parÁmetros organolÉpticos y fisicoquÍmicos para la caracterizaciÓn y uso del propÓleos a nivel...

UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA

SEDE VIÑA DEL MAR - JOSÉ MIGUEL CARRERA

PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FISICOQUÍMICOS

PARA LA CARACTERIZACIÓN Y USO DEL PROPÓLEOS

A NIVEL INDUSTRIAL

Trabajo de Titulación para optar al Título

Profesional de Técnico Universitario en

QUÍMICA, MENCIÓN QUÍMICA

ANALÍTICA

Alumno:

Sr. Jonathan Valladares Salazar

Profesor Guía:

Dr. Manuel Saavedra González

2009

Para mis padres con mucho cariño…

Gracias a sus esfuerzos y dedicación a mi

formación como persona. A Ilse por su

cariño y apoyo incondicional durante todo

este largo tiempo.

Agradezco en forma mu especial a Don

Patricio Fernández, Don Fredy Valdés y

APICAS, por la gran ayuda proporcionada;

y a todas las personas que con sus

conocimientos y aportes contribuyeron a la

realización de este trabajo.

RESUMEN

Keywords: Propóleos – Propiedades fisicoquímicas – Características organolépticas

– Apicultura.

El propóleos es un producto apícola resinoso y complejo, con una apariencia

variable, producto de la mezcla de sustancias resinosas, gomosas y balsámicas. Estas

son recolectadas por la abeja (Apis mellifera) de distintas fuentes botánicas, las que son

transportadas a la colmena, donde son modificadas física y químicamente, para cumplir

con la función de proteger a la misma de distintos patógenos y evitar la propagación de

enfermedades. Gracias a la compleja composición que posee, tiene innumerables

propiedades terapéuticas que han sido estudiadas en todo el mundo. Los compuestos

identificados en propóleos de colmenas ubicadas en emplazamientos cercanos entre sí

no difieren significativamente, aunque desde el punto de vista cuantitativo pueden ser

variables. Ello implica que los propóleos deben ser caracterizados en función de la zona

geográfica de ubicación de las colmenas, para poder ser comercializados.

El presente trabajo tiene como objetivo principal establecer parámetros

organolépticos y fisicoquímicos que permitan caracterizar el propóleos, para su

comercialización a nivel industrial, a través de la determinación de las características

organolépticas y propiedades fisicoquímicas del propóleos, recolectado en la localidad

de Tapihue, Casablanca, Quinta Región de Chile. Las características organolépticas

determinadas son: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor, consistencia a

temperatura ambiente e impurezas visibles. Las determinaciones fisicoquímicas

realizadas son: cera, impurezas mecánicas, compuestos fenólicos totales, índice de

oxidación, compuestos flavonoides totales, índice de yodo, pérdida por calentamiento,

cenizas, sustancias extraíbles en n-hexano, resinas solubles en etanol y espectro de

absorción UV-visible. Todo lo anterior, según metodologías estipuladas en la norma

Rusa RST-RSFSR-317-77 y la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008.

A partir de los resultados obtenidos en los análisis realizados se puede concluir

que, en general, las propiedades del propóleos analizado se sitúan dentro de los

parámetros de calidad exigidos por la norma Rusa, y que cumple con todos los

parámetros de calidad exigidos por la norma Argentina, por tanto puede ser utilizado a

nivel industrial y competir en el mercado externo.

ÍNDICE

RESUMEN

SIGLAS Y SIMBOLOGÍA

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

CAPÍTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES

1.1. PROPÓLEOS

1.1.1. Definición técnica

1.1.2. Características fisicoquímicas del propóleos

1.1.3. Composición universal del propóleos

1.2. RECOLECCIÓN DEL PROPÓLEOS

1.2.1. Método técnico (uso de mallas)

1.2.2. Método artesanal (raspado)

1.2.3. Recomendaciones para la recolección de propóleos

1.2.4. Almacenamiento, conservación y transporte

1.3. USOS DEL PROPÓLEOS

1.3.1. Usos en la colmena

1.3.2. Usos del propóleos en el hombre

1.3.3. Formas de propóleos

1.4. CARACTERIZACIÓN Y CALIDAD DEL PROPÓLEOS

1.4.1. Caracterización del propóleos de acuerdo a normas

1.4.2. Calidad del propóleos

CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL

2.1. TOMA DE MUESTRA

2.1.1. Tamaño de la muestra

2.1.2. Acondicionamiento de la muestra

2.2. DETERMINACIONES ORGANOLÉPTICAS

2.2.1. Procedimiento

2.3. DETERMINACIONES FISICOQUÍMICAS

2.3.1. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Rusa

2.3.2. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Argentina

CAPÍTULO 3: RESULTADOS

3.1. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS

3.2. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS

3.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Rusa

3.2.2. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Argentina

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

ANEXO A: FOTOGRAFÍAS EXPERIMENTALES

ANEXO B: PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA

ANEXO C: DETERMINACIÓN DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS

ANEXO D: GRÁFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIÓN

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1-1. Propóleos recién cosechados

Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recolección de propóleos

Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recolección de propóleos

Figura 1-4. Raspado, para la recolección de propóleos

Figura 1-5. Extracto alcohólico de propóleos

Figura 1-6. Características organolépticas que permiten evaluar la calidad del propóleos

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propóleos

Tabla 1-2. Consideraciones clínicas asociadas al uso de los propóleos

Tabla 1-3. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Rusa

Tabla 1-4. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Argentina

Tabla 3-1. Características organolépticas del propóleos analizado

Tabla 3-2. Resultados de la determinación del porcentaje de cera

Tabla 3-3. Resultados de la determinación del porcentaje de impurezas mecánicas

Tabla 3-4. Resultados de la determinación de los compuestos fenólicos

Tabla 3-5. Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma Rusa)

Tabla 3-6. Resultados de la determinación cualitativa de los compuestos flavonoides

Tabla 3-7. Resultados de la determinación del índice de yodo

Tabla 3-8. Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Rusa

Tabla 3-9. Resultados de la pérdida por calentamiento

Tabla 3-10. Resultados de la determinación de cenizas

Tabla 3-11. Resultados de la determinación de sustancias extraíbles en n-hexano

Tabla 3-12. Resultados de la determinación de resinas solubles en etanol

Tabla 3-13. Resultados de la determinación de impurezas mecánicas

Tabla 3-14. Resultados de la determinación de compuestos fenólicos totales

Tabla 3-15. Resultados de la determinación de flavonoides totales

Tabla 3-16.Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma

Argentina)

Tabla 3-17. Resultados determinación del espectro de absorción UV-visible

Tabla 3-18.Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma

Argentina

SIGLAS Y SIMBOLOGÍA

SIGLAS

INN : Instituto Nacional de Normalización.

INTA : Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria.

NCh : Normas Chilenas.

PM : Peso Molecular.

UNSE : Universidad Nacional de Santiago del Estero, Argentina.

UV : Ultravioleta.

SIMBOLOGÍA

a : Intercepto de la recta o curva de calibrado.

b : Pendiente de la recta o curva de calibrado.

cm : Centímetro.

g : Gramo.

ºC : Grados Celsius.

h : Hora.

L : Litro.

m : Metro.

m² : Metro cuadrado.

mg : Milígramo.

ml : Mililitro.

mm : Milímetro.

min : Minuto.

N : Normalidad.

nm : Nanómetro.

ppm : Partes por millón.

r : Coeficiente de regresión.

s : Segundo.

Tº : Temperatura.

INTRODUCCIÓN

El propóleos es un producto apícola utilizado desde tiempos remotos por sus

propiedades medicinales, es una sustancia gomo-resinosa, producto del procesamiento

por parte de la abeja (Apis mellifera), de resinas vegetales de variado tipo. Las abejas

utilizan el propóleos para recubrir todas las grietas y abertura de la colmena. Además de

cumplir esta función, el propóleos evita contaminaciones debido a que posee acciones

fungicida y antibiótica. Es una sustancia de compleja composición química, ya que

contiene más de ciento sesenta compuestos activos, entre ellos, flavonoides

(principalmente quercetina), ácido benzoico y ácido cafeico y sus derivados [2,8]. Su

composición es compleja y variada por cuanto depende de la flora y de las condiciones

geográficas y climáticas donde se elabora el producto.

Actualmente existe una demanda mundial creciente de este producto apícola,

ya que es utilizado en diversas actividades y en numerosos países, que cuentan con

normas, reglamentación y aprobación oficial para su empleo a nivel industrial. Esto ha

traído como consecuencia la necesidad de su estudio, control de calidad y

caracterización en general.

En Chile, éste es un recurso natural que no ha sido explotado y aprovechado en

su plenitud, existiendo un manejo artesanal de él, además no se cuenta con normas que

permitan la caracterización y evaluación de calidad del propóleos, para poder ser

utilizado a nivel industrial; por tanto se necesita establecer parámetros que permitan

caracterizar el propóleos, además se requiere de un amplio estudio y difusión de las

diferentes propiedades y beneficios de él [5].

En el presente trabajo se realiza la caracterización organoléptica y

fisicoquímica de un propóleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta

Región de Chile, a través de análisis organolépticos y fisicoquímicos, estipulados en dos

normas internacionales (norma Rusa RST-RSFSR-317-77 y norma Argentina IRAM-

INTA-15935-1:2008), utilizadas para su caracterización.

El desarrollo de este trabajo se fundamenta en que para comercializar en el

mercado internacional el propóleos chileno es necesario caracterizarlo y cumplir con

exigencias de calidad, requeridas por los países importadores. En este sentido, la

concepción más actualizada de su caracterización y control de calidad consiste en el

desarrollo de dos etapas de análisis, para el uso de propóleos a nivel industrial, estas son:

Determinación de las características organolépticas

Determinación de las propiedades fisicoquímicas

El desarrollo de los análisis se lleva a cabo en el Laboratorio de Química de la

Universidad Técnica Federico Santa María, Sede Viña del Mar, José Miguel Carrera;

durante los meses de Noviembre y Diciembre del año 2008.

Establecer parámetros que permitan caracterizar y utilizar a nivel industrial el

propóleos, a través de la determinación de las características organolépticas y

propiedades fisicoquímicas, permitirá la elaboración de normas de calidad adecuadas a

este producto a nivel nacional, que sirvan como elementos útiles para su control,

verificación y para caracterizar el producto ofrecido, cuando él mismo sea destinado a la

exportación para poder cumplir con las exigencias del mercado internacional.

OBJETIVO GENERAL

Establecer parámetros organolépticos y fisicoquímicos que permitan

caracterizar el propóleos, a través de análisis realizados a un propóleos, empleando dos

normas internacionales utilizadas para su caracterización y control de calidad.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar las características organolépticas del propóleos, a través de lo

establecido en ambas normas.

• Verificar las propiedades y composición fisicoquímica del propóleos a través de

análisis estipulados en ambas normas.

• Analizar estadísticamente los resultados obtenidos.

• Detectar la norma que permite una mejor caracterización del propóleos.

CAPÍTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES

1. ANTECEDENTES GENERALES

1.1. PROPÓLEOS

Definición de acuerdo a la Real Academia Española: Sustancia cérea con que

las abejas bañan la colmena o vasos antes de empezar a obrar.

1.1.1. Definición técnica

Mezcla compleja de origen biológico elaborado a partir de resinas, bálsamos,

gomas y otras exudaciones de algunas especies vegetales (pino, abeto, sauce, abedul,

varias especies de álamo, fresno, roble, etc.), que la abeja Apis mellifera recoge y

modifica, adicionándoles cera, polen y enzimas entre otros materiales, con el propósito

de proteger la colmena de las adversidades del medio, asegurando estabilidad térmica y

protección contra problemas microbiológicos [2 ,5 ,8].

Fuente: Bracho, 2008

Figura 1-1. Propóleos recién cosechados

También se entiende por propóleos el producto compuesto de sustancias

resinosas, gomosas y balsámicas, ceras, aceites esenciales y polen, de consistencia

viscosa, elaborado por las abejas (Apis mellifera), a partir de ciertas especies vegetales,

que son transportadas al interior de la colmena y modificadas parcialmente con sus

secreciones salivares [8].

Esta sustancia, elaborada por las abejas, es conocida por el hombre desde

tiempos remotos. La utilizaban los sacerdotes egipcios y más tarde, los griegos, quienes

lo denominaron propóleos. El término ‘propóleos’ proviene del griego propolis pro: que

significa delante de, y polis, que quiere decir ciudad [2]. Por su consistencia y

estructura, los propóleos pueden clasificarse en dos grupos: los de naturaleza fluida y

los balsámicos-oleorresinosos. Los primeros presentan una fracción importante de

agentes volátiles, mientras que en los balsámicos predomina la consistencia densa, con

bajo contenido de compuestos volátiles, susceptibles de polimerización y que con

frecuencia se percibe el aroma de las plantas en forma concentrada; en general son

sustancias viscosas, semisólidas y cauchosas [11].

