas.

La tincin H&E marca y dene bien el ncleo, el citoplasma y la membrana celularpor anidad de electrones, resultando en la coloracin azul oscuro del ncleo y la paredde las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por

efecto de la eosina. Los tejidos se tien para aumentar el contraste natural y hacer msevidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrnseco. Adems dever la clula individualmente, la tincin H&E permite observar en conjunto las clulas delos rganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciacin.

Existen otras tinciones especiales que resaltan ciertas partes de los tejidos u organeloscelulares, como el cido peridico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasmade las clulas que contienen carbohidratos (msculo). Para teir hongos de negro, seutiliza la tincin de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones parahongos suelen tener sales de plata, tambin se utilizan para detectar bacterias comoespiroquetas (Levaditi) y bacilos cido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones

para camarones incluyen la de Gram (bacterias), Brown & Brenn (rickettsias), Steiner& Steiner (espiroquetas y rickettsias), Giemsa (bacterias), Wright (rickettsias), Pinkerton(rickettsias), Kinyoun (bacterias cido-alcohol resistentes), McManusPAS (glicgeno yhongos), Feulgen (ADN) y Tricromo de Masson (contrastes especiales).

Montaje.El exceso de colorante despus de la tincin se elimina con agua o alcohol yse deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando despus dealcohol absoluto a una solucin de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gotade blsamo de Canad (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejndosesecar. El corte obtenido, generalmente de no ms de 3 micras de espesor, estar listo para

ser observado a travs de un microscopio ptico.Lectura e interpretacin. Una adecuada interpretacin de un corte observado almicroscopio ptico, depende de factores como el plano del corte, la tincin utilizada yla interpretacin funcional. Respecto al plano, es fundamental reconstruir la estructuratridimensional de clulas, tejidos y rganos a partir de cortes bidimensionales. Latincin es tambin fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base enlas estructuras microscpicas que queremos estudiar. En cuanto a la interpretacin


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MTODO DE HISTOLOGA

Figura 1.26 Fijacin de un camarn juvenil P.vannamei. La solucin que se est inyectandoal animal an vivo, es Davidson - AFA. Nteseel cambio de color del hepatopncreas que pasde amarillo (normal) a anaranjado, por efectodel jador luego de haber sido inyectado. Seobserva el uso indispensable de guantes para lamanipulacin de esta solucin jadora.

Figura 1.27 Cabina para extraccin de gases,utilizada para la manipulacin de muestras quehan sido jadas para procesamiento histolgico.Se observa un vidrio de seguridad en el frente,a travs del cual se pueden ver las muestras

que se manipulan y el cual protege la cara desalpicaduras de reactivos irritantes. Tambincuenta con fuente de agua para lavado deelementos o partes del cuerpo en donde hayacado algn reactivo histolgico.

funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y funcin de loobservado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estticas del corte enlas dinmicas de la vida. Es fundamental para una correcta interpretacin de hallazgoshistopatolgicos, que la observacin sea hecha por un ojo entrenado en patologa y, enparticular, en los tejidos especcos de la especie que se va a estudiar. No es sucientetener lminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad ptica bajo elmicroscopio, si quien las examina no tienen habilidad para diferenciar tejidos sanos derganos o tejidos con lesiones.

Durante la preparacin de los cortes histolgicos, pueden presentarse alteracionesdenominadas artefactos, los cuales deben ser reconocidos y diferenciados de reasconservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustanciasen la preparacin del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en lapreparacin, contaminacin de los colorantes o, errores de montaje como pliegues.


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MTODO DE HISTOLOGA

Figura 1.28 Procesador de tejidos para histologa.

Este equipo cuenta con 10 vasos de 1 L cada uno,donde se hace la deshidratacin de los tejidos y seincorpora parana lquida a temperatura controlada(2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados ala derecha). Cuando esta se enfra, da textura rme altejido y permite realizar cortes con el micrtomo sinque se deformen por el paso de la cuchilla.

Figura 1.29 Central de bloqueo. Esta unidad poseesupercies y compartimentos con temperaturascontroladas electrnicamente (T1, T2 y T3) y permitepreparar los bloques de parana con los tejidosincluidos. Durante este proceso, el tejido en paranaes ubicado en un cassette plstico y cubierto conparana lquida obtenida a travs de un dispositivoespecial (P), para formar un bloque. Este se solidicaluego de estar por unos minutos sobre una superciecon escarcha que posee el mismo equipo (E).

Figura 1.30 Corte de tejidos en el micrtomo. Se observa uncassette (blanco) con un corte de cefalotrax (anaranjado)siendo montado en la base mvil de un micrtomo, antesde que sean cortadas las secciones a 3 micras de grosor.


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MTODO DE HISTOLOGA

Figura 1.31 Bao de recuperacin de tejidos,en el cual las tiras de parana con tejido que

se han obtenido con el micrtomo, son puestasen otacin en agua caliente. La parana seexpande con el calor y se elige el mejor corte,capturndolo con una lmina portaobjetos yubicndolo sobre esta en la posicin en la cualva a quedar de forma denitiva.

Figura 1.32 Batera de tincin con hematoxilinay eosina, en la cual se agregan los colorantesa los tejidos para obtener el contraste entre lasdiferentes clulas y entre las distintas partes decada una. En la foto se observan los reactivosutilizados para la tincin de rutina, donde sepuede apreciar la canasta con lminas siendo

inmersa en eosina.

Figura 1.33 Lmina portaobjetos con corteshistolgicos de un camarn juvenil P. vannamei,los cuales han sido teidos con H&E. Se observaun corte longitudinal de cefalotrax (C), unotransversal de abdomen (A) y uno longitudinalde branquias (B).


