PRACTICA Nº 4.

OBTENCIÓN DE ETANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE INMOVILIZADA EN AGAR

1. MARCO TEÓRICO:

El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un área de la Ing. Biotecnológica en continua expansión. Un aspecto clave del proceso es extender el uso de los mismos en un sistema continuo dando como resultado una disminución de los costos del proceso y otras ventajas como una mayor pureza del producto y mayor productividad.

Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan, según la European Federation of Biotechnology (1983) define a los biocatalizadores inmovilizados como células, organelos u enzimas (o combinación de ellos) confinados o localizados en cierta región definida del espacio, con retención de su actividad catalítica, que pueden ser usados de modo repetido y continuo, y que además permite obtener el producto final deseado exento de sustancias biológicas y células, excluyendo algunas etapas de purificación.

En algunos casos, los biocatalizadores se encuentran unidos a materiales de soporte insolubles (carriers) y en otros casos se encuentran confinados por atrapamiento

Las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae han sido utilizadas tradicionalmente en la industria de la producción de etanol, con el propósito de incrementar los niveles productivos, uno de los procedimientos biotecnológicos más útiles es inmovilizar las levaduras en diferentes soportes como agar, alginato de calcio, carragenatos, colágeno, almidón, etc., obteniéndose pellets, que permiten la difusión de los sustratos (glucosa) y productos (etanol y dióxido de carbono). Por tanto las instalaciones piloto producen durante meses continuamente etanol a partir de glucosa con la ayuda de células inmovilizadas.

El objetivo es incrementar la producción de etanol, simultáneamente con el mantenimiento del nivel proteico mediante la utilización de las técnicas de inmovilización.

2. OBJETIVOS:2.1.Comprender los principios básicos de la inmovilización de células. 2.2.Explicar la inmovilización de Saccharomyces cerevisiae en soporte de agar. 2.3.Explicar el proceso de obtención de etanol a partir de materia prima fermentable y

levaduras inmovilizadas en agar. 2.4.Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación. 2.5.Enfatizar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad, responsabilidad,

cooperación y perseverancia.

3. MATERIALES:

3.1.Material biológico: Levadura liofilizada, Saccharomyces cerevisiae.

3.2.Materia prima fermentable: Mosto de uvas.

3.3.Insumos: Aceite. Agar-agar.

3.4.Material de vidrio: Baguetas. Balones de 250 mL. Beakers de 250, 400 y 600 mL. Matraces de 250 mL. Probetas de 50 y 100 mL. Pipetas Pasteur.

3.5.Otros: Agitador magnético. Espátula. Gasa. Jeringa hipodérmica (20 mL) Morteros. Papel toalla.

3.6.Equipos: Balanza analítica. Baño termostático. Hotplate. Licuadora. Refractómetro.

4. PROCEDIMIENTO DETALLADO:

4.1.Acondicionamiento de materiales: Solubilizar la levadura liofilizada en agua destilada.

En un balón disolver el agar en agua destilada, con calentamiento y agitación constante.

Calibrar el Baño María a 50ºC, para mantener el agar licuado. Colocar en una probeta de 100 mL de aceite vegetal y posteriormente llevarlo al

refrigerador.

4.2.Inmovilización de la enzima: Mezclar 50 mL de la suspensión de levaduras y 50 mL de agar-agar licuado.

Homogenizar.

Tomar en una jeringa hipodérmica 20 mL de la mezcla y dejar caer gota a gota en la

Probeta que contiene el aceite. Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.

Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves. Secar los pellets en papel toalla.

4.3.Obtención de la materia prima fermentable: Obtener por prensado mosto de uva.

Filtrar con una gasa el jugo obtenido.

Tomar una alícuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados Brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.

4.4.Obtención del etanol: En un beaker, colocar los pellets y el mosto de uva. Agitar la mezcla en un hot plate.

Tomar alícuotas y leer los grados Brix en el refractómetro, cada día durante una semana.

Figura N°4: Mosto de uva con levaduras inmovilizadas en agar

Fuente: Registro de la práctica

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

Días Viernes Lunes Miércoles Jueves°Brix 17°Brix 25°Brix 18°Brix 14°Brix

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

25

30

Grados Brix

Tiem

po (d

ias)

Gráfica: Grados °Brix vs. diasDurante el tiempo que el mosto de uvas con levaduras inmovilizadas estuvo alcanzo su mayor rango de producción de etanol el día lunes pero los días miércoles y jueves descendieron debido quizá a que la cantidad de azúcar del mosto de uvas ya fue degradado por la levadura quedándose esta sin sustrato para degradar y transformar el azúcar en etanol.

6. CONCLUSIONES:

La utilización de levaduras para producir etanol mediante la fermentación alcohólica de azucares es una técnica bastante interesante debido a que intervienen una serie de reacciones bioquímicas, en la práctica realizada vimos que nuestros grados de alcohol medidos por el refractómetro fue descendiendo debido a que la levadura dejo de producir etanol porque el azúcar que degrada se consumió o debido a la cantidad de oxigeno que se le suministro a esta.

7. SUGERENCIAS:

Se podría plantear la utilización de otra levadura y que esta consuma orto tipo de azúcar y poder compararla con la levadura utilizada en esta práctica (saccharomyces cerevisiae).

8. CUESTIONARIO:

¿Por qué es importante la inmovilización de células?

Es una técnica que nos ayuda a mantener las características específicas de las células que se va a inmovilizar y pudiéndolas utilizar en otro momento sin el riesgo de desnaturalizarse por motivos ambientales, bioquímicos o metabólicos.

¿Qué otros método se utiliza para inmovilizar células?

Entrecruzamiento fisico (floculacion). Entrecruzamiento covalente. Adsorcion sobre matrices insolubles Enlace covalente con matrices insolubles. Entrampamiento fisico en materiales porosos. Encapsulamiento. Enlace Covalente Enlaces Cruzados y Autoinmovilización Sistemas con Membranas

¿Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?

La inmovilización de levaduras en perlas es mantener la actividad metabólica de la levadura para ser utilizada con éxito en fermentaciones como el vino blanco y producción de etanol.

¿En qué consiste la fermentación alcohólica?

Consiste en la transformación de azucares por una serie de reacciones bioquímicas para producir etanol, una las principales reacciones es la glucolisis.

¿Cuál es el fundamento del refractómetro?

El refractometro se utiliza PARA medir el índice de refracción de sólido y líquidos, permitiendo de esta manera:

Identificar una sustancia. Verificar la pureza de una muestra. Analizar el porcentaje de un soluto en una solución. Otros análisis cualitativos.

9. BIBLIOGRAFÍA:

http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2011/03/14/la-fermentacion-alcoholica-como-se-produce-y-aplicaciones/

http://www.ehowenespanol.com/vino-tinto-partir-uvas-frescas-como_174817/

http://www.verema.com/articulos/500449-levaduras-fermentacion-alcoholica-ii

http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=181

10. ANEXOS:

http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2011/03/14/la-fermentacion-alcoholica-como-se-produce-y-aplicaciones/