¿¿PlPláásticos Bacterianos?sticos Bacterianos?

Dr. Jorge MartDr. Jorge Martíínez Silvanez SilvaProfesor InvestigadorProfesor InvestigadorFacultad de Ciencias QuFacultad de Ciencias Quíímicas, UANLmicas, UANL

Algunos usos de los PlAlgunos usos de los Pláásticossticos

Bolsas para compras y empaques de alimentosEstructuras mecánicas y de soporte de todo tipoPinturas Materiales impresos de todo tipoPiezas de motores de autosArmas

Énfasis Packaging› N°3 › mayo/junio 2007

Requerimientos para el Envasado Requerimientos para el Envasado Efectivo de AlimentosEfectivo de Alimentos

No TóxicoProteger de contaminación microbiológicaProteger del ingreso de olores ambientalesBarrera a la humedad y O2

TransparenteCompatible con el alimentoFácil de abrirBajo costoDeposición luego del uso: Fácil

Basada en Basada en Fuentes Fuentes

RenovablesRenovables SSííntesis ntesis MicrobianaMicrobiana

PoliPoliéésteressteresAlifAlifááticosticos

PoliPoliéésteressteresAlifAlifááticotico--aromaromááticos ticos

PoliesteramidasPoliesteramidas

Alcoholes Alcoholes polivinpoliviníílicoslicos

PolihidroxialcanoPolihidroxialcano--atosatos ((PHAsPHAs))

PolihidoxibutiratoPolihidoxibutirato--coco--valeratovalerato (PHBV)(PHBV)

PLA obtenido de PLA obtenido de

mamaííz o almidz o almidóónn

PlPláásticos Celulsticos Celulóósicossicos

PlPláásticos obtenidos sticos obtenidos

de Soyade Soya

PlPláásticos de almidsticos de almidóónn

Fuentes Fuentes PetroPetro--Bio Bio (Mixed)(Mixed)

SoronaSorona

Poliuretano Poliuretano BiobasadoBiobasado

EpEpóóxidosxidosBiobasadosBiobasados

Blendas, Blendas, etcetc

PolPolíímerosmeros: : ClasificaciClasificacióónn

SintSintééticas ticas PetroPetro--basadasbasadas

SSííntesis ntesis bacterianabacteriana de de polipoli--HAsHAs

GrGráánulos en el microorganismonulos en el microorganismo

Direct route

Polímero

Productoplástico

Luz solar

Procesofermentativo

Cosecha

BiodegradaciónCarbohidrato

PHBPHB

Courtesy: Metabolix & BiomerCourtesy: Metabolix & Biomer

SSííntesis ntesis bacterianabacteriana de de polipoli--HAsHAs

O

R

OH

OH

xn

EstructuraEstructura del PHAdel PHA

PHAPHA RRPHB PHB -- CHCH33PHV PHV -- CHCH22CHCH33PHBV (BiopolPHBV (Biopol®®) ) -- CHCH33 & CH& CH22CHCH33PHBHxPHBHx -- CHCH33 & & -- (CH(CH22))22CHCH33PHBO PHBO -- CHCH33 & & -- (CH(CH22))44CHCH33

R = R = HidrocarburoHidrocarburo((hastahasta CC1313))

x = 1 a 3 o x = 1 a 3 o mmááss

Courtesy: Metabolix & BiomerCourtesy: Metabolix & Biomer

BioplBiopláásticossticos BacterianosBacterianosVentajas

▲ Síntesis amigable al ambiente▲ Biodegradable

▲ Excelentes propiedades mecánicas

▲ Excelente procesabilidad

▲ De fuentes renovables

▲ Termoplástico

Desventajas▲ Variedad de estructuras

▲ Ausencia de grupos reactivos

▲ Alto costo de producción

▲ Estrecha ventana de procesamiento

▲ Fragilidad

Propiedades de los Propiedades de los polihidroxialcanoatospolihidroxialcanoatos

Protección:Barrera a la luzBarrera a gases (O2, CO2, C2H4)Barrera al vapor de aguaBarrera a la pérdida de aromas y sabores

Énfasis Packaging› N°3 › mayo/junio 2007

AplicacionesAplicaciones

Matrices liberadoras de Matrices liberadoras de sustancias: fsustancias: fáármacos, rmacos,

insecticidas, herbicidas o insecticidas, herbicidas o fertilizantes

Empaquetamiento de alimentos: recipientes,

filmes, bolsas, recubrimientos de papel fertilizantes

AplicacionesAplicaciones

Otros dispositivos como: cuchillas, utensilios, Otros dispositivos como: cuchillas, utensilios, papaññales, productos de higiene femenina, ales, productos de higiene femenina,

recipientes para cosmrecipientes para cosmééticos, shampoo y otros.ticos, shampoo y otros.