1.1.2. Características fisicoquímicas del propóleos

Su color puede variar desde amarrillo verdoso, verde oscuro a marrón oscuro,

puede ser de color verde, pardo, castaño o rojizo, e incluso puede ser casi negro,

dependiendo de su origen botánico [8], algunos son firmes, mientras que otros son

gomosos y elásticos. El aroma puede ser placentero a yemas de álamo, miel, ceras y

vainilla o se puede relacionar con la flora nativa del sector, en algunos casos el

propóleos suele ser amargo, picante y hasta astringente [3, 8, 11].

El propóleos es soluble en alcohol etílico y en solventes como el éter, bencina

y acetona entre otros; pero a excepción del alcohol etílico, estas sustancias son tóxicas y

no deben utilizarse para la elaboración de extractos de propóleos.

El propóleos presenta una consistencia variable, dependiendo de su origen [8],

de las condiciones geográficas y climáticas donde se elabora el producto. Hasta los

15°C es duro y se torna más maleable a medida que aumenta la temperatura. Su punto

de fusión varía entre 60 a 70°C, llegando en algunos casos hasta 100°C [12]. Cuando se

calienta el propóleos lentamente a baño maría se separa en dos partes; una gruesa se

deposita en el fondo y la otra sobrenadante en la superficie (cera de propóleos) [4].

1.1.3. Composición universal del propóleos

Su composición química es bastante compleja. La composición del propóleos

varía dependiendo de las fuentes vegetales de origen y de su función específica dentro

de la colmena [8]. Básicamente se compone de un 50-55% de resinas y bálsamos, 30-

40% de cera de abeja, 5-10% de aceites esenciales o volátiles, 5% de polen y 5% de

materiales diversos (orgánicos y minerales) [2].

En líneas generales, en todos los propóleos se encontraran:

Resinas y bálsamos aromáticos 50-55 %

Cera 7,5-35 %

Aceites volátiles 10 %

Polen 4 - 5 %

Sustancias orgánicas y minerales 5 %

1.1.3.1. Compuestos identificados en propóleos

Se han identificado más de ciento sesenta compuestos, de los cuales un 50%

son compuestos fenólicos, a los cuales se les atribuye la acción farmacológica. En

términos de acción farmacológica, los principales constituyentes del propóleos son los

compuestos fenólicos. Estos se caracterizan por la presencia de al menos un grupo

oxhidrilo unido directamente a un anillo aromático [8].Los principales compuestos

fenólicos identificados son:

• Aldehídos aromáticos (vainillina e isovainillina).

• Cumarinas, esculetol, escopoletol.

• Ácidos aromáticos y sus ésteres.

• Triglicéridos fenólicos.

• Flavonoides.

En la naturaleza se pueden encontrar diversos tipos de compuestos fenólicos,

entre los que se pueden citar, los ácidos fenólicos (benzoico, cafeico, ferúlico y

cinámico) y los flavonoides. Algunos compuestos fenólicos de origen vegetal resultan

familiares, al menos por su acción organoléptica; por ejemplo, la vainillina, el anetol y el

eugenol [8].

1.1.3.2. Flavonoides identificados en propóleos

Los flavonoides son compuestos químicos de origen botánico con una marcada

actividad biológica y han sido usados como indicadores de la calidad del propóleos. Los

propóleos están constituidos fundamentalmente por flavonoides, derivados de esteres y

ácidos fenólicos. Walker y Crane en 1987 reportaron la presencia de 38 flavonas, 12

derivados del ácido benzoico, 14 derivados del alcohol cinamílico y el ácido cinámico,

12 componentes entre alcoholes, cetonas y fenoles, 7 terpenos, 11 esteroides, 7 azúcares

y 2 aminoácidos. Los flavonoides son constituyentes principales de resinas y bálsamos

[11]. Los flavonoides absorben radiación electromagnética en la zona UV - VIS y de

esta forma representan una protección natural para las plantas contra la radiación UV

del sol. Esto explica el efecto protector sobre la piel de ciertos preparados en base a

propóleos. Por otra parte presentan una barrera química de defensa contra

microorganismos (hongos, bacterias y virus) [8].

Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propóleos

Flavonas Flavonoles Flavononas Flavononoles

Acacetina Galangina Pinostrobina Pinobanksina

Crisina Amarilla Izalqinina Sakuranetina.

Pectolinarigenina Kampferol

Tectocrisina Quercetina

Apigenina Ramnocitrina

Fuente: Caneo (2006)

Los flavonoides, desde el punto de vista estructural, corresponden a un sistema

de tres anillos fusionados en una secuencia de carbonos que presenta un heterociclo

central en una estructura C6C3C6, que ha sido discutida ampliamente por su estabilidad y

reactividad. Estos compuestos suelen presentar a lo menos tres hidroxilos fenólicos,

condición que facilita su clasificación y reactividad frente al tricloruro de aluminio y

2,4-Dinitrofenilhidracina (2,4D) [11].

1.1.3.3. Otras sustancias identificadas en propóleos

Además de una gran cantidad de compuestos fenólicos, se han identificado en

el propóleos otros compuestos:

• Alcoholes

• Ácidos alifáticos y ésteres

• Aminoácidos

• Chalconas y Dihidrochalconas

• Flavononas

• Flavonas y Flavonoles

• Hidrocarburos, ésteres y éteres

• Ácidos grasos

• Cetonas

• Terpenos

• Esteroides

• Azúcares

• Minerales

• Vitaminas

Ácidos aromáticos: cafeico, ferúlico, cinámico, cumárico, gálico y salicílico.

Ácidos grasos: palmítico, oleico, esteárico, linoleico, linolénico, araquidónico, cerótico

y mirístico.

Terpenos: cimeno, cineol, limoneno, bisabolol, xantorreol y alfa-acetoxibetulenol.

Minerales: aluminio, plata, bario, boro, cromo, cobalto, cobre, estaño, hierro, magnesio,

manganeso, molibdeno, níquel, plomo, selenio, silicio, estroncio, titanio, vanadio y zinc.

Vitaminas: Pro-vitamina A, vitamina B1, B2, y B3.

1.2. RECOLECCIÓN DEL PROPÓLEOS

La recolección del propóleos de la colmena ha sido realizada casi siempre por

simple raspado, con una espátula de acero inoxidable, de las paredes interiores de la

colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propóleos, este es un

método bastante engorroso. En el mercado existen rejillas para la recolección de

propóleos que se colocan debajo de la tapa y que consisten en una lámina plástica con

ranuras que las abejas se apresuran a rellenar con propóleos, lo que permite su fácil

retirada y recolección. Posteriormente se congelan y una simple presión sobre las

mismas permitirá que los propóleos se desprendan de las ranuras [12].Los métodos más

utilizados para la recolección del propóleos de la colmena son: el método técnico (uso de

mallas y el método artesanal (raspado).

1.2.1. Método técnico (uso de mallas)

Se ha experimentado con éxito el empleo de mallas o rejilla plástica con

agujeros de aproximadamente 1,5 - 3,0mm., como las mallas matrizadas y mosquiteras.

Mallas matrizadas: placas de material plástico (41 x 25cm y aprox. 0,4 cm de espesor),

en las cuales se encuentran estampadas la ranuras donde se depositará el propóleos.

Mallas mosquiteras: tejidos de hilos plásticos de 55 x 45cm, que se termosella en los

bordes antes de utilizar; es recomendables que sean blancas o de colores claros,

evitando el color negro (hasta no demostrar que este color sea contaminante). No se

utilizan mallas metálicas porque contaminan el propóleos y las de fibra de vidrio

tienden a romperse con el manipuleo.

Fuente: Salamanca (2000)

Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recolección de propóleos


Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recolección de propóleos

El método consiste en cortar secciones de la malla del tamaño de la superficie

de la colmena y colocarlos sobre los marcos de la última alza de la colmena [12].Es útil

colocar estas últimas en forma simétrica sobre el ancho del alza y luego de algunas

semanas moverlas hacia el otro extremo, de tal modo de incentivar a las obreras a que se

enfrenten a los nuevos espacios vacíos, lo cual permitirá obtener una mayor recolección.

Cualquiera de estas mallas que se vaya a utilizar es conveniente instalarlas en primavera

y otoño, pudiendo ser retiradas en cualquier época del año, previo congelado en un

freezer.

Posteriormente, se congelan entre -10° y -20°C, para desprender fácilmente el

propóleos, durante por lo menos una hora, lo que torna a la resina rígida y frágil, fácil

de separar de la malla mediante "manipuleo". El congelado generalmente se realiza

durante 1 ó 2 horas [7].

1.2.2. Método artesanal (raspado)

Consiste en raspar con una espátula de acero inoxidable las paredes interiores

de la colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propóleos. Para un

adecuado raspado, hay retirar las alzas y cuadros al preparar las colmenas para la

invernada, ya que se aprovecha este momento para confinar la colonia al menor espacio

posible y el material excedente será transportado al taller del apicultor. Además en esa

época la temperatura baja facilita la separación del propóleos de la madera y el estado

rígido de la resina limita la posible contaminación con trozos de madera, abejas y otros

contaminantes macroscópicos.

No todas las variedades de abejas propolizan con la misma intensidad, una

misma colmena propolizará diferentes cantidades en distintas épocas y aún puede haber

diferencias en las cantidades producidas en cada año, pues las abejas trabajan según sus

necesidades y posibilidades [4]. La apariencia externa de los propóleos puede variar de

una extracción a otra, vale indicar que los propóleos sólo pueden retirarse de las

colmenas cuando se cosechen por medio de raspado dos veces al año, ésto por razones

de protección de la misma colmena [12].


Figura 1-4. Raspado, para la recolección de propóleos

1.2.3. Recomendaciones para la recolección de propóleos

Utilizar una espátula de acero inoxidable, sin mucho filo para reducir el riesgo

de arrastrar virutas de madera, para la recolección de propóleos por raspado.

Cuidar de no raspar donde haya pintura sobre la madera, pues ésta es uno de los

mayores responsables de la contaminación del propóleos y es fácilmente

detectable.

Realizar el raspado del propóleos que se encuentra en las superficies interiores

de la colmena: tapa, cuadros y cajas, desechando el que se encuentra en el

fondo, pues generalmente está muy contaminado.

La recolección se debe realizar con las manos y espátula libres de restos de

miel, tierra o cualquier otra sustancia que pueda contaminarlo.

Durante la cosecha, el propóleos no debe exponerse a la incidencia directa de

los rayos solares, evitándose su almacenamiento cerca de fuentes de calor.

No debe mezclarse con la cera que se encuentra en la tapa, entre los marcos y

sobre ellos. Siempre debe tratar de evitarse que el propóleos se compacte. Para

lograrlo, el propóleos recolectado no se debe comprimir con las manos para

formar pelotas, por el contrario, se debe mantener en formas de escamas y/o

trozos sueltos.

En ningún caso se deberá recolectar el propóleos a partir de chapas o

superficies metálicas, el carácter ácido del producto por lo general ha permitido

la reacción de dicha superficie induciendo concentraciones indeseables.

Durante el trabajo con las abejas no se deben usar tratamientos químicos,

porque estas sustancias químicas pueden contaminar el propóleos. Si se utilizan

tratamientos químicos para controlar la varroa es imperativo sacar el propóleos

antes de aplicar cualquier tratamiento.

La cosecha del propóleos puede variar entre 100g y 400g por colmena al año,

dependiendo de una serie de factores como el método utilizado para la recolección del

propóleos [12]. Con el método de mallas pueden alcanzarse hasta los 500g, mejorando la

calidad, sin incrementar demasiado los costos de producción [7].

1.2.4. Almacenamiento, conservación y transporte

El primer paso luego de obtenido el propóleos, es la limpieza del mismo con

una pinza, cuidando de retirar contaminantes macroscópicos como abejas, trozos de

madera, pasto, etc. Se debe cuidar de retirar aquellos trozos de propóleos que puedan

venir con pintura adherida, ya que ésta es una de las principales fuentes de

contaminación.

Una vez recolectados, deben almacenarse en frascos de vidrio o de preferencia

en bolsas de polietileno, se sugiere no embalar más de un kilogramo para

facilitar su análisis posterior.

Es apropiado conservarlo en frascos de vidrio de color ámbar, que lo proteja de

las altas temperaturas y en especial de la luz.

Su temperatura de conservación idónea es 15°C, a más de 20°C comienza a

desactivarse y permite la reproducción de algunos parásitos.

Si el propóleos recolectado se va a almacenar por largo tiempo, se debe

conservar sometiéndolo a temperaturas que oscilen entre –10° y –20°C durante

48 horas.

1.3. USOS DEL PROPÓLEOS

1.3.1. Usos en la colmena

El propóleos en la colmena cumple diversas funciones que son difíciles de

priorizar, generalmente las abejas lo utilizan para:

Barnizar el interior de la colmena (incluidos los panales) con fines

desinfectantes.

