OLI-83 BÚSQUEDA Y ANÁLISIS DE MARCADORES MOLECULARES AFLPS Y MICROSATÉLITES ASOCIADOS A RESISTENCIA A SPILOCAEA OLEAGINA, AGENTE CAUSAL DE LA ENFERMEDAD DEL REPILO ABEL ROSADO REY; DAVID POSE PADILLA; MIGUEL ÁNGEL BOTELLA MESA; VICTORIANO VALPUESTA FERNÁNDEZ. Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología Vegetal,. Edificio I+D 3ª Planta, Universidad de Málaga 29071 Málaga. Teléfono 952131932 Fax 952131932. Correo Electrónico: abeluso@uma.es, dpose@uma.es, mabotella@uma.es, valpuesta@uma.es FORO DEL OLIVAR Y MEDIO AMBIENTE RESUMEN Entre los pocos datos que existen en España sobre las pérdidas de cosechas, se recoge que un 12% se debe a enfermedades, siendo una de las más importantes la causada por el hongo Spilocaea oleagina, agente causal del repilo. Los datos actuales sobre el grado de resistencia de las distintas variedades del olivo al repilo no son consistentes y, en algunas ocasiones, contradictorios. Esto podría explicarse por la presencia de variabilidad genética no caracterizada correctamente en el hongo o en los cultivares estudiados, lo que podría significar que los datos no corresponden a poblaciones homogéneas. Nuestro grupo ha desarrollado herramientas moleculares para la caracterización de aislados de repilo (González-Lamothe et al., 2002) pero no existe ninguna información molecular sobre la existencia de variabilidad genética en el olivo que pueda ser utilizada como marcador de resistencia. La obtención de dicho marcador sería muy importante para el diseño y aplicación de medidas de resistencia a la infección así como para la mejora genética de las variedades comerciales existentes. Nuestro objetivo primordial por tanto, es la búsqueda de los posibles polimorfismos existentes entre variedades de olivo con diferentes grados de susceptibilidad utilizando para ello dos aproximaciones moleculares diferentes: (1) El uso de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) y (2) el uso de microsatélites. SUMARIO La estructura varietal del olivo en España se caracteriza por el uso de un elevado número de cultivares autóctonos, que en su mayoría no satisfacen las necesidades de la olivicultura moderna. Es por tanto necesario el desarrollo de un programa de selección y mejora que brinde nuevas variedades al sector. La existencia en Córdoba de una colección mundial de cultivares de olivo bien caracterizada, en condiciones de campo e in vitro, respecto a su tolerancia o susceptibilidad al repilo nos ha permitido el estudio de variedades utilizando marcadores moleculares. De esta forma se ha podido evaluar la posibilidad de la mejora asistida por marcadores para el desarrollo de nuevas variedades de olivo resistentes a dicha enfermedad. OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO Búsqueda de marcadores AFLPs y microsatélites asociados a la resistencia a repilo en la colección de cultivares del Banco de Germoplasma de Córdoba para ser integrados en una base de datos de marcadores moleculares de dicha colección y evaluar su uso potencial en la mejora e identificación de esta especie. Dicho objetivo principal se subdivide a su vez en una serie de objetivos especificos que son: Mejora de la técnica AFLP utilizando el secuenciador ALF. Análisis de las variedades resistentes y susceptibles procedentes del Banco Mundial. Evaluación de los datos obtenidos e integración en la base de datos.

METODOLOGÍA El estudio utilizando AFLPs se llevó a cabo sobre 45 entradas del Banco Mundial de Germoplasma de Córdoba (Ver póster) Treinta entradas fueron consideradas susceptibles y 15 consideradas

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resistentes al repilo según datos procedentes de prospecciones y observaciones de campo así como inoculaciones artificiales. (Trapero comunicación personal; López Doncel et al. 1995). Estos individuos se agruparon en tres subgrupos de resistencia y tres de susceptibilidad para que el análisis por AFLP fuera más homogéneo y se eliminaran falsos positivos. Para el análisis de marcadores moleculares en poblaciones segregantes se seleccionaron 45 individuos descendencia de un cruzamiento Lechín de Sevilla (resistente) x Picual (susceptible) realizado por el departamento de agronomía de la Universidad de Córdoba. La extracción de DNA se realizó a partir de muestras de hoja joven utilizando un protocolo modificado de Dellaporta et al. (1983). El procedimiento de AFLP se realizó a partir del protocolo de Vos et al.(1995) y consistió fundamentalmente en : Digestión del DNA genómico con dos endonucleasas de restricción Unión de adaptadores de DNA de doble hebra a los fragmentos resultantes de las digestiones Reacciones de amplificación de los fragmentos de restricción en dos pasos, un primer paso de

preamplificación y un segundo de amplificación selectiva. Fraccionamiento de los fragmentos amplificados mediante electroforesis. La electroforesis se

llevó a cabo en un secuenciador ALF (Automated Laser Fluorecent) (Pharmacia LKB) y el procesamiento de datos se realizó utilizando el programa Allelink v.1.0. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el paquete SAS ( SAS Institute, 1987).

