obtención de ácido láctico a partir de la caña de...

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACY T-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA - UVG -

INFORME FINAL

Obtención de ácido láctico a partir de la caña de azúcar

PROYECTO FODECYT No. 003-2008

CARLOS EDMUNDO ROLZ ASTURIAS Investigador Principal

GUATEMALA, AGOSTO DEL 2011

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AGRADECIMIENTO La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología –FONACYT- otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

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EQUIPO DE INVESTIGACIÓN:

M.Sc. Carlos E. Rolz Asturias Investigador Principal

M.Sc. Luis Roberto De León Fajardo

Investigador Asociado

Lic. Fabiola Prado de Micheo Investigador Asociado

Sr. Carlos Humberto Arias Méndez

Técnico de Laboratorio

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Resumen Se llevaron a cabo una serie de pruebas experimentales para comprobar la factibilidad de

transformar, sin su previa extracción, los azúcares solubles presentes en la caña de azúcar

madura a ácido láctico. Se utilizaron cepas de diferentes bacterias lácticas y una cepa del

hongo Rhizopus oryzae. La bacteria L. lactis DSM 4366 y el hongo R. oryzae CBS 146.22

fueron capaces de crecer empleando la sacarosa extraída de la caña y producir ácido

láctico. Las primeras horas de operación en los diferentes sistemas ensayados fueron

exitosas. El pH descendió paulatinamente entre el intervalo de 6.0 a 5.0. El crecimiento fue

notorio y el rendimiento para el caso del hongo de ácido láctico en base al azúcar

consumido, fue igual a 0.89, valor que estuvo en el rango alto de los rendimientos

reportados en la literatura con otros substratos. Ambos microorganismos mostraron una

inhibición en su crecimiento cuando el pH descendió por debajo de 4.6 a 4.8, siendo

entonces, bastante sensibles al efecto dañino del ácido láctico disociado que se acumuló en

el medio al disminuir el pH. Las bacterias lácticas B.coagulans DSM 23080, L. lactic DSM

4366 y L. paracasei DSM 20008 utilizaron igualmente la glucosa o la sacarosa como única

fuente de carbono, tanto en pruebas empleando reactivos puros, como en pruebas con jugo

de caña en donde además de los azúcares anteriores, utilizaron también la fructosa

presente. Sin embargo, fue necesario agregar al medio una fuente compleja de nitrógeno

orgánico, fosfato y minerales. En el caso del hongo R. oryzae CBS 146.22, asimiló sin

problemas los tres azúcares presentes en el jugo de caña, sacarosa, glucosa y fructosa.

Además, creció mejor al agregar 4 g/L de una fuente de nitrógeno inorgánico, fosfato y

magnesio. Por medio de un diseño factorial de experimentos se constató la existencia de

una interacción entre la fuente de nitrógeno y las sales. Se logró operar satisfactoriamente

un sistema de extracción fermentación circulando el medio entre el tanque fermentador y el

recipiente extractor. El sistema funcionó mejor con caña pulverizada y parcialmente

deshidratada o pasterizada, con el objeto de bajar la carga microbiana existente en la caña

original, aún después de ser lavada con agua. El hongo mostró una tendencia a adherirse a

las superficies de vidrio del recipiente o las superficies de acero inoxidable de los

accesorios internos en el tanque, aglomerándose en grandes flóculos blancos semejantes al

algodón. Se demostró, a través de una simulación simple, el efecto significativo que los

cambios del rendimiento del ácido láctico y del porcentaje del consumo de los azúcares

presentes al inicio del proceso tienen sobre el costo unitario de producción.

Palabras clave: Caña de azúcar – Ácido láctico – Fermentación

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Summary Bench scale experiments were done in order to characterize the biological transformation

into lactic acid of the soluble sugars present in the lignocellulosic matrix of sugarcane

particles. Different lactic acid bacteria and a R. oryzae strain were tested and compared.

Both L. lactic DSM 4366 and R. oryzae CBS 146.22 were able to utilize the sugars for

lactic acid production. The early part of the batch fermentations of the different systems

employed was a successful operation. Gradually pH decreased from an initial value close

to 6.0 to around 5.0. Growth was obvious and the fermentation yield, in terms of sugar

consumed, for R. oryzae was 0.89, value that is in the upper part of the range of values

reported in the literature for various substrates. However both microorganisms showed

growth inhibition by product accumulation. The effect was observed when pH reached

values between 4.6 and 4.8 when undoubtedly the lactic acid molecule was dissociated. On

the other hand, B. coagulans DSM 23080, L. lactic DSM 4366 and L. paracasei DSM

20008 in tests employing pure compounds or sugar cane juice, used sucrose as efficiently

as glucose. The growth medium, however, required the addition of a complex organic

nitrogen source, phosphate and minerals. A factorial design showed that for R. oryzae the

addition of inorganic nitrogen, phosphate and magnesium enhanced lactic acid production

from sugarcane soluble sugars, and factor interactions were significant. A bench scale

extraction fermentation systems with media circulation was successfully operated.

Pulverized and pasteurized partially dehydrated cane was preferred. As was expected R.

oryzae showed a tendency to adhere to glass and stainless steel surfaces, forming large

fluffy flocs resembling cotton. The unitary production cost for lactic acid was heavily

influenced by the fermentation yield and sugar consumption, as shown by a simple

numerical simulation.

Key words: Sugar cane – Lactic acid - Fermentation

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ÍNDICE

PARTE I INTRODUCCIÓN Y METODOLOGÍA

I.1 INTRODUCCIÓN I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala I.2.2 Justificación de la investigación I.3 OBJETIVO E HIPÓTESIS I.3.1 Objetivo general I.3.2 Objetivos específicos I.3.3 Hipótesis I.4 METODOLOGÍA I.4.1 Microorganismos empleados en la experimentación I.4.2 Pruebas exploratorias del crecimiento en frascos I.4.3 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña

I.4.4 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña congelada I.4.5 Aumento de escala: extracción-fermentación de flujo circulante I.4.6 Trazo de gráficas y análisis estadístico

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PARTE II MARCO TEÓRICO

II.1 Producción industrial de ácido láctico II.2 Proceso industrial convencional II.3 Desarrollos en progreso II.4 Microorganismos productores de ácido láctico II.5 Experiencias con productos de caña de azúcar II.6 Experiencias con otras materias primas azucaradas II.7 Experiencias con otros substratos II.8 Experiencias en el mejoramiento de cepas y optimización de medios II.9 Estudios del proceso II.10 Cinética y modelos en la producción de ácido láctico

PARTE III RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.1 RESULTADOS III.1.1 Recuperación de las cepas de microorganismos III.1.2 Pruebas exploratorias del crecimiento en frascos III.1.3 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña deshidratada III.1.4 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña congelada III.1.5 Aumento de escala: extracción-fermentación de flujo circulante III.1.6 Aspectos técnico-económico del proceso III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

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PARTE IV

CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES, BIBLIOGRAFÍA Y ANEXO S IV.1 CONCLUSIONES IV. 1.1 Primera conclusión IV. 1.2 Segunda conclusión IV. 1.3 Tercera conclusión IV. 1.4 Cuarta conclusión IV. 1.5 Quinta conclusión IV.2 RECOMENDACIONES IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS (bibliografía citada en el texto) IV.4 ANEXOS IV.4.1 ANEXO 1. Referencias no citadas en texto

PARTE V INFORME FINANCIERO

V.1 Informe financiero

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PARTE I

INTRODUCCIÓN Y METODOLOGÍA I. 1 Introducción

El incremento reciente en los precios del petróleo ha puesto de manifiesto al

público en general la relación directa que dicho indicador tiene sobre el mercado de los

combustibles. Más solapadamente, sin embargo, paulatinamente se hará notar también, la

influencia sobre el suministro y la estructura económica de los compuestos químicos, ya

que se producen a partir del mismo en la inmensa red mundial de instalaciones

petroquímicas. No es tanto el volumen del petróleo destinado a este fin, ya que se estima

está cerca del 5 % del total de petróleo consumido en el mundo (Sauer et al 2007), sino

que es el futuro incierto en el precio del petróleo el factor que podría ser significativo.

Siguiendo con este razonamiento, en el presente informe se aborda el tema de la

producción del ácido láctico a partir de recursos renovables como es la caña de azúcar. A

continuación, se define en particular el tema relacionándolo con la situación mundial, los

pormenores locales que hacen atractiva la proposición y la justificación de la investigación

presente. Inmediatamente se exponen los objetivos contractuales y la correspondiente

hipótesis, seguido de la metodología experimental empleada elaborada en detalle.

La segunda parte del informe se refiere a los antecedentes científicos y técnicos

asociados al proceso de la producción del ácido láctico a partir de carbohidratos solubles

como la sacarosa proveniente de la caña de azúcar. Incluye los resultados de una extensa y

completa revisión de la literatura científica reciente.

En la tercera parte se exponen los resultados que luego se discuten. Primero, se

describen las pruebas tentativas para recuperar las cepas de microorganismos y hacerlas

crecer en medios estériles y recomendados. En dichas pruebas se observó el tipo de

crecimiento, tanto en forma macro como micro. Se constató que los microorganismos

produjeran un medio ácido al crecer y con las bacterias lácticas, en especial, que crecieran

empleando como fuente de carbono, la glucosa y la sacarosa. Luego se exploró, en algunos

casos empleando diseños específicos de experimentos, los efectos sobre el crecimiento, la

producción del ácido y el consumo de los carbohidratos presentes en la caña de azúcar, y

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ante todo, la presencia en el medio de la lignocelulosa de la caña. Acá se trabajo con caña

molida a diferente tamaño de partícula y, con o sin, esterilización previa. Todos los

ensayos mencionados se llevaron a cabo en frascos agitados trabajando en volúmenes de

100-125 mililitros de medio. Segundo, se describen los intentos de aumentar de escala a un

fermentador de dos litros de capacidad y finalmente el de acoplar el fermentador a un

extractor externo y operar el sistema resultante con circulación de medio.

Finalmente en la cuarta parte se presentan las conclusiones del trabajo experimental

y las recomendaciones pertinentes. Se lista la bibliografía citada en texto y los anexos

obligados al contrato.

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I.2 Planteamiento del problema

La producción de ácido láctico es una actividad industrial dinámica que se

encuentra en crecimiento a escala mundial. Esto se debe al potencial de los biopolímeros y

otros compuestos que pueden derivarse del mismo. La mayoría de aplicaciones están

siendo desarrolladas por empresas privadas, quienes han sufragado los costos, no solo de la

investigación, sino del desarrollo del proceso, de la caracterización de los productos

obtenidos y de las pruebas de aceptación por los posibles usuarios en el mercado

consumidor. Por lo tanto es una tecnología que porta la etiqueta de la propiedad intelectual.

Por otro lado, en las universidades y en los centros de investigación se ha detectado, a

través de publicaciones científicas, actividades experimentales dirigidas a mejorar el

proceso. Por ejemplo, el aumento de la actividad del microorganismo, una mayor

resistencia del mismo a condiciones altas de acidez en el medio, fuentes más baratas de

carbono, nitrógeno y otros nutrientes, y procesos más simples para recuperar y purificar el

ácido láctico producido. Dentro de este marco, resulta atractivo explorar la posibilidad de

producir el ácido láctico directamente del tallo de la caña de azúcar reducido a partículas o

trocitos, en un sistema que en una sola etapa extraiga los azúcares solubles de la matriz

sólida de la caña en suspensión y al mismo tiempo un microorganismo presente en la fase

líquida extractora, los convierta a ácido láctico. Es de especial interés investigar el efecto

del pH, los nutrientes necesarios y el comportamiento de los microorganismos en presencia

de los sólidos en suspensión.

I.2.1 Antecedentes en Guatemala Guatemala posee una industria azucarera dinámica con experiencia en la

producción de azúcar, cruda y refinada. Los actuales ingenios en operación son eficientes

en el uso de los recursos y han efectuado inversiones para asegurarse la co-producción de

energía eléctrica, la cual venden al sistema nacional de distribución. Así mismo, en años

recientes han invertido, por la creciente demanda de etanol combustible, destilerías anexas

que convierten los azúcares no recuperados en las melazas a etanol. Dicho producto se

exporta en su totalidad a Europa, generando las divisas correspondientes.

Lo anterior indica que la caña de azúcar y sus subproductos pueden considerarse

como recursos renovables empleados en la producción de alimentos (azúcar), combustibles

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(etanol), energía eléctrica, y eventualmente, como se propone en este estudio, productos

químicos (ácido láctico).

I.2.2 Justificación de la investigación La investigación del ácido láctico se ha incrementado en los últimos años. Sin

embargo una alta proporción de los esfuerzos se han dirigido a la utilización del almidón

de los cereales hidrolizados como la principal materia prima. Lamentablemente, emplear

cereales en la producción de compuestos químicos, ocasiona un desbalance en la seguridad

alimentaria de un país o región geográfica; por lo que no es una actividad sostenible.

Utilizar la caña de azúcar, u otros cultivos ricos en azúcares solubles, es, desde dicha

perspectiva, una atractiva actividad agrícola que puede generar empleo y desarrollo en el

área rural.

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I.3 Objetivo e hipótesis I.3.1 Objetivo general

Objetivo general: Consiste en establecer experimentalmente (proof of concept) la

factibilidad de obtener ácido láctico por la fermentación directa, es decir sin previa

extracción del jugo, de los azúcares de la caña, en sistemas de alta concentración de

sólidos.

I.3.2 Objetivos específicos

Objetivos específicos:

a) Se emplearán dos tipos de microorganismos para comprobar la producción de

ácido láctico de trocitos de caña a punto de corte. Por un lado, se ensayarán cepas de

bacterias lácticas, y por el otro, una cepa del hongo filamentoso Rhizopus oryzae.

b) Se optimizará el medio de cultivo para la mejor cepa, buscando el mayor

rendimiento y tasa de producción de ácido láctico.

c) Se operará un sistema de lecho fijo con circulación de medio y se hará una

estimación de costos de una hipotética planta a escala industrial.

I.3.3 Hipótesis Los rendimientos de ácido láctico producido directamente de la caña de azúcar por

diversos microorganismos son adecuados y se logran en una medio de cultivo simple.