Cerrar grietas, reducir vías de accesos y consolidar los componentes

estructurales, para evitar las corrientes de aire o el frío.

Reducir al mínimo las vías de acceso (piqueras) o crear obstáculos que impidan

la entrada de enemigos, tales como, mariposas y otros insectos

Evitar las vibraciones de los panales cuando las colmenas están situadas sobre

árboles, que mueven sus copas por el viento.

Recubrir los cadáveres de los enemigos que se hayan introducido en la colmena

(escarabajos, roedores, lagartijas, etc.), que quedan embalsamados evitando su

descomposición. Esta propiedad del propóleos ya era conocida por los egipcios

los sacerdotes lo utilizaban para momificar los muertos [2,8].

De todas las variantes en que lo emplean es seguramente la de barnizar toda la

colmena, la más importante; constituye un modo de escudo protector de los moradores

contra una amplia gama de microorganismos, que ayudados por el calor y la humedad

procedente de la colmena, vivirían sobre las paredes perjudicándolos, para este fin es

amasado con las mandíbulas y va siendo colocado con gran perseverancia hasta que

toda la madera esté cubierta [12].

1.3.2. Usos del propóleos en el hombre

La utilización del propóleos en diversos ámbitos, radica en sus propiedades

antimicrobianas, bacteriostáticas y bactericidas, proporcionadas por los ácidos

oxibenzoico, metoxibenzoico, cafeico, ferulico, etc. Por su parte, los flavonoides (con

más de cuarenta acciones farmacológicas) son la base de su versatilidad terapéutica. Sus

cualidades antioxidantes (además de reducir el efecto de los radicales libres) son

responsables de la acción antiviral, al inhibir el desarrollo de virus patógenos. Además

de su amplio efecto antibacteriano, el propóleos estimula la reacción inmunológica del

organismo, complementando ambas funciones sin producir alteraciones de la flora

bacteriana, cosa que ocurre con los antibióticos de síntesis. También se lo emplea con

buenos resultados en el tratamiento de amigdalitis y faringitis. Los profesionales que

emplean su voz son grandes consumidores de miel con propóleos y caramelos o jarabe

de propóleos. Además, este producto natural brinda resultados ventajosos en infecciones

respiratorias altas, cuando se los administra en forma de colutorios o inhalaciones, sólo o

asociado a antibióticos [8].

Dentro de las principales actividades en las que se utiliza el propóleos,

destacan:

La medicina humana y veterinaria.

La agricultura.

La apicultura.

La industria de alimentos.

La cosmetología.

La farmacología.

La odontología.

Se han encontrado resultados positivos al usar propóleos en el tratamiento de

procesos tales como:

Gripe.

Sinusitis.

Otitis.

Laringitis.

Bronquitis.

Asma bronquial.

Neumonía crónica.

Tuberculosis pulmonar.

En farmacología, se utiliza para la preparación de productos farmacéuticos,

como remedios, gracias a su gran cantidad de propiedades; en la industria alimenticia,

para la conservación de alimentos; en cosmetología, para la fabricación de una gran

cantidad de productos, como cremas; en odontología, incrementa la salud bucal por sus

principios antisépticos, antibióticos y antiinflamatorios; se utiliza para el tratamiento de

abcesos, caries, aftas, gingivitis e higiene bucal. Además estimula la generación de la

dentina (esmalte dental) e impide la formación de caries y placa bacteriana.

La farmacopea actual menciona su uso como hipocolesterolemiante o reductor

de la tasa de colesterol en sangre por el hecho de disminuir la absorción de las grasas a

nivel intestinal. La acción antimicrobiana del propóleos está reconocida mundialmente y

así lo avalan los numerosos trabajos realizados en este campo en Europa, en los cuales se

informa que sus extractos poseen acción antibacteriana, antiviral y antimicótica.

Su utilización se ha mantenido durante siglos hasta nuestros días, en que se

están realizando investigaciones científicas sobre el empleo de preparados a base de

propóleos en los campos de la biología, la medicina humana y la medicina veterinaria.

Tabla 1-2. Consideraciones clínicas asociadas al uso de los propóleos

Casos Actividad

Alergología

Asma bronquial; inmunodepresiones con manifestaciones

alérgicas; dermatitis alérgica; neurodermatitis;

rinofaringitislaringitis alérgicas

Angiología Úlcera en las extremidades inferiores de causa vascular

Colonproctología Hemorroides; fístulas anales y perianales; colitis ulcerativa

Dermatología

Acné; dermatitis seborreica; psoriasis; verrugas vulgares;

verrugas plantares; condilonas; epiteliomas; pitiriasis;

micosis; vitiligo.

Endocrinología Hipercolesterolemias; hipertriglicerclemias

Gastroenterología Parositósis, especialmente Giardiasi; úlceras pépticas;

gastritis

Geriatría Úlceras decúbito

Inmunología Inmunodepresiones

Oftalmología Conjuntivitis virales, bacterianas y alérgicas

Otorrinolaringologí

a

Rinitis bacteriana, viral y alérgica; faringitis y laringitis;

postoperatorio de extirpación de pólipos nasales; hemostático

en amigdolectomía.

Otros

Artritis reumatoidea, osteomielitis, micosis vaginal;

parasitosis; paiplomatosis, heridas sépticas de difícil

cicatrización. Lupus eritematoso, estrés; neurosis; demencia

senil


1.3.2.1. Propiedades biológicas y terapéuticas [8]

A partir de la década del sesenta se efectúan las primeras investigaciones

científicas que develan la compleja estructura del propóleos y ponen de manifiesto

numerosas aplicaciones farmacológicas. Científicos de diferentes disciplinas

profundizaron en su estudio, por lo que hoy se tiene respuesta a muchos interrogantes

acerca de los mecanismos de acción que explican sus propiedades antimicrobianas,

cicatrizantes, estimulantes del sistema inmunológico y antioxidantes. Su notable

capacidad cicatrizante, desinfectante y antiinflamatoria lo hace indicado para heridas,

quemaduras y afecciones de la piel. La compleja composición le confiere al propóleos

capacidad:

Antibacteriana.

Antifúngica.

Antiviral.

Cicatrizante.

Antiinflamatoria.

Bioestimulante y regenerante.

Antioxidante.

Capacidad antibacteriana: Fue una de las primeras propiedades constatadas. Múltiples

estudios bacteriológicos in vitro confirmaron su acción bacteriostática y bactericida. Los

principales responsables de esta propiedad son los flavonoides galangina y

pinocembrina, y los derivados del ácido benzoico, ferúlico y cafeico. Itoh y

colaboradores del Instituto de Investigación Zenyaku Kogyo Co evaluaron la capacidad

antimicrobiana de diferentes tipos de propóleos ante el Helicobacter pylori. Hay gran

cantidad de evidencias que permiten atribuir a esta bacteria la génesis de la gastritis, la

úlcera gastroduodenal e incluso el cáncer gástrico. Una muestra de origen argentino

demostró poseer la mayor capacidad antibacteriana ante esta bacteria, siendo los

principales responsables los flavonoides pinocembrina, en primer lugar, y luego la

galangina y la crisina. Los tratamientos actuales consisten en la utilización de uno o más

antibióticos, costosos, de eficacia dudosa, y que no están exentos de efectos secundarios.

Un estudio realizado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de

Oxford, publicado en Microbiologie Research, informa que el ácido cinámico y algunos

flavonoides desactivan la energía de la membrana citoplasmática, inhibiendo la

motilidad bacteriana, haciéndola más vulnerable al ataque del sistema inmunitario y

potenciando los antibióticos.

Capacidad antiviral: En Francia, los Dres. Amoros y Sauvager, de la Facultad de

Medicina de Rennes, confirmaron la acción virulicida frente a los tipos uno y dos del

herpes, pero también ante poliovirus. Establecieron que el propóleos reduce la síntesis

del ADN viral y que los responsables son los flavonoides, que actúan en sinergismo con

un éster del ácido cafeico y el ácido ferúlico. Otro tipo de patología viral que responde

favorablemente al propóleos es el Herpes Zoster (culebrilla), patología con expresión

cutánea, dolorosa, de pobre respuesta a los tratamientos convencionales. Tratado

precozmente en el período eruptivo, la remisión se acorta y se evita la neuralgia

postherpética. Otro virus como el VIH también ha llamado la atención. Un grupo de

investigadores del Albert Einstein College of Medicine de Nueva York publicó, en 1997,

un trabajo en el que explican cómo determinaron la capacidad del propóleos de suprimir

la replicación del VIH-1 y su efecto inmunoestimulante.

Capacidad cicatrizante y antiinflamatoria: El propóleos ganó espacios importantes en

el tratamiento de heridas por su capacidad antibacteriana, y por su notable capacidad

cicatrizante y antiinflamatoria. Estas últimas son comparables a la capacidad de

antiinflamatorios de síntesis como el diclofenac. Se señaló al ácido cafeico como

responsable de inhibir la dihidrofolato reductasa, porque reduce la producción de

interleuquinas y prostaglandinas. En 1996 se publicó un trabajo elaborado en el

Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford, en el cual los autores

atribuyen esta acción del propóleos a un éster del ácido cafeico (CAPE), al ácido cafeico

y a la quercetina. Actuando a nivel de los macrófagos, suprime la producción de

prostaglandinas y leucotrienos. Empleando modelos "in vivo" e "in vitro" constataron

que el propóleos suprime la vía de la lipooxigenasa del ácido araquidónico.

Capacidad inmunomoduladora: Diversos trabajos demuestran que el propóleos

estimula la inmunidad inespecífica y la inmunidad específica; y tanto la inmunidad

celular (mediada por los linfocitos T) como la humoral (mediada por los linfocitos B).

En ratones infectados con el virus influenza tipo A y tratados con propóleos, se constató

un aumento de los linfocitos T, un mayor nivel de fagocitosis y una menor mortalidad,

en comparación con animales testigo no tratados. Los autores determinaron que se

estimula la liberación del factor inhibidor de la migración de los leucocitos.

Capacidad antioxidante: En los últimos años ha ganado importancia el consumo de

antioxidantes, en especial los de origen natural, para la prevención de enfermedades de

gran trascendencia como la arterioesclerosis, el reuma e incluso el cáncer. Los

antioxidantes, como la vitamina E (alfa tocoferol), impiden la oxidación lipídica (por

transformación del colesterol LDL en colesterol HDL), reduciendo el riesgo de

enfermedades cardiovasculares, y además neutralizan los radicales libres, que son los

responsables del envejecimiento celular. El propóleos posee una potente capacidad

antioxidante.

El propóleos ha ganado espacios importantes en el tratamiento de heridas, por

su capacidad antibacteriana y por su notable capacidad cicatrizante y antiinflamatoria.

Posee una potente capacidad antioxidante, que le permite adquirir insospechables

perspectivas de desarrollo [2].

Para mantener sus propiedades requiere que se lo preserve de la luz y de las

altas temperatura, dada las delicadas características biológicas de sus componentes. A

pesar de que la temperatura de la colmena es de 34-35°C, extremadamente favorable

para la reproducción de microorganismos, el propóleos permite que permanezca estéril.

1.3.3. Formas de propóleos

Las principales formas de encontrar este producto apícola en el mercado son:

Propóleos en bruto: es el obtenido directamente de la colmena, sin purificar.

Productos con agregados de propóleos: spray de propóleos, caramelos, miel con

propóleos y tintura de propóleos.

Extracto de propóleos: es el producto semielaborado, que se obtiene procesando el

propóleos en bruto con alcohol etílico, de manera de extraer los componentes

biológicamente activos. A partir del extracto obtenido se pueden desarrollar una gran

variedad de productos, como tinturas y cremas [2].

Fuente: López del Villar y Ubillús Celi (2004)

Figura 1-5. Extracto alcohólico de propóleos

En la actualidad, existe en el mercado farmacéutico internacional una infinita

gama de productos que usan el propóleos y cada vez adquiere más importancia en las

farmacopeas y cosmética moderna debido a sus valiosas propiedades terapéuticas [7]. Se

le puede encontrar en tres formas de presentación:

Sólida: en pasta para masticar, granulado o en polvo.

Semisólida: pomadas y ungüentos.

Líquida: solución alcohólica o acuosa.

1.4. CARACTERIZACIÓN Y CALIDAD DEL PROPÓLEOS

1.4.1. Caracterización del propóleos de acuerdo a normas

Los estándares oficiales de calidad, utilizados para su caracterización y la

evaluación de su calidad, existen para el propóleos en varios países del este europeo y

en otros lugares del mundo, la mayoría de estándares se refieren al producto en bruto y a

veces, a sus extractos. Los límites máximos y mínimos para ciertos compuestos

químicos están determinados, pero son pocas las pruebas estandarizadas que están

disponibles para determinar la actividad biológica de varios componentes.

