obtenciÓn de un hidrolizado enzimÁtico bioactivo de...

OBTENCIÓN DE UN HIDROLIZADO ENZIMÁTICO BIOACTIVO DE PROTEÍNA MICROALGAL CON

POTENCIAL ANTIMICROBIANO

Lucia Verdugo González

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Maestría en Ciencias-Biotecnología

Medellín, Colombia

2018

OBTENCIÓN DE UN HIDROLIZADO

ENZIMÁTICO BIOACTIVO DE PROTEINA MICROALGAL CON POTENCIAL

ANTIMICROBIANO

Lucia Verdugo González

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Ciencias-Biotecnología

Director:

MSc, Alejandro Acosta Cárdenas

Codirectores:

Ph.D., Arley David Zapata Zapata Ph.D., Edith Marleny Cadena Chamorro

Línea de Investigación:

Biotecnología microalgal

Grupo de Investigación:

Grupo de Biotransformación-Universidad de Antioquia

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Maestría en Ciencias-Biotecnología

Medellín, Colombia

2018

“Y si todo esto es un sueño, que importa. Me gusta y quiero seguir soñándolo “

Luis Sepúlveda

Agradecimientos

Al grupo de Procesos Agrícolas de la Universidad Nacional, por su disposición y ayuda

incondicional.

Al acuario del Parque Explora por permitirnos usar sus instalaciones y equipos.

Al PECET por brindarme el espacio y la confianza para desarrollar mi experimentación,

especialmente a Sergio Pulido, María Fernanda Flores y Hoover Pantoja, quienes, gracias

a su paciencia y su valioso esfuerzo, me permitieron incursionar en un área desconocida.

A los profesores Carlos Eduardo Mejía, Luisa Fernanda Rojas y Orlando Ruíz por su aporte

invaluable en este trabajo.

A mi compañero Jeison Guayara por su amistad y respaldo en cada etapa del proceso.

A todos los integrantes del grupo Biotransformación por su apoyo moral y académico

durante estos años.

A mis tutores Alejandro Acosta, Arley Zapata y Edith Cadena por su infinita paciencia, sus

sugerencias y enseñanzas, que me hicieron mejorar profesional y personalmente.

A mis amigos por compartir los buenos y malos momentos.

A mi mamá por ser mi motivación constante, por sus consejos y palabras de aliento y a mi

papá a quien llevo en mi corazón.

Resumen

Las microalgas son microorganismos fotosintéticos, ampliamente utilizados a nivel

industrial por su alto contenido de proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, pigmentos

entre otros. Específicamente la proteína microalgal es una fuente prometedora de péptidos

con propiedades bioactivas, entre ellas, antimicrobianas. Los péptidos antimicrobianos

poseen un amplio rango de acción contra bacterias, hongos, virus, parásitos y células

tumorales y no producen la resistencia de los antibióticos convencionales.

En este trabajo, a partir de biomasa de la microalga Nannochloropsis sp. se obtuvo un

extracto de proteínas mediante el desarrollo de un protocolo de disrupción celular

mecánica por homogenización a pH neutro, el cual alcanzó un porcentaje de lisis del 60%.

El extracto y la biomasa intacta fueron sometidos a hidrolisis enzimática con dos proteasas

de manera simultánea, papaína y pancreatina, alcanzando un grado de hidrólisis superior

al 80% y al 20% respectivamente, después de 6 horas de reacción, demostrando la

resistencia que ejerce la pared celular frente la acción enzimática. Se evaluó el efecto

antimicrobiano de diferentes concentraciones del extracto hidrolizado con un tamaño

menor a 3KDa contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans,

obteniendo porcentajes de inhibición de 93,14%, 96,65% y 14,46% respectivamente,

convirtiendo a Nannochloropsis sp, en una microalga con un gran potencial para la

obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana.

Palabras clave: péptidos antimicrobianos, proteína microalgal, hidrolizado enzimático,

Nannochloropsis sp.

8 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial

antimicrobiano

Abstract

Microalgae are photosynthetic organisms, widely used at industrial level for their high

content of proteins, lipids, carbohydrates, vitamins, pigments and others. Specifically, the

microalgal protein is a promising source of peptides with bioactive properties, including

antimicrobial. Antimicrobial peptides have a wide range of action against bacteria, fungi,

viruses, parasites and tumor cells and do not produce the resistance of conventional

antibiotics.

In this work, from Nannochloropsis sp biomass, a protein extract was obtained through the

development of a mechanical cell disruption protocol by homogenization, which reached a

60% lysis percentage. The extract and the intact biomass were subjected to enzymatic

hydrolysis with two proteases simultaneously, papain and pancreatin, reaching a degree of

hydrolysis higher than 80% and 20% respectively, after 6 hours of reaction, demonstrating

the resistance exerted by the cell wall against enzymatic action. The antimicrobial effect of

different concentrations of the fraction less than 3KDa of the hydrolyzed extract against

Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans was evaluated, obtaining

average inhibition percentages of 93,14, 96,65% and 14,46% respectively, converting

Nannochloropsis sp, into a microalgae with a great potential for obtaining bioactive peptides

with antimicrobial activity.

Keywords: antimicrobial peptides, microalgal protein, enzymatic hydrolyzate,

Nannochloropsis sp.

Contenido

Pág.