AplicacionesAplicaciones

Otras aplicaciones mOtras aplicaciones méédicas: hilos quirdicas: hilos quirúúrgicos, vendas para heridas, rgicos, vendas para heridas, uso en ortopedia donde se conjuga tambiuso en ortopedia donde se conjuga tambiéén con propiedades n con propiedades

piezopiezo--elelééctricas que estimulan el crecimiento del hueso.ctricas que estimulan el crecimiento del hueso.

Costo de ProducciCosto de Produccióónn

Nuevas bacterias

Organismosrecombinantes

Procesos de fermentación y

extracción de PHAs

AMBIENTES DE LAS BACTERIAS PRODUCTORAS DE PHAs

Aislamiento y PurificaciAislamiento y Purificacióón de Microorganismosn de Microorganismos

MEDIO BASEGlucosa-Manitol 5,0 g Peptona 2,5 gExtracto de levadura 2,5 g Nilo rojo 0,01%Agar 1,2 g

48 aislados bacterianos

Esquema de Producción de PHAs por Bacterias Silvestres

120 r.min-1, 30 OC, 24 h.

8000 r.min-1 x 5 min Lisis: Hipoclorito de Na, 37 OC, 2 h.

8000 r.min-1 /5 min

Cultivo por estrCultivo por estríías de las cepas en as de las cepas en medio NR (placa), 36 h.medio NR (placa), 36 h.

ObservaciObservacióónn bajo luzbajo luz ultravioleta ultravioleta de las cepas NR positivas.de las cepas NR positivas.

A. IdentificaciA. Identificacióón de los Aislados Seleccionadosn de los Aislados Seleccionados

Características del cultivo

Características microscópicas

Perfil de oxidación de azúcares (Api 50 CHB)

B. CaracterizaciB. Caracterizacióón del Poln del PolíímeromeroFTIR CG-MASAS

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 1200e3

250e3

500e3

750e3

1000e3

1250e3

1500e3

1750e3

2000e343

7442

57 85

103

117

SelecciSeleccióón e Identificacin e Identificacióón de un n de un Aislado Productor de Aislado Productor de CopolCopolíímeromero

48 Morfotipos RN +3 Morfotipos CG –

13 Morfotipos Copolímero

SelecciSeleccióón de Aislados Bacterianos n de Aislados Bacterianos Productores de PHAProductores de PHA

MORFOTIPOSNR positivos Copolímero

Bacillus mycoides FLB2

HomopolímeroRhizobium tropici 3A

CromatogramaCromatograma de Gases de de Gases de ÉÉsteres de Metilo steres de Metilo y Espectro FTIR del PHA de la cepa FLB2y Espectro FTIR del PHA de la cepa FLB2

OptimizaciOptimizacióón de los Medios de Cultivo n de los Medios de Cultivo (Agitadora)(Agitadora)

SUSTRATOS

MelazaExtracto de carne Extracto de levaduraSacarosaManitol

CONDICIONESInóculo 18 horasConcentración 10%

Agitación 120 rpm

Temperatura 30 OC

METODO (Box y col., 1988) Exploratorio Diseño Factorial 23

Máxima pendiente Bloques al azarOptimización Diseño factorial 23 con

puntas de estrella

Variable de respuesta PHA en mg.L-1

Perfil tPerfil tíípico de una fermentacipico de una fermentacióónn

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

t (h)

Abs

(600

nm

)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000PH

B m

g/L

Abs PHB

Perfil de fermentación típica de Rhizobium tropici-3, en fermentador Inforst HT con vaso de 7,5 L y volumen efectivo de 5 L de medio optimizado (Lasala, 2000), 500 rpm y 1 v.v.m., 30 ± 2,5°C y pH inicial de 6,6 ± 0,3, µ=0.031 h-1.

Perfil de Fermentación de Bacillus mycoides Cepa FLB2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Tiempo horas

Azu

car

g/L

0

2

4

6

8

10

12

PH

A-B

iom

asa

g/L

Azucar Biomasa PHA

Estudio de aplicaciEstudio de aplicacióón de la tecnologn de la tecnologíía a FedFed--BatchBatch..

Estudios de algunos parámetros cinéticos de la cepa Rhizobium tropici-3.

µ (h-1)

0

0.04

0.08

0.12

0.16

0.2

0 3 6 9 12 15 18 21 S (g/L)

1/µ (h)

4

5

6

7

8

9

0 0.1 0.2 0.3 0.41/S (g-1/L)

Relación entre µ y la concentración inicial de sacarosa en el medio de fermentación y relación de los inversos de estas mismas variables.Cultivo en agitadora, 10 h a 70 r.min-1 con regulación de la temperatura 32±2 ºC, pH inicial= 6.73.

012345678

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10t(h)

dC/dt (g/h)dC/dt(g.h-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10 12

C (g.L-1)

Comportamiento de la velocidad de consumo de sacarosa en función de la concentración de la misma en el medio optimizado y en función del tiempo. Cultivo en zaranda de 10 horas a 70 rpm con regulación de la temperatura 32 ± 2 ºC, pH inicial= 6.73.