En algunos países existen normas que permiten caracterizar y avaluar la

calidad del propóleos:

• Norma Rusa RST-RSFSR-317-77.

• Norma Húngara MSZ 08/0184-79.

• Norma Ramal Búlgara ON 25 72 483-84.

• Norma Ramal Cubana NRAG 1135-94.

• Reglamentación del Ministerio de Agricultura de Brasil: Reglamento técnico

para fijar la identidad y calidad de propóleos. 1999.

• Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008.

En Brasil, la Instrucción Normativa Nº 3/01, establece las inspecciones físico-

químicas y metodología de análisis para el propóleos en bruto y su extracto, en Bélgica

y Grecia poseen normativa para productos apícolas que incluyen el propóleos [8].

Cada región presenta condiciones de flora diversa, dependiente de fenómenos

locales, influenciados por la temperatura, las precipitaciones, el tipo de suelo, la

humedad relativa, brillo solar y la evapotranspiración. En este sentido es indispensable

considerar la similitud en algunos componentes básicos de algunos vegetales, cuyas

características particulares vendrán dadas por las diversas combinaciones de los

elementos que las constituyen. Esto se comprenderá mejor al analizar la relación entre

la composición química de los propóleos y sus propiedades medicinales. Los

componentes identificados en muestras de propóleos analizados permiten establecer

relaciones directas con las propiedades medicinales que se le han atribuido [12].

Los compuestos identificados en propóleos de colmenas ubicadas en

emplazamientos cercanos entre sí no difieren significativamente, aunque desde el punto

de vista cuantitativo pueden ser variables. Ello implica que los propóleos deban ser

estudiados y caracterizados en función de la zona geográfica de ubicación de las

colmenas, para determinar sus propiedades, compuesto químicos presentes y

características físicas y organolépticas.

Para caracterizar el propóleos hay que determinar: el porcentaje de cera , las

impurezas mecánicas, los compuestos fenólicos, el índice de oxidación, flavonoides

totales, el índice de yodo, la humedad, la cenizas, las resinas, el aspecto externo, color,

sabor, estructura, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles.

La caracterización de este producto de la colmena es fundamental para la

diferenciación del producto y conlleva una mejor ubicación a nivel comercial.

1.4.1.1. Norma Rusa RST-RSFSR-317-77

Esta norma establece los requisitos técnicos, organolépticos y fisicoquímicos

que deben cumplir el propóleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo

de productos relacionados.

Requisitos técnicos según la norma

a. El propóleos debe corresponder con las exigencias de la presente norma.

b. Los índices organolépticos y fisicoquímicos deben corresponder con las

exigencias señaladas (ver tabla 1-3).

c. No se permite el calentamiento del propóleos en su procesamiento primario.

Tabla 1-3. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Rusa

DENOMINACIÓN DE LOS INDICES VALORES ACEPTADOS

Aspecto externo Pelotas granos o briquetas

Color Verde oscuro, pardo o gris con matices

verde, amarillo, Castaño oscuro o rojo

Olor Característico, resinoso, aromático ( la

mezcla de olores de la miel ) de las hierbas

aromáticas, del pino y del álamo

Sabor Amargo, algo fuerte

Estructura Espesa. Con deformaciones

Heterogéneas

Cera No más del 30 %

Índice de oxidación No mayor de 22 s

Reacción cualitativa ante los compuestos flavonoides Positiva

Impureza mecánica No más del 20 %


Compuestos fenólicos No menos de 30 %

Índice de yodo No menor de 35 %

Fuente: Norma Rusa RST-RSFSR-317-77

1.4.1.2. Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008

Esta norma establecen los requisitos organolépticos y fisicoquímicos que deben

cumplir el propóleos en bruto, para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de

productos relacionados. Esta norma se aplica al propóleos en bruto, a granel y

fraccionado.

Requisitos técnicos según norma

a. Los índices organolépticos y fisicoquímicos deben corresponder con las

exigencias señaladas (ver tabla 1-4).

b. El propóleos en bruto no debe contener sustancias extrañas a sus procesos de

producción y elaboración.

c. No se admite el agregado de aditivos.

d. Los materiales de los utensilios que se utilicen para la recolección del

propóleos en bruto (por ejemplo, espátulas, mallas y trampas) deben ser

bromatológicamente aptos.

e. Debe ser envasado en envases de material bromatológicamente apto,

almacenados en un sitio fresco y oscuro. El envase debe ser tal que le

confiera al producto una protección adecuada respecto de la humedad, la luz

y la temperatura excesiva.

Tabla 1-4. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Argentina


Aspecto externo Homogéneo o heterogéneo, de

Preferencia en trozos no comprimidos.

Color Amarillo, pardo, verdoso, marrón, rojizo,

negro y otros similares, variando conforme

a su origen botánico y/o geográfico

Olor Resinoso o balsámico, según su origen

botánico y/o geográfico.

Sabor Variable, de suave y balsámico a

fuerte y picante, según su origen

botánico y/o geográfico.

Consistencia a T° ambiente Maleable o rígido, según su

origen botánico y/o geográfico.

Pérdida por calentamiento Máximo 10%

Cenizas Máximo 5%


Sustancias extraíbles en n-hexano Máximo 35%

Índice de oxidación Máximo 22 s

Impurezas mecánicas Máximo 25%

Compuestos fenólicos Mínimo 5%

Resinas solubles en etanol Mínimo 35%

Flavonoides Mínimo 1,0%

Espectrograma UV-VIS Máximo de absorción entre 270 y 315 nm.

Fuente: Norma Argentina IRAM-INTA N°15935-1:2008

1.4.2. Calidad del propóleos

La calidad de los propóleos está directamente relacionada con los métodos de

recolección, almacenamiento y conservación [6].Si bien la calidad del propóleos

depende del tipo de flora y del ambiente; es decisivo en este sentido el trabajo del

apicultor. La calidad del producto resultante estará directamente relacionada con:

Almacenamiento y conservación.

Lugar de procedencia.

Flora predominante en la zona.

Zona de la colmena desde donde se extrajo.

Método de recolección utilizado.

La calidad de propóleos va a estar básicamente determinada por la cantidad de

principios activos que puedan extraerse de ellos, si el propóleos se conserva por más de

un año, su actividad biológica comienza a decrecer.

Una forma simple de determinar la calidad de una muestra, consiste en oprimir

una pequeña parte entre los dedos índice y pulgar, si sentimos consistencia terrosa la

muestra es de poca calidad por la presencia de un exceso de mezclas mecánicas, si es

demasiado maleable tendrá una cantidad excesiva de cera por lo tanto su calidad será

también inferior. Para que las propiedades del propóleos recogido no se pierdan o

alteren, es recomendable acopiarlo en frascos de vidrio color ámbar, hasta que se

entregue para su utilización. Se debe tener la precaución de no almacenar grandes

volúmenes, para evitar que se compacte desmereciendo significativamente la calidad del

propóleos.

Es muy difícil establecer lineamientos para el propóleos, ya que presenta

diferentes colores, olores y composición. La mayoría de propóleos fresco tiene un olor

resinoso agradable. Deberá tener el menor contenido de cera posible y estar libre de

residuos contaminantes que se puedan ver a simple vista.

Las múltiples y variadas propiedades del propóleos, dependen de sus

componentes, y justifican la necesidad de una correcta evaluación de su calidad, y si

bien distintos países disponen de parámetros oficiales para dicha evaluación, son escasos

los ensayos de que se disponen para medir su actividad biológica [5]. Para que la calidad

de un propóleos se considere buena debe cumplir los siguientes requisitos:

a. Estar libre de contaminantes tóxicos.

b. Contener bajos porcentajes de cera, materia insoluble y cenizas.

c. Definir su procedencia botánica para determinar el tipo de compuestos

activos.

d. Tener contenidos elevados de principios activos.

Para evaluar la calidad del propóleos además de la inspección visual y de sus

características físicas y organolépticas (aspecto, consistencia, sabor, color y olor), que

proporcionan una apreciación subjetiva del producto y cierta relación con su calidad

real, se deben determinar los contenidos de principios activos que permiten una

evaluación real y objetiva [5]. Por tanto es necesario determinar los contenidos de:

fenoles, flavonoides, cera, cenizas, entre otros.

Fuente: Farré, Frasquet y Sánchez (2004)

Figura 1-6. Características organolépticas que permiten evaluar la calidad del propóleos

Un análisis primario de cualquier muestra de propóleos permitirá determinar en

líneas generales la presencia cera, que siempre estará íntimamente mezclada a los

mismos, en proporciones relativamente altas (20-30%). Las muestras obtenidas por

raspado de cuadros presentan mayores cantidades; resinas y bálsamos aromáticos (40-

50%), aceites esenciales (5-10%), polen (4-5%) y mezclas mecánicas (10-30%), que se

encuentran en los propóleos empleados con fines constructivos, donde al parecer han

sido acondicionados para aumentar su consistencia [12]. La cera y las mezclas

mecánicas constituyen casi siempre entre el 40 al 50% de la masa total, no habiéndose

podido demostrar su actividad terapéutica; se debe señalar que los microelementos

detectados se encuentran en su mayor parte en las mezclas mecánicas, siendo

precisamente el resto lo que corresponde a la parte biológicamente activa, la calidad de

los propóleos estará determinada por su presencia y será inversamente proporcional a las

cantidades de materias insolubles.

CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. TOMA DE MUESTRA

Se toma una muestra de propóleos a través del método de raspado del apiario

seleccionado, de distintas colmenas que conforman el apiario, previa enumeración de

las colmenas y selección de algunas de ellas de forma aleatoria a través de la NCh

(norma chilena) oficial 43.Of61, selección de muestras al azar, INN-Chile; para formar

un muestra compuesta (no menor de 200g) representativa del apiario, que se denominó:

MP- A. Recolectada en el mes de Noviembre del año 2008 (ver anexo A), a la muestra

se le consignan los siguientes datos, tabulados en una ficha entregada previamente:

• Ubicación del apiario: localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta Región de

Chile.

• Tamaño del apiario: 300m2.

• Identificación del apicultor: Fredy Valdés Álvarez.

• Método de recolección: raspado.

• Época de cosecha: primavera.

• Cantidad de colmenas: 126.

• Cantidad de colmenas seleccionadas para la toma de muestra: 20.

2.1.1. Tamaño de la muestra

Se determina el tamaño de la muestra a través de un plan de muestreo simple,

utilizando un nivel de inspección “normal” para usos generales, considerando las

colmenas como lotes y seleccionando las colmenas a través de la tabla de números al

azar:

Tamaño del lote (N) = 126.

Letra-código del tamaño de la muestra: F.

Tamaño de la muestra(n): 20.

Punto de partida (fila, columna): 15,11.

Colmenas seleccionadas: 1,17,19,21,23,29,40,42,53,55,67,71,76,77,104,110,119,120,

122,124.

2.1.2. Acondicionamiento de la muestra

Antes de iniciar las determinaciones en el laboratorio, hay que acondicionar la muestra

eliminando las impurezas visibles que acompañan al propóleos, tales como virutas de

madera, partes de abejas, restos de pintura, restos vegetales, etc.

La muestra de propóleos en bruto se mantiene refrigerada para su conservación

adecuada; a bajas temperatura el propóleos se vuelve rígido, lo cual favorece su

molienda. Una vez congelado, debido a su consistencia y en algunos casos a su

heterogeneidad, la muestra de propóleos en bruto se fracciona mecánicamente en tres

trozos, un trozo se utiliza para realizar las determinaciones organolépticas, el otro para

realizar las determinaciones fisicoquímicas, este se muele en un mortero de porcelana,

manualmente, y el último se guarda en el laboratorio para realizar análisis de arbitraje.

Después de la molienda deben conservarse refrigerados, protegidos de la luz en

recipientes de vidrio color ámbar, hasta que se lleve acabo los análisis.

2.2. DETERMINACIONES ORGANOLÉPTICAS

Las determinaciones organolépticas de la muestra de propóleos, como materia

prima, se lleva a cabo analizando cualitativamente los parámetros sensoriales

descriptivos, utilizando el protocolo de la UNSE-INTA (ver anexo B), realizadas por un

grupo de diez apicultores semientrenados que califican los atributos a través de un

“análisis descriptivo de categorización cuantitativa relativa”.

Este análisis consiste básicamente en realizar la descripción de las

características organolépticas del propóleos asignándole valores cuyo orden creciente o

decreciente se ajusta al carácter de más intenso o aceptable para el propóleos; hasta

obtener las características que más se ajustan a la realidad de la muestra analizada (ver

anexo C).

Descriptores organolépticos: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor,

consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles.

2.2.1. Procedimiento

Para determinar el color, se coloca la muestra sobre una superficie blanca y se

compara el color con una escala de colores, en un ambiente con buena

iluminación. Calificando el color según tonalidades predominantes en la

muestra.