Agradecimientos ............................................................................................................. 6

Resumen .......................................................................................................................... 7

Abstract............................................................................................................................ 8

Contenido ........................................................................................................................ 9

Lista de figuras .............................................................................................................. 11

Lista de tablas ............................................................................................................... 12

Lista de abreviaturas ..................................................................................................... 13

Introducción................................................................................................................... 15

1. Estado del arte ....................................................................................................... 17 1.1 Microalgas .........................................................................................................17 1.2 Extracción de proteína ......................................................................................20 1.3 Hidrolizados proteicos .......................................................................................23

1.3.1 Papaína y Pancreatina .................................................................................... 24 1.4 Antibióticos tradicionales ...................................................................................26 1.5 Péptidos antimicrobianos ..................................................................................28

2. Objetivos ................................................................................................................. 31 2.1 General .............................................................................................................31 2.2 Específicos ........................................................................................................31

3. Metodología ............................................................................................................ 33 3.1 Cultivo y obtención de biomasa .........................................................................33 3.2 Lisis celular y extracción de proteína .................................................................33

3.2.1 Cuantificación de proteína ............................................................................. 36 3.3 Hidrólisis enzimática empleando proteasas .......................................................36

3.3.1 Actividad enzimática de proteasas ................................................................. 36 3.3.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura ................................ 38 3.3.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico.............................................. 39 3.3.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ..................................... 40 3.3.5 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier .................................. 41

3.4 Actividad antimicrobiana....................................................................................41 3.4.1 Porcentaje de inhibición ................................................................................. 43

3.5 Análisis estadísticos ..........................................................................................43


antimicrobiano

4. Resultados y discusión ......................................................................................... 45

4.1 Lisis celular y extracción de proteína ................................................................ 45 4.2 Hidrólisis enzimática ......................................................................................... 49

4.2.1 Actividad enzimática de proteasas ................................................................ 49 4.2.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura ................................ 50 4.2.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico ............................................. 53 4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ..................................... 55 4.2.5 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier ................................. 57

4.3 Actividad antimicrobiana ................................................................................... 59

5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63 5.1 Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 64

6. Bibliografía ............................................................................................................. 65

A. Anexo: Perfil de proteína soluble en el tiempo para papaína y pancreatina. .... 75

B. Anexo: Análisis estadísticos ................................................................................. 77

C. Anexo: Curvas de calibración ............................................................................... 82

D. Anexo: Especificaciones de las enzimas empleadas. ......................................... 84

Lista de figuras

Figura 1. Células de Nannochloropsis sp. .......................................................................18

Figura 2. Modelo de la pared celular de Nannochloropsis (Scholz et al., 2014). .............20

Figura 3. Protocolo de actividad antimicrobiana. ................ ¡Error! Marcador no definido.

Figura 4. Protocolo de lisis celular y extracción de proteínas por homogenización. ........47

Figura 5. Células de Nannochloropsis sp. al inicio y al final del tratamiento de lisis celular.

........................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 6. Diagrama de superficie de respuesta estimada en diferentes niveles de pH y

temperatura de la papaína sobre caseína. ......................................................................50


temperatura de la pancreatina sobre caseína. .................................................................51

Figura 8. Gráfico de contornos para ambas enzimas utilizadas a diferentes niveles de

temperatura y pH. ............................................................................................................53

Figura 9. Sustratos sometidos a hidrólisis proteica con el complejo enzimático. .............54

Figura 10. Grado de hidrólisis en el tiempo obtenido después de proteólisis enzimática

de papaína-pancreatina a 44oC y pH 7 sobre caseína, biomasa microalgal sin tratamiento

y extracto de proteínas de Nannochloropsis sp ...............................................................55

Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). M) Marcador molecular

utilizado. 1) Muestra de extracto antes de hidrólisis. 2) Muestra del extracto después de

someterse a hidrólisis enzimática. ...................................................................................56

Figura 12. Espectros FT-IR de biomasa de Nannochloropsis sp. y los diferentes extractos

de proteína obtenidos. .....................................................................................................58

Figura 13. Crecimiento de S. aureus, E. coli y C.albicans con diferentes concentraciones

de extracto hidrolizado (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)) ...........................59

Figura 14. Porcentaje de inhibición de E.coli, S.aureus y C.albicans a diferentes

concentraciones de hidrolizado enzimático. ....................................................................60

Figura 15. Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Papaína (E/S 1%

p/p) sobre caseína. ..........................................................................................................75

Figura 16. . Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Pancreatina (E/S

1%p/p) sobre caseína......................................................................................................76

Figura 17. Curva de calibración para actividad enzimática de proteasas. .......................82

Figura 18. Curva de calibración de BSA para el método de Lowry. ................................83

Figura 19. Ficha dada por el fabricante de la enzima Papaína 4000 DB. ........................85

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Composición bioquímica de algunas especies de Nannochloropsis. ................. 18

Tabla 2. Comparación del perfil de aminoácidos de Nannochloropsis con proteínas de

referencia. (mg/g proteína) .............................................................................................. 19

Tabla 3. Biofuncionalidades de péptidos y proteínas de microalgas. .............................. 19

Tabla 4. Mecanismos de lisis celular para diferentes especies de Nannochloropsis

mediante tratamientos individuales o consecutivos ......................................................... 22

Tabla 5. Aplicaciones industriales de algunas enzimas (Liu & Kokare, 2016). ................ 23

Tabla 6. Características generales de algunas proteasas. .............................................. 25

Tabla 7. Algunos antibióticos de origen microbiano (Centrón, 2015). ............................. 27

Tabla 8. Antibióticos y antifúngicos convencionales para el tratamiento de infecciones

causadas por E. coli, S.aureus y C. albicans .................................................................. 27

Tabla 9. Métodos secuenciales de extracción de proteína. ............................................. 34

Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración de Tirosina. ...................................... 37

Tabla 11. Condiciones experimentales en el diseño de superficie respuesta para ambas

enzimas. ......................................................................................................................... 38

Tabla 12. Tipos de soluciones buffer empleadas en el experimento de acuerdo al pH del

tratamiento. ..................................................................................................................... 39

Tabla 13. Concentración de Nitrógeno total y proteína cruda en la biomasa inicial de

Nannochloropsis sp......................................................................................................... 45

Tabla 14. Rendimiento de extracción de los métodos de lisis celular. ............................. 46

Tabla 15. Porcentaje de lisis celular bajo diferentes ciclos de homogenización. ............. 47

Tabla 16. Porcentaje de células lisadas en el método de homogenización. .................... 47

Tabla 17. Concentración de proteína y actividad específica de los extractos enzimáticos

empleados de acuerdo a la metodología de Sigma-Aldrich (2014).................................. 49

Tabla 18. Condiciones de temperatura y pH que maximizan el grado de hidrólisis de

acuerdo a las condiciones planteadas para cada enzima. .............................................. 51

Tabla 19. Condiciones de temperatura y pH óptimas reportadas en la literatura para las

enzimas empleadas. ....................................................................................................... 52

Tabla 20. Concentración de proteína en las fracciones obtenidas del extracto hidrolizado.