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I.4 Metodología I.4.1 Microorganismos empleados en la experimentación

Los microorganismos empleados fueron cultivos puros obtenidos de colecciones de

prestigio internacional. Se adquirieron dos grupos diferentes. Cuatro cepas del grupo de

bacterias lácticas y una cepa del hongo filamentoso Rhizopus oryzae productor de ácido

láctico.

Las bacterias lácticas siguientes fueron obtenidas de la colección DSMZ,

Braunschweig, Alemania: DSM 23080 Bacillus coagulans, DSM 4366 Lactococcus lactis

subsp. Lactis, DSM 20008 Lactobacillus paracasei subs. Paracasei, DSM 20080

Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus.

Las bacterias lácticas crecieron en medios sólidos en agar y medios líquidos en

caldo recomendados y denominados MRS de Merck (Man, Rogosa and Sharpe) cuya

composición era, en gramos por litro: peptona universal, 10.0; extracto de carne, 5.0;

extracto de levadura, 5.0; D(+)-Glucosa, 20.0; fosfato dibásico de potasio 2.0; citrato

dibásico de amonio, 2.0; acetato de sodio, 5.0; sulfato de magnesio, 0.1; sulfato de

manganeso, 0.05; Agar, 12.0.

La cepa del hongo fue obtenida de la colección CBS, Utrecht, Países Bajos: CBS

148.22 Rhizopus oryzae.

La cepa del hongo se creció en agar papa dextrosa de Merck en medio sólido y en

caldo Sabouraud 2 % de glucosa de Merck en medio líquido.

I.4.2 Pruebas exploratorias del crecimiento en frascos

Los ensayos preliminares para observar el crecimiento del hongo Rhizopus oryzae y la

verificación de la producción de ácido se llevaron a cabo en frascos de vidrio de 250 mL,

colocados en un agitador rotatorio de piso (Incubator Shaker, Model 25) a 150 rpm. y a 30 oC, en observación hasta siete días.

Los medios de cultivo ensayados fueron los siguientes:

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1. Glucosa 100 g /l, Sulfato de amonio 2 g/l, Fosfato monobásico de potasio 0.65 g/l,

Sulfato de Magnesio 0.25 g/l

2. Sacarosa 100 g /l, Sulfato de amonio 2 g/l, Fosfato monobásico de potasio 0.65 g/l,


3. Melaza 200 g/l, Sulfato de amonio 2 g/l, Fosfato monobásico de potasio 0.65 g/l,


4. Glucosa 100 g/l, Sacarosa 100 g/l, Melaza 200 g/l y las sales mencionadas

Los medios en los frascos se esterilizaron por 20 minutos a 121 oC (Autoclave Napco

Model 8000-DSE). Al enfriarse se inocularon con una sección del crecimiento del hongo

en tubo de agar papa dextrosa. Al final del experimento se tomaron registros fotográficos y

el pH (Mettler Toledo Modelo MP 125)

Las pruebas de crecimiento con las bacterias lácticas se llevaron a cabo empleando

jugo de caña de azúcar como fuente de carbono. Los tallos de caña sin hojas y penacho que

se emplearon estaban congelados a -10 oC desde 16 meses atrás (Whirlpool Chest freezer

Model EH 220F). Los tallos se cortaron en segmentos empleando una sierra de mano y

luego se pulverizaron en un molino de laboratorio (IKA Works A11). Las partículas finas se

extrajeron con agua a ebullición en forma paulatina hasta lograr un jugo con sólidos

solubles equivalente a 5.9 oBrix medidos con un refractómetro manual (Sper Scientific

Modelo 300034).

El medio empleado consistió en 100 mL de jugo de caña de azúcar y 0.5 gramos de

extracto de levadura (Merck). El pH del medio fue de 5.9 agregando aproximadamente 100

mL a frascos de 250 mL, los cuales se esterilizaron a 121 oC por 30 minutos. Luego se

enfriaron y se inocularon con el crecimiento de las mismas en agar MRS.

Los frascos conteniendo el DSM 4366 L. lactis y DSM 20008 L. paracasei se

colocaron en el agitador antes mencionado a 40 oC y 100 rpm por un tiempo de 50 horas.

La cepa DSM 23080 B. coagulans a 45 oC y 200 rpm. Al final se obtuvo el pH y la

densidad óptica de la suspensión medida empleando un espectrofotómetro a 600 nM de

longitud de onda (Shimadzu modelo mini UV 1240).

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Con el objeto de comparar el crecimiento de las bacterias lácticas en glucosa con el

crecimiento en sacarosa, lo cual indicaría si las bacterias poseen una invertasa activa que

hidrolice la sacarosa, o simultáneamente, que posean un sistema de transporte de sacarosa

hacia el interior de la célula, se realizaron dos pruebas de crecimiento en frasco, la primera,

empleando la bacteria DSMZ 20008 L. paracasei y la segunda, DSM 23080 Bacillus

coagulans.

En el ensayo con L. paracasei DSMZ 20008 se prepararon dos medios, el primero

conteniendo glucosa y el segundo conteniendo sacarosa, como fuente de carbono. La

cantidad de azúcares en los medios se determinaron por dos métodos. El método del fenol-

sulfúrico para estimar azúcares totales y la cromatografía líquida de alta presión para

determinar azúcares individuales. Se agregó 0.5 g de extracto de levadura y 0.1 g de

K2HPO4. Los frascos de 250 mL con 100 mL de medio se esterilizaron a 121 oC por 30

minutos. Luego fueron inoculados y se incubaron a 40 oC y 100 rpm por 72 horas. Al final

de la prueba se determinaron la densidad óptica de la suspensión, el peso seco de biomasa

de bacteria láctica, y el pH. El peso seco se determinó centrifugando una alícuota a 10 oC y

4,000 rpm en una centrífuga de mesa (Eppendorf Table top refrigerated Centrifuge Model

5804R) y luego secando el sedimento en un horno a 65 oC hasta peso constante (Fisher

Scientific Isotemp Incubator).

En el ensayo con B. coagulans DSM 23080 los dos frascos anteriormente descritos

fueron inoculados y se incubaron a 40 oC y 250 rpm por 48 horas. Luego se les adicionó

0.1 g de CaCO3 y se incubaron por otras 24 horas.

Para cuantificar los azúcares, sacarosa, glucosa y fructosa se empleó un

cromatógrafo líquido del alta presión (Agilent 1100), equipado con un detector de índice de

refracción (Agilent 1200), una columna Zorbax NH2 de 5 µm de recubrimiento, 4.6 mm de

diámetro interno y 25 cm de largo, el flujo en la columna fue de 1.5 mL por minuto. La

fase móvil fue una mezcla de 70 y 30, acetonitrilo y agua respectivamente. La temperatura

de operación fue de 25 oC.

I.4.3 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña deshidratada

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Se empleó caña variedad PR-752002 suministrada por el Ingenio Madre Tierra y

cultivada en el campo Sur de la UVG en Santa Lucía Cotzumalguapa, Escuintla, a una

altura aproximada de 300 msn. Fue cortada a los 307 días de haber sido plantada, molida

en un molino de acción trituradora (Trapp modelo TR-200) y deshidratada a 60oC en un

horno de bandejas con aire forzado de planta piloto. La humedad de la caña fue de 7.14%

y su contenido de azúcar fue de 38.47 % en base seca. Se pesaron 10 gramos de caña seca

en frascos de 250 mL y luego se les agregó 50 mL de la solución de sulfato de amonio y 50

mL de la solución de sales, hasta quedar las partículas sumergidas. Se empleó un diseño

factorial 23, (Diseño 3FI de StatEase® Versión 7) consistente en ocho experimentos sin

réplica. En base a este diseño se agregaron sulfato de amonio y sales (KH2PO4,

MgSO4.7H2O, ZnSO4) a dos niveles. Luego la suspensión se esterilizó por 15 minutos a

121oC. Los frascos se inocularon con una suspensión de esporas del hongo CBS 148.22 R.

oryzae a dos diluciones, de acuerdo con el diseño factorial. La concentración alta agregada

al frasco fue de 17.8 x 107 esporas. La concentración baja fue de 4.45 x 107 esporas. Los

frascos se colocaron en el agitador antes mencionado a 30 oC y 150 rpm. Se observaron a

diferentes tiempos, corrigiendo el pH por adición de 0.5 gramos de Ca2CO3 si fue

necesario. También se confirmó la viabilidad de las esporas en la suspensión, sembrando

una alícuota en una caja de Petri con agar nutritivo. Las tres variables de respuesta del

diseño factorial fueron: a) crecimiento (estimado en forma cualitativa, 1, 2, y 3 del menor

crecimiento al mayor); b) la concentración del acido láctico producido y c) la cantidad de

azúcar de la caña consumida expresada como % del valor original. Las dos últimas

variables fueron analizadas por cromatografía líquida de alta presión.

I.4.4 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña congelada

Se llevaron a cabo dos pruebas con caña madura PR-752002 que se

mantuvo congelada a -10 oC. La primera prueba se realizó con la caña molida pero sin

esterilizar. En la segunda prueba, la caña molida se esterilizó previamente. En ambos

casos, la caña congelada se pulverizó como antes se mencionó. La caña tenía una

humedad de 69.7 %. El contenido de azúcar total determinado por el método del fenol-

sulfúrico fue de 63.3 % en base seca.

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En la primera prueba se procedió de la manera siguiente. Como inóculo se

prepararon tres frascos conteniendo 75 mL de medio Saboraud y se les agregó a cada uno,

un mL de una suspensión de esporas de CBS 148.22 R. oryzae, conteniendo 2.35 x 106

esporas por mL. Por aparte se prepararon tres frascos con 50 mL del medio siguiente:

peptona 5 g/L; fosfato dibásico de potasio 0.4 g/L; sulfato de magnesio 0.4 g/L y carbonato

de calcio 0.2 g por frasco. El medio anterior se esterilizó por 15 min a 121 oC. Se agregó

el frasco de inóculo al frasco del medio y la mezcla resultante se agrego al frasco

conteniendo la caña. Los tres frascos preparados se colocaron en el agitador a 28 oC y 125

rpm. La fermentación se paró a las 120 horas. Se cuantificó el pH en el líquido filtrado.

Luego se centrifugó y en el líquido se determinaron ácido láctico y etanol.

En la segunda prueba se procedió de la manera siguiente. Se prepararon tres frascos

con 50 mL del medio conteniendo: peptona 5 g/L, fosfato dibásico de potasio 0.4 g/L,

sulfato de magnesio 0.4 g/L, y carbonato de calcio 0.2 gramos por frasco. Por otro lado, la

caña molida se agregó al medio y los frascos se esterilizaron por 15 min. a 121 oC. Como

inóculo se prepararon tres frascos de la manera anteriormente descrita y se agregó a los

frascos de medio y caña previamente esterilizados y enfriados. Luego se procedió como

antes se describió.

I.4.5 Aumento de escala: extracción-fermentación de flujo circulante

En la primera prueba se empleó caña de la variedad NA56, la cual se encontraba

almacenada desde hacía aproximadamente 18 meses a -10 oC. La caña se pulverizó como

antes se mencionó y luego se dejó por 12 horas en una incubadora a 60 oC, con el objeto de

reducir la carga natural microbiana en la misma. La humedad resultante de la caña fue de

30 %. En una segunda prueba también se empleó caña en trocitos de aproximadamente 1.5

a 2.0 cm de diámetro obtenidos al cortar la caña a mano con una sierra manual, los trocitos

se colocaron en la incubadora a 60 oC por 22 horas. La humedad final fue de 21.58 %. En

ambos casos se pesaron aproximadamente 200 gramos de caña y se colocaron en el

recipiente extractor.

Los microorganismos empleados fueron: a) (primera y segunda prueba) el hongo

CBS 148.22 R. oryzae, el cual se creció en un frasco de 250 mL con 200 mL de un medio

conteniendo 5 g de sacarosa, 0.5 g de YE y 0.1 g K2HPO4 a 30 oC y 250 rpm por 72 horas;

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por aparte se prepararon 1.5 litros del medio únicamente con YE y K2HPO4, se agregaron

al tanque fermentador y se esterilizaron; y b) (tercera prueba) la bacteria láctica DSM 4366

L. lactis, la cual se creció en un frasco de 250 mL con 200 mL de caldo Sabouraud y 0.25

g/L de extracto de levadura a 30 oC y 100 rpm por 72 horas. En este caso se prepararon 6

frascos (1.5 litros) para cargar directamente al fermentador.

El sistema de extracción-fermentación con flujo circulante consistió en lo siguiente.

Un fermentador de laboratorio Bioflo 2000 (New Brunswick Scientific) con un tanque de

vidrio de 2 litros en donde se controló la temperatura a 30 oC, una agitación de 200 rpm y

en el caso del hongo, una tasa de aireación de 1 volumen de aire por volumen de líquido

por minuto. Un frasco erlenmeyer de dos litros en donde se colocó la caña. Luego se

conectaron los recipientes empleando mangueras de hule y por medio de dos bombas

pulsantes de laboratorio (Masterflex L/S), se circuló el medio del fermentador al

erlenmeyer que contenía la caña, y de este de nuevo al fermentador, cerrando de esta

manera el ciclo. El sistema se operó hasta terminar la fermentación.

1.4.3 Trazo de gráficas y análisis estadístico. Las gráficas se elaboraron empleando Prism® versión 4-03 (GraphPad) y

Sigmaplot® versión 10 (Systat Software).

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PARTE II

MARCO TEÓRICO

II.1 Producción industrial de ácido láctico

Las dos compañías de productos químicos más grandes del mundo, Dow y Dupont,

ambas de EE.UU. han apostado a la biomasa como fuente de materia prima y a la

biotecnología industrial como la herramienta que producirá los compuestos químicos clave

del futuro en instalaciones industriales denominadas biorefinerías, por analogía a las

refinerías actuales que operan procesando el petróleo. Ambas empresas seleccionaron a la

glucosa proveniente de la hidrólisis del almidón del maíz como la materia prima a emplear

utilizando fermentaciones controladas, con el objeto de producir, ácido láctico en el caso

de Dow, y 1,3-propano diol en el caso de Dupont. Ambos productos empleados luego para

obtener polímeros con una amplia gama de aplicaciones. Los ejemplos anteriores no son

los únicos casos. Al contrario, se han identificado doce productos de sumo interés en los

planes para las posibles biorefinerías del futuro, como se observa en la gráfica 1.

