INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Práctica No.1: “Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método de Sanger”

Objetivos Determinar mediante el método de Sanger, aminoácidos con grupo alfa-amino terminal presentes en la cadena molecular de la

hemoglobina.

Introducción La hemoglobina es una proteína de los glóbulos rojos que desempeña una función de transporte, puesto que lleva el oxígeno por la sangre. Además, consta de cuatro cadenas de polipétidos que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno. Este nivel de organización es llamada estructura cuaternaria. Dentro de esta estructura es posible establecer la identidad de los aminoácidos N-Terminales alfa-amino y conocer el número exacto de cadenas que contiene unas moléculas de proteínas, mediante diversos

métodos como el Método de Sanger y la Degradación de Edman. En el Método de Sanger el 1-fluoro-2,4-Dinitrobenceno (DNFB ó reactivo de Sanger) reacciona con los grupos alfa-amino o con grupos imidazol, fenólicos y épsilon amino dando lugar a DNP-aminoácidos. Los aminoácidos libres finalmente resultantes son identificados por cromatografía.En la Degradación de Edman, el Fenil Isotiocianato (PITC ó reactivo de Edman) reacciona con los grupos amino de los aminoácidos N-Terminales en condiciones alcalinas suaves y forma Aducto feniltiocarbamilo. El producto se trata con ácido fluorhídrico anhidro que separa el resto N-Terminal en forma de su derivado de la tiazolinona, pero

no hidroliza otros enlaces peptídicos.

ResultadosCONCEPTO DESCRIPCIÓN

Apariencia del derivado dinitrofenilado Suspensión/ verde-rojizoApariencia de la solución después de la extracción con éter con

FeSO4

Suspensión/amarilla

Apariencia del centrifugado Precipitado/amarilloApariencia del hidrolizado Liquida/amarillo

MUESTRA FRENTE DE LA MUESTRA

FRENTE DEL DISOLVENTE (Regulador de citratos)

RELACIÓN DE FRENTES (Rf)

CROMATOGRAMA

DNP-Val 27.9cm 40.8cm 0.6830

DNP-Phe 23.7cm 40.7cm 0.5823

DNP-Glu 29.2cm 41cm 0.7121

DNFB 19cm 40.3cm 0.4714

Muestra problema

Fs1= 24.5cm 39.8cm 0.6155

Tabla 2.-Observaciones en la cromatografía en papel de los aminoácidos dinitrofenilados tipo y la muestra

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR -HERNANÁNDEZ CASIANO ZAIRA-LUNA CALLEJAS BENJAMÍN3IM1ALCÁNTARA FARFÁN VERÓNICA

UNIDAD DE APRENDIZAJE:ALUMNOS:

GRUPO:PROFESORA:

Tabla 1.-Observaciones en la preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina

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Fs2=17.7cm 39.8cm 0.4447

Discusión de resultadosPARTE 1:Al agregar el bicarbonato de sodio a la hemoglobina provocamos la desprotonación parcial de sus grupos aminos lo que favoreció (al mantener un pH básico) la reacción de Sustitución Nucleofílica Aromática entre la hemoglobina y el DNFB (1fluro-2,4 dinitro- benceno) obteniendo mayoritariamente derivados a la Hemoglobina dinitrofenilada en forma de suspensión de color verde-rojizo (Tabla1). Debido a que el pH de la suspensión oscilaba entre 8 y 9 se ajustó debajo de 3 al usar aproximadamente 12 gotas de HCl 3N el cuál eliminó los restos de bicarbonato de sodio presentes.Se realizaron tres extracciones con éter saturado con solución de FeSO4 (agitando moderadamente) a la suspensión para eliminar el exceso de DNFB residual (desechándolo en la fase etérea) ya que éste tiene carácter no polar al igual que el éter por lo que son afines entre sí.La hemoglobina dinitrofenilada (fase acuosa) la colocamos en baño maría para eliminar los residuos de éter que pudieron haber quedado y posteriormente la centrifugamos durante 15 minutos, eliminando el sobrenadante.Al hidrolizar el precipitado de la centrifugación con HCl 6N (calentamiento en la autoclave por 3 horas a 15 libras por pulgada cuadrada de presión) todos los enlaces peptídicos de la hemoglobina dinitrofenilada se rompieron pero el enlace entre el grupo 2,4-dinitrofenilo y el grupo α-amino del aminoácido N-terminal fue relativamente estable frente a la hidrólisis ácida, por consiguiente, el hidrolizado del péptido dinitrofenilado contenía todos los restos aminoácidos de la cadena peptídica en forma de aminoácidos libres, a excepción del resto N-terminal, el cual aparece como derivado 2,4-dinitrofenilado, de color amarillo (Tabla1).De acuerdo con el autor Francis A. Carey el DNFB también puede reaccionar con los grupos imidazol, épsilon amino y fenólicos de los aminoácidos histidina, lisina y tirosina respectivamente, por lo que después del hidrolizado se tuvieron los DNP-aminoácidos terminales, los DNP derivados no terminales (DNP-Tyr, DNP-Lys, DNP-His), muy poco DNFB residual y los aminoácidos libres. Ante ello fue necesario realizar 3 extracciones con éter, solvente que por tener un carácter no polar al igual que los DNFB-aminoácidos terminales, permitió que éstos quedaran en la fase etérea (la cual se calentó para eliminar el éter residual) y por otro lado los aminoácidos libres y los DNP derivados no terminales al ser afines al carácter polar del agua se quedan en la fase acuosa la cual fue desechada.