....................................................................................................................................... 57

Lista de abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

ANOVA

BHI

Análisis de varianza

Brain Heart Infusion

BSA Seroalbúmina bovina

CO2 Dióxido de carbon

DBO Demanda biológica de oxígeno

DNA Ácido desoxirribonucléico

DQO Demanda química de oxígeno

EPA

FTIR

Ácido eicosapentaeinoico

Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier

E/S Relación enzima-sustrato

KDa Kilodalton

mL Mililitro

mm

mM

Milímetro

Milimolar

NaOH Hidróxido de sódio

PAMs Péptidos antimicrobianos

PDA Potato Dextrose Agar


antimicrobiano

Abreviatura Término

rpm Revoluciones por minute

TCA Ácido tricloroacético

TSA Trypticase Soy Agar

UFC Unidades formadoras de colonias

V Voltios

µL Microlitro

µm Micrómetro

µmol Micromol

Introducción

Las microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares, fotosintéticos,

capaces de transformar la luz solar en energía, para cumplir todas sus funciones vitales

(Catalá, 2013). Los usos tradicionales de las microalgas como biomasa obtenida de forma

natural abarcan principalmente campos como la nutrición humana y la alimentación animal

(Casal, 2010). Sin embargo, las microalgas pueden producir una gran cantidad de

productos de interés entre los cuales se encuentran vitaminas (Quintana, Hernández

Nazario, Morris, & Fernandez Gonzalez, 1999), lípidos (Cho, Oh, Park, Lee, & Park, 2013),

proteínas (Ursu et al., 2014), aminoácidos esenciales (Tibbetts, Bjornsson, & McGinn,

2015), carbohidratos (Martín, Lorenzo, Muñoz, Blanco, & Bolado, 2016), compuestos

bioactivos (Santhosh, Dhandapani, & Hemalatha, 2016), pigmentos (Romero et al., 2017),

productos farmacéuticos, entre otros.

Específicamente, las proteínas provenientes de microalgas han recibido especial

interés por sus posibles propiedades bioactivas cumpliendo funciones antioxidantes (I. C.

Sheih, Wu, & Fang, 2009), hepatoprotectoras (Ibañez, Herrero, Mendiola, & Castro-

Puyana, 2012), antihipertensivas (Ejike et al., 2017) y antimicrobianas (Sun, Chang, Li, &

Li, 2016), entre otras. Sin embargo, su interés no reside únicamente en la proteína intacta

como tal, sino también en los péptidos presentes en sus secuencias, responsables de las

funciones nombradas anteriormente, los cuales sólo serán activos después de su

liberación mediante hidrólisis enzimática con proteasas (Fernández, 2015).

En la actualidad, la constante preocupación por la resistencia que han generado los

microorganismos ante el uso excesivo e indebido de los antibióticos convencionales, se ha

incrementado dadas las dificultades en el tratamiento y control de enfermedades

infecciosas. La resistencia que generan los antibióticos es una respuesta natural de

adaptación evolutiva de los microorganismos frente a un estímulo constante (Y. Sánchez,

2015). El mecanismo de acción de estos compuestos permanece estable, perdiendo

comúnmente su eficacia. En este sentido, una buena solución ante este problema es


antimicrobiano

encontrar compuestos que presenten mecanismos de acción diferentes como es el caso

de los péptido antimicrobianos (PAMs).

Los PAMs se han encontrado desde la década de los años 20, en diferentes

fuentes, como microorganismos, insectos, anfibios, plantas o mamíferos y su aislamiento

y caracterización empezó a llevarse a cabo en los años 80 (M. L. Sánchez, 2016). Estos

compuestos hacen parte del sistema inmune innato de gran variedad de organismos,

actuando como una barrera natural contra el ataque de patógenos (Y. Sánchez, 2015).

Presentan ciertas ventajas como su amplio espectro de acción antimicrobiana, eficaz

contra bacterias, hongos, virus o parásitos y la vasta diversidad estructural, que le confiere

la posibilidad de poseer varios blancos moleculares en su papel terapéutico, entre los que

se encuentran membranas celulares, DNA/RNA, proteínas, ácidos nucleicos y enzimas

(Jessica Castañeda et al., 2009; M. L. Sánchez, 2016).

Se han reportado investigaciones donde se demuestra el potencial de diferentes

péptidos e hidrolizados proteicos de origen microalgal con actividad antimicrobiana (Sun

et al., 2016), actividad antiviral (El-Baz, El-Senousy, El-Sayed, & Kamel, 2013), actividad

inmunoreguladora (Hirahashi et al., 2002; Humberto J. Morris et al., 2007), las cuales abren

el camino a nuevas propuestas en el campo del desarrollo de productos de origen biológico

a partir de una fuente de proteína no convencional, como la biomasa microalgal, con una

amplia gama de aplicaciones, más allá de la alimentación animal y humana, precisando

las herramientas modernas de la biotecnología para brindar una plataforma a la obtención

y aplicación de nuevos agentes terapéuticos (Samarakoon & Jeon, 2012).

En este trabajo, se desarrolló una estrategia para la lisis celular y

consecuentemente la liberación de proteínas provenientes de la microalga

Nannochloropsis sp., mediante un tratamiento mecánico. Posteriormente, se llevó a cabo

una hidrólisis enzimática con un complejo de proteasas sobre las proteínas vegetales y se

evaluó la actividad antimicrobiana del extracto hidrolizado obtenido contra los

microorganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans, con el fin

de probar su efectividad en diferentes morfologías celulares.

Estado del arte 17

1. Estado del arte

1.1 Microalgas

Existen más de 200.000 especies de microalgas aproximadamente, algunas de las

cuales han jugado un papel importante en el campo biotecnológico por su implementación

en industrias como la de alimentos, cosméticos, fármacos, biocombustibles, fertilizantes,

tratamiento de aguas, entre otros (Bleakley & Hayes, 2017). Adicionalmente, las

microalgas pueden cultivarse en cualquier época del año (Zeriouh, 2013) y juegan un papel

biorremediador eliminando metales pesados, nitrógeno y fósforo de aguas contaminadas,

disminuyendo las cargas de DBO y DQO (Hernández & Labbé, 2014), incorporando en su

ciclo metabólico CO2 atmosférico y produciendo biomasa.