Gráfica 1. Compuestos claves para la producción industrial en las biorefinerías

Fuente: Chem. & Eng. News, May 31, pp 31-34, 2004

La gráfica 2 ofrece una visión general del concepto de la biorefinería, en donde se

observan dos etapas en el proceso claramente definidas. La primera consistente en un

procesamiento primario de cualquier biomasa, que se efectúa con el objeto de separar

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físicamente diversas fracciones o separar componentes específicos. La segunda implica

procesos, tanto termoquímicos como microbiológicos, para producir diversos compuestos

puros.

Gráfica 2. Concepto de una biorefinería

Fuente: (Sauer et al 2007)

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La gráfica 3 ofrece una vista de la planta de Cargill-Dow en Blair, Nebraska para

producir 140,000 toneladas por año de ácido láctico. La empresa opera con el nombre

NatureWorks LLC. El ácido láctico se polimeriza a ácido poliláctico. Los diferentes

biopolímeros se comercializan con el nombre de Ingeo™. La compañía holandesa CSM

adquirió los derechos de Dow y recientemente compró a Cargill el resto de acciones. La

planta es operada actualmente por Purac, subsidiaria de CSM. Además de la planta

industrial en EEUU, Purac opera plantas productoras en Tailandia, Brazil y España. La

compañía ha desarrollado tecnología propia sobre la polimerización estereo-compleja

basada en ésteres cíclicos del ácido láctico, denominados l-lactide y d-lactide, creando

polímeros con características únicas de estabilidad al calor y de resistencia al impacto, que

permite emplearlos para fábricas piezas por moldeo dirigidas a la industria automotriz. Así

mismo está desarrollando, junto con un consorcio de empresas, un proyecto para emplear,

en lugar de la glucosa del maíz, glucosa proveniente de celulosa de desecho producida por

la industria de pulpa y papel.

Gráfica 3. Planta de ácido poliláctico en Blair, Nebraska

Fuente: (Chem. & Eng. News, May 31, pp 31-34, 2004)

La empresa Galactic produce ácido láctico, poliláctico, lactato de calcio y etil

lactato, en Bélgica, China y EEUU a partir de azúcar. La capacidad sobrepasa las 100,000

toneladas anuales. La empresa Henan Jindan Lactic Acid Technology Co.,Ltd, es el mayor

productor en China con una capacidad de 80,000 toneladas anuales. Emplea el almidón de

maíz como materia prima.

22

El mercado estimado de los productos derivados del ácido láctico producido

de materias primas renovables a través de procesos fermentativos empleando

microorganismos es atractivo para la inversión en este campo, como se muestra en el

cuadro 1. Además en la gráfica 4 se muestra los procesos involucrados en forma de

diagrama de flujo.

Cuadro 1. Demanda estimada de los productos derivados del ácido láctico

Fuente: (Data & Henry 2006)

Gráfica 4. Diagramas de operaciones empleados en la posible producción de derivados del ácido láctico

Fuente: (Data & Henry 2006)

II.2 Microorganismos productores de ácido láctico

En la actualidad el primer proceso de polimerización

que tiene mayor interés industrial. Sin embargo, el potencial es enorme, ya que pueden

producirse empleando reacciones catalizadas química y/o biológicamente

siguientes: a) lactato de etilo, componente indispensable de los solventes renovables, b)

propilén glicol, empleado como humectante en diversas formulaciones y como materia

prima para producir polímeros, c) óxido de propileno, materia prima para la producción de

poliuretanos y d) el ácido acrílico y los ésteres acrílicos empleados en producir una

variedad de plásticos.

El proceso de polimerización parte del

partir de una deshidratación del ácido láctico, como se muestra en la gráfica 5. El isómero

levo del ácido láctico es con el que se obtiene

cíclico es polimerizado, o copolimerizado con otras moléculas, en procesos catalíticos, en

donde se abre el anillo del éster cíclico y se forma una unidad monomérica que se repite n

veces, de acuerdo con el peso m

gráfica 6.

Gráfica 5.

Microorganismos productores de ácido láctico

En la actualidad el primer proceso de polimerización mostrado anteriormente

mayor interés industrial. Sin embargo, el potencial es enorme, ya que pueden

producirse empleando reacciones catalizadas química y/o biológicamente

: a) lactato de etilo, componente indispensable de los solventes renovables, b)

opilén glicol, empleado como humectante en diversas formulaciones y como materia


poliuretanos y d) el ácido acrílico y los ésteres acrílicos empleados en producir una

El proceso de polimerización parte del éster cíclico denominado lactide


levo del ácido láctico es con el que se obtiene un mayor rendimiento de lactide.



veces, de acuerdo con el peso molecular del polímero. Dicho mecanismo se ilustra en la

. Producción de lactide a partir del ácido láctico

Fuente: Data & Henry 2006

Dextro Levo

mostrado anteriormente es el

mayor interés industrial. Sin embargo, el potencial es enorme, ya que pueden

producirse empleando reacciones catalizadas química y/o biológicamente los compuestos

: a) lactato de etilo, componente indispensable de los solventes renovables, b)

opilén glicol, empleado como humectante en diversas formulaciones y como materia


poliuretanos y d) el ácido acrílico y los ésteres acrílicos empleados en producir una amplia

éster cíclico denominado lactide, obtenido a


un mayor rendimiento de lactide. El éster



olecular del polímero. Dicho mecanismo se ilustra en la

24

Gráfica 6. Mecanismo de polimerización

Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/Polylactic_acid

Los biopolímeros formados son termoplásticos y biodegradables. No es el propósito

de esta sección enumerar los productos en el comercio y sus características físicas, sin

embargo en el cuadro 2 se ilustra algunos polímeros y copolímeros informados en la

literatura académica. El lector podrá consultar información adicional y específica de los

productos de las empresas industriales mencionadas con antelación.

Cuadro 2. Polímeros y copolímeros del ácido láctico

Fuente: Narayanan et al 2004

25

II.2 Proceso industrial convencional El microorganismo productor de ácido láctico se reproduce en un fermentador

empleando un carbohidrato como fuente de carbono y energía en un medio al cual se le ha

adicionado nitrógeno proteico y otros nutrientes. Se adiciona un exceso de hidróxido o

carbonato de calcio para neutralizar el ácido producido, mantener el pH entre 5-6 y

producir lactato de calcio. Al terminar el lote de la fermentación el medio se acidifica con

ácido sulfúrico, se filtra para remover biomasa celular y el sulfato de calcio insoluble. El

líquido se concentra por evaporación, se esterifica con metanol o etanol, luego se purifica

por destilación, y finalmente de nuevo se vuelve a hidrolizar con agua. El ácido láctico

producido tiene la pureza requerida para polimerizarse o emplearse en síntesis química

para la producción de otros compuestos. Un diagrama de flujo simplificado se muestra en

la gráfica 7.

Gráfica 7. Proceso convencional para producir ácido láctico por fermentación de carbohidratos

Fuente:(Data & Henry 2006)

C6H12O6 CH3CHOHCOOH2

CH3CHOHCOOH2 + Ca(OH)2 Ca(CH3CHOHCOO)2+ H2O2

CH3CHOHCOOH2+Ca(CH3CHOHCOO)2 +H2SO4 CaSO4

CH3CHOHCOOH+ +C2H5OH CH3CHOHCOOC2H5 H2O

26

Existen varias instancias en el proceso que influyen significativamente en el costo

de producción. Las mismas están asociadas con la serie de operaciones necesarias para

purificar el producto y que se ilustraron en la gráfica 7. El manejo y la posible venta del

sulfato de calcio producido como un subproducto son factores a tomar en cuenta, ya que

aproximadamente se produce una tonelada de sulfato por tonelada de ácido láctico

producido. Existe una investigación continua para explorar alternativas y algunas de ellas

que han llegado a la práctica son celosamente restringidas por las empresas.

II.3 Desarrollos en progreso

Se han identificado varias líneas de acción. Una de ellas es la de diseñar un

microorganismo capaz de producir ácido láctico en condiciones ácidas, de manera que se

elimine del proceso el empleo de las sales de calcio y por ende, la producción del

subproducto sulfato de calcio. Resultados experimentales de la misma fueron presentados

por Dan Beacom de la compañía Cargill en la reunión de la Sociedad Americana de

Química (ACS) en San Francisco, CA, Marzo 22 del 2010. Se seleccionó una levadura,

CB1, que no es del género Saccharomyces, entre aproximadamente 1,200 levaduras

ensayadas. La levadura era tolerante a un medio ácido, poseía una tasa de consumo de

azúcares adecuada y no requería de nutrientes complejos para crecer. Por medio de

técnicas de biología molecular, se logró suprimir en el genoma de la levadura la actividad

del gen PDC, que en glicólisis lleva a la producción de etanol, además, se le adicionó el

gen LDH, que controla la conversión de piruvato a ácido láctico. Se ha optimizado la

producción del ácido y ha sido exitoso el aumento de escala. La tecnología desarrollada es

de propiedad de la empresa.

Otra línea de acción es la de consolidar la producción del polímero adentro del

microorganismo o célula manipulada, en lugar de llevar a cabo la polimerización como una

etapa posterior a la producción del ácido. Dos artículos describen los resultados. El

primero es el de Taguchi, Yamada et al (2008) sobre investigaciones realizadas en Japón,

en el cual se informa del desarrollo de una cepa de E. coli recombinante capaz de

transformar el lactato en lactil-CoA y luego en el éster poliláctico, tal como se ilustra en la

gráfica 8.

27

Gráfica 8. Microorganismo recombinante capaz de producir ácido poliláctico

Fuente: Taguchi, Yamada et al (2008)

El segundo artículo es de la República de Corea en donde desarrollaron una cepa de

E.coli recombinante capaz de producir el polímero (Jung, Kim et al 2010, Yang, Kim et al

2010), empleando la estrategia ilustrada en la gráfica 9. Se observa, en la preparación de

microscopía electrónica, los corpúsculos intracelulares que aglutinan el polímero formado.

Gráfica 9. Microorganismo recombinante capaz de producir ácido poliláctico

28

Fuente: Jung, Kim et al 2010, Yang, Kim et al 2010

Finalmente conviene citar el artículo de revisión reciente de Okano, Tanaka y

colaboradores (2010) quienes resumen los esfuerzos que se han llevado a cabo para

simplificar el proceso y el costo de producción empleado técnicas recombinantes. Las

manipulaciones se han realizado en las bacterias lácticas, la Escherichia coli, el

Corynebacterium glutamicum y en levaduras. Entre las modificaciones están. a) la

introducción de genes productores de enzimas amilolíticas, de manera que al emplear

almidón como materia prima, se produzca el ácido láctico en una sola etapa, consolidando

el proceso; y b) se han introducido genes de manera que el microorganismo pueda utilizar

simultáneamente azúcares de seis y de cinco carbonos, de manera que pueda emplearse

eficientemente la mezcla de azúcares producida en la hidrólisis de residuos

lignocelulósicos.

II.4 Microorganismos productores de ácido láctico

Las bacterias lácticas (LAB) y algunos hongos filamentosos constituyen el grupo de

microorganismos que producen ácido láctico durante su crecimiento en carbohidratos y su

expulsión hacia el medio en donde son cultivados (Wee, Kim et al 2006; John,

Nampoothiri et al 2007a). Las LAB se clasifican como homo fermentativas, solo producen

ácido láctico, o como hetero fermentativas, que producen además de ácido láctico, etanol,

diacetilo, formato, acetoina o ácido acético, ver gráfica 10. Las LAB son anaerobias y

emplean el piruvato, punto final del metabolismo de Embden-Meyerhof, para producir el

ácido láctico, producido en sus formas levo o dextro. Entre las LAB homo fermentativas

están el Lactococcus lactis y los Lactobacillus delbrueckii, helveticus y casei (John et al

2007).

29

Gráfica 10. Metabolismo de carbohidratos por las LAB

Fuente: (Wee, Kim et al 2006)

Entre los hongos filamentosos productores

de ácido láctico el más empleado a la fecha es el

Rhizopus oryzae. El mismo emplea el ciclo del

Krebs (TCA) para metabolizar carbohidratos en un

medio aeróbico. Como se muestra en la gráfica 11,

en dicho ciclo pueden producirse otros ácidos,

como el cítrico y succínico, dependiendo del género

y la cepa en particular del hongo. Uno de los

objetivos al emplear el hongo es el de evitar que

parte del carbono vaya hacia otros ácidos que no

sean el láctico. En el caso de Rhizopus oryzae, el

ácido que se acumula es con frecuencia el fumárico.

Como se explicó anteriormente, algunos de los

ácidos en el ciclo de Krebs están entre los

productos de una posible bio-refinería.

Gráfica 11. Metabolismo de carbohidratos por hongos filamentosos

Fuente: Goldberg, Rokem et al 2006

30

II.5 Experiencias con productos de caña de azúcar En el cuadro 3 se ha resumido la información de las experiencias previas para

producir ácido láctico de las melazas, del jugo de caña y del jugo del cogollo y de las hojas

obtenida de artículos científicos. Las observaciones siguientes son pertinentes:

a) los ocho trabajos realizados emplearon bacterias lácticas, la mayoría

Lactobacillus delbrueckii;

b) en varios casos la bacteria fue aclimatada al substrato y/o se indujeron

mutaciones con luz ultravioleta con el objeto de mejorar la tolerancia al ácido láctico

producido y aumentar la productividad;

c) las melazas o los jugos fueron enriquecidos con una o varias fuentes de

nitrógeno, prefiriéndose el extracto de levadura (EL);

d) en todos los casos el pH se controló arriba del valor del pKa de 3.86, o sea

cuando un 50 % del ácido está disociado. Mientras más arriba está el pH de este valor,

menos ácido se encuentra no disociado y así se evita la inhibición;

e) el CaCO3 fue la sal más empleada para controlar el pH, agregada como un

sólido, el cual enturbia el medio pues es poco soluble;

f) la temperatura en la mayoría de los casos estuvo alrededor de 40 oC;

g) los azúcares iniciales (sacarosa, glucosa y fructosa) presentes en la melaza y los

jugos de caña estuvieron arriba de 100 g/L, llegando a un valor máximo de 200 g/L;

h) la mayor cantidad de ácido producido fue de 166 g/L empleando un mutante;

i) los rendimientos (Y) basados en los azúcares iniciales (no los consumidos) fueron

altos en algunos casos, arriba de 0.90, (90 %), indicando esto que el consumo de azúcares

fue alto.

