UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Lluvia Briseida Espinoza Morales

Métodos cromatográficos

Fase estacionaria

Plana

Columna

Papel

Capa fina

Gases

Adsorción

Partición

Adsorción Intercambio iónico

Partición Exclusión

AFINIDAD

Líquidos

Cromatografía de adsorción sólido-líquido

Soporte sólido + Ligandos

Retienen a los analitos Separaciones

hormona-receptor

proteína-metal o cofactores como ATP

antígeno-anticuerpo

SOPORTE Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con rigidez, inerte y

estable (agarosa, acrílica).

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Ligando específico unido a la matriz.

F. MÓVIL (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la afinidad con el ligando de

la fase estacionaria.

Estructura

Normal

Inversa

No especifica

Es el material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad.

Propiedades:

• Tener una gran superficie,

• Tamaño del grano controlable,

• Porosidad controlable,

• Carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas,

• Estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.

Material utilizado para el soporte son:

Geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

Soportes

Fase estacionaria

Fase móvil

Ligando unido a soporte sólido insoluble

• Solución sin ligando

• Solución con ligando libre

Preparación de la columna

• El tamaño de la columna esta determinado por la cantidad de muestra a fraccionar, en una relación adsorbente/muestra de 100:1.

• El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo más frecuente es en forma de papilla con el eluyente. Se hace de la siguiente manera:

1. Se coloca la columna recta

2. Se le agrega de 2 a 4 cm, por encima de la lana de vidrio, de solvente. Se elimina el aire que puede permanecer retenido en las paredes, agitando por medio de una varilla de vidrio.

3. Se agrega la papilla y se dan pequeños golpecitos a la columna durante el llenado, mediante un tubo de goma, hasta alcanzar la altura deseada.

4. Se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente. La altura del disolvente no debe exceder más de 2 a 5 cm sobre el sólido.

Preparación de la muestra

• La muestra se aplica en forma líquida. Si es necesario se diluye y se aplica

directamente.

• Si la muestra es sólida, se disuelve en un pequeño volumen de disolvente. El

disolvente puede ser el mismo que se utiliza como fase móvil u otro que sea miscible

con ella.

Aplicación de la fase móvil

• Se aplica con una pipeta cuenta gotas.

• Cantidad: de 0.5 a 1 cm arriba del lecho de la columna

Características generales de la cromatografía de afinidad que la distinguen de otros tipos de cromatografías líquidas:

– Alta selectividad en el mecanismo de retención

– Campo de aplicación restringido

– Separación de un solo soluto analito

– Empleo de sistema de baja presión

– Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica

Ligando

Según su naturaleza

Según su actuación Específicos y generales

Macromoléculas biológicas

Etapas fundamentales

M

1. Inmovilización del ligando

+ L M - L

2. Adsorción de la sustancia a purificar

M - L + M - L - P + P

A

A = Enlace Covalente

3. Desorción de la sustancia fijada

M - L - P M - L + P

1 2 3

1. Se introduce en la columna un volumen muestra

2. La columna contiene un soporte polimérico inerte enlazado covalentemente a un ligando de afinidad

3. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito de la muestra insertada que queda retenido

4. Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento.

5. A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el

acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-

ligando, del soluto (proteína) o de ambos.

6. Generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de

los sitios activos; se eluye así el soluto de interés.

7. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna,

lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y

constituye una etapa rápida.

Fundamento de las separaciones por cromatografía de afinidad

NO INTERACCIÓN RÁPIDAS

No se unen al ligando de la fase estacionaria

INTERACCIÓN LENTAS

Se unen al ligando de la fase estacionaria

Elución específica

ANÁLISIS DEL

CONTENIDO DE LAS

FRACCIONES

PERFIL DE ELUCIÓN

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

ues

ta d

el d

etec

tor

fracción

Moléc. distribuida en f.móvil

Moléc. distribuida en f.estacionaria

Espectrofotométrico Abs 280nm – Proteínas Otras Abs - Colorantes

FRACCIONES

1 2 4 5 6 7 8 9 3

El HPLC es una técnica, en columna, utilizada para separar los componentes de una

mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias

analizadas y la columna cromatográfica.

Utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica.

Aplicaciones

Idónea para separaciones de especies no volátiles

y termolábiles

Sustancias: aminoácidos, proteínas, ácidos

nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,

drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos,

esteroides, especies organometálicas y una

cierta variedad de sustancias inorgánicas.

Generalmente en fase inversa: fase estacionaria de C8-C18; fase móvil acuosa con

acetonitrilo o etanol.

– Útil para sustancias:

• Alto peso molecular

• Baja volatilidad

• Lábiles, degradaciones térmicas

• Polares

1. Reservorio para el disolvente y sistema para desgasificarlo

2. Bomba (Velocidad de flujo: 3 mL/min)

3. Precolumna

4. Sistema de Inyección

5. Columna

6. Detectores

Partes de un instrumento

Presiones estables hasta 6000 psias

Flujo libre de pulsaciones

0,1 a 10 mL/min

Control y reproducibilidad del flujo de solvente

Resistencia a la corrosión

Reservorio de Solvente

Bomba

Contenedores

Sistema de gasificación

Precolumnas Retirar las impurezas del disolvente

Sistema de Inyección Válvulas giratorias para muestras

2 a 100 µL

Columnas

Detectores Propiedad de fase móvil

Propiedad de la sustancia a separar

Capilares

De rango analítico

De diámetro interno grande

Elección del solvente

Características:

• Pureza y Estabilidad

• Disolver la muestra

• Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles

• No degradar o disolver la fase estacionaria

• Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión

• Ser compatible con el detector utilizado

Programación del solvente

Existen dos métodos de programación del solvente en HPLC:

1. Elución Isocrática: Separación en la que se utiliza solamente un disolvente.

2. Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Se utilizan dos y a veces más disolventes que difieren significativamente en su polaridad.

Agua, el metanol y el acetonitrilo

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Control de temperatura

• La mayoría del trabajo en cromatografía líquida se realiza a temperatura

ambiente y sin termostatización.

• En el comercio se encuentran columnas con camisas para agua que se utilizan

cuando se desea un control preciso de la temperatura.

Análisis Cualitativo y Cuantitativo

• El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina

tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica

de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

• Como en Cromatografía de gases.

BIBLIOGRAFÍA

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm

http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf

YOUNG, Stella de. “Introducción a la cromatografía”. Universidad Nacional de Colombia.

ISBN9581701192, 9789581701193