Nannocholoropsis es un género compuesto por 5 especies unicelulares, de forma

redonda, con un diámetro celular que va de 2-5 µm (Rojo, Morales, Ibarra, Martínez, &

Medina, 2016). Esta microalga ha sido ampliamente utilizada en la industria acuícola, por

presentar un elevado valor nutricional y producir compuestos químicos de alto valor

industrial como pigmentos (clorofila a, zeaxantina, cantaxantina y astaxantina) y ácidos

grasos poliinsaturados, especialmente el ácido eicosapentaeinoico (EPA), el cuál ha sido

utilizado para tratamiento de diversas enfermedades (Rocha, Garcia, & Henriques, 2003).


antimicrobiano

Figura 1. Células de Nannochloropsis sp.

Si bien la composición bioquímica de las microalgas dependen de muchos factores

como las condiciones de cultivo, disponibilidad de nutrientes, salinidad, temperatura, luz,

pH entre otros, y puede variar inclusive en la misma cepa, el perfil de aminoácidos, se

mantiene relativamente estable frente a estas condiciones (Cañavate, 2011).

Tabla 1. Composición bioquímica de algunas especies de Nannochloropsis.

Microalga Proteína (%) Carbohidratos (%) Lípidos (%) Referencia

Nannochloropsis sp. 60 15 16 Khatoon et al., 2014

Nannochloropsis oculata 19 37 11 Cavonius et al., 2016

Nannochloropsis oceánica 14,46 8,33 30,7 Ashour et al., 2017

La calidad nutricional de las proteínas se puede determinar por el contenido,

proporción y disponibilidad de estos aminoácidos (Ursu et al., 2014). En este sentido, las

bondades nutricionales de la proteína microalgal son comparables con proteínas vegetales

como la soya (Zeriouh, 2013), como se muestra en la tabla 2.

Estado del arte 19

Tabla 2. Comparación del perfil de aminoácidos de Nannochloropsis con proteínas de

referencia. (mg/g proteína)

Aminoácido esenciales

Patrón (1-3 años) a

Soya a Nannochloropsis granulata b Nannochloropsis sp. c

Histidina 18 27 7,5 7,6

Isoleucina 25 48 17,4 11,5

Leucina 55 67 32,4 29,8

Lisina 51 81 24,1 22,9

Metionina y cisteína

25 30 11,4 3,8

Fenilalanina y tirosina

47 65 33,2 34

Treonina 27 43 16,5 17,2

Triptófano 7 15 0,4 N.C

Valina 32 50 21,5 15,1

N.C: No cuantificado a: Tomado de Ridner (2006) b:Tomado de Tibbetts et al. (2015) c: Tomado de James, Al-Hinty, & Salman (1989)

La proteína microalgal como fuente alternativa a la proteína vegetal convencional

presenta importantes ventajas con respecto a su producción y obtención. Mientras que los

cultivos habituales precisan grandes extensiones de tierra fértil y cantidades significativas

de agua potable, las microalgas no las requieren para su crecimiento, lo cual no las

convierte en una competencia para la producción de alimentos y otros cultivos necesarios

(Bleakley & Hayes, 2017), evitando así, impactos ambientales negativos.

De manera general, las proteínas, hidrolizados proteicos y péptidos de una gran

variedad de cepas de microalgas han presentado diferentes funciones biológicas, estos

pueden alterar las funciones fisiológicas, aumentar el impacto positivo mediante la unión a

receptores específicos o inhibición de reacciones enzimáticas (Samarakoon & Jeon, 2012).

En la tabla 3, se muestra un resumen de la variedad de funciones reportadas por diferentes

investigadores.

Tabla 3. Biofuncionalidades de péptidos y proteínas de microalgas.

Microalga Función Referencia

Arthrospira maxima, Spirulina sp., Chlorella vulgaris

Antioxidante (Lisboa, Pereira, Alberto, & Costa, 2016; Martínez, Martínez, & Dávila, 2015; I.-C. Sheih, Wu, & Fang, 2009)

Spirulina platensis Antiviral (El-Baz et al., 2013)


antimicrobiano

Spirulina platensis, Chlorella vulgaris

Inmunoestimulante (Hirahashi et al., 2002; Humberto Joaquín Morris et al., 2009; Watanuki, Ota, Tassakka, Kato, & Sakai, 2006)

Arthrospira máxima Quelante (Martínez et al., 2015)

Chlorella vulgaris Emulsificante (Ursu et al., 2014)

Nannochloropsis oculata Antihipertensiva (Wishvajith Samarakoon et al., 2013)

Spirulina platensis, Chlorella vulgaris

Antimicrobiana (El-Baz et al., 2013; Sedighi, Jalili, Ranaei-Siadat, & Amrane, 2016)

Chlorella vulgaris Anticancerígena (Sedighi et al., 2016)

1.2 Extracción de proteína

La pared celular de las microalgas se presenta como una barrera de protección

contra factores ambientales, permite la transferencia de compuestos hacia el exterior, y

adicionalmente, contiene compuestos de interés como proteínas, carbohidratos, lípidos,

carotenoides, taninos e incluso lignina (Scholz et al., 2014). La pared celular de

Nannochoropsis sp. tiene un grosor que va desde 63 a 119 nm, dependiendo de cada cepa

y sus rasgos genéticos (Jeong et al., 2017).

Es importante resaltar que una etapa crítica en la consecución de compuestos

intracelulares es la disrupción celular ya que es necesario la ruptura de la pared celular de

las microalgas para lograr una adecuada liberación de las moléculas de interés (Bernaerts

et al., 2018; Carl Safi et al., 2014). Sin embargo, este paso puede llegar a ser un

inconveniente en el caso de Nannochloropsis sp. debido a la rigidez que presenta su pared

celular, formada por dos capas. Una capa interior compuesta por celulosa (aprox. el 75%

en peso) y una capa exterior hidrofóbica, llamada algaenan (Z. Zhang & Volkman, 2017),

las cuales le confieren una resistencia mecánica importante.