Color: negro , marrón, marrón oscuro, marrón claro, verde oscuro, verde, verde claro,

gris, amarillo, tintes castaños, tintes rojizos, tintes naranjas, marrón verdoso, verde

amarillento, tintes castaño rojizo, tintes castaño naranja, marrón amarillento, amarillo

verdoso, marrón verdoso amarillento.

La determinación del color, constituye una de las características organolépticas

más importantes para clasificar los propóleos de orígenes diversos [3].

Para determinar el aspecto externo y estructura, se compara con las referencias

gráficas de un propóleos estándar actualmente comercializado. Determinando

el aspecto externo y estructura por observación.

Aspecto externo: Polvo, granulado, masa irregular con brillo, masa irregular opaca,

trozos irregulares opacos, trozo irregulares con brillo.

Estructura: Homogénea o heterogénea.

Para la evaluación del olor y sabor, se retira una porción de la muestra a fin de

que el envase no interfiera en la percepción olfativa. Posteriormente, la muestra

se coloca en la parte media de la lengua por unos segundos y se compara el

sabor con un propóleos estándar actualmente comercializado. Para determinar

el olor, se huele la muestra y se compara el olor con un propóleos estándar

actualmente comercializado.

Olor: Inodoro, levemente reinoso, resinoso, resinoso aromático, resinoso muy

aromático.

Sabor: Insípido, dulce, salado, amargo, picante.

Para determinar su consistencia a temperatura ambiente, se retira una porción

de la muestra y se coloca en un vidrio reloj, hasta que alcance la temperatura

ambiente en el laboratorio. Determinando la consistencia por opresión de la

muestra con los dedos y comparándola con un propóleos estándar actualmente

comercializado.

Consistencia a temperatura ambiente: Muy blando, blando, poco blando o duro.

• Para determinar las impurezas visibles, se retira una porción de la muestra y se

coloca en un vidrio reloj, y con la ayuda de pinzas se determinan las impurezas

por observación.

2.3. DETERMINACIONES FISICOQUÍMICAS

2.3.1. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Rusa

2.3.1.1. Determinación del porcentaje de cera

La cera de abejas corresponde a una secreción natural, producida por dos pares

de glándulas, ubicadas en la zona central del abdomen de las abejas jóvenes. Esta

secreción está compuesta principalmente por ésteres de ácidos grasos y alcoholes, siendo

una sustancia insoluble en agua.

Fundamento teórico

Determinación del contenido de cera presente en la muestra, por gravimetría

sobre el residuo de cera, obtenido por calentamiento del propóleos en solución acuosa,

ya que este es insoluble en agua, posterior filtración y secado en estufa a 80°C.

Equipos y materiales

- Material usual de laboratorio.

Procedimiento

- Pesar al 0,1 mg, 3 g de muestra en un vaso precipitado de 250 ml, agregar 200

ml de agua destilada y mezclar.

- Hervir por 15 a 20 min.

- Cumplido el tiempo, enfriar con un chorro de agua, si es que no ha alcanzado la

temperatura ambiente y filtrar.

- Tarar un papel filtro, colocar en la estufa a 80°C y pesar cada cierto tiempo

hasta obtener un peso constante. Se considerará peso constante, cuando la

diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg.

Expresión de cálculo

% Cera = A x 100 B

Donde:

A = masa del residuo, en g.

B = masa inicial de la muestra, en g.

2.3.1.2. Determinación del porcentaje de impurezas mecánicas

Las impurezas mecánicas son todos los elementos ajenos al propóleos, que han

sido incorporados durante el proceso de recolección y manipulación de éste, por

ejemplo: patas de abejas o parte de ellas, residuos de papel, plástico, madera, resto de

pinturas, etc.

Fundamento teórico

Determinar el contenido de impurezas mecánicas presentes en la muestra, a

través de un análisis gravimétrico del residuo obtenido, al adicionar solución de

cloroformo-acetona 2:1 a 1g de propóleos, posterior filtración de él y donde las

impurezas son insolubles en esta solución.



Reactivos y soluciones

- Cloroformo, PM = 119,38 g/mol, grado p.a., Vimaroni.

- Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler.

- Solución de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa

esmerilada 20 ml de cloroformo y 10 ml de acetona.

Procedimiento

- Pesar 1g de muestra en un vaso precipitado de 250ml.

- Adicionar 15 ml de solución de cloroformo-acetona 2:1, agitar y mantener en

descanso durante 1h a temperatura ambiente y posteriormente filtrar.

- Guardar el filtrado para la determinación de compuestos fenólicos (2.3.1.3.).

- Lavar el papel filtro con el residuo, con 15 ml de solución de cloroformo-

acetona 2:1. Colocar el papel filtro sobre un vidrio reloj.

- Secar a temperatura ambiente, llevar a desecador y pesar cada cierto tiempo

hasta obtener peso constante. Se considerará peso constante, cuando la

diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg.


% Impurezas mecánicas = (M 3 – M 2 ) x 100 M1

Donde:

M1 = masa de la muestra inicial en g.

M2 = masa del papel filtro, en g.

M3 = masa del papel filtro conteniendo el residuo, en g.

2.3.1.3. Determinación de los compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos son ácidos aromáticos, poseen en común un anillo

aromático con uno o más sustituyentes hidroxilos, junto a los flavonoides, le confieren al

propóleos sus múltiples aplicaciones farmacéuticas; los principales compuestos

fenólicos del propóleos son: ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido cinámico y ácido

benzoico, entre otros.

Fundamento teórico

Determinar los compuestos fenólicos en la muestra de propóleos, a través de

un análisis gravimétrico del residuo obtenido, al tratar el filtrado obtenido en la

determinación de impurezas mecánica con óxido de aluminio, posterior filtrado y lavado

con cloroformo-acetona 2:1. Se basa en la adsorción de los compuestos fenólicos del

propóleos, sobre el óxido de aluminio activado, y la máxima capacidad de dilución en la

solución cloroformo-acetona.




- Óxido de aluminio, grado p.a., May and Baker, lote: 6155.

- Cloroformo, PM = 119,38g/mol, grado p.a., Vimaroni.

- Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler.

- Solución de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa

esmerilada, 10 ml de cloroformo y 5 ml de acetona.

Procedimiento

- Tomar el filtrado obtenido en la determinación de impurezas mecánica (2.3.1.2)

y agregar 15 g de óxido de aluminio.

- Agitar y filtrar.

- Lavar el papel filtro con la solución cloroformo-acetona 2:1 hasta eliminar todo

el óxido de aluminio. Registrar como “A”.

- Paralelamente, tomar otro papel filtro, a este último agregar 15 g de oxido de

aluminio más 5 ml de la solución cloroformo-acetona 2:1. Registrar como “B”.

- Colocar ambos papeles filtro en la estufa a una temperatura de 80° C por 30

min.

- Enfriar en el desecador y pesar ambos papeles filtro hasta obtener peso

constante.


% Compuestos fenólicos = (B – A) x 100 M

Donde:

A = masa del papel filtro “A”, en g.

B = masa del papel filtro “B”, en g.

M = masa de la muestra inicial, en g.

2.3.1.4. Determinación del índice de oxidación (según norma Rusa)

Este índice se define como el tiempo de decoloración, medido en segundos, de

una solución de KMnO4 0.1000N, se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre

compuestos fenólicos del propóleos (fenoles y compuestos insaturados). Depende de los

compuestos fenólicos y en menor medida de los ácidos grasos insaturados de cadena

larga.

Fundamento teórico

Determinación del índice de oxidación, para verificar las propiedades

antioxidantes, midiendo el tiempo de decoloración de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N.

Agregado a 2 ml de una suspensión acuosa de propóleos (obtenida mediante una

extracción de 0,2 g de propóleos con 5 ml de alcohol etílico 95º, posterior agregado de

100 ml de agua destilada y filtrado) y 1 ml de solución de H2SO4 al 20 % (V/v).



- Cronómetro.


- H2SO4 al 20% (V/v).

- Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., artículo Nº1010080000, lote: 61190257213.

- KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1000 ml de agua destilada y

mantener a ebullición suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24

h protegido de la luz, filtrar a través de filtro Gooch G4 y guardar en botella

ámbar. Estandarizar el KMnO4 con una solución estándar de Na2C2O4 0,1000N.

Procedimiento

- Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado de 250 ml, agregar 5 ml de

alcohol etílico.

- Dejar reposar aproximadamente 1 h a temperatura ambiente y agregar 100 ml

de agua destilada, filtrar.

- Tomar una alícuota de 10 ml del filtrado y llevar a un matraz aforado de 100

ml. Aforar con agua destilada.

- De esta solución tomar una alícuota de 2 ml y llevar a un tubo de ensayo,

adicionar 1 ml de H2SO4 al 20% (V/v).

- Agitar por 1 min y agregar 1 gota de KMnO4 0,1000 N, con un cronómetro,

registrar el tiempo en el que ocurre el cambio de color.


El tiempo en que desaparece el color rosado de la solución, corresponde al

índice de oxidación que esta dado en segundos (s).

2.3.1.5. Determinación cualitativa de los compuestos flavonoides

Los flavonoides son pigmentos provenientes de exudados vegetales, con

múltiples aplicaciones biológicas: antibacteriana, antimicótico, antiviral, antioxidante,

cicatrizante, entre otras. Contienen quince átomos de carbono en su núcleo básico y

están configurados bajo un sistema C6-C3-C6, en el cual dos anillos aromáticos llamados

“A” y “B” están unidos por una unidad de tres átomos de carbono, que pueden formar o

no un tercer anillo, que en caso de existir es llamado anillo “C”.

Fundamento teórico

Determinar la presencia de compuestos flavonoides en el propóleos, basado en

la formación de compuestos coloreados, por reacción de los flavonoides con el acetato

de plomo y el hidróxido de sodio.




- Acetato de plomo II, grado p.a., Merck, lote: 107375.

- Acetato de plomo al 10% (P/v): pesar 10g de acetato de plomo, traspasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua

destilada y aforar.

- NaOH, grado p.a., Loba Chemie, artículo: 5900, lote: Nº A023706.

- NaOH al 20% (P/v): pesar 20g de NaOH en balanza granataria, traspasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua

destilada y aforar.

- Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., articulo Nº1010080000, lote: B11081.

Procedimiento

- Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado y agregar 5 ml de alcohol

etílico.

- Colocar el vaso de precipitado en baño maría por 3 min. Enfriar y filtrar la

solución.

- Tomar una alícuota de 1 ml del filtrado, llevar a un vaso precipitado de 100 ml

y añadir 10 ml de alcohol etílico.

- De esta solución tomar una alícuota de 1 ml, llevar a un tubo de ensayo (tubo

“A”), y adicionar 1 gota de NaOH al 20% (P/v).

- Paralelamente, en otro tubo de ensayo (tubo B) tomar 1 ml de la solución y

agregar 0,5 ml (10 gotas) de acetato de plomo al 10% (P/v).

- Observar el cambio de color resultante.


La solución del tubo “A” debe colorearse rápidamente de un color anaranjado-

amarillento, y oscurecerse. La solución del tubo “B” dará un color amarillo-verdoso y

precipitará.

2.3.1.6. Determinación del índice de yodo

Se define el índice de yodo como el número de gramos de yodo que pueden ser

absorbidos por 100 g de grasa. El índice de yodo representa el verdadero grado de

insaturación de las grasas o ácidos grasos, solamente cuando los enlaces dobles de los

ácidos grasos no son conjugados (en los que los dobles enlaces de la cadena carbonada

están siempre separados, por lo menos, por dos enlaces sencillos); en caso contrario la

absorción del halógeno no es cuantitativa.

Fundamento teórico

Determinar los gramos de yodo que pueden ser absorbidos, bajo condiciones

determinadas por 100g de grasa a través de la valoración del yodo liberado con

Na2S2O3*5H2O 0,1000N, utilizando como indicador almidón al 5% (P/v).




- Ácido acético glacial, grado p.a., Merck, lote: A968192823.

- KI 10 %: pesar 10 g de KI, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de

100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar.

- Na2S2O3*5H2O 0,1000 N: pesar en balanza granataria 12,6 g de Na2S2O3*5H2O,

agregar 5 gotas de cloroformo, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado

de 500 ml y aforara con agua destilada; estandarizar la solución con cobre

electrolítico.

- Solución bromo–yodo: pesar 13,2 g de yodo cristalizado en un vaso

precipitado, disolver con mínima cantidad de ácido acético glacial, colocar a

baño maría hasta disolución a una temperatura entre 60 y 70ºC, enfriar y añadir

3 ml de bromo p.a.; traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml

y aforar con ácido acético glacial.

- Almidón al 5% (P/v): disolver 5 g de almidón soluble p.a., con agua destilada

caliente en un vaso precipitado (hacer una pasta) hasta transparencia y traspasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml.