31

Cuadro 3. Ensayos previos con productos de la caña de azúcar

Fuente: FODECYT 003-2008

II.6 Experiencias con otras materias primas azucaradas

La producción de ácido láctico de melazas de remolacha ha sido informada en la

literatura (Monteagudo, Rincón et al 1993; Monteagudo, Rodríguez 1994; Kotzamanidis,

Roukas et al 2002). Los autores han empleado cepas de L. delbruekii, encontrando que la

Microorganismo Fuente de C

Azúcares g/L

Ácido láctico

g/L

Y (t, h)

pH (T, oC)

Nutrientes (g/L)

Referencia

L. delbrueckii NCIM2025

Melazas caña

78 76 0.97 (24)

7 (40)

EL (15) Urea (10) MnSO4 (0.5) CaCO3 (10)

Bhatt & Srivastava 2008

L. delbrueckii JCM1148

Melazas caña

119 107 0.90 (48)

6 (40)

No se informa

Calabia & Tokiwa 2007

Jugo caña 133 120 0.95 (36)

6 (40)

Jugo beet 105 84 0.88 (48)

6 (40)

L. delbrueckii Melazas caña (hidro +)

148 129 0.87 (24)

6.5 (42)

EL (5) CaCO3 (40)

Dumbrepatil, Adsul et al 2008

Uc-3 mutant 190 166 0.87 (24)

Melazas caña (hidro +)

200 120 0.60 (24)

7 (42)

EL (10) CaCO3 (50)

Patil, Kadam et al 2006

L. delbrueckii NCIM2365 Uc-3 mutant

Melazas caña (hidro +)

150 78 128

0.52 (48) 0.85 (36)

(42) EL (10)

Kadam, Patil et al 2006

Lactobacillus sp FCP2

Jugo caña 139 104 0.75 (120)

6 (40)

EL (10) Peptona (5) MgSO4 (0.2) KH2PO4 and K2HPO4 (1.5)

Timbuntam, Sriroth et al 2006

Lactoccocus lactis lactis

Mezcla Jugo caña y jugo cogollo y hijas

85 70 82 (72)

6 (32)

EL (30) Serna Cock & Rodríguez de Stouvenel 2006

Enterococcus faecalis RKY1

Melazas caña

130 200

65 96

34 48

7 (38)

EL (30) Wee, Kim et al 2004

32

adición de extracto de levadura y de carbonato de calcio al medio eran cruciales para lograr

rendimientos adecuados. Los últimos autores citados reportaron los datos siguientes: 90

g/L de ácido láctico producido, a partir de 97 g/L de azúcares, un rendimiento de 93 %, en

24 horas de cultivo de L. delbruekii NCIMB 8130, adicionando 50 g/L de extracto de

levadura y 50 g/L de carbonato de calcio, a un pH de 7 y una temperatura de 45 oC.

Los azúcares solubles del dátil se han empleado experimentalmente como materia

prima para producir ácido láctico en aquellos países productores de esa fruta (Nancib,

Nancib et al 2001; 2005; 2009; Chauhan, Trivedi et al 2007). Se han utilizado bacterias

lácticas, Lactobacillus casei rhamnosus NRRL-B445, Lactococcus lactis lactis ATCC

19435, y Lactobacillus sp KCP01. Es interesante mencionar que empleando una mezcla de

L. casei y L. lactis, un medio de jugo de dátiles (50 g/L de glucosa y 40 % g/L de fructosa),

EL 10 g/L, acetato de sodio 2 g/L, fosfatos de potasio 6 g/L, sulfato de magnesio 0.5 g/L y

sulfato de manganeso 0.03 g/L, un pH controlado de 6, 36 oC, y 19 horas de incubación, se

obtuvo la óptima concentración de ácido láctico, equivalente a 60 g/L. De estos datos se

obtiene una eficiencia de 67 %.

En el cuadro 4 se han anotado las experiencias realizadas con jugo extraído del tallo

del sorgo dulce. Se observa, como en la caso de la caña de azúcar, que se han empleado

bacterias lácticas y al medio de fermentación se le ha agregado principalmente extracto de

levadura como nutriente. El rendimiento obtenido también ha sido similar.

Cuadro 4. Ensayos previos con productos del sorgo dulce


Microorganismo Fuente de C

Azúcares g/L

Ácido láctico

g/L

Y (t, h)

pH (T, oC)

Nutrientes (g/L)

Referencia

Lactobacillus plantarum

ATCC 14917

Jugo de sorgo dulce

70 60 0.86 (60)

6.5 (42)

Vecht juice

5.6 N en base seca

Samuel, Lee et al 1980

Lactobacillus paracasei

Jugo de sorgo dulce

100 91 0.91 6 (33)

EL (10) Peptona

(20)

Richter & Träger 1994

Lactobacillus paracasei

Jugo de sorgo dulce

86 82 0.95 (35)

6 (33)

EL (10) Peptona

(20

Richter & Berthold

1998 Lactobacillus sp.

MKT-878 (NCAIM B02375)

Jugo de sorgo dulce

invertido

130 108 0.83 5.8 (37)

EL (10) Gluten

trigo (20)

Hetényi, Gal et al 2010

33

II.7 Experiencias con otros substratos

La producción de ácido láctico empleando el suero de leche ha sido un proceso

tradicional (Mehaia & Cheryan 1987; Kulozick, Hammelehle et al 1992). Las bacterias

lácticas son capaces de asimilar la lactosa que es el azúcar componente del suero en una

concentración de 40 a 50 g/L. Roukas & Kotzekidou (1998) reportaron datos empleando

suero deproteinizado enriquecido con extracto de levadura, peptona, sulfatos de manganeso

y magnesio, la mezcla de dos bacterias lácticas L. casei y L. lactis en solución o

encapsuladas en alginato, dos formas de operación, por lotes y por lotes alimentados, a un

pH de 6.0 y 32 oC. Obtuvieron concentraciones de ácido láctico en 24 horas de operación

entre 22 y 46 g/L con un rendimiento entre 0.45 y 0.62. Panesar, Kennedy et al (2007)

reportaron datos empleando suero deproteinizado enriquecido con extracto de levadura,

sulfato de manganeso y carbonato de calcio, una cepa de L. casei encapsulada en gel de

pectato. Obtuvieron en 48 horas concentraciones de ácido láctico de 33 g/L y un

rendimiento de 0.82.

Existen datos de la transformación de los azúcares solubles (glucosa, fructosa,

sacarosa, maltosa) extraídos de la semillas de carob (Ceretonia siliqua) empleando R.

oryzae NRRL 395 (Bulut, Elibol et al 2004). Así también Ge, He y colaboradores (2010)

informan de la producción a partir del topinambur (Helianthus tuberosus) empleando L.

casei G-02, en un proceso simultáneo de sacarificación de la inulina y fermentación de la

fructosa producida. Con la adición de 10 g/L de citrato al medio, en 30 horas produjeron

141 g/L de ácido láctico, con un rendimiento de 0.93.

El substrato más empleado en la experimentación, sin embargo, ha sido el almidón

contenido en cereales y tubérculos y en aguas industriales del procesamiento de alimentos.

Se han ensayado diferentes estrategias resumidas en forma diagramática en las gráficas 12

y 13 que se muestran a continuación.

34

Gráfica 12. Alternativas para utilizar el almidón como materia prima en la producción de ácido láctico

Fuente: Zhang, Jin et al (2007b)

Gráfica 13. Estrategias para utilizar el almidón como materia prima en la producción de ácido láctico

Fuente: John, Nampoothiri et al (2007a)

Las alternativas que se presentan consisten en, o hidrolizar previamente el almidón

a glucosa y luego convertirla a ácido láctico, o emplear el almidón directamente para

producir ácido láctico. En ambos casos un primer y obligado paso consiste en que el

35

polímero del almidón debe hidratarse (gelatinizarse) y su estructura molecular debe

modificarse por la acción de la enzima α amilasa.

En el cuadro 5 se han anotado aquellos trabajos de investigación en donde

empleando bacterias lácticas, otras bacterias y el hongo Rhizopus, se han procesado

materias primas, como las harinas y salvados de trigo, maíz arroz y cebada, harinas de

tubérculos como la papa, el camote y la yuca, efluentes industriales conteniendo almidón y

residuos sólidos de cocina.

Cuadro 5. Ensayos previos con materias primas, efluentes industriales conteniendo almidón y sólidos de cocina

Materia prima Microorganismos Referencia Harina de trigo Salvado de trigo

Bacterias lácticas Enterococcus faecalis

Hofvendahl & Hahn-Hägerdal (1997) Akerberg & Sacchi (2000) Naveena, Altaf et al (2005a), (2005b) Oh, Wee et al (2005) Altaf, Naveena et al (2006) Li, Han et al (2010)

Harina de maíz Bacterias lácticas Enterococcus faecalis Rhizopus sp.

Hang (1989) Zhang & Cheryan (1991) Yin, Nishina et el (1997) Tay & Yang (2002) Miura, Arimura et al (2003) Oh, Wee et al (2005) Altaf, Naveena et al (2007)

Salvado de arroz Bacterias lácticas Tanaka, Hoshina et al (2006) Harina de cebada Rhizopus sp. Oh, Wee et al (2005) Harina de papa Efluente del procesamiento de papa

Bacterias lácticas Rhizopus sp.

Anuradha, Suresh et al (1999) Oda, Saito et al (2002) Huang, Jin et al (2003) (2005) Zhang, Jin et al (2007c)

Harina de camote Rhizopus sp. Yen, Chen et al (2010) Yen & Lee (2010)

Harina de yuca Streptococcus bovis Bacterias lácticas

Ghofar, Ogawa et al (2005) John, Sukumaran et al (2007) Rojan, Kesavan Madhavan et al (2007)

Harina de lenteja roja

Altaf, Venkateshwar et al (2007)

Desperdicios de cocina

Bacterias lácticas Kim, Kim et al (2003) Wang, Wang et al (2005) Ohkouchi & Inoue (2006) Okano, Kimura et al (2007) Ye, Lu et al (2008) Zhang, He et al (2008)


36

Existe opinión de que alimentos como cereales o tubérculos no deberían emplearse

en producir productos químicos. La razón es obvia, dichas materias primas constituyen los

alimentos básicos de la dieta humana y por lo tanto, su disponibilidad, calidad nutritiva y

precio inciden directamente en la seguridad alimentaria.

La materia prima que no necesariamente incide con el anterior dilema es la

denominada lignocelulósica, es decir, árboles, arbustos y sus residuos, gramíneas y plantas

similares, y bagazos generados en la agroindustria, los cuales están químicamente

constituidos de celulosa, hemicelulosa y lignina. En el país, dicha materia prima, en varias

formas se emplea para generar energía, como la leña para cocinar, o el bagazo de caña para

co-generar electricidad.

La matriz de lignocelulosa es un polímero heterogéneo que resiste la hidrólisis

enzimática, necesaria para generar los azucares fermentables. Estos son principalmente

dos, la glucosa generada de la hidrólisis de la celulosa y la xilosa generada de la hidrólisis

de la hemicelulosa. Para que la hidrólisis pueda llevarse a cabo es necesario realizar

pretratamientos de la materia prima. Este problema no es un objetivo del proyecto y por lo

tanto no se discutirá.

La literatura reciente informa de una serie de experimentos para producir ácido

láctico de madera y residuos agrícolas y de los azúcares producidos por la hidrólisis de

estos.

El cuadro 6 lista cuatro referencias de estudios de la producción de ácido láctico de

di- y tri-sacáridos (celobiosa y celotriosa), como también de monosacáridos (xilosa y

glucosa).

37

Cuadro 6. Estudios de la asimilación de azúcares provenientes de la hidrólisis de la lignocelulosa

Azúcares Microorganismos Referencia

Celobiosa y celotriosa

L. delbrueckii mutant Uc3

Adsul, Khire et al (2007)

Xilosa R. oryzae Maas, Bakker et al (2006) Maas, Springer et al (2008)

Xilosa y glucosa Bacterias lácticas Taniguchi, Tokunaga et al (2004) Mezcla de pentosas L. bifermentans Givry, Prevot et al (2008)


El cuadro 7 lista varias referencias de estudios en donde se han empleado residuos

agrícolas previamente hidrolizados, tanto en técnicas de hidrólisis y fermentación

conjuntas, como separadas y además, en donde se han empleando cultivos de

microorganismos puros para producir ácido láctico.

Cuadro 7. Estudios de la asimilación de azúcares provenientes de la hidrólisis química o

enzimática de residuos agrícolas e industriales

Hidrolizado de fibra de maíz

Bacillus coagulans Bischoff, Liu et al (2010 )

Hidrolizado de lodos de la industria del papel

Bacillus coagulans Budhavaran & Fan (2009)

Hidrolizado de tallos de uva L. pentosus Bustos, Moldes et al (2005) Hidrolizado de sólidos provenientes del procesamiento de la manzana

L. rhamnosus Gullón, Alonso et al (2008) Gullón, Yáñez et al (2008)

Hidrolizado alcalino de paja de trigo

Bacillus coagulans Maas, Bakker et al (2008)

Hidrolizado paja arroz L. brevis Kim, Block et al (2010) Hidrolizado de madera procesada

L. delbrueckii Moldes, Alonso et al (2001)

Hidrolizado del papel de oficina

R. oryzae Park, Anh et al (2004)

Hidrolizado de bagazo de caña

Bacillus sp. Patel, Ou et al (2005) Lopaiboon, Thani et al (2010)

Hidrolizado de sólidos provenientes del procesamiento de la uva

L. pentosus Portilla-Rivera, Moldes et al (2007)

Hidrolizados del olote L. rhamnosus Rivas, Moldes et al (2004b) Guo, Yan et al (2010)

Hidrolizados de madera Enterococcus faecalis Wee, Sun et al (2006)

38

Hidrolizados de tallos de soya

L.casei Xu, Wang et al (2007)

Hidrolizados de varios residuos agrícolas

L. delbrueckii Shen & Xia (2006)

Hidrolizados de varios residuos agrícolas

L. delbrueckii L. plantarum

Sreenath, Moldes et al (2001)

Efluente directo del procesamiento de papa, maíz, trigo y piña

R. oryzae R. arrhizus

Jin, Yin et al (2005)

Efluente directo del procesamiento de piña

L. lactis Ueno, Ozawa et al (2003)


Finalmente debe mencionarse el estudio de Gao, Yang et al (2008) quienes aislaron

una mezcla de bacterias que podían fermentar a ácido láctico la paja de arroz sin

tratamiento alguno. En la mezcla se detectaron L. fermentum, L. paracasei y L. plantarum.