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MTODO DE HISTOLOGA

Figura 1.34 Corte histolgico de un segmento delcorazn de un camarn subadulto P. vannamei.Se observa la vlvula artica de un animal sano(echas), en el lugar donde la hemolinfa ingresaa la arteria aorta (A). H&E. Amplicacin 100X.

Figura 1.35 Corte histolgico de hepatopncreasde un camarn subadulto P. vannamei. Seobservan tbulos normales compuestos pordiferentes tipos de clulas y con un lumenen el centro. No hay evidencia de lesionesque sugieran presencia de una enfermedaddegenerativa. H&E. Amplicacin 200X.

Figura 1.36 Corte histolgico de hepatopncreasde un camarn juvenil P. vannamei, coninamacin a causa de la enfermedad NHP.Los principales hallazgos histopatolgicos sonagregacin hemoctica severa (inamacin),melanizacin de varios tbulos, citolisis yprdida de la arquitectura de la zona afectada.H&E. Amplicacin 200X.


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1.7 Pruebas con anticuerpos

Objetivo. La prueba de ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) es una pruebarpida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antgeno (viral o

bacteriano) presente en una muestra de camarn, con el n de detectar la presencia ono de dicho agente patgeno en la muestra. Esta prueba que utiliza anticuerpos para eldiagnstico de enfermedades en camarones, se llama en espaol inmunoanlisis ligadoa enzimas o tambin enzimoinmunoanlisis de adsorcin (EIA).

Descripcin. La tcnica de ELISA utiliza anticuerpos especcos para la identicacinde antgenos tambin especcos, los cuales son componentes estructurales (usualmenteprotenas) de agentes patgenos o, protenas nicas producidas o inducidas por ellos.

Esta prueba provee una estrategia de diagnstico la cual es potencialmente muyrpida (en algunos casos slo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran

nmero de muestras en un pequeo espacio tanto en laboratorio como en condicionesde campo. La prueba de ELISA puede ser realizada con base en anticuerpos policlonaleso monoclonales.

Metodologa. La prueba de ELISA combina la especicidad de anticuerpos con lasensibilidad de pruebas enzimticas simples, usando anticuerpos o antgenos acopladosa una enzima fcilmente detectable. La ELISA puede proporcionar un sistema til para lamedicin de la concentracin de un antgeno o de un anticuerpo. Hay dos variacionesprincipales en este mtodo: la ELISA puede usarse para detectar la presencia de antgenosque son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen unantgeno.

Una prueba de ELISA es un procedimiento que involucra cinco pasos generales:1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antgeno; 2) bloqueo de todos lossitios no cubiertos por el antgeno, para evitar resultados falsos positivos; 3) adicin deanticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adicin de anticuerpos conjugados con unaenzima; 5) reaccin de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado,indicando as una reaccin positiva. Hay muchos tipos diferentes de ELISA. Uno de lostipos ms comunes es la ELISA sandwich. La siguiente es la metodologa general pararealizar una prueba de ELISA. Algunos pasos, reactivos y cantidades podrn cambiarsegn se requiera para cada protocolo asociado con un antgeno en particular.

Una microplaca para ELISA se debe cubrir con el antgeno apropiado, llenandolos pozos con 100 L del antgeno diluido. Se incuba toda la noche a 4C y se lava elantgeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan lospozos con agua destilada y se vacan de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 vecesms utilizando PBS-Tritn.

Se debe bloquear la unin no especca agregando 200 L de BSA/PBS 1% y seincuba luego por 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se lava la microplaca como semencion anteriormente y se agregan 100 L de las muestras diluidas en los respectivospozos de la microplaca. Hay que asegurarse de incluir siempre controles positivoy negativo y, si es necesario, una curva estndar. Se incuba por 1 hora a temperaturaambiente y se repite luego el paso del lavado.

Luego se prepara la dilucin apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugadocon fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rbano (los anticuerpos deben ser tituladospara buscar obtener una dilucin ptima).

Se deben agregar luego 100 L del anticuerpo del segundo paso a los pozos y seincuba por 1 hora. Hay que repetir nuevamente el paso del lavado. Se prepara la solucin


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del substrato y se agregan 100 L a los pozos, incubando luego a temperatura ambientepor 60 minutos. Finalmente se agrega la solucin de parada en cantidad suciente y seleen las microplacas en un lector de ELISA.

MTODO DE PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARMETROS

INMUNOLGICOS(ESPECTROFOTOMETRA)

Figura 1.37 Procedimiento de ELISA enmicroplaca de 96 pozuelos. Se jan anticuerposy se agrega el antgeno complementario.Esta unin se detecta agregando un segundoanticuerpo contra el mismo antgeno, marcadocon una enzima. Esta, en contacto con unsubstrato, produce color cuya intensidad esproporcional a la cantidad de antgeno presenteen la muestra. Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.38 Microplacas de ELISA con96 pozuelos, utilizadas para pruebas conanticuerpos y en mediciones de parmetrosinmunolgicos de camarones. Son montadas enun lector de ELISA para detectar por colorimetra

la cantidad existente de un antgeno de inters.Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.39. Lector de microplacas de ELISA con96 pozuelos. Colormetro que permite hacerlecturas de punto nal, funcionando de maneraindependiente o conectado a un computadorpara registro y anlisis de datos. Tiene capacidadpara almacenar 100 ensayos y 20 microplacasde datos. Foto: Cultek S.L.U.


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Jorge Cullar-Anjel Mtodos de Diagnstico de Enfe

patologia e inmunologia

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