Procedimiento

- Pesar 0,05 g de muestra de propóleos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con

tapa esmerilada.

- Agregar 2,5 ml de cloroformo y 6,25 ml de la solución bromo-yodo. Tapar el

matraz y colocar en la oscuridad por 1 h.

- Agregar 5 ml de KI 10 %, 50 ml de agua destilada y 4 a 7 gotas de la solución

de almidón al 5% (P/v).

- Agitar y valorar con la solución de Na2S2O3*5H2O 0,1000N, hasta observar

decoloración de la solución.

- Hacer un blanco de reactivos en las mismas condiciones experimentales de la

muestra.


Índice de yodo = (B - A) x N x 0,1269 x 100 = [gI2 /100g de muestra] M

Donde:

A: ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en la muestra.

B: ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en el blanco.

M: masa de la muestra, en g.

N: normalidad del Na2S2O3*5H2O.

2.3.2. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Argentina

2.3.2.1. Pérdida por calentamiento

Fundamento teórico

Determinar la pérdida de masa por calentamiento, expresadas en g/100g de

propóleos, a través de un análisis gravimétrico, secando una porción de muestra en

estufa a 105°C, y pesando la muestra seca hasta obtener peso constante.



Procedimiento

- Tarar una cápsula de porcelana limpia, previamente secada en estufa a 100°C ±

2°C, y en mufla a 550°C ± 25°C.

- Pesar al 0,1 mg, en una cápsula de porcelana, aproximadamente 4 g de

propóleos.

- Calentar en estufa regulada a 100°C ± 2°C durante 2 h. Luego retirar la cápsula,

colocarla en un desecador hasta que llegue a temperatura ambiente, y pesar la

cápsula con la muestra.

- Así tratada, reservar la cápsula para la determinación de cenizas (2.3.2.2.).


H = (A – B) x 100 C

Donde:

H = pérdida por calentamiento, en g/100g de muestra.

A = masa de la cápsula con la muestra húmeda, en g.

B = masa de la cápsula con la muestra seca, en g.

C = masa de la muestra inicial, en g.

2.3.2.2. Determinación de cenizas

Fundamento teórico

Determinar la materia inorgánica, expresadas en gramos de cenizas por 100 g

de propóleos, por gravimetría, calcinando una porción de muestra en mufla a 500°C, y

pesando las cenizas obtenidas hasta conseguir peso constante.



Procedimiento

- Colocar en un horno de mufla la cápsula de porcelana con la muestra seca

provenientes de (2.3.2.1.), previamente quemada en mechero bajo campana.

- Incinerar a 550°C ± 25°C, hasta obtener cenizas sin residuos carbonosos.

- Retirar cuidadosamente la cápsula, del horno de mufla y dejar enfriar en un

desecador hasta que se alcance la temperatura ambiente.

- Pesar hasta obtener peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas

sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg.


C = (A – B) x 100 D

Donde:

C = contenido de cenizas, en g/100g de muestra.

A = masa de la cápsula con las cenizas, en g.

B = masa de la cápsula, en g.

D = masa de la muestra húmeda, en g.

2.3.2.3. Determinación de sustancias extraíbles en n-hexano

Si bien otras normativas denominan este requisito como ceras, el método

aplicado determina otras sustancias extraíbles en n-hexano distintas de las ceras.

Fundamento teórico

Determinación de sustancias extraíbles en n-hexano por un análisis

gravimétrico, sobre el residuo obtenido mediante una extracción con n-hexano, en un

equipo Soxhlet, durante el tiempo necesario para extracción total, comprobable, de la

cera, posterior destilación del n-hexano, secado de las sustancial extraíbles en estufa a

105°C y obtención de peso constante de las sustancias extraíbles.


- Equipo para extracción (Soxlhet).

- Equipo de destilación.

- Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80°C.



- n-hexano, grado p.a., Merck, Artículo: 1043672500.

Procedimiento

- Pesar aproximadamente 2 g de la muestra al 0,1 mg, colocar en un cartucho de

celulosa seco, o bien envolver en un papel de filtro seco, ambos previamente

tarados, y colocar en el cuerpo de un extractor de Soxlhet.

- Tarar el balón del extractor de Soxlhet, previamente secado en estufa a 80°C.

- Colocar en él, un volumen adecuado de n-hexano, (aproximadamente una vez y

media el volumen del sifón), conectar al extractor y comenzar a calentar hasta

que el solvente entre en ebullición.

- Mantener en esas condiciones durante 6 h, a una velocidad de aproximadamente

120 gotas a 150 gotas de condensado por minuto.

- Sacar el remanente de la muestra del extractor, secar y reservar para las

determinaciones de resinas solubles en etanol e impurezas mecánicas (según

2.3.2.4. y 2.3.2.5. respectivamente). En el balón queda la cera disuelta en n-

hexano.

- Evaporar el solvente por destilación. Después de evaporado el n-hexano,

colocar el balón en la estufa de 80°C por lo menos 30 min.

- Colocar el balón en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir

el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando

dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg.


SE = (A – B) x 100 M

Donde:

SE = contenido de sustancias extraíbles en n-hexano, en g/100g de muestra.

A = masa del balón con sustancias extraíbles, en g.

B = masa del balón vacío, en g.

M = masa de la muestra, en g.

2.3.2.4. Determinación de resinas solubles en etanol

Fundamento teórico

Determinación de resinas en propóleos, por gravimetría del residuo obtenido

mediante una extracción con alcohol etílico 95°, en un equipo Soxhlet, con posterior

destilación del alcohol ,secado de la resina en estufa a 80°C y obtención de peso

constante. Las resinas representan la fracción útil del propóleos.


- Equipo para extracción (Soxlhet).

- Equipo de destilación.

- Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80°C.




- Tricloruro de fierro, grado p.a., Scharlau, lote: Hi0336

- Solución de FeCl3 al 10% (P/v): pesar 10 g de FeCl3 p.a., transvasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, disolver y aforar con agua

destilada.

Procedimiento

- Colocar el remanente de cada una de las muestras, resultantes de la extracción

de sustancias extraíbles (según 2.3.2.3), en el cuerpo de un extractor Soxlhet.

- Colocar en el balón del extractor Soxlhet un volumen adecuado de alcohol

etílico 95º, armar el equipo para la extracción y comenzar a calentar hasta que

el solvente entre en ebullición. Mantener en esas condiciones durante 6 h como

mínimo, a una velocidad de aproximadamente 120 gotas a 150 gotas de

condensado por minuto.

- Continuar la extracción, hasta que el líquido en contacto con la muestra se

encuentre incoloro. El punto final de la extracción se controla agregando una

gota de este alcohol, a un tubo de ensayo que contenga una solución de FeCl3 al

10% (P/v).

- Si el color de la solución cambia de amarillento a verdoso, ello indica la

presencia de sustancias fenólicas y por lo tanto es necesario continuar con la

extracción. En caso contrario se da por finalizada la extracción.

- Transvasar cuantitativamente el contenido del balón a un matraz aforado de 100

ml y llevar a volumen con alcohol etílico 95º. Tomar una alícuota de 50 ml y

colocar en un balón de destilación previamente pesado. Eliminar

completamente el alcohol etílico mediante el equipo de destilación.

- Coloca en un frasco color ámbar, con tapa y con capacidad adecuada, el

volumen restante (50 ml), reservar para la determinación de fenoles totales,

flavonoides y espectro de absorción UV (según 2.3.2.7., 2.3.2.6. y 2.3.2.9.,

respectivamente).

- Sacar del extractor el remanente de la muestra y reservar para la determinación

de impurezas mecánicas (según 2.3.2.5.).

- Las resinas quedan en el balón de destilación, el cual se coloca en una estufa a

80°C, para evaporar los restos de alcohol etílico 95º. Después de evaporado el

alcohol, retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente

y pesar. Repetir el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se

verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg.


Donde:

R = contenido de resinas, en g/100g de muestra.

A= masa del balón con resinas, en g.

B = masa del balón vacío, en g.


Aforo = volumen al cual se diluye el extracto etílico total de resinas, en ml.

Alícuota = volumen tomado para evaporar el alcohol etílico, en ml.

2.3.2.5. Determinación de impurezas mecánicas

La impureza mecánica es todo resto de madera, metales, mallas, hilos, insectos

y materiales que pudieran encontrarse en el propóleos en bruto[8].

Fundamento teórico

Determinación de impurezas mecánicas por gravimetría del residuo insoluble

que queda en el cartucho del Soxhlet luego de la determinación de resinas según 2.3.2.4,

empleando alcohol etílico 95°, posterior secado del cartucho en estufa a 105°C y

obtención de peso constante.



Procedimiento

- Secar en la estufa a 80°C los remanentes de cada una de las muestras

provenientes de la determinación de resinas, según 2.3.2.4. (en cartucho o

encerrada en papel).

- Retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente y

pesar.

- Repetir el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica

cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg.


IM = (A – B) x 100 M

Donde:

IM = contenido de impurezas mecánicas, en g/100g de muestra.

A = masa del cartucho o papel filtro con el remanente, en g.

B = masa del cartucho o papel filtro, en g.


2.3.2.6. Determinación de compuestos fenólicos totales

El método empleado permite cuantificar los compuestos fenólicos totales

presentes en el propóleos, y se expresan como equivalentes de ácido gálico. Se basa en

la reacción de oxidación de los fenoles, por acción del reactivo fosfotúngstico, y la

aparición de una coloración azul por la reducción del reactivo a óxidos azules de

tungstenos y molibdenos.

Fundamento teórico

Determinación de compuestos fenólicos totales por espectrofotometría, con el

reactivo de Folin-Ciocalteu, trabajando a 765 nm sobre los extractos alcohólicos

obtenidos según 2.3.2.4, y empleando ácido gálico como patrón.



- Espectrofotómetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199-

900 nm.

- Baño de agua que opere a una temperatura de 50ºC.


- Ácido gálico monohidratado, grado p.a., Sigma, lote: WE8343.

- Solución patrón de ácido gálico de 0,5 mg/ml (500ppm): Disolver 0,05 g de

ácido gálico p.a. en agua destilada y llevar a un matraz aforado de 100ml.

Mantener la solución refrigerada a 4ºC y utilizar después de 48 h de haberla

preparado.

- Alcohol etílico al 10% (V/v): tomar 10 ml de alcohol etílico p.a. y llevar a un

matraz aforado de 100 ml, aforar con agua destilada.

- Reactivo de Folin-Ciocalteu, Merck, lote: 80300769, artículo: 1.09001.0100.

Nota: el reactivo de Folin-Ciocalteu se puede preparar a partir de los siguientes

componentes:

• 100 g de wolframato de sodio hidratado p.a.

• 25 g de molibdato de sodio hidratado

• 50 ml de ácido fosfórico de 85 ml/100 ml p.a.

• 100 ml de ácido clorhídrico de 36 ml/100 ml p.a.

• 150 g de sulfato de litio hidratado.

• Bromo (ampollas).

Mezclar los reactivos mencionados dentro de un balón de 1000 ml y se calienta

a reflujo suave, durante 10 h. Dejar enfriar, y luego se lava el condensador con 50 ml de

agua destilada, la que se escurre sobre el balón. Añadir 150 g de sulfato de litio

hidratado y una o dos gotas de bromo. Llevar a ebullición, sin el condensador, dentro de

una campana de extracción de gases, hasta que la solución quede libre de bromo (lo que

se evidencia porque el color verde se torna amarillo brillante).

- Carbonato de sodio anhidro, grado p.a., Merck, artículo: 1.06392.1000, lote:

A968192823

- Solución de carbonato de sodio 1,5 N: Disolver 159 g de carbonato de sodio

anhidro p.a. en 700 ml de agua destilada caliente, enfríar traspasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml y completar con agua

destilada.

Procedimiento

- Tomar una alícuota de 5 ml de cada uno de los extractos alcohólicos obtenidos

en la determinación de resinas (según 2.3.2.4.) y colocar en un matraz aforado

de 100 ml. completar con agua destilada y agitar.

- Tomar una alícuota de 1 ml de la solución anterior y colocar en un matraz

aforado de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de Folin-

Ciocalteu, agitar suavemente y dejar reposar durante 2 min.

- Añadir 4 ml de la solución de carbonato de sodio y completar el volumen con

agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un baño de agua a 50°C

durante 5 min, y enfríar hasta temperatura ambiente.

- Homogeneizar el contenido de los matraces antes de efectuar la medición.

- Colocar la solución en una cubeta de vidrio y leer la absorbancia en un

espectrofotómetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas

condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en

lugar de la muestra.

- Con el valor de absorbancia obtenido interpolar en la curva de calibración.

Preparación de la curva de calibración

- Tomar alícuotas de 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml y 25 ml de la solución patrón de

acido gálico y colocar en matraces aforados de 25 ml. Completar el volumen

con una solución de alcohol etílico al 10% (V/v). Las diluciones así preparadas

contendrán 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,4 mg/ml y 0,5 mg/ml,

respectivamente, de ácido gálico.