II.8 Experiencias en el mejoramiento de cepas y optimización de medios

Oda, Yajima et al (2002) estudiaron diferentes cepas de R. oryzae y lograron

separar dos grupos. Uno productor de ácido láctico, y el otro no. Esta diferencia la

atribuyeron a la diferente composición de los ácidos grasos presentes.

Bai, Zhao y colaboradores (2004a) emplearon luz ultravioleta para inducir

mutagénesis en L. lactis desarrollando una cepa mutante que mostró una tasa mayor del

consumo de glucosa del medio. En otro trabajo similar (Bai, Zhao et al 2004b)

desarrollaron mutantes de R. oryzae al exponerlo a la luz ultravioleta, el dietilsulfato y

radiación de Co60, dichos mutantes produjeron mayor cantidad de ácido láctico

proveniente en la ruta metabólica del ácido pirúvico. Kadam, Patil y colaboradores (2006)

emplearon luz ultravioleta para desarrollar mutantes de L. delbrueckii. Las cepas mutantes

mostraron una tasa mayor de crecimiento, menor fase de retardo, mayor productividad y

una mayor concentración final de ácido láctico en el medio. Tanto la cepa original como

las mutantes no pudieron crecer en sacarosa, xilosa o maltosa como fuente de carbono.

Xu, Bai et al (2010) emplearon energía radiante iónica para generar mutantes de la bacteria

Sporolactobacillus sp. Los mismos produjeron mayor cantidad de ácido láctico resultante

39

de una mayor actividad de las enzimas, 6-fosfofructokinasa, kinasa pirúvica y

deshidrogenasa láctica.

Skory (2000, 2004) ha manipulado genéticamente al hongo R. oryzae

introduciéndole en su genoma fragmentos del gen ldhA con el objeto de aumentar la

actividad de la enzima dehidrogenasa láctica. La cepa transgénica produjo mayor cantidad

de ácido láctico y menores cantidades de ácido fumárico y etanol. Zhou, Yamano et al

(2005) emplearon una cepa transgénica productora de etanol de Escherichia coli, a la cual

le removieron genes de rutas metabólicas indeseables y lograron una cepa productora de

ácido láctico.

También se ha informado de adaptaciones a ciertos medios (Lee 2007) o la adición

de nutrientes específicos (Yoo, Chang et al 1997; Demirci, Pometto et al 1998; van-Niel &

Han-Hägedahl 1999; Kwon, Lee et al 2000). Wang, Sun et al (2005) utilizando R. oryzae

encontraron que el nivel de fosfato en el medios influenciaba la producción de los ácidos

láctico y fumárico. Una concentración de 0.40 de fosfato monobásico de potasio favorecía

al láctico en detrimento del fumárico.

Se ha empleado la técnica de diseño de experimentos para optimizar el medio

(Woiciechowski, Soccol et al 1999; Hujanen, Linko et al 2001; Bustos, Moldes et al 2004;

Liu, Liao et al 2006; Liu, Yang et al 2006; John, Sukumaran et al 2007; Altaf,

Venkateshwar et al 2007; Bhat & Srivastava 2008; Ye, Lu et al 2008; Zhang & Block

2009).

II.9 Estudios del proceso

Se han estudiado algunos efectos de variables de operación sobre la productividad

del ácido láctico. Las principales han sido el pH y la temperatura de operación (Guyot,

Calderón et al 2000; Adamberg, Kask et al 2003) y la concentración del oxígeno disuelto

en el medio (Okino, Suda et al 2006).

Además de los reactores tradicionales de tanques agitados se ha explorado el

comportamiento de otras geometrías, por ejemplo, columnas de burbujeo con R. oryzae

(Du, Cao et al 1998; Liu, Miura et al 2006; Zhang, Jin et al 2009). Otros han intentado

40

acoplar con el reactor la unidad de separación del ácido láctico para evitar la inhibición del

mismo; entre ellos resaltan, el sistema de membranas electrolíticas investigado

principalmente por investigadores japoneses (Hongo, Nomura et al 1986; Yao & Toda

1990; Ishizaki, Nomura et al 1990; Gao, Michiteru et al 2005; Hirata, Gaoa et al 2005);

también el empleo de líquidos iónicos formando una segunda fase extractora en el reactor

(Matsumoto, Mochiduki et al 2004; Hossain & Maisuria 2008) o por adsorbentes

(Senthuran, Senthuran et al 2004). Sin embargo, la remoción del ácido láctico del medio

empleando resinas de intercambio iónico pareciera ser una operación sencilla y de fácil

aumento de escala. La adsorción iónica puede acoplarse al reactor (Ataei & Fasheghani-

Farahani 2008; Patel, Jesse et al 2008) o puede ser parte de las operaciones unitarias de

purificación corriente abajo (Tong, Fu et al 2004). Finalmente también se ha acoplado al

reactor un sistema de nanofiltración para concentrar el ácido láctico (Taniguchi, Kotani et

al 1987; Wang, Hatanaka et al 1988) o membranas de cerámica (Ohashi, Yamamoto et al

1999).

Una estrategia diferente ha consistido en aislar al microorganismo del medio

empleando técnicas de encapsulamiento en varios polímeros (Hang, Hamamci et al 1989;

Tamada, Begum et al 1992; Park, Kosakai et al 1998; Garbayo, Vilchez et al 2004; Tsen,

Lin et al 2004; Rosenberg, Rebros et al 2005; Idris & Suzana 2006; Efremenko, Spiricheva

et al 2006a; 2006b; Liu, Liao et al 2006; Petrov, Yankov et al 2006; Schepers, Thibault et

al 2006; Ganguly, Dwivedi et al 2007; John, Nampoothiri et al 2007b; Petrov, Petrova et al

2007; Sirisansaneeyakul, Luangpipat et al 2007; Subba Rao, Prakasham et al 2008).

Otros investigadores han experimentado con diferentes técnicas de alimentar el

medio al reactor (Liu, Miura et al 2005) y en específico, por ejemplo, los lotes alimentados

(Ding, Tan et al 2006), lotes repetidos (Yin, Yahiro et al 1998), la alimentación y la

descarga intermitente (Martak, Schlosser et al 2003), sistema de operación continua con

reciclo de células (Hjörleifsdottir, Seevaratnam et al 1990; Xu, Chu et al 2006), y aquella

con un control de retroalimentación por glucosa y una operación con lote alimentado (Li,

Lu et al 2010).

También se han reportado pruebas en las cuales se han agregado soportes plásticos

compuestos al reactor para facilitar el crecimiento y el mantenimiento de las bacterias

lácticas en el reactor (Demirci & Pometto 1995; Ho, Pometto et al 1997a; 1997b; 1997c).

41

Conviene citar entre las operaciones unitarias corriente abajo que se han

investigado a la nanofiltración (Kang, Chang et al 2004) y la destilación reactiva (Kumar

2006).

II.10 Cinética y modelos en la producción de ácido láctico La cinética de la producción del ácido láctico ha sido estudiada previamente y

varios modelos se han empleado en la investigación. Con los modelos obtenidos es posible

estimar la concentración de biomasa del microorganismo, el substrato utilizado y el ácido

láctico producido en función del tiempo del lote de fermentación. Sin embargo, las

ecuaciones contienen una serie de constantes cinéticas y parámetros, cuyos valores

numéricos han tenido que estimarse por técnicas matemáticas a partir de datos

experimentales. Se tiene el riesgo entonces que la validez del modelo está restringida a las

condiciones experimentales de donde se obtuvo la información.

No es el propósito principal de este proyecto estudiar la cinética y el modelo de la

producción del ácido láctico, y por lo tanto no se hará una descripción histórica de su

desarrollo. Basta mencionar alguno de ellos.

Razvi, Zhang et al (2008) emplearon glucosa y fuentes de nitrógeno orgánicas para

modelar la producción de ácido láctico por el Lactococcus lactis ssp. IL1403.

Para estimar la producción de biomasa microbiana emplearon una forma de la

ecuación logística, que en su expresión diferencial e integrada resultó de la manera

siguiente:

dx

dtx

x

xmm

= −µ ( )1

xx e

x

xe

ot

m

t

m

m

=− −

µ

µ1 10 ( )

42

En donde el subíndice m indica el máximo valor y el 0, el valor inicial. La tasa de

crecimiento es igual a µ y depende del microorganismo empleado.

Para estimar el cambio de la utilización del substrato se empleó la ecuación de Pirt

que contiene, el coeficiente de mantenimiento celular ms y el rendimiento de biomasa-

substrato Yx/s.

En donde k es una constante propia del sistema experimental.

Para estimar la concentración de ácido láctico identificada con la letra p en función

del tiempo, los autores emplearon la clásica ecuación de Luedeking y Piret.

En donde α y β son constantes. El conjunto de ecuaciones puede emplearse para estimar a

cualquier tiempo t, las concentraciones de biomasa microbiana x, de substrato s y producto

p, siempre y cuando se conozca el valor numérico de las constantes.

dS

dt Y

dx

dtm x

x ss= −1

/

s sY

x xm x

k

x x

x xx s

s m m

m

= − − + −−0 0

0

1

/

( ) ln

dp

dt

dx

dtx= +α β

p p x xx

k

x x

x xm m

m

= + − − −−0 0

0

α β( ) ln

43

PARTE III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La presentación de los resultados se ha elaborado dentro del orden lógico del

desarrollo de la investigación, aunque es preciso aclarar que no necesariamente ha

coincidido con la secuencia en que se realizaron las pruebas. Se ha creído conveniente

adoptar esta estrategia ya que en la investigación se emplearon dos tipos diferentes de

microorganismos, y por lo tanto ocurrió con frecuencia, que se avanzaba más con unos que

con los otros.

Primero, se describen las pruebas tentativas para recuperar las cepas y hacerlas

crecer en medios estériles y recomendados. En dichas pruebas se observó el tipo de

crecimiento, tanto en forma macro como micro. Se constató que los microorganismos

produjeran un medio ácido al crecer y con las bacterias lácticas, en especial, que crecieran

empleando como fuente de carbono, la glucosa y la sacarosa. Luego se exploró, en algunos

casos empleando diseños específicos de experimentos, los efectos sobre el crecimiento, la

producción del ácido y el consumo de los carbohidratos presentes en la caña de azúcar, y

ante todo, la presencia en el medio de la lignocelulosa de la caña. Acá se trabajo con caña

molida a diferente tamaño de partícula y con o sin esterilización previa. Todos los ensayos

mencionados se llevaron a cabo en frascos agitados trabajando en volúmenes de 100-125

mililitros de medio. Segundo, se describen los intentos de aumentar de escala a un

fermentador de dos litros de capacidad y finalmente el de acoplar el fermentador a un

extractor externo y operar el sistema resultante con circulación de medio.

III.1.1 Recuperación de las cepas de microorganismos

Las cepas crecieron adecuadamente, con excepción de la cepa DSM 20080

Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus, por lo que se eliminó de los ensayos. En el

cuadro 8 se presentan preparaciones microscópicas del crecimiento logrado. Nótese la

diferencia de forma entre los bacilos y el coco. Los primeros son cilíndricos y el segundo

esférico. Las tres cepas, sin embargo forman cadenas de longitud variada y son poco

frecuentes a la vista las células individuales.

44

Cuadro 8. Observación al microscopio de las bacterias lácticas previa tinción de azul de metileno

Bacteria láctica Observación microscópica

DSM 23080 Bacillus coagulans

DSM 4366 Lactococcus lactis subsp. lactis

DSM 20008 Lactobacillus paracasei subs. paracasei


El crecimiento del hongo en medio sólido fue típico mostrando un micelio

blanco. En medio líquido, como era de esperarse, su crecimiento fue en forma de

filamentos.

45

Gráfica 14. Inicio del crecimiento en filamentos en medio líquido del hongo R. oryzae


III.1.2 Pruebas exploratorias del crecimiento en frascos

El hongo Rhizopus oryzae creció en los medios descritos anteriormente en forma

adecuada, como se observa en la gráfica 15 para los medios con glucosa y sacarosa

(medios 1 y 2 respectivamente). Se observó un menor crecimiento en el medio conteniendo

melaza como única fuente de carbono (medio 3).

Gráfica 15. Crecimiento en medio líquido del hongo R. oryzae empleando glucosa (1) y

sacarosa (2) como fuente de carbono


46

El pH del medio en los frascos al final de la prueba fue de 2.45 para el medio con

glucosa, 2.50 para el medio con sacarosa, 6.50 para el medio con melaza y 5.23 para el

medio conteniendo las tres fuentes de carbono anteriores. Se notó una diferencia en los

medios conteniendo melaza. Para explicar este evento podría considerarse la posibilidad de

que la melaza tuviera compuestos químicos que actuaron como un medio regulador

evitando una franca disminución del pH.

Se observó también el efecto marcado que tuvo el pH en la morfología del hongo

cuando este creció en frascos agitados, tal como se observa en el cuadro 9. El pH más

ácido al final de la fermentación provocó que el micelio formara aglomeraciones esféricas

en lugar de una suspensión homogenea en el medio.

Cuadro 9. Observación del tipo de crecimiento en frascos agitados

Inóculo

pH 3.2

47

pH 1.6


Las tres cepas de bacterias lácticas crecieron adecuadamente en el jugo de

caña. Los valores al final de la prueba correspondientes al pH y a la densidad óptica se han

anotado en el cuadro 10. Las pruebas se llevaron a cabo en duplicado y se observa que la

variación en los resultados fue aceptable.