Extensiones

Capa 1 : Base de Algaenan

Capa 2 : Base de Celulosa

Struts

Membrana de plasma

Citoplasma

Figura 2. Modelo de la pared celular de Nannochloropsis (Scholz et al., 2014).

Estado del arte 21

Se han estudiado diversos mecanismos para este fin, utilizando herramientas

químicas, biológicas y mecánicas. Algunas técnicas incluyen molienda (Schwenzfeier,

Wierenga, & Gruppen, 2011), extracción con solventes (Lee, Show, Ling, & Chang, 2017),

congelación/descongelación (Wang & Zhang, 2012), hidrólisis enzimática (R. Zhang, Chen,

& Zhang, 2018), ultrasonido (Gerde et al., 2013), agitación mecánica (Lupatini et al., 2017),

alta presión (Carl Safi et al., 2014), descargas eléctricas de alto voltaje (Grimi et al., 2014).

En este sentido, la composición de la microalga empleada, su morfología y la composición

específica de la pared celular (Ursu et al., 2014), son elementos fundamentales en la

escogencia del método de extracción ya que éste permitirá garantizar su efectividad en

cuanto a la liberación de compuestos y la estabilidad de todos los metabolitos de interés.

En la tabla 4, se resumen algunas investigaciones empleando diferentes técnicas

para lisis y extracción de proteína de diversas especies de la microalga Nannochloropsis.

Estado del arte 22

Tabla 4. Mecanismos de lisis celular para diferentes especies de Nannochloropsis mediante tratamientos individuales o

consecutivos

Microalga Tipo de extracción Características del proceso Concentración Tiempo Rendimiento Referencias

Nannochloropsis granulata

Fluidos supercríticos CO2 supercrítico, 70°C, 35MPa 350 g 4,5 horas - (Tibbetts et al., 2014)

Nannochloropsis spp. Ultrasonido y Solventes

a pH elevado

Pulsos de 30 s on, 2 minutos off / pH 11,

60°C

5%(p/v) 4 minutos 30% (Gerde et al.,

2013)

Nannochloropsis oculata Disrupción celular con alta presión

2700 bar 0,5 g biomasa/25 mL de agua

destilada

2 pasos 52% (Carl Safi et al., 2014)

Tratamiento químico Solvente: Agua destilada, pH 12 (NaOH 2N), 40°C, en agitación

2 horas 31,10%

Ultrasonicación 20 kHz, Ciclo 5 s on, 15 s off. 30 minutos 13,50%

Molienda manual Molienda y suspensión en agua destilada 2 horas 9,70%

Nannochloropsis gaditana

Campo eléctrico pulsado Longitud de pulso:5 mS; intervalo entre pulsos:5s, Campo de fuerza:30 kV cm-1

60 g/L 10 pulsos 5% (C Safi et al., 2017)

Homogenización de alta presión

1500 bar, velocidad de flujo: 9L/h 100g/L 1 paso 50%

Tratamiento enzimático Alcalase, pH 8 y 50°C. E/S:5%(v/p) 4 horas 35%

Molienda Molino de bolas compuestas de óxido de

zirconio 0,5 mm. Velocidad de agitación 8m/s

100 g/L 1 hora 50%

Tratamientos de lisis celular mediante procesos secuenciales y/o consecutivos

Nannochloropsis sp Campo eléctrico pulsado 20 kV/cm, 1–4 ms, 13,3–53,1 kJ/kg 1% (p/p)

NA Cantidad total de

proteína soluble extraída: 0,7%

(Grimi et al.,

2014)

Descarga eléctrica de

alto voltaje

40 kV/cm, 1–4 ms, 13,3–53,1 kJ/kg 2-800

segundos

Ultrasonicación 200 W, 1–8 min, 12–96 kJ/kg 1-8 minutos

Homogenización de alta

presión

150 MPa, 1–10 passes, 150–1500 kJ/kg NA

Estado del arte 23

1.3 Hidrolizados proteicos

Existe un gran número de microorganismos productores de enzimas, ya sean

bacterias, actinomicetos, hongos y levaduras extracelulares o intracelulares, su producción

es tan versátil como atractiva sumado a una amplia variedad de estructuras y aplicaciones.

Muchas de ellas se producen extracelularmente mediante procesos industriales, ejemplo

de ellos son amilasas, proteasas, pectinasas, lipasas, xilanasas, celulasas, y las lacasas

(Liu & Kokare, 2016). Algunas industrias que utilizan enzimas en sus procesos se aprecian

en la tabla 5.

Tabla 5. Aplicaciones industriales de algunas enzimas (Liu & Kokare, 2016).

Industria Tipo de enzima

Alimentos, lácteos y bebidas Proteasas, Lactasas, Lipasas, Pectinasas, Amilasas, Amiloglucosidasas, Glucosidasas

Detergentes Amilasa, Celulasa, Lipasa, Proteasa, Manasa

Textiles Amilasa, Celulasa, Pectinasa, Catalasa, Keratinasa, Peroxidasa, Proteasa.

Alimentación animal Proteasa, Xilanasa

Producción de etanol Celulasa, Lacasa, Mananasa

Papel y pulpa Amilasa, Celulasa, Lacasa, Celulasa,Hemicelulasa, Proteasa, Lipasa, Xilanasa

Cueros Proteasa, Lipasa

Farmaceútica Peroxidasa, Penicilin acilasa

Biología Molecular Enzimas de restricción, Polimerasas, DNA Ligasa

Las proteasas (EC 3: 4, 11-19, 20-24, 99) (peptidasa o proteinasa) constituyen un

grupo grande y complejo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces covalentes

peptídicos. Las proteasas se pueden clasificar en función del pH, la especificidad del

sustrato, similitud con enzimas bien caracterizadas, y el sitio activo.