- Tomar 1 ml de cada una de las soluciones patrón diluidas y colocar en matraces

aforados de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de Folin-

Ciocalteu, agitar suavemente y dejar en reposo durante 2 min.

- Añadir 4 ml de la solución de carbonato de sodio y completar el volumen con

agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un baño de agua a 50°C

durante 5 min y enfríar hasta temperatura ambiente.

- Colocar las soluciones en cubetas de vidrio y leer la absorbancia en un

espectrofotómetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas

condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en

lugar de la solución patrón diluida (stock).

- Las diluciones así preparadas contendrán 0 mg/ml (blanco); 0,004 mg/ml; 0,008

mg/ml; 0,012 mg/ml; 0,016 mg/ml y 0,020 mg/ml, respectivamente, de ácido

gálico.


Tener en cuenta que el extracto alcohólico (normalmente de 100 ml) se obtuvo

a partir de 50 ml del extracto alcohólico provenientes de la determinación de resinas al

procesar la muestra.

FE = (ABS – a) x 5000 b M

Donde:

FE = contenido de fenoles totales, expresado como su equivalente en ácido gálico, en

g/100g de muestra.

ABS = absorbancia leída a 765 nm en la muestra.

b = pendiente de la recta obtenida en la curva de calibración.

a = intercepto de la recta obtenido en la curva de calibración.

M = masa de la muestra utilizada en la determinación de sustancias extraíbles en n-

hexano, en g.

5000 = factor de dilución para expresar la concentración, en g/100g de muestra.

2.3.2.7. Determinación de flavonoides totales

Las flavonas y flavonoles, desde el punto de vista reactivo, forman complejos

estables con el tricloruro de aluminio y son susceptibles de analizar mediante

espectrofotometría UV- visible.

Fundamento teórico

Determinación de flavonoides totales por espectrofotometría del complejo

flavonoides-AlCl3, de color amarillo formados específicos para flavonas y flavanoles

(3,5-hidroxiflavonas y 3,5-hidroxiflavonoles) en medio metanólico, a 425 nm, sobre los

extractos alcohólicos obtenidos en la determinación de resinas (según 2.3.2.4),

empleando quercetina dihidratada como patrón.




900 nm.


Observación: Debido a la peligrosidad de los reactivos utilizados en esta técnica se debe

utilizar propipeta en todas las mediciones de volumen.

- Quercetina dihidratada, grado HPLC, 99,0% de pureza, Calbiochem, lote:

D00047624, artículo: 551600.

- Solución stock de quercetina de 1 mg/ml:

Disolver 100 mg de quercetina dihidratada en 100 ml de metanol. Conservar en

la oscuridad y refrigerada.

- Solución patrón de quercetina de 100 μg/ml (100ppm):

Tomar 10 ml de la solución stock y disolver en matraz aforado de 100 ml con

metanol. Se debe conservar en la oscuridad y refrigerada.

- Alcohol metílico, grado HPLC, J. T. Baker, lote: B38E2.

- Solución de tricloruro de aluminio al 5% (P/v):

Pesar 10g de tricloruro de aluminio p.a. y disolver en 200 ml de metanol.

Observación: trabajar bajo campana con mucho cuidado, empleando guantes, ya que el

tricloruro de aluminio es muy corrosivo e higroscópico.

Procedimiento

- A partir de los extractos alcohólicos obtenidos en la determinación de resinas

(según 2.3.2.4), pipetear 0,1 ml de cada uno de ellos en sendos matraces de 25

ml, agregar 0,5 ml de solución de tricloruro de aluminio y aforar con alcohol

metílico.

- Preparar un blanco con 0,1 ml de alcohol etílico y 0,5 ml de solución de

tricloruro de aluminio, y aforar con alcohol metílico en un matraz aforado de 25

ml.

- Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, colocar en una cubeta de vidrio y

leer la absorbancia a 425 nm. Si la absorbancia es mayor que 0,400 repetir la

determinación tomando un volumen menor de extracto alcohólico. Del mismo

modo, si se obtiene una lectura muy baja, aumentar el volumen de dicho

extracto

Preparación de la curva de calibración

- Para realizar la curva de calibración: preparar soluciones de 2 μg/ml, 4 μg/ml, 6

μg/ml, 8 μg/ml y 10 μg/ml de quercetina, respectivamente.

- En sendos matraces aforados de 25,0 ml pipetear 0,0 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5

ml; 2,0 ml y 2,5 ml de la solución patrón de quercetina. Agregar 0,5 ml de la

solución de tricloruro de aluminio a cada una de ellas y al blanco. Aforar a 25

ml con alcohol metílico.

- Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, y leer las absorbancias a 425 nm.


Tener en cuenta que el extracto alcohólico (normalmente de 100 ml) se obtuvo

a partir de 50 ml de cada uno de los extractos alcohólicos provenientes de la

determinación de resinas al procesar la muestra.

FlT = (ABS – a) x 2,5 b M

Donde:

FlT = contenido de flavonoides totales de propóleos, expresado como su equivalente

en quercetina dihidratada, en g/100 g.

ABS = absorbancia leída a 425 nm en la muestra.

b = pendiente de la recta obtenida en la curva de calibración.

a = intercepto de la recta obtenido en la curva de calibración.

M = masa de la muestra utilizada en la determinación de sustancias extraíbles en

n-hexano, en g.

2,5 = factor de dilución para expresar la concentración, en g/100 g.

2.3.2.8. Determinación del índice de oxidación (según norma Argentina)

Fundamento teórico

Determinación del índice de oxidación, en segundos, midiendo el tiempo de

decoloración de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N. Agregado a 2 ml de una suspensión

acuosa de propóleos (obtenida mediante una extracción de 0,2 g de propóleos con 5 ml

de alcohol etílico al 95º durante 1 hora, con posterior agregado de 100 ml de agua

destilada y filtrado), y 1ml de solución de H2SO4 al 20 % (V/v).

Se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre compuestos fenólicos del

propóleos (fenoles y compuestos insaturados).



- Cronómetro.


- H2SO4 al 20% (V/v).


- KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1L de agua destilada y

mantener a ebullición suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24

h protegido de la luz, filtrar a través de filtro Gooch G4 y guardar en botella

ámbar. Estandarizar con Na2C2O4 0,1000 N (previamente seco a 110ºC por 2 h).

Procedimiento

- Pesar 0,2 g de la muestra de propóleos y colocar en un Erlenmeyer de 125 ml,

añadir 5 ml de alcohol etílico 95º y dejar en reposo durante 1 h.

- Agregar 100 ml de agua destilada, agitar, filtrar a través de un papel de filtro y

recoge el filtrado en un vaso precipitado.

- Colocar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo, añadir 1 ml de solución de

H2SO4 al 20% (V/v) y agitar durante 1 min. Finalmente, agregar en el tubo 0,05

ml (1 gota) de la solución de permanganato de potasio 0,1000 N.

- Poner en marcha el cronómetro en el preciso momento en que la gota entra en

contacto con la solución acidulada de propóleos, agitando constantemente. La

gota debe caer directamente sobre la solución y no sobre las paredes del tubo.

- Registra el tiempo, en segundos, que la solución tarda en decolorarse.


El tiempo en que desaparece el color rosado de la solución, corresponde al

índice de oxidación que esta dado en segundos.

2.3.2.9. Determinación del espectro de absorción UV- visible

Dada la naturaleza aromática, los compuestos fenólicos muestran intensa

absorción en la región UV del espectro, siendo éste método espectral especialmente

importante para su identificación.

Fundamento teórico

Determinar el espectro de absorción UV- visible del extracto alcohólico

obtenido en la determinación de resinas, para comprobar la presencia de compuestos

fenólicos al registra un máximo de absorbancia entre 270 nm y 315 nm.



900 nm.

- Cubetas de cuarzo, de 1cm de paso óptico, para trabajar en la región UV del

espectro.




Procedimiento

- A partir del extracto alcohólico obtenido en la determinación de resinas (según

2.3.2.4), efectuar una dilución de 1 en 1000 con alcohol etílico.

- Realizar un barrido completo de longitudes de onda desde 240 nm hasta 420

nm.

- Graficar los valores de absorbancia medidos en función de la longitud de onda

de la radiación.


La presencia de compuestos fenólicos resulta positiva si se registra un máximo

de absorbancia entre 270 nm y 315 nm.

CAPÍTULO 3: RESULTADOS

3. RESULTADOS

3.1. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS

El análisis sensorial de las características organolépticas, permitió establecer los

atributos óptimos para la muestra de propóleos analizado.

Tabla 3-1. Características organolépticas del propóleos analizado

Característica organoléptica Resultado

Color Marrón verdoso

Aspecto externo Trozos irregulares con brillo

Sabor Amargo

Estructura Heterogéneo

Olor Resinoso aromático

Consistencia a temperatura ambiente Poco blando

Impurezas visibles Virutas de madera, restos de pintura

y partes de abejas

3.2. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS

3.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Rusa

Tabla 3-2. Resultados de la determinación del porcentaje de cera

Análisis % CeraMedia

aritmética

Desviación

estándarValor aceptado

1 39,36

38,34 ±2,10No más del

30 %2 39,73

3 35,92

Tabla 3-3. Resultados de la determinación del porcentaje de impurezas mecánicas

Análisis%Impurezas

mecánicas

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 35,90

36,24 ±1,34No más del

20 %2 37,71

3 35,10

Tabla 3-4. Resultados de la determinación de los compuestos fenólicos

Análisis%Compuestos

fenólicos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 8,09

8,62 ±1,36No menos de

30 %2 7,62

3 10,17

Tabla 3-5. Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma Rusa)

AnálisisÍndice de

oxidación(s)

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 9,05

8,25 ±0,69No mayor de

22 s2 7,80

3 7,91

Tabla 3-6. Resultados de la determinación cualitativa de los compuestos flavonoides

AnálisisCompuestos

flavonoidesResultado aceptado

1 +

+2 +

3 +

Tabla 3-7. Resultados de la determinación del índice de yodo

Análisisg de I2/100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 60,56

61,90 ±1,27No menos de

35 g de I2/100g2 63.09

3 62,06

Tabla 3-8. Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Rusa

Características fisicoquímicas Resultado Valor aceptado

(*) %Cera 38,34 ± 2,10 No más del 30 %

Índice de oxidación( s) 8,25 ± 0,69 No mayor de 22 s

(*) %impurezas mecánica 36,24 ± 1,34 No más del 20 %

(*)%Compuestos fenólicos 8,62 ± 1,36 No menos de 30 %

Compuestos flavonoides + +

(*)Índice de yodo(gI2 /100g de muestra) 61,90 ± 1,27No menos de

35 gI2/100g

(*) = resultado expresado en la media aritmética y la desviación estándar.

3.2.2. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Argentina

Tabla 3-9. Resultados de la pérdida por calentamiento

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 2,51

2,26 ±0,23Máximo

10,0g/100g2 2,06

3 2,22

Tabla 3-10. Resultados de la determinación de cenizas

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 1,66

1,51 ±0,15Máximo

5,0g /100g2 1,36

3 1,51

Tabla 3-11. Resultados de la determinación de sustancias extraíbles en n-hexano

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 22,60

25,7 ±2,95Máximo

35,0g /100g2 28,47

3 26,03

Tabla 3-12. Resultados de la determinación de resinas solubles en etanol

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 49,67

48,01 ±1,72Mínimo

35,0g /100g2 48,13

3 46,24

Tabla 3-13. Resultados de la determinación de impurezas mecánicas

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 10,38

10,47 ±0,57Máximo

25,0g /100g2 9,95

3 11,08

Tabla 3-14. Resultados de la determinación de compuestos fenólicos totales

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 10,35

10,05 ±0,27Mínimo

5,0g /100g2 9,84

3 9,96

Tabla 3-15. Resultados de la determinación de flavonoides totales

Análisisg /100g de

propóleos

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 2,75

2,76 ±0,01Mínimo

1,0g /100g2 2,77

3 2,75

Tabla 3-16. Resultados de la determinación del índice de oxidación

( según norma Argentina)

AnálisisÍndice de

oxidación (s)

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor

aceptado

1 7,83

7,67 ±0,14 Máx. 22s2 7,62

3 7,56

Tabla 3-17. Resultados determinación del espectro de absorción UV-visible

AnálisisMáximo de

absorbancia

Media

aritmética

Desviación

estándar

Valor aceptado

(Máx. de absorbancia)

1 290nm

293,93 ±5,77 entre 270-315nm2 300nm

3 290nm

Tabla 3-18.Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Argentina

Características fisicoquímicas Resultado Valor aceptado

(*)Pérdida por calentamiento 2,26 ± 0,23 Máximo 10,0g/100g

(*)Cenizas 1,51 ± 0,15 Máximo 5,0g /100g

(*)Sustancias extraíbles en n-hexano 25,7 ± 2,95 Máximo35,0g/100g

(*)Resinas solubles en etanol 48,01 ± 1,72 Mínimo 35,0g/100g

(*) Impurezas mecánicas 10,47 ± 0,57 Máximo 25,0g/100g

(*)Compuestos fenólicos totales 10,05 ± 0,27 Mínimo 5,0g/100g

(*)Flavonoides totales 2,76 ± 0,01 Mínimo1,0g/100g

Índice de oxidación(s) 7,67±0,14 Máximo 22s

Espectro de absorción UV- visible(nm) 293,93 ± 5,77Máx. de absorbancia

entre 270-315nm

(*) = resultado expresado en g/100g de propóleos.