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30t(horas)

PHB(g/L)

Variante 1 Variante 2 Variante 3 Variante 4

Perfiles de la producción de PHB de las cuatro variantes de cultivo por lote incrementado realizada en frascos de 2L, con 1L de medio optimizado, agitación neumática de 0.5vvm, temperatura 30 ± 2,5 °C y pH inicial de 6,58.

Productividad: Agitadora P= 0.084 g.L-1.h-1

Fermentador de 5L P= 0.90 g.L-1.h-1

Cultivo en Fermentador

de 5L

Escalado:Cultivo en 50 L, 500 r.min-1, 1vvm, 30°C

Banco de cepa Preinóculo

1 L con 250 mL de medio de cultivo

optimizado, 12 h de cultivo, 100 rpm, 30 0C

Cultivo de 20 h, 500 rpm, 1 wm,

30 0C. Centrifugación (Recuperación de la biomasa)

Extracción del polímero (lejía de cloro + EDTA , 37 °C, 1.5 h)

Purificación

(Cloroformo, 2h, 45°C, agitación)

CentrifugaciónFiltración y destilación

Esquema del proceso de escalado de la producción de PHB en 50 L.

ConclusionesConclusiones GeneralesGenerales

Fue elaborado un método de selección en placa de cepas productoras de polihidroxialcanoatos .Colección de cepas productoras de niveles hasta de 8 g.L-1 de polihidroxialcanoatosempleando sacarosa como fuente de C.Elaboración de un esquema de obtención del polímero con la reducción de solventes.

Conclusiones (cont.)Conclusiones (cont.)

La homogeneidad del sistema es mLa homogeneidad del sistema es máás s importante importante qqueue la aireacila aireacióón.n.

Los microorganismos empleados son Los microorganismos empleados son resistentes a altosresistentes a altos esfuerzos cortantes.esfuerzos cortantes.

El mejor criterio de escalado es el de la El mejor criterio de escalado es el de la velocidad tangencial.velocidad tangencial.

El El pHpH óóptimo inicial es de 6,58 ptimo inicial es de 6,58 ±± 0,32 sin 0,32 sin ajuste posterior.ajuste posterior.

Conclusiones (cont.)Conclusiones (cont.)

Las condiciones de fermentaciLas condiciones de fermentacióón son: n son: 2222––24h; in24h; inóóculo de 10 % en fase culo de 10 % en fase exponencial media.exponencial media.

Es posible sustituir el Hipoclorito de sodio Es posible sustituir el Hipoclorito de sodio en laen la primera fase de extracciprimera fase de extraccióón por n por hidrhidróóxido de amonio.xido de amonio.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

Realizar estudios que permitan confirmar la Realizar estudios que permitan confirmar la ruta metabruta metabóólica propuesta que conduce a la lica propuesta que conduce a la ssííntesis del copolntesis del copolíímero P(3mero P(3--HBHB--coco--HV) HV) producido por la cepa de producido por la cepa de B. mycoidesB. mycoides FLB2.FLB2.

Optimizar las condiciones de agitaciOptimizar las condiciones de agitacióón y n y aireaciaireacióón en fermentador de 5 L para n en fermentador de 5 L para desarrollar una estrategia de produccidesarrollar una estrategia de produccióón del n del copolcopolíímero sintetizado por la cepamero sintetizado por la cepa B. B. mycoides mycoides FLB2FLB2

Estudios Fundamentales para la Estudios Fundamentales para la AplicaciAplicacióónn

Materiales compuestos con Materiales compuestos con hidroxiapatitahidroxiapatita, de , de uso en ortopedia.uso en ortopedia.

Mezclas de PHA con otros polMezclas de PHA con otros políímeros meros biodegradables, con el objetivo de disminuir biodegradables, con el objetivo de disminuir su costo y tambisu costo y tambiéén variar sus propiedades.n variar sus propiedades.

Estudio de los procesos de difusiEstudio de los procesos de difusióón y n y permeacipermeacióónn en membranas densas de PHA, en membranas densas de PHA, de vapores de agua, alcohol, etc.de vapores de agua, alcohol, etc.

ParticipantesParticipantes

Dr. Jorge Martínez, Profesor Titular, Responsable del Laboratorio de Fisiología Microbiana, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba.

MC Maria Elena Carballo, Profesor AsistenteMC Rubén Solano, TécnicoEstudiantes de Licenciatura:Ileana Paneque, Zhenia Banchicova, Maylen López

Estudiantes de Maestría:Fátima Lasala, Gretel Gómez, Julyet Marrero,

Otros Colaboradores (Instituto de Oceanología):

MC Roberto Núñez

MC Eudalys Ortiz

Ing. Osmar Barbán