En este sentido, La hidrólisis proteica consiste básicamente en la ruptura del enlace

peptídico presente en la cadena de las proteínas, con la generación de polipéptidos e

incluso aminoácidos libres (Vioque & Millán, 2005).


antimicrobiano

k-1 H2O

El proceso de hidrólisis proteolítica está constituido por tres reacciones

consecutivas. Inicialmente se forma un complejo enzima proteína, con la consecuente

liberación de un péptido, por el rompimiento del enlace peptídico. Este péptido se separa

de la enzima y el proceso vuelve a continuar sobre el nuevo péptido o la proteína inicial

(Benitez, Ibarz, & Pagan, 2008).

𝐸 + 𝑆𝑘1⇔𝐸𝑆

𝑘2→ 𝐸𝑃 + 𝐻 − 𝑃´

𝑘3→ 𝐸 + 𝑃 − 𝑂𝐻 + 𝐻 − 𝑃´

Donde:

E: Enzima, S: Sustrato, P,P´: Péptidos resultantes, kx: Constante de velocidad de reacción.

La hidrólisis enzimática de proteínas presenta ciertas características como la

selectividad, dado que las enzimas son específicas para un determinado enlace y la

reacción se lleva cabo a condiciones moderadas de temperatura y pH, generalmente en el

intervalo de 40 a 60°C y un rango de pH entre 4-8 (Guadix, Guadix, Páez, González, &

Camacho, 2000).

La naturaleza de los péptidos formados en la hidrólisis enzimática, dependen en

gran medida de la naturaleza de las proteasas utilizadas. Las enzimas con actividad

endopeptidasa, rompen los enlaces peptídicos ubicados en el interior de la cadena

proteica, generando péptidos de bajo peso molecular. En contraste, las enzimas con

actividad exopeptidasa, rompen los enlaces en los residuos ubicados en los extremos de

la cadena, logrando polipéptidos y aminoácidos libres (Suarez, 2010).

1.3.1 Papaína y Pancreatina

La papaína pertenece a la familia de las cistein proteasas, puede ser estable y

activa en variadas condiciones, incluso a temperaturas elevadas. Esta enzima se obtiene

del látex del fruto de Carica papaya, la cual contiene cuatro endopeptidasas de cisteína,

incluyendo papaína, quimopapaína, glicil endopeptidasa y caricaína. (Worthington

Biochemical Corporation, 2016). Es ampliamente utilizada en una gran variedad de

sectores industriales como la panadera, láctea, cervecera, peletera (cueros) (Garcia &

Roldan, 2005). Esta enzima tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos donde

Estado del arte 25

los residuos de aminoácidos aromáticos del grupo carbonil son arginina, lisina o glutamina

(Banchon, 2005).

Por su parte, la pancreatina es un extracto obtenido del páncreas porcino. Contiene

un conjunto de enzimas que pueden clasificarse en proteasas, lipasas y amilasas (Enzyme

Educational Institute, 2018). La actividad de dichas enzimas puede variar dependiendo del

origen del páncreas y del tratamiento de las glándulas extraídas. Las enzimas Tripsina,

Quimotripsina y Elastasa son endopeptidasas específicas, las cuales rompen enlaces

peptídicos preferiblemente en el terminal carboxílico de L-aminoácidos básicos, aromáticos

y alifáticos, respectivamente (BIOZYM, 2016). Lo anterior le confiere un amplio rango de

especificidad y una alta eficiencia en el proceso de proteólisis. En la tabla 6, se exponen

algunas características de las estas enzimas.

Tabla 6. Características generales de algunas proteasas.

Nombre común

Familia Número de

residuos

Tipo de reacción

Enlaces de ruptura

PM* (KDa)

Referencias

Papaína Cistein proteasa

212 endopeptidasa Arg, Lys 23,406 ((Bermúdez Molina & Lipe Snabria, 2005;

Murugesh Babu, 2013; Sigma-Aldrich, 2018b)

Tripsina Serin proteasa

223 endopeptidasa Arg, Lys 23,4 (Schmidt, Jelsch, Ostergaard, Rypniewski, & Lamzin, 2003; Sigma-

Aldrich, 2018c)

Elastasa Serin proteasa

240 endopeptidasa Ile, Gly, Ala, Ser, Val y

Leu

25,9 (Glass, 2018; Sigma-Aldrich, 2018b)

Quimotripsina Serin proteasa

245 endopeptidasa Tyr, Trp, Phe, Leu

25 (Kashima et al., 1998; Sigma-Aldrich, 2018a)

*PM: Peso molecular

En cuanto a los estudios referentes a hidrolizados enzimáticos de biomasa

microalgal, Morris et al., (2001), investigaron 5 combinaciones enzimáticas en la hidrólisis

de las proteínas presentes en la biomasa autotrófica de la microalga Chlorella vulgaris

tratada previamente con etanol. Los mejores resultados se obtuvieron con las mezclas

papaína-tripsina y papaína-pancreatina, obteniendo grados de hidrolisis mayores a 55% y

50% respectivamente. Se emplearon 10 unidades proteolíticas de cada enzima por gramo

de biomasa. Se evidenció también, un efecto positivo del empleo de mezclas enzimáticas

en comparación con las enzimas individuales, lo cual está mediado por la superposición

de sus acciones hidrolíticas. Sun et al.( 2016), también comprobó que el efecto combinado


antimicrobiano

de enzimas proteolíticas puede incrementar el grado de hidrólisis con respecto a la acción

de enzimas individuales, sobre un extracto proteico de Spirulina platensis. Los resultados

obtenidos por los autores mostraron incrementos en el grado de hidrólisis de hasta 38,6%

cuando se empleó un método secuencial de proteasa alcalina, seguido de papaína, con

respecto al uso de papaína únicamente.

Posteriormente, Morris et al., (2008), quienes estudiaron la hidrólisis enzimática de

la proteína presente en Chlorella vulgaris 87/1 con pancreatina, observaron la influencia

de diferentes parámetros de reacción, destacando que los valores más recomendados

para llevar a cabo el proceso de hidrólisis es una relación enzima-sustrato de 30-40

Unidades/g alga, una concentración de biomasa de 10-15% y un rango de pH de 7,5 a 8.