PARTE 2:En esta parte pudimos notar con el cromatograma y la relación de frentes (como se muestra en la Tabla 2) que las

muestras patrón más acercadas a nuestro valor de muestra problema fueron el DNFB y la Valina. Esto lo atribuimos primeramente a que nuestra muestra problema presentaba DNP-aminoácidos terminales de valina con restos de DNFB (que fue uno de los componentes con menor relación de frentes). Sin embargo, la movilidad en ambos fue distinta porque que el DNFB es un componente menos afín al diluyente (regulador de citratos) que los DNP-aminoácidos de la valina.

Conclusiones Los DNP-aminoácidos terminales de la

hemoglobina tienen un carácter no polar, no presentan carga y son insolubles en agua.

Los grupos aminos libres de la hemoglobina se comportan como nucleófilos lo cual le permite llevar a cabo una reacción de Sustitución Nucleofílica Aromática con el DNFB en el método de Sanger.

La cromatografía en papel nos permite la separar mezclas de aminoácidos e identificar DNP-aminoácidos terminales libres de la hemoglobina por comparación con muestras patrón.

El aminoácido N-terminal de la hemoglobina es la valina.

Bibliografía y fuentes web[1] AUDESIRK, Teresa y Bruce E. Byer. Biología. Ciencia y naturaleza. 2da edición. Ed. PEARSON, México, 2008, pp. 47-51, 62p.[2] Francis A. Carey “Química Orgánica” Sexta edición Ed. Mc Graw Hill , México 2011 págs.1123-1127[3] http://www.slideshare.net/Ichiriki/bioquimica-estructural Preguntas extra_¿Por qué se utiliza bicarbonato de sodio y no hidróxido de sodio en la preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina?Para contestar esta pregunta es necesario saber que es una reacción de sustitución nucleofílica aromática en donde el autor John Mc Murry la define como “aquella donde un nucleófilo se adiciona a un grupo saliente de un anillo aromático (grupo halogenuro de arilo) deficiente electrónicamente, formando un intermediario estabilizado por resonancia entre los grupos sustractores o atrayentes de electrones (grupos nitros posicionados en orto y para con respecto al grupo saliente) el cual provoca la eliminación del ión halogenuro para dar el producto de sustitución más estable”.Debido a que el bicarbonato de sodio es ligeramente básico no lleva a cabo la reacción de Sustitución Nucleofílica Aromática con el DNFB puesto que los grupos aminos libres

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tienen un mayor carácter nucleofílico que éste, pero si se usará como medio alcalino al Hidróxido de Sodio cuyo grupo hidroxilo tiene un mayor carácter nucleofílico que los grupos aminos libres de la hemoglobina, éste participaría en la reacción provocando la eliminación del grupo saliente que en este caso fue el flúor y obteniéndose mayoritariamente al 1-hidroxi, 2,4-dinitrobenceno en lugar de la hemoglobina dinitrofenilada.