DISCUSIÓN

Con respecto a las características organolépticas del propóleos analizado (tabla

3-1), determinadas por un grupo de diez apicultores semientrenados a través de un

“análisis descriptivo de categorización cuantitativa relativa”, utilizando el protocolo de

la UNSE-INTA (anexo B); el color marrón verdoso que presenta el propóleos, se debe al

tipo de vegetación existentes en cercanía del apiario y la flora predomínate en la zona.

El aspecto externo (trozos irregulares con brillo) y estructura (heterogénea) no

difieren en forma significativa con otros propóleos nacionales e internacionales, que se

presentan en trozos irregulares, el brillo se debe a la cera de abeja presente en el

propóleos. Su heterogeneidad se debe a que el propóleos es una mezcla compleja que se

vuelve más heterogénea utilizando el método de recolección de raspado. El olor del

propóleos (muy aromático), demuestra que el propóleos es un producto natural

aromático, a pesar de su baja concentración en aceites esenciales [3]. El sabor que

presenta el propóleos (amargo) es atribuido a las resinas y algunos compuestos químicos

presentes en el propóleos. La consistencia a Tº ambiente del propóleos (poco blando a

los 20ºC) tiene directa relación con características geográficas y climáticas de la zona de

la cual se tomó la muestra, ya que Casablanca se caracteriza por ser un valle prelitoral

que presenta un clima más bien frío, neblinas matinales y una amplitud térmica entre el

día y la noche. La temperatura media del verano es de 25°C y la anual es de 14,4°C, los

meses amenazantes con heladas son Agosto y Octubre, de Noviembre (mes de

recolección del propóleos) a Abril se considera más bien seco.

En cuanto a las impurezas visibles presentes en el propóleos (virutas de

madera, restos de pintura y partes de abejas) principalmente se debe al método de

recolección utilizado.

Según los resultados de los análisis realizados a través de la norma Rusa

(tabla 3-8), el propóleos presenta un índice de oxidación de 8,25 ± 0,69 s, atribuido a los

compuestos fenólicos presentes en el propóleos, este resultado depende de la

subjetivada y criterio analítico por parte del analista, ya que se estima el tiempo en que

desaparece el color rosado de la solución, cumpliendo con el valor exigido en la norma;

un índice de yodo de 61,90 ± 1,27 gI2/100g de muestra, representando el grado de

insaturación de las grasas o ácidos grasos presentes en el propóleos, cumpliendo con el

valor exigido en la norma; a demás presenta reacción positiva ante la presencia de

compuestos fenólicos, cumpliendo con los parámetros de calidad exigidos para estos

análisis; no así el porcentaje de impurezas mecánicas obtenido (36,24 ± 1,34%), el

porcentaje de cera (38,34 ± 2,10%) y porcentaje de compuestos fenólicos (8,62 ±

1,36%). El no cumplimiento de estos parámetros de calidad se debe al método de

raspado utilizado para la recolección del propóleos, lo que determinó la incorporación al

producto de distintos tipos de impurezas: astillas de madera, cera, partes de abejas,

restos de pinturas, etc. que en algunos casos se pueden separar del propóleos y en otros

casos quedan incorporadas, disminuyendo la calidad del mismo.

Los resultados obtenidos a través de las metodologías estipuladas en la norma

Rusa, pueden estar condicionados por una serie de factores analíticos, como la falta de

experiencia por parte del analista en el desarrollo de estos análisis; perdidas de muestras

en el desarrollo de los análisis, etc. Ya que la mayoría de las determinaciones se

realizaron a través de análisis gravimétricos.

De acuerdo a los resultados obtenidos de los análisis fisicoquímicos realizados

al propóleos, según la norma Argentina (tabla 3-18) el propóleos presenta un 2,26 ±

0,23% de pérdida por calentamiento; 1,51 ± 0,15% de cenizas, que representa la materia

inorgánica presente en el propóleos; 25,7 ± 2,95% de sustancias extraíbles en n-hexano,

obteniéndose un menor porcentaje con respecto al porcentaje de cera obtenido según la

norma Rusa, ya que las metodologías analíticas utilizadas son distintas; 48,01 ± 1,72%

de resinas solubles en etanol, representando la fracción útil del propóleos; 10,47 ±

0,57% de impurezas mecánica, obteniéndose un porcentaje menor en comparación al

obtenido a través de la norma Rusa, ya que la metodología analítica utilizada es distinta;

10,05 ± 0,27% de compuestos fenólicos totales, expresado como su equivalente en

ácido gálico, que le otorgan las propiedades biológicas al propóleos; 2,76 ± 0,01% de

flavonoides totales, expresado como su equivalente en quercetina dihidratada, este

análisis junto con la determinación de fenoles totales constituyen las determinaciones

más importantes ya que los flavonoides junto a los fenoles le otorgan al propóleos sus

propiedades biológicas y terapéuticas. Según los resultados de ambos análisis

(determinación de compuestos fenólicos y flavonoides totales), el propóleos en estudio

cumple satisfactoriamente con los parámetros de calidad exigidos en la norma,

otorgándole al propóleos grandes posibilidades de comercialización a nivel nacional e

internacional.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Después de llevar acabo los análisis organolépticos y fisicoquímicos, realizados

al propóleos, en el Laboratorio de Química de la Universidad Técnica Federico Santa

María, Sede Viña del Mar, José Miguel Carrera, se puede llegar a las siguientes

conclusiones:

El propóleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca, Quinta Región

de Chile, presenta un aspecto de trozos irregulares con brillo, una estructura

heterogénea, un color marrón verdoso, un olor resinoso aromático, un sabor amargo, con

una consistencia poco blanda a temperatura ambiente (20ºC). Además de presentar

virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas.

De acuerdo a la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 que establece e identifica los

requisitos organolépticos y fisicoquímicos mínimos exigidos, que debe cumplir el

propóleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos

relacionados; los resultados de las características organolépticas se sitúan dentro de los

parámetros de calidad exigidos por la norma mencionada. Los resultados de las

propiedades fisicoquímicas, generalmente se sitúan dentro de los parámetros de calidad

exigidos, a excepción del porcentaje de cera, impurezas mecánicas y compuestos

fenólicos, ya que los valores de calidad exigidos en estos análisis son muy elevados en

comparación con la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008.

Según la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, los resultados de las

propiedades organolépticas y fisicoquímicas se sitúan dentro de los parámetros de

calidad exigidos por la norma mencionada, sin excepción alguna, superando en todos los

casos los valores de calidad mínimos exigidos, por tanto el propóleos cumple con los

parámetros de calidad estipulados en esta norma internacional, y puede ser utilizado a

nivel industrial y competir en el mercado externo.

Se puede concluir que realizando una adecuada recolección del propóleos a

través del método de raspado, utilizando una espátula de acero inoxidable, es posible

obtener propóleos que cumplan satisfactoriamente con los requisitos de calidad mínimos

exigidos por la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, a pesar de que en algunos

casos no se pueden separar las impurezas mecánicas del propóleos, disminuyendo la

calidad del mismo.

Recomendaciones:

Para analizar organolépticamente el propóleos se recomienda utilizar el

protocolo de la UNSE-INTA, de la Argentina, ya que los descriptores organolépticos

estipulados en este protocolo, permiten una buena y completa caracterización

organoléptica del propóleos, a través de análisis sensoriales.

Se recomienda analizar y caracterizar fisicoquímicamente el propóleos por la

norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, ya que al comparar esta con la norma

Rusa, esta permite una mayor cuantificación de los compuestos químicos presentes en el

propóleos; las técnicas y métodos analíticos empleados en esta norma, son mas

actualizados que los empleados en la norma Rusa RST-RSFSR-317-77, y permiten la

cuantificación más precisa de los compuestos químicos del propóleos (compuestos

fenólicos, flavonoides, resinas totales, sustancias extraíbles en n-hexano, etc.) que son

muy importantes para determinar su calidad .

Se considera conveniente el uso de mallas en la colmena para la recolección de

propóleos, ya que no solamente se evita la incorporación de impurezas por raspado, sino

también se obtiene un producto con mayor cantidad de resinas totales y compuestos

fenólicos, y menor cantidad de cera, proporcionándole una mayor calidad al propóleos

recolectado.

Este producto apícola está incrementando su demanda externa es por ello que se

debe mejorar las prácticas apícolas llevadas a cabo en Chile, tanto para su recolección,

almacenamiento y transporte; para contar con un producto de buena calidad que pueda

competir a nivel internacional y al que pueda asignársele un valor agregado .

BIBLIOGRAFÍA

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http://www.scielo.cl/pdf/ciagr/v35n1/art02.pdf

ANEXOS

ANEXO A: FOTOGRAFÍAS EXPERIMENTALES

Apiario seleccionado: localidad de Tapihue, Casablanca Quinta Región de Chile

Recolección del propóleos, por el método de raspado

Muestra de propóleos recolectado

ANEXO B: PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA

RECEPCIÓN DE MUESTRAS PROPÓLEOS EN BRUTO

Número FechaIdentificación Origen

Peso g Recolección

Remitente

Observaciones

CARACTERIZACIÓN ORGANOLÉPTICA

Aspecto externoPolvoGranuladoMasa irregular con brilloMasa irregular opacaTrozos irregulares opacosTrozo irregulares con brillo

ColorNegroMarrónMarrón oscuroMarrón claroVerde oscuroVerdeVerde claroGrisAmarilloTintes castañosTintes rojizosTintes naranjasMarrón verdosoVerde amarillentoTintes castaño rojizoTintes castaño naranjaMarrón amarillentoAmarillo verdosoMarrón verdoso amarillento

ANEXO C: DETERMINACIÓN DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS

Tabla C-1. Determinación del color

EstructuraHomogénea

Heterogénea

Consistencia a T° ambienteMuy blandoBlandoPoco blandoDuro

SaborInsípidoDulceSaladoAmargoPicante

OlorInodoroLevemente ReinosoResinosoResinoso aromáticoResinoso muy aromático

ColorAnalista

%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Negro 0Marron(, 0Marron oscuro 0Marron claro 0Verde oscuro 0Verde 0Verde claro 0Gris 0Amarillo 0Tintes castaños X X X X 40Tintes rojizos 0Tintes naranjas 0Marrón verdoso X X X X X X 60Verde amarillento 0Tintes castaño rojizo 0Tintes castaño naranja 0Marrón amarillento 0Amarillo verdoso 0Marrón verdoso

Amarillento0

Tabla C-2. Determinación del sabor

Analista Insípido Dulce Salado Amargo Picante

1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 20 0 0 80 0

Tabla C-3. Determinación del aspecto externo

Analista Polvo Granulado

Masa irregular

con brillo

Masa irregular

opaca

Trozos irregulares

opacos

Trozo irregulares con brillo

1 X

2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 0 0 0 0 20 80

Tabla C-4. Determinación de la estructura

Analista Homogénea Heterogénea

1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 0 100

Tabla C-5. Determinación del olor

Analista InodoroLevemente

resinosoResinoso

Resinoso aromático

Resinoso muy

aromático1 X2 X

3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 0 0 10 70 20

Tabla C-6. Determinación del sabor

Analista Insípido Dulce Salado Amargo Picante1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 20 0 0 80 0

Tabla C-7. Determinación de la consistencia a temperatura ambiente

AnalistaMuy

blandoBlando

Poco blando

Duro

1 X2 X3 X

4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X% 0 10 80 10

ANEXO D: GRÁFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIÓN

Ecuación de regresión lineal fenoles totales

y = bx + a

Donde:

a = -0,018

b = 115,9

r = 0,9990

y = 115,9x + (-0,018)

Gráfico D-1. Absorbancia v/s concentración (mg/ml) de fenoles

Ecuación de regresión lineal flavonoides totales

y = bx + a

Donde:

a = -0,0014

b = 0,0790

r = 0,9997

y = 0,0790x + (-0,0014)

Gráfico D-2. Absorbancia v/s concentración (ppm) de flavonoides

parÁmetros organolÉpticos y fisicoquÍmicos para la caracterizaciÓn y uso del propÓleos a nivel...

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