Por otro lado, Lisboa et al., (2014) estudiaron la reacción de hidrólisis de la biomasa

de Chlorella pyrenoidosa y Spirulina sp. usando proteasas comerciales que actuaban en

diferentes rangos de pH. En los experimentos realizados variaron la concentración de

enzima (5-10 U/mL), la concentración de sustrato (5-10%) y el tiempo de reacción (60-240

min), obteniendo los mayores grados de hidrólisis a las 4 horas para ambas microalgas.

Más adelante, Lisboa et al., (2016), obtuvieron un hidrolizado enzimático a partir de

biomasa de Spirulina sp. con la enzima comercial Protemax 580L y estudiaron las

propiedades funcionales de éste, así como su potencial antioxidante. Los autores

encontraron un incremento en la digestibilidad, la solubilidad, la capacidad de retención de

agua y la actividad antioxidante del hidrolizado al compararla con la biomasa original.

Como muestran las investigaciones previas, es necesario el uso de un complejo

enzimático de proteasas para obtener mayores grados de hidrólisis y en ese sentido,

incrementar las posibilidades de obtener péptidos de bajo peso molecular, con posibles

propiedades antimicrobianas.

1.4 Antibióticos tradicionales

Los antibióticos pueden ser de origen natural o semisintético (Seija & Vignoli, 2006).

Los de origen natural son sintetizados por microorganismos como metabolitos

secundarios, estos productores de antibióticos van desde las bacterias, actinomicetos y

hongos filamentosos, hasta algunas especies de hongos superiores y algas, siendo los

actinomicetos, los responsables de más del 60% de la producción, especialmente el

Estado del arte 27

género Streptomyces (Egas & Tinajero, 2016). En la tabla 7 se muestran algunos

antibióticos de origen natural.

Tabla 7. Algunos antibióticos de origen microbiano (Centrón, 2015).

Antibiótico Microorganismo productor

Penicilina G Penicillium notatum

Estreptomicina Streptomyces griseus

Cefalosporina C Cephalosporium acremonium

Clortetraciclina Streptomyces aerufaciens

Cloranfenicol Streptomyces venezuelae

Vancomicina Nocardia orientalis

Eritromicina Streptomyces erythreus

Kanamicina Streptomyces kanamyceticus

Gentamicina Micromonospora purpurea

Lincomicina Streptomyces lincolnensis

Tobramicina Streptomyces tenebrarius

Tres de los microorganismos más usados para pruebas de evaluación de actividad

antimicrobiana son E. coli, S. aureus y C. abicans, ya que son representantes de las

bacterias Gram negativas, Gram positivas y de levaduras, respectivamente. Comúnmente,

los tratamientos con antibióticos para infecciones causadas por este tipo de

microorganismos, si no presentan una resistencia específica, se muestran en la tabla 8.

Tabla 8. Antibióticos y antifúngicos convencionales para el tratamiento de infecciones causadas por E. coli, S.aureus y C. albicans

Espectro antimicrobiano

Antibiótico Tipo Referencias

Escherichia coli Aminopenicilinas Betalactámico

(Seija & Vignoli, 2006) Cefalosporinas de primera

generación

Staphylococcus aureus

Eritromicina Macrólidos

Estreptomicina, Kanamicina, Gentamicina,

Neomicina

Aminoglucósidos

Moxifloxacina, Trovafloxacina

Quinolonas

Antifúngicos

Candida albicans Fluconazol y Voriconazol Azoles (Aguado et al., 2011; Allevato,

Negroni, & Galimberti,

2007)

Anfotericina B liposomal Polienos

Caspofungina Anidulafungina

Micafungina

Lipopéptidos


antimicrobiano

La resistencia bacteriana adquirida a antibióticos se ha presentado desde el inicio

de su uso como tratamientos de enfermedades infecciosas (Pérez & Robles, 2013). Los

mecanismos de acción que ejercen las células patógenas frente a los antibióticos son

modificación o hidrólisis de la estructura química del mismo, disminución de la captación,

inactivación o modificación del sitio blanco o alteración de las barreras de permeabilidad

como mecanismos de eflujo o expulsión (Cabrera Alaix & Mejía Otero, 2008; Pérez &

Robles, 2013). Estás bacterias resistentes a uno o más antibióticos (multiresistentes) son

una preocupación a nivel mundial, pues se han convertido en una amenaza para la salud

pública al ser inmunes a los tratamientos convencionales, provocando que las

enfermedades persistan (Castañeda, Gómez, Corrales, & Cortés, 2016). Adicional al

problema social que esto genera, la carga económica que origina esta situación a los

sistemas de salud de cada país es bastante considerable, debido principalmente al

aumento de los costos de tratamiento y las estancias hospitalarias prolongadas (Cabrera

Alaix & Mejía Otero, 2008).

En vista de esta problemática, existe una necesidad de implementar nuevos

compuestos terapéuticos, entre los cuales los péptidos antimicrobianos han presentado

una clara acogida (Castañeda et al., 2009).

1.5 Péptidos antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos son una herramienta del sistema inmune innato

presente en plantas, insectos y organismos vertebrados, cuyos mecanismos de acción

presentan una extensa variedad que va desde promover procesos antiinflamatorios, activar

procesos de cicatrización, interaccionar con la pared celular, hasta inhibir la síntesis de

proteínas y de ácidos nucleicos (Téllez & Castaño, 2010). Comúnmente, poseen un

tamaño pequeño de entre 12-100 residuos de aminoácido y son de naturaleza catiónica

(Jenssen, Hamill, & Hancock, 2006). Su amplia acción ha demostrado ser rápida y eficaz

contra bacterias, hongos, virus, parásitos e incluso células cancerígenas (Zhu, Liu, & Niu,

2017). Estas moléculas obtienen su clasificación de acuerdo a su estructura secundaria,

que puede ser de hélices-α, láminas-β o en estructura de asa y extendida, siendo las

primeras dos, las más usuales (Zhu et al., 2017).