El análisis de microsatélites y las pruebas de paternidad de los individuos del cruzamiento se realizó como ha sido descrito previamente en ( de la Rosa et al., 2004) INNOVACIÓN Y RELEVANCIA DEL TRABAJO Un avance importante en el análisis del genoma de plantas ha sido el desarrollo de mapas genéticos y físicos saturados de marcadores moleculares. Estos han suministrado información considerable sobre la organización y la evolución de los genomas vegetales. Estudios realizados en los años 70s demostraron que los genomas de plantas se componen de secuencias repetidas y DNA de simple copia. Estás secuencias de baja copia incluyen las regiones génicas que han sido analizadas predominantemente por la genética clásica siguiendo los fenotipos mutantes o la variación natural. Recientemente los polimorfismos en longitud de fragmentos amplificados por la reacción de PCR (AFLPs) han sido especialmente útiles para el análisis simultáneo de múltiples loci. Esta técnica permite no sólo la generación de mapas genéticos de alta densidad (Keim et al. 1997), sino también establecer relaciones genéticas dentro de una especie (Hill et al. 1996) y , lo que es más importante para el objetivo final del proyecto, ser utilizada convenientemente para el programa de mejora (Brignetti et al. 1997). Los AFLPs producen un gran número de fragmentos polimórficos sin necesidad de probar muchos cebadores, lo que aumenta su eficacia como marcador. Es un marcador consistente y rápido y la resolución de fragmentos en geles de poliacrilamida permite ver bandas claras con ausencia de ruido de fondo. Al igual que otros marcadores basados en polimorfismos de los fragmentos de DNA se expresan independientemente del ambiente, de fenómenos genéticos (pleiotropía, epistasia y aditividad) y del tejido. Nosotros hemos aplicado esta herramienta molecular a la colección del Banco Mundial en relación a un problema agronómico importante como es la resistencia al repilo. Otro tipo de marcador como los microsatélites aparece como una técnica poderosa y tiene grandes ventajas su utilización como marcador molecular co-dominante. Nosotros lo hemos aplicado a un cruzamiento entre una variedad resistente y una susceptible en un primer paso para certificar la fidelidad del mismo. La combinación de distintos marcadores moleculares aumenta la eficiencia de selección permitiendo una selección temprana (especialmente importante en una especie leñosa como el olivo) reduciendo el tamaño de las poblaciones necesarias para el análisis.

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RESULTADOS Optimización del protocolo de AFLP para secuenciadores ALF. Los parámetros optimizados para la obtención de AFLPs rápidos y reproducibles fueron los siguientes: Protocolos de extracción de DNA genómico ( Modificado de Dellaporta (1983)) Cantidad inicial de DNA de partida (1µg) Dilución de molde primario (1/50) Dilución de molde secundario (1/10) Combinaciones de nucleótidos selectivos en la amplificación (+3/+3 y +3/+4). Electroforesis (Condiciones de gel lento, Tampón TBE 0.5X, 20 mW, 1500 V) Análisis de las variedades resistentes y susceptibles del Banco Mundial de Córdoba usando AFLPs El resultado de los análisis utilizando AFLPs fue el siguiente. Combinaciones de cebadores comprobadas: 96 Número de fragmentos medio por combinación de cebadores : 75 Número total de marcadores analizados: 7200 Número medio de marcadores analizados por cromosoma 320 Número de marcadores polimórficos con esta metodología: 4 Análisis de las variedades resistentes y susceptibles del Banco Mundial de Córdoba usando microsatélites. Secuencias microsatélite analizados 10 Microsatélites polimórficos en la población analizada 10 Alelos a analizar 70 Alelos asociados a resistencia 0 Análisis de paternidad de los individuos procedentes del cruzamiento Lechín de Sevilla x Picual utilizando microsatélites Individuos analizados 45 Número de microsatélites utilizados 4 Individuos con ,al menos, la dirección del cruzamiento incorrecta 8 Individuos no pertenecientes al cruzamiento 1 CONCLUSIONES El grado de resistencia o susceptibilidad en variedades de olivo se realiza en su gran mayoría en condiciones de campo en ambientes diferentes y sin elementos comunes de comparación por lo que la utilización de un elevado número de variedades en los estudios aumenta las posibilidades de enmascarar los marcadores moleculares asociados a resistencia. Ningún polimorfismo obtenido en el análisis de subgrupos por AFLP ha podido asociarse claramente a Resistencia. El único candidato con posibilidades es el marcador 220 M30-E41 que aparece en 11 variedades susceptibles y en ninguna de las Resistentes. El análisis por AFLP de una población segregante procedente de un cruzamiento de una variedad resistente x una susceptible comprobados por estudios de campo e in vitro es una aproximación más adecuada para la obtención de marcadores asociados. El uso de microsatélites de olivo es una herramienta muy poderosa y simple para el análisis de poblaciones segregantes. De los 45 individuos procedentes del cruzamiento Lechín de Sevilla x Picual solamente 36 pueden ser individuos del cruzamiento después del análisis de 4 microsatélites. El polimorfismo observado en los marcadores microsatélites en la población de estudio permite la realización de estudios de relaciones genéticas y buscar asociaciones entre dichos marcadores y diversas características agronómicas de interés (contenido graso, juvenilidad, etc)

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REFERENCIAS Barranco et al.,1998 El cultivo del olivo 2ª edicion 473-480 Brignatti et al.,1997 Theor.Appl.Gen, 1202-1210 De la Rosa et al.,2004 HortScience 39 Dellaporta et al., 1983 Plant Molec. Biol. Rep. 19-21 Hill et al., 1996 Theor.Appl.Gen, 1202-1210 Keim et al., 1997 Crop.Sci.,537-543 Lopez-Doncel et al,1995 V Symposium Nacional de de Sanidad Vegetal. Sevilla Vos et al., 1995 Nucleic Acids Res. 4407-4414

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