Cuadro 10. Crecimiento de bacterias lácticas en jugo de caña

Cepa pH pH DO DO B. coagulans DSM 23080 4.33 4.29 0.976 0.950 L. lactis DSM 4366 4.71 4.63 0.764 0.754 L. paracasei DSM 20008 3.94 4.12 1.371 1.531


Se observa en la gráfica 16 que conforme se logró una mayor densidad

óptica de la suspensión, lo cual era equivalente a una mayor cantidad de biomasa, el pH del

medio disminuyó, indicando con esto una mayor producción de ácido láctico. La cepa

DSM 20008 L. paracasei mostró el mayor crecimiento y producción de ácido.

48

Gráfica 16. Crecimiento en jugo de caña de las bacterias lácticas


En la prueba de crecimiento de L. paracasei DSMZ 20008 el contenido de glucosa

en el medio inicial fue de 5.04 g /100 mL y el de sacarosa 5.11 g/100 mL. Luego de

esterilizarse el medio el frasco de glucosa tenía un color pardo, como se ilustra en la

gráfica 17.

Gráfica 17. Medios de glucosa y sacarosa para el crecimiento de bacterias lácticas


Cepas 4366, 23080, 20008

3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.000.70.80.91.01.11.21.31.41.51.61.7

pH

DO

49

El crecimiento obtenido fue adecuado en los dos medios como se muestra en las

gráficas 18 y 19.

Gráfica 18. Medios turbios de glucosa y sacarosa al final del crecimiento de L. paracasei

DSMZ 20008


Gráfica 19. Observación microscópica al final del crecimiento de L. paracasei DSMZ 20008


50

En el cuadro 11 se observa un peso seco abundante de biomasa bacteriana, similar

en los dos medios y además, una reducción del pH significativa (indicador de la

producción de ácido).

Cuadro 11. Crecimiento de L. paracasei DSMZ 20008 en glucosa y sacarosa

Medio OD Peso seco

g/L pH

Glucosa 0.449 2.09 3.27 Sacarosa 0.455 2.31 3.22


En la prueba de crecimiento de B. coagulans DSM 23080 la concentración de

azúcares por HPLC en los medios después de esterilizar se observa en el cuadro 12. La

glucosa empleada contenía algo de fructosa. La sacarosa comercial empleada, contenía

glucosa y fructosa.

Cuadro 12. Distribución de azúcares en los medios

Medio Sacarosa

g/100 mL Glucosa

g/100 mL Fructosa g/100 mL

Total g/100 mL

Medio Glucosa 0.0 4.889 0.464 5.353 Medio Sacarosa 4.086 0.334 0.200 4.620


El crecimiento del microorganismo fue adecuado en los dos medios, como se

muestra en la gráfica 20.

51

Gráfica 20. Crecimiento a las 48 horas (izquierda) y 72 horas (derecha) de B. coagulans DSM 23080


En el cuadro 13 se han anotado los datos de peso seco y pH para los dos medios a

los dos tiempos de observación. El peso seco fue menor que el obtenido con el L.

paracasei DSMZ 20008. Igualmente el pH disminuyó menos. El crecimiento fue más

abundante en sacarosa que en glucosa, aunque el pH final fue menor en el medio con la

glucosa.

Cuadro 13. Peso seco y pH en los medios de glucosa y sacarosa a las 72 horas de cultivo

Medio OD Peso seco g/L

pH

Glucosa 1.232 1.30 5.24

Sacarosa 1.701 1.69 5.71


52

Se observó un consumo de azúcares por el crecimiento del microorganismo en los

dos medios, como lo muestran las cifras del cuadro 14, sin embargo el consumo fue bajo y

la tasa de consumo lenta. La adición de carbonato de calcio a las 48 horas no aceleró el

consumo.

Cuadro 14. Consumo de azúcar en los medios de glucosa y sacarosa

Medio y tiempo

Sacarosa g/100mL

Glucosa g/100mL

Fructosa g/100mL

Total g/100mL

Consumo g/100mL

Glucosa 48 h

0.0 3.764 0.575 4.339 1.014

Sacarosa 48 h

3.595 0.0 0.0 3.595 1.025

Medio y tiempo

Sacarosa g/100mL

Glucosa g/100mL

Fructosa g/100mL

Total g/100mL

Consumo g/100mL

Glucosa 72 h

0.0 3.562 0.563 4.125 1.228

Sacarosa 72 h

3.645 0.0 0.296 3.941 0.679


III.1.3 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña deshidratada

La apariencia de la caña finamente molida puede apreciarse en la gráfica 21. El

horno de bandejas empleado para deshidratarla en la gráfica 22. La caña seca en el frasco y

en suspensión luego de la esterilización en la gráfica 23.

El efecto del calor en la esterilización a alta temperatura sobre el material resultante

puede apreciarse por el cambio de color de la suspensión hacia uno más obscuro. Este

efecto no se observó durante el secado de la caña a baja temperatura. La caña se molió en

partícula fina con el objeto de minimizar efectos de transferencia de masa durante el

proceso subsiguiente de extracción y fermentación simultanea de los azúcares.

53

Gráfica 21. Caña durante el proceso de trituración


Gráfica 22. Caña durante el proceso de secado


54

Gráfica 23. Efecto de la esterilización en las partículas de caña. Caña fresca (izquerda).

Caña esterilizada (derecha).


El diseño factorial empleado para observar el efecto de dos niveles de la

fuente de nitrógeno y las sales, y dos niveles de inóculo, se presenta en el cuadro 15. El

nivel mayor de la variable se identifica con el número uno positivo, y el valor menor con el

uno negativo. En cada columna existen cuatro niveles positivos y cuatro negativos, y las

filas no se repiten. El nivel de las variables se presenta en el cuadro 16.

Cuadro 15. Diseño factorial con variables codificadas

Experimento NH4SO4 Sales Inóculo

1 1 -1 -1 2 1 1 -1 3 -1 -1 1 4 1 1 1 5 -1 -1 -1 6 -1 1 1 7 1 -1 1 8 -1 1 -1


55

Cuadro 16. Niveles de las variables

NH4SO4

g/L KH 2PO4

g/L MgSO4.7H2O

g/L ZnSO4

g/L Nivel alto 4. 0.6 0.65 0.09 Nivel bajo 1.0 0 0 0


Los datos experimentales de las tres variables respuesta se encuentran en el cuadro 17.

Cuadro 17. Diseño factorial y valor de las variables respuesta a los 7 días Experimento NH4SO4

g/L Sales g/L

Inóculo Crecimiento Ácido láctico

g/L

Azúcar Consumida

% 1 4.00 -1 -1 3 0.3358 96.53 2 4.00 1 -1 2 0.4055 100.00 3 1.00 -1 1 3 0.6713 95.81 4 4.00 1 1 1 0.4863 97.74 5 1.00 -1 -1 2 0.6458 91.96 6 1.00 1 1 1 0.7133 94.67 7 4.00 -1 1 3 1.3910 94.42 8 1.00 1 -1 3 0.9053 96.17


El crecimiento del hongo CBS 148.22 R. oryzae en los frascos puede apreciarse en

la gráfica 24. Se observa claramente que hubo una aglomeración del micelio del hongo en

la superficie, posiblemente por una preferencia de aglutinarse a la superficie de vidrio del

frasco. Resultó inesperado que no hubo una afinidad del micelio hacia las partículas

fibrosas de la caña..

56

Gráfica 24. Crecimiento suerficial y aglomerado del hongo


Con respecto a la variable de respuesta relacionada con el crecimiento, la cual fue

subjetiva como se explicó con antelación, el análisis de variancia incluyó unicamente el

factor correspondiente al sulfato de amonio, como responsable de un porcentaje

mayoritario de la variación. tal como se aprecia en el cuadro 16 y la gráfica 25.

Cuadro 18. Factor determinante para explicar la variación de la apreciación del crecimiento del hongo


Término Efecto estandarizado

Suma de cuadrados

Contribución %

A-NH4SO4 1.5 4.5 81.82

57

Gráfica 25. Diagrama de Pareto para los datos de crecimiento del hongo


El análisis de variencia mostrado en el cuadro 19 indica que el modelo es

significativo y que existe solo un 0.20% de probabilidad que un valor F de esa magnitud

ocurriera al azar o por causa del procedimiento experimental.

Cuadro 19. Análisis de variancia completo para los datos de crecimiento

Fuente Suma de

cuadrados Grados de libertad

Cuadrado del

promedio

Valor F Valor P

Modelo 4.50 1 4.50 27 0.0020 A-NH4SO4 4.50 1 4.50 27 0.0020 Residual 1.00 6 0.17

Cor. Total 5.50 7


Con respecto a la variable de respuesta relacionada con la produccón de ácido

láctico, el modelo sugerido fue mas complejo que el anterior, incluyendo los tres efectos

Pareto Chart

t-V

alue

of

|Eff

ect|

Rank

0.00

1.30

2.60

3.90

5.20

Bonferroni Limit 3.99706

t-Value Limit 2.44691

1 2 3 4 5 6 7

A

58

primarios, dos interacciones binarias y la interacción terciaria (AB, BC y ABC). Esto se

demuestra en el cuadro 20 y en la gráfica 26. La mayor contribución a la variación de los

datos experimentales lo explican las interacciones entre los factores, con excepción del

factor primario identificado con la concentración de la fuente inorgánica de nitrógeno. Lo

anterior implica que la producción de ácido láctico está influenciada por más factores de

los incluidos en el diseño experimental.

Cuadro 20. Factores determinantes para explicar la variación de la producción de ácido láctico

Término Efecto estandarizado

Suma de cuadrados

Contribución %

A-NH4SO4 0.26 0.14 17.56 B-Sales 0.088 0.016 1.99

C-Inóculo 0.075 0.011 1.41 AB 0.32 0.21 26.32 BC 0.33 0.21 26.90

ABC 0.32 0.20 25.81


Gráfica 26. Diagrama de Pareto para los datos de producción de ácido láctico


Pareto Chart

t-V

alue

of

|Eff

ect|

Rank

0.00

171.38

342.76

514.14

685.53



1 2 3 4 5 6 7

BC AB ABC

A

BC

59

El análisis de variencia mostrado en el cuadro 21 indica que el modelo es



Las siguientes propiedades del ajuste indican que la variación en la respuesta en

relación al posible error experimental fue adecuado: a) desviación estándar, 6.718E-004; b)

R-Cuadrado, 1.0000; c) R-Cuadrado Ajustado, 1.0000; d) C.V. %, 0.097; e) R-cuadrado

de la predicción, 1.0000; y f) Precisión, 1679.276.

Cuadro 21. Análisis de variancia completo para los datos de producción de ácido láctico

Fuente Efecto estandarizado

Grados de

libertad

Cuadrado del

promedio

Valor F Valor P

Modelo 0.79 6 0.13 2.912E+5 0.0014 A-NH4SO4 0.14 1 0.14 3.069E+5 0.0011 B-Sales 0.016 1 0.016 34693.96 0.0034 C-Inoculo 0.011 1 0.011 24682.06 0.0041 AB 0.21 1 0.21 4.599E+5 0.0009 BC 0.21 1 0.21 4.699E+5 0.0009 ABC 0.20 1 0.20 4.509E+5 0.0009 Residual 4.513E-7 1 4.513E-7 Cor Total 0.79 7


Con respecto a la variable de respuesta relacionada con la cantidad de azúcares

consumidos el modelo sugerido incluyó el nivel de sales, y las dos interacciones binarias

de este factor con el nivel de sulfato de amonio y con el nivel de inóculo. Esto se observa

en el cuadro 22 y la gráfica 27.

Cuadro 22. Factores determinantes para explicar la variación del consumo de azúcares

Término Efecto

estandarizado Suma de

cuadrados Contribución

% B-Sales 2.16 9.33 23.39

AB -3.395 23.06 57.78 BC -1.68 5.65 14.15


60

Gráfica 27. Diagrama de Pareto para los datos del consumo de azúcares


El análisis de variencia mostrado en el Cuadro 23 indica que el modelo es



Las siguientes propiedades del ajuste indican que la variación en la respuesta en

relación al posible error experimental fue adecuado: a) desviación estándar, 0.68; b) R-

cuadrado, 0.9531; c) R-cuadrado ajustado, 0.9179; d) C.V. %, 0.71, e) R-cuadrado de la

predicción, 0.8124; y f) Precisión, 14.960.

Cuadro 23. Análisis de variancia completo para los datos del consumo de azúcares

Fuente Efecto estandarizado

gl Cuadrado del

promedio

Valor F Valor P

Modelo 38.03 3 12.68 27.10 0.0041 B-Sales 9.33 1 9.33 19.95 0.0011 AB 23.05 1 23.05 49.28 0.0022 BC 5.64 1 5.64 12.07 0.0255 Residual 1.87 4 0.47 Cor Total 39.90 7


Pareto Chart

t-V

alue

of

|Eff

ect|

Rank

0.00

1.75

3.51

5.26

7.02



1 2 3 4 5 6 7

AB

B

BC

61

Las gráfica 29 ilustra el efecto sobre el consumo de azúcares de la interacción entre

los niveles de sulfato de amonio y sales.

Gráfica 29. Interacción real de los factors sulfato de amonio y concentración de sales


III.1.4 Pruebas en frascos agitados con partículas de caña congelada

La gráfica 30 ofrece dos vistas de la suspensión de esporas del hongo CBS 148.22 R.

oryzae empleada para preparar los inóculos.

Gráfica 30. Inóculo de esporas


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Consumo azúcares

B- -1.000B+ 1.000

X1 = A: NH4SO4X2 = B: Salts

Actual FactorC: Inoculo = 0.00

B: Salts

1.00 1.75 2.50 3.25 4.00

Interaction

A: NH4SO4

Con

sum

o az

úcar

es

91.9

93.925

95.95

97.975

100

62

Los resultados de los tres frascos empleados en la primera prueba de caña sin

esterilizar se encuentran el cuadro 24. El pH final estuvo elevado y el ácido producido

bajo. Además de ácido láctico se encuentra anotada la cantidad de etanol detectada en el

medio.

Cuadro 24. Variables de respuesta en la prueba con caña previamente congelada sin esterilizar

Frasco Caña fresca g pH final Etanol

g/100 mL Ácido láctico

g/100 mL 1 23.0 5.30 0.406 0.004 2 22.4 5.00 0.336 0.203 3 21.4 4.95 0.297 0.174


La gráfica 31 muestra el crecimiento de microorganismos en el frasco 2 después de

99 horas de fermentación. Se observa un crecimiento del hongo en la superficie del frasco

de color blanco adherido a la pared de vidrio formando un anillo. También se observa el

aspecto turbio de la fase líquida. La observación microscópica muestra la ausencia de

micelio de hongo y la proliferación de bacterias y levaduras naturalmente presentes en la

caña. Esta fue la causa de la producción de etanol en el frasco.

Gráfica 31. Frasco 2 mostrando una contaminación de levaduras y bacterias


63

En el cuadro 25 se resumen los estimados del coeficiente de rendimiento (Y) en

base al azúcar inicial en el frasco, suponiendo consumo completo, y el ácido láctico

producido por el hongo. Se observa que los valores en los tres frascos son bajísimos

debido a la contaminación

Cuadro 25. Estimados del coeficiente de rendimiento en la prueba con caña previamente congelada sin esterilizar

Frasco Azúcar total inicial, g

Ácido láctico producido, g

Y

1 4.39 0.01 0.00

2 4.28 0.25 0.06

3 4.09 0.22 0.05


Los resultados de los tres frascos empleados en la segunda prueba de caña con

esterilización previa se encuentran el cuadro 26. En este caso el pH fue más bajo, se

produjo menos etanol y más ácido láctico que en el ensayo con caña sin esterilizar.

Cuadro 26. Variables de respuesta en la prueba con caña previamente congelada y esterilizada

Frasco Caña fresca g pH final Etanol g/100 mL

Ácido láctico g/100 mL

1 28.1 4.8 0.041 1.300

2 28.8 5.5 0.000 0.479

3 28.4 6.2 0.145 1.330


La gráfica 32 muestra el estado del medio en los tres frascos. Al inicio se nota que

la caña se encuentra totalmente sumergida en el medio. Es notorio el crecimiento

superficial blanco adherido a la pared de vidrio del hongo al final de la fermentación. La

gráfica 33 contiene observaciones microscópicas al final de la fermentación del medio y de

la biomasa adherida a la pared de vidrio del frasco. El hongo en el medio fue escaso y el

micelio fue abundante adherido a la pared de vidrio.

64

Gráfica 32. Frascos al inicio (izquierda y al final de la fermentación (derecha)


Gráfica 33. Observación microscópica del medio (derecha) y de la biomasa del hongo adherida a la pared de vidrio del frasco


En el cuadro 27 se resumen los estimados del coeficiente de rendimiento (Y) en

base al azúcar inicial en el frasco, suponiendo consumo completo, y el ácido láctico

producido por el hongo. Se observa que los valores obtenidos en esta prueba con la caña

estéril fueron mejores que los de la prueba con caña sin esterilizar. Sin embargo, el frasco

dos tuvo un comportamiento anómalo y podría decirse que fue un resultado fallido.

65

Cuadro 27. Estimados del coeficiente de rendimiento en la prueba con caña previamente congelada y esterilizada

Frasco Azúcar total

inicial, g Ácido láctico producido, g

Y

1 5.32 1.63 0.31

2 5.45 0.60 0.11

3 5.37 1.66 0.31


III.1.5 Aumento de escala: extracción-fermentación de flujo circulante

El sistema fermentativo de circulación empleado en la prueba con el hongo CBS

148.22 R. oryzae se muestra en la gráfica 34. Se observa el hongo creciendo en forma

miceliar en el seno del líquido turbio y también, adherido a las superficies de acero

inoxidable y vidrio del tanque, formando flóculos densos. Las partículas de caña se

encuentran en el frasco de vidrio, en donde se extrae el azúcar de la caña y pasa al medio

líquido en donde es utilizada por el hongo para crecer y producir ácido láctico. Las dos

bombas circulantes se encargan de trasladar en forma continua el medio de un recipiente al

otro. El medio en el tanque se mantiene a una temperatura controlada, agitado y aireado en

forma constante.

Gráfica 34. Sistema de extracción –fermentación con flujo circulante a escala de

laboratorio


Fermentador: controltemperatura y aireación

Bombas de circulación

Recipiente de extracción

Fermentador: controltemperatura y aireación

Bombas de circulación

Recipiente de extracción

66

La caña pulverizada fresca y parcialmente deshidratada se observa en la gráfica 35

en donde se observa que la deshidratación no causó un cambio notorio de color en la

misma.

Gráfica 35. Caña pulverizada fresca (izquierda) parcialmente deshidratada

(derecha)


El gradual crecimiento del hongo en el fermentador en forma de flóculos se muestra

en la gráfica 36 a las 24 horas de proceso.

Gráfica 36. Crecimiento del hongo en el fermentador


Partícula finaPartícula finaPartícula fina Sin dañotérmico

Sin dañotérmico

Sin dañotérmico

Crecimiento inicial

en flóculos

Crecimiento inicial

en flóculos

A las 24 h

flóculos adheridos

A las 24 h

flóculos adheridos

67

Los cambios detectados se muestran en el cuadro 28. La primera columna indica

que el pH disminuyó en aproximadamente una unidad. La segunda columna muestra la

producción de ácido láctico. La tercera columna muestra el consumo de sacarosa. Al inicio

solo se detectó sacarosa pues fue el medio en el cual se creció el inóculo en el fermentador.

En las siguientes muestras aparecen también, la glucosa y la fructosa, provenientes de la

caña, o de la acción de la invertasa del hongo, o de ambos.

Cuadro 28. Estimados del coeficiente de rendimiento en la prueba con caña previamente congelada y esterilizada

Muestra pH Ácido

Láctico g/100 mL

Sacarosa g/100 mL

Glucosa g/100 mL

Fructosa g/100 mL

Inicio 5.02 0.60 5.28 0.00 0.00 6 horas 4.64 1.50 6.56 0.30 0.87

24 horas fermentador 4.19 1.57 4.60 0.14 0.44 24 horas extractor 4.42 1.88 3.45 0.61 1.90

Promedio de las dos muestras a las 24 horas

1.72 4.02 0.38 1.06


Se estimó el rendimiento Y de la manera siguiente: acido láctico producido: 1.72 –

0.60 = 1.12. Azúcar consumida: 5.28 – 4.02 = 1.26. Y = (1.12/1.26) = 0.89.

La cifra anterior puede considerarse solamente una aproximación. Primero, porque

el volumen del líquido en el sistema no fue constante por pérdidas por evaporación.

Segundo, se supuso que el azúcar consumido se refería a la sacarosa. Tercero, las

cantidades de glucosa y fructosa detectadas se supusieron que procedían de sacarosa

extraída de la caña e invertidas por la enzima del hongo.

Aunque el rendimiento obtenido fue aceptable, la tasa de producción, sin embargo,

fue muy lenta. Se supone el descenso del en el medio pH afectó el metabolismo del hongo.

68

La caña cortada en trocitos se muestra en la gráfica 37. Se observa que el

pretratamiento térmico para remover humedad y pasterizar no indujo colores obscuros y

extraños. Por el contrario, se notó una palidez del color superficial original.

Gráfica 37. Trocitos de caña frescos (izquierda) y trocitos parcialmente deshidratados (derecha)


El fermentador tenía 1.6 litros del medio estéril, más una carga de bentonita

en proporción de 3 g/L. La bentonita se agregó como material de soporte con el objeto de

que el hongo lo usara para crecer, evitando la formación de aglomerados en la superficie

metálica y de vidrio del fermentador. Se muestra su aspecto turbio al inicio del proceso en

la gráfica 38. Además, en la gráfica 39 se muestra el sistema de circulación de medio en

operación y se nota un crecimiento del hongo en la superficie de los trocitos en el

recipiente extractor, y un crecimiento, relativamente menor en comparación con el

observado cuando no se usó bentonita en el medio, en las superficies metálicas y de vidrio

en el fermentador.

69

Gráfica 38. Tanque del fermentador al inicio de la circulación del medio


Gráfica 39. Sistema de circulación del medio


El cuadro 29 muestra los valores de pH de las diferentes muestras obtenidas durante

el período en que funcionó el sistema de extracción-fermentación. Se observó un descenso

gradual del pH lo que implicó una paulatina producción de ácidos y la acidificación del

medio. Sin embargo, el cambio fue lento y en el período de las 45 horas a las 52 horas de

operación la acidificación estaba estable. Lo anterior confirma el efecto inhibitorio de la

Caña en trocitos

Crecimiento hongo

Caña en trocitos

Crecimiento hongo

70

acidez sobre el metabolismo del hongo. La concentración final de ácido láctico final fue de

=0.25 g/L, cinco veces más baja que la de la prueba anterior con caña pulverizada. Por otro

lado, se confirmó que la cepa de hongo no producía ácido fumárico.

Cuadro 29. Cambios de pH en el sistema

Muestra pH 1. Fermentador inóculo antes de iniciar circulación 6.44 2. Fermentador 4.0 hr 5.44 3. Fermentador 21.0 hr 4.72 4. Fermentador 23.5 hr 4.60 5. Fermentador 28. 0 hr 4.45 6. Fermentador 45.0 hr 3.90 7. Extractor 45.0 hr 4.06 8. Fermentador 48.0 hr 3.98 9. Fermentador 52.0 hr 3.93


El sistema de extracción-fermentación cuando se empleó la bacteria láctica DSM

4366 L. lactis y la caña en trocitos, se muestra en la gráfica 40. Se observa que se empleó

como recipiente extractor una columna inclinada en lugar del recipiente de vidrio anterior.

La entrada del medio a la columna era por la parte inferior. La salida por la parte superior.

Se observa, también, el medio turbio, tanto en la columna, como en el tanque fermentador.

Gráfica 40. Sistema de extracción-fermentación con medio circulante


71

Los datos obtenidos se muestran en el cuadro 30. La tercera columna muestra la

densidad óptica del medio circulante, que se empleó para obtener una estimación del peso

seco de bacterias, empleando la ecuación siguiente que previamente se obtuvo en forma

experimental.

Se observó un aumento de la biomasa microbiana. La quinta columna muestra el

descenso de pH, explicado por el aumento de ácido láctico en el medio, el cual se observa

en la sexta columna. La producción fue baja.

Cuadro 30. Cambios durante la operación de la cantidad de biomasa microbiana, el pH, y

la producción de ácido láctico


La operación del sistema con caña en trocitos, tanto con el hongo, como con la

bacteria láctica, fue menos satisfactoria que al emplear caña pulverizada.

III.1.6 Aspectos técnico-económico del proceso

El costo de producción del ácido láctico se ha proyectado de tal manera que los

polímeros derivados del mismo puedan competir con el precio de los polímeros

actualmente en uso obtenidos del petróleo. La meta es de un precio del polímero entre US$

1.0 y US$1.3 por kilogramo (Datta, Tsai et al 1995; John, Nampoothiri et al 2007a). Por

otro lado, el precio de venta del ácido láctico con una pureza aceptable para el consumo

humano y una concentración de un 88%, oscila actualmente entre US$1.38 a US$1.54

(John, Nampoothiri et al 2007a). Se observa entonces que es necesario mejorar

substancialmente la tecnología de operación para que el proceso fuese rentable.

Muestra

Tiempo horas

DO

Peso biomasa seca g/L

pH

Ácido láctico

g/100 mL 0 0.0 1.38 1.26 5.97 1 0.5 1.41 1.29 5.08 0.262 2 4.5 1.44 1.31 5.12 0.265 3 23.0 1.59 1.46 4.69 0.491 4 28.5 1.80 1.65 4.24 0.474

( / ) . * .g L DO= −0 9328 0 02938

72

Si se piensa que debe emplearse el azúcar de la caña o del sorgo dulce como

materia prima para producir ácido láctico, hay que considerar otro factor. El precio de

venta del azúcar en el mercado nacional para consumo humano está alrededor de US$0.775

por kilogramo. Desde esta perspectiva, la producción del ácido láctico, con un precio

unitario mayor que el azúcar, tendría un atractivo industrial, es decir, es factible emplear

caña de azúcar con el único propósito de producir ácido láctico.

Datta, Tsai et al (1995) estimaron que era factible alcanzar un costo de producción

de ácido láctico de US$0.56 por kilogramo; en donde el costo de la materia prima

representaba el 7.2 %. Por otro lado, Akerberg & Zacchi (2000) empleando glucosa

obtenida de cereales, estimaron un costo de producción entre US$0.90 y US$1.00 por

kilogramo, contribuyendo el costo de la materia prima cerca del 23 %.

Empleando el estimado de Akerberg & Zacchi (2000) por ser de fecha más reciente

y suponiendo un costo de US$1.00 para una producción con un rendimiento Y, kg de ácido

láctico por kg de azúcar consumido, de 0.64 y un consumo del 90 % de los azúcares por

parte del microorganismo empleado, se ha efectuado una simulación de la variación del

costo de producción en función de estos parámetros. Los resultados se muestran en la

gráfica 41, en donde el costo unitario en el eje vertical disminuye conforme el rendimiento

Y cambia desde 0.47 hasta o.64. El parámetro que separa las tres curvas en la gráfica es el

consumo de azúcares, el cual se varió desde 70 hasta 90 %. El costo de producción

aumenta cuando el consumo disminuye.

73

Gráfica 41. Simulación del costo de producción en función del rendimiento y el consumo


III.2 Discusión de resultados Sobre los microorganismos y substratos empleados.

Cepas de DSM 4366 L. lactis como de DSM 20008 L. paracasei habían sido

empleadas previamente para producir ácido láctico a partir de diferentes preparaciones de

jugo o melazas de caña de azúcar, jugo de sorgo dulce, melazas de remolacha, jugo de

dátiles, y extracto de topinambur (Richter & Träger 1994; Richter & Berthold 1998;

Nancib, Nancib et al 2001, 2005, 2009; Serna Cock & Rodríguez de Stouvenel 2007;

Chauhan, Trivedi et al 2007: Ge, He et al 2010). Su empleo en nuestras pruebas, por lo

tanto, estaba respaldado científicamente.

Fue desafortunado que la cepa DSM 20080 Lactobacillus delbrueckii subs.

Bulgaricus no pudo recuperarse de la preparación en que fue enviada, ya que se ha

mencionado en la literatura de su empleo exitoso con melazas y jugo de caña y con

melazas de remolacha (Patil, Kadam et al 2006; Kadam, Patil et al 2006; Calabia &

Tokiwa 2007; Bhat & Srivastava 2008; Dumbepratil, Adsul et al 2008).

Y kg láctico/kg azúcar

0.46 0.48 0.50 0.52 0.54 0.56 0.58 0.60 0.62 0.64 0.66

US

$/kg

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

90 % consumo azúcares80 % consumo azúcares70 % consumo azúcares

74

Por otro lado, para el DSM 4380 B. coagulans no se encontró referencia alguna con

estos substratos.

Con respecto al hongo CBS 148.22 R. oryzae, Bulut, Elibol et al (2004) publicaron

la producción de ácido láctico a partir de melazas de remolacha y de los azúcares solubles

de la semilla del carob. No se había empleado previamente con melazas o jugo de caña

(Zhang et al 2007), de manera que los resultados acá reportados son noveles en ese sentido.

Sin embargo, uno de los aspectos importantes que se menciona con frecuencia

(Zhang, Jin et al 2007b) ha sido la morfología del hongo durante su crecimiento, ya que se

ha constatado experimentalmente que la misma ha tenido un impacto significativo en la

utilización de nutrientes. De estas experiencias se ha recomendado la búsqueda de factores

que induzcan una morfología del hongo consistente en esferas de diámetro pequeño,

prefiriéndose a las otras que se han observado, por ejemplo, micelio en filamentos,

aglomerados superficiales o flóculos de mayor tamaño.

Se han reportado en la literatura situaciones experimentales parecidas a las

informadas acá. Por ejemplo, la gráfica 42 ilustra en varias exposiciones el diferente

crecimiento que se obtiene en agar, de cepas de hongo crecidas previamente en

fermentadores bajo diferentes condiciones, por ejemplo, el haber empleado diferente

cantidad del inóculo, de acuerdo con la base empleada para neutralizar el ácido producido

en el fermentador, y el empleo de soportes en el tanque fermentador.

Gráfica 42. Grupo de ilustraciones que muestran la diferente morfología del hongo al crecer sobre agar

Figure 3. Mycelial morphology in the culture with (A) and without (B) addition of the support and PEO. After the culture, the

culture broth was transferred to a 9-cm Petri dish and the photograph was taken

76

Fig. 1 Pictures of fungal growth suspended in fermentation broth in 15 cm petri dishes showing the

morphology change by different neutralizing agents after 48 h of cultivation a CaCO3 b ammonical solution c NaOH d NaHCO3

Fuente: Kosakai, Park et al 1997; Park, Kosakai et al 1998; Liu, Liao et al 2006;

Buyükkileci, Hamamc et al 2006;Yen, Chen et al 2010

La tendencia del hongo de adherirse a las superficies del fermentador y sus

accesorios también ha sido notada por investigadores previos (Zhou, Du et al 2000). La

gráfica 43 ilustra en varias exposiciones la similitud de lo encontrado acá.

Gráfica 43. Grupo de ilustraciones que muestran la afinidad del micelio del hongo de adherirse a las superficies de vidrio y de acero inoxidable

Fuente: Kosakai, Park et al 1997

77

Se han intentado acciones de diseño mecánico para evitar la formación de de estas

adherencias. La primera, consistió en emplear reactores de impulso por aire y sin agitación

mecánica. La gráfica 44 muestra en varias exposiciones los diseños empleados y los

resultados obtenidos.

Gráfica 44. Grupo de ilustraciones que muestran los diseños de fermentadores de impulso de aire

Fuente: Park, Kosakai et al 1998; Miura, Arimura et al 2004

78

La segunda, consistió en emplear reactores con soportes sobre los cuales se

aglomeraba el crecimiento del hongo. La gráfica 45 muestra en varias exposiciones los

diseños empleados y los resultados obtenidos.

Gráfica 45. Grupo de ilustraciones que muestran los diseños de fermentadores con soportes

Fuente: Tay, Yang et al 2002; Liu, Liao et al 2006

79

Los soportes permiten el crecimiento del hongo en forma de micelio fino. La

gráfica 46 muestra en varias exposiciones de microscopía electrónica el evento de la

adhesión y la forma del mismo.

Gráfica 46. Microscopía electrónica del crecimiento del hongo sobre los soportes

Fig. 2 a–d Scanning electron microscopy micrographs of the surfaces of an empty PVA cryogel granule (a, b) and that with fungus cells (c, d), where carrier (1) and fungus mycelium (2) are marked with arrows

Fuente: Efremenko, Spirichiva et al 2006a; 2006b

Sin embargo, el aumento de escala continua siendo un problema de ingeniería con

las cepas del hongo CBS 148.22 R. oryzae y no se han encontrado soluciones probadas

experimentalmente, por lo menos los resultados no han sido publicados.

80

Una ventaja mostrada en la experimentación con el hongo CBS 148.22 R. oryzae

fue la de poder usar fuentes de nitrógeno y fósforo necesarias para crecer y producir ácido

láctico relativamente económicas, sugeridas por Zhang, Jin et al (2007). Los resultados

mostrados en el diseño factorial empleado con caña deshidratada mostraron que el sulfato

de amonio, el fosfato de potasio y los sulfatos de magnesio y zinc afectaron la producción

de ácido y el consumo de azúcares. El efecto fue no solo primario, es decir cada factor por

separado, sino que la interacción entre ellos también fue significativa.

Por el contrario, en todos los ensayos con las bacterias lácticas fue necesario

adicionar una fuente compleja de nitrógeno, sales y vitaminas para obtener un crecimiento

y una producción de ácido láctico. Se empleó el extracto de levadura, materia prima de un

costo relativamente alto, en las proporciones indicadas y recomendadas en la literatura (ver

cuadros 3 y 4). Lo anterior representa una desventaja económica respecto al medio más

simple requerido por el hongo.

El empleo de un material insoluble, en este caso partículas o trocitos de caña de

azúcar, no ha sido común en las investigaciones previas para producir ácido láctico. Por

ejemplo, el bagazo de caña se empleó como soporte para producir ácido láctico, mezclado

con bagazo de yuca previamente hidrolizado enzimáticamente, formando un medio sólido

húmedo, pero sin una fase acuosa libre (John, Nampoothiri et al 2006). Sin embargo, en

dicho trabajo la fuente de carbono era glucosa soluble proveniente de la hidrólisis del

almidón y el bagazo de caña era un simple soporte. En nuestra investigación,

opuestamente, la sacarosa estaba dentro de la caña en suspensión, siendo extraída por el

agua y luego convertida a ácido láctico.

Las partículas de caña o los trocitos resultaron problemáticos para el proceso, ya

que sino se reducía la carga microbiana presente en la superficie de la caña previamente

lavada con agua, fuese por pasterización (deshidratación parcial a baja temperatura) o

esterilización (alta temperatura), la producción de ácido (disminución del pH) era

prácticamente nula. Debe considerarse que lo anterior representa un costo extra al

aumentar de escala el proceso.

81

Sobre la fermentación y el proceso.

Las tres bacterias lácticas y el hongo resultaron sensibles a una disminución del

pH. La acumulación del ácido en el medio inhibió drásticamente el crecimiento

microbiano, disminuyendo las tasas de consumo de azúcar y de producción de ácido. La

adición de carbonato de calcio sólido al frasco no aportó una mejoría, como se ha

reportado comúnmente en la literatura (Hofvendahl & Hahn-Hägerdal 2000; Wee, Kim et

al 2006; John, Nampoothriri et al 2007a; Sauer, Porro et al 2007; Doran-Peterson, Cook et

al 2008).

Las primeras horas de operación en los diferentes sistemas ensayados, cuando el pH

estaba entre 5.0 y 6.0, fueron exitosas, el microorganismo creció, volviendo turbio el

medio en el caso de las bacterias, y formando aglomerados visibles de micelio para el

hongo, la tasa de producción del ácido láctico fue aceptable al igual que el consumo de

azúcares, y por lo tanto el rendimiento. Luego, cuando el pH descendió por debajo de 4.6 a

4.8, los efectos negativos de la inhibición anteriormente mencionada se hicieron sentir.

La operación del sistema de extracción-fermentación con medio circulante, tanto

con el hongo CBS 148.22 R. oryzae, como con el DSM 4366 L. lactis, y con caña en

partículas o trocitos, mostró el mismo problema de inhibición del sistema por un descenso

paulatino del pH.

El rendimiento estimado como el cociente de la concentración de ácido láctico en el

medio y la cantidad de azúcares iniciales disponibles dentro de las partículas de caña, fue

aceptable únicamente para las primeras horas de operación. Como se presentó en la

simulación de costos, el rendimiento y el consumo de azúcares son factores que inciden

significativamente con el costo de producción. Es preciso en futuros ensayos controlar el

pH a valores cercanos de 6.0 en el medio del fermentador, de manera que la producción del

ácido continúe.

82

PARTE IV

CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES, BIBLIOGRAFÍA Y ANEXO S

IV.1 Conclusiones

Objetivo específico: se emplearán dos tipos de microorganismos para comprobar la

producción de ácido láctico de trocitos de caña a punto de corte. Por un lado, se ensayarán

cepas de bacterias lácticas homo fermentativas, y por el otro, una cepa del hongo

filamentoso Rhizopus oryzae.

IV. 1.1 Primera conclusión: la bacteria L. lactis DSM 4366 y el hongo R. oryzae

CBS 146.22 fueron capaces de crecer empleando la sacarosa extraída de la caña y producir

ácido láctico. Las primeras horas de operación en los diferentes sistemas ensayados fueron

exitosas. El pH descendió paulatinamente entre el intervalo de 6.0 a 5.0. El crecimiento fue

notorio y el rendimiento para el caso del hongo de ácido láctico en base al azúcar

consumido, fue igual a 0.89, valor que estuvo en el rango alto de los rendimientos

reportados en la literatura con otros substratos. Ambos microorganismos mostraron una

inhibición en su crecimiento cuando el pH descendió por debajo de 4.6 a 4.8, siendo

entonces, bastante sensibles al efecto dañino del ácido láctico disociado que se acumuló en

el medio al disminuir el pH.

Objetivo específico: se optimizará el medio de cultivo para la mejor cepa, buscando

el mayor rendimiento y tasa de producción de ácido láctico.

IV. 1.2 Segunda conclusión: las bacterias lácticas B.coagulans DSM 23080, L. lactic

DSM 4366 y L. paracasei DSM 20008 utilizaron igualmente la glucosa o la sacarosa como

única fuente de carbono, tanto en pruebas empleando reactivos puros, como en pruebas con

jugo de caña en donde además de los azúcares anteriores, utilizaron también la fructosa

presente. Sin embargo fue necesario agregar al medio una fuente compleja de nitrógeno

orgánico y vitaminas, ambas contenidas en el extracto de levadura adicionado en

proporción de 5 g/L. También fue necesario agregar K2HPO4 en proporción de 1 g/L. En el

caso del hongo R. oryzae CBS 146.22, asimiló sin problemas los tres azúcares presentes en

el jugo de caña, sacarosa, glucosa y fructosa. Además, creció mejor al agregar 4 g/L de una

fuente de nitrógeno inorgánico, NH4SO4, de precio unitario menor que el precio del

83

extracto de levadura. Fue necesario agregar pequeñas cantidades de KH2PO4 y MgSO4, 0.6

g/L. Por medio de un diseño factorial de experimentos se constató la existencia de una

interacción entre la fuente de nitrógeno y las sales.

Objetivo específico: se desarrollará un prototipo de reactor para aumentar la escala de

la fermentación de trocitos de caña y se hará una estimación de costos de una hipotética

planta a escala industrial.

IV. 1.3 Tercera conclusión: se logró operar satisfactoriamente un sistema de

extracción fermentación circulando el medio entre el tanque fermentador y el recipiente

extractor. El sistema funcionó mejor con caña pulverizada que con caña en trocitos. Fue

necesario pasterizar previamente la caña, deshidratándola parcialmente a valores cercano

del 30 %, empleando una temperatura relativamente baja de 60 oC. El paso anterior fue

necesario para bajar la carga microbiana existente en la caña original, aún después de ser

lavada con agua. En las pruebas con caña fresca se produjo etanol por la presencia de

levaduras que colonizan la superficie de la caña. En las pruebas con caña estéril, 121 oC

por 30 minutos, se observó la posible generación de compuestos inhibitorios al crecimiento

de los microorganismos que impartieron un color obscuro al medio.

IV. 1.4 Cuarta conclusión: el aumento de escala correspondiente al pasar de un

volumen de un frasco al volumen de un tanque presentó serios problemas al emplear el

hongo. Este mostró una tendencia a adherirse a las superficies de vidrio del recipiente o las

superficies de acero inoxidable de los accesorios internos, aglomerándose en grandes

flóculos blancos semejantes al algodón.

IV. 1. 5 Quinta conclusión: se demostró, a través de una simulación simple, el efecto

significativo que los cambios del rendimiento del ácido láctico y del porcentaje del

consumo de los azúcares presentes al inicio del proceso tienen sobre el costo unitario de

producción.

84

IV.2 Recomendaciones

Futuras investigaciones deben de tomar en cuenta lo siguiente:

1) Es imprescindible un sistema experimental en donde se pueda controlar el valor

del pH en el medio en un valor cercano a 6.0 por medio de la adición

automática de una solución básica.

2) Es necesario experimentar con reactores de geometría diferente a la del tanque

agitado al aumentar de escala, por ejemplo, reactores de columna, cuando se

emplearan bacterias, o de columna e impulso de aire, cuando se empleara el

hongo.

3) Debería experimentarse con un sistema de fermentación al estado sólido, es

decir, lograr el crecimiento directo del microorganismo sobre la superficie de la

caña pulverizada, sin la necesidad de agregar agua para la extracción de los

azúcares.

85

IV.3 Referencias Bibliográficas (Bibliografía citada en el texto) Adamberg, K., S. Kask, et al. (2003) The effect of temperature and pH on the growth of

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IV.4 ANEXOS

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IV.4.1 ANEXO 1: Referencias no citadas en texto Akerberg, C., K. Hofvendahl, et al. (1998) Modelling the influence of pH, temperature,

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100

PARTE V

INFORME FINANCIERO V. 1. Informe Financiero

obtención de ácido láctico a partir de la caña de...

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