Estado del arte 29

Algunos investigadores han reportado estudios que demuestran la actividad

antimicrobiana de hidrolizados proteicos y péptidos provenientes de microalgas como en

el caso de Morris et al. (2003), quienes evaluaron el efecto de la administración de un

hidrolizado proteico de Chorella vulgaris a una concentración de 500 mg/Kg, como

complemento nutricional en ratones Balb/c malnutridos. Identificaron una actividad

inmunoreguladora en el preparado, al lograr una restauración total de leucocitos,

acompañada de una mayor proliferación de linfocitos y niveles incrementados de

monocitos circulantes en la sangre periférica de los ratones tratados.

En los animales que recibieron el hidrolizado, se estimuló la proliferación de las

células del sistema fagocítico mononuclear y el metabolismo de los macrófagos, expresado

por una mayor actividad de la enzima fosfatasa ácida lisosomal y se evidenció el aumento

del peso relativo y actividad hematopoyética del bazo.

Investigadores como El-Baz et al.(2013), quienes probaron el efecto antiviral de un

extracto de Spirulina platensis en etanol, contra Adenovirus tipo 7, Coxsackievirus B4,

Astrovirus tipo 1, Rotavirus Wa y Adenovirus tipo 40, lograron demostrar un porcentaje de

reducción del 53,3%, 66,7%, 76,6%, 56,7% y 50% respectivamente. Adicionalmente,

pusieron a prueba el extracto mencionado con Escherichia coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, y Candida albican. Mostrando halos de

inhibición en los casos de Enterobacter faecalis y Candida albicans.

Por otro lado, Sun et al. (2016), aislaron el péptido SP-1, extraído de la microalga

Spirulina platensis y determinaron sus características más relevantes, su secuencia

compuesta por 18 aminoácidos, un peso molecular de 1,87 KDa, punto isoléctrico de 5,8

entre otros, y comprobaron la actividad antimicrobiana de éste contra Escherichia coli y

Staphylococcus aureus, hallando la concentración mínima inhibitoria de 8 mg/mL y 16

mg/mL respectivamente.

Sedighi et al. (2016), por su parte, señalaron que el extracto proteico hidrolizado

con pepsina de la microalga Chlorella vulgaris, tuvo un efecto inhibidor en la viabilidad de

células cancerígenas, correspondientes a adenocarcinoma MCF-7. Los investigadores

compararon el efecto antitumoral de la biomasa, la proteína antes de hidrólisis y el extracto

hidrolizado. Hallaron que el extracto hidrolizado, con péptidos de peso molecular entre 3-

5 KDa, redujo el crecimiento celular en más del 60%, después de 72 horas de incubación,

con un valor IC50 de 50 μg/μL.


antimicrobiano

Las investigaciones anteriores demuestran el potencial existente en la proteína

microalgal como fuente de compuestos biológicamente activos, específicamente de tipo

antimicrobiano, sin embargo, es claro que hace falta incursionar más en el área y explorar

más especies de microalgas, que han presentado buenas características en diferentes

aplicaciones industriales, como el caso de Nannochloropsis sp., que si bien, ha sido

estudiada ampliamente en el campo de los biocombustibles y la alimentación acuícola,

existe un vacío en las investigaciones referentes a su estudio como fuente importante de

proteína con propiedades terapéuticas.

Objetivos 31

2. Objetivos

2.1 General

Obtener un hidrolizado enzimático bioactivo a partir de proteína microalgal de

Nannochloropsis sp. con potencial antimicrobiano.

2.2 Específicos

Desarrollar un protocolo de extracción de proteínas de biomasa microalgal.

Evaluar la acción de dos enzimas proteolíticas, papaína y pancreatina, en el

proceso de hidrólisis sobre proteína microalgal.

Determinar la actividad antimicrobiana del hidrolizado enzimático obtenido en tres

microorganismos diferentes Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida

albicans.

Metodología 33

3. Metodología

3.1 Cultivo y obtención de biomasa

La biomasa de Nannochloropsis sp. fue cultivada en las instalaciones del acuario

del Parque Explora, en fotobioreactores de 250 litros de capacidad, como parte del trabajo

de maestría “Producción de biomasa microalgal, en fotobiorreactores al aire libre, en el

Urabá Antioqueño”.

Como medio de cultivo se empleó fertilizante agrícola NPK 13:40:13, con un

fotoperiodo de 24 horas de luz. Después de 11 días, se agregaron 9 mL de NaOH 0,5M

por litro de cultivo a cada reactor, con el fin de flocular la biomasa cultivada y facilitar su

concentración (Rojo et al., 2016). El tiempo de sedimentación fue de 24 horas, después

del cual se recolectó la biomasa. Se hicieron entre 3 y 5 lavados de la misma con agua,

para eliminar el exceso de sales presentes en el cultivo y posteriormente, se secó en un

horno WTC BINDER por 4-5 días a 50°C.

3.2 Lisis celular y extracción de proteína

Para la lisis y extracción de proteínas, se probaron diferentes métodos en

secuencia, comprendiendo tratamientos químico, biológico y físico, como se aprecia en la

tabla 9

Para la evaluación de los tratamientos la biomasa se secó a 50 oC en un horno

WTC BINDER por 4-5 días, posteriormente, ésta se maceró manualmente en un mortero

hasta obtener un polvo fino. Para la extracción con etanol absoluto se tomaron 100 gramos


antimicrobiano

de biomasa y se agregaron 400 mL de etanol. Se dejó en agitación suave por 24 horas,

bajo calentamiento controlado, no sobrepasando los 40°C. La biomasa se filtró y se separó

del sobrenadante (Humberto Joaquín Morris et al., 2008; R. Zhang et al., 2018).

Tabla 9. Métodos secuenciales de extracción de proteína.

Tratamiento Método Características Referencias

Químico Extracción con etanol Concentración de biomasa: 250 mg/mL, 40°C, 24 horas en agitación

suave.

(Humberto Joaquín Morris et al., 2008; R.

Zhang et al., 2018)

Biológico /

Enzimático

Hidrólisis enzimática con celulasa

Enzima: Acellerase 1500(Novozyme). E/S: 20 U/g biomasa, pH:4,8, 50°C,

por 4 horas

(C Safi et al., 2017; R. Zhang et al., 2018)

Físico Congelación/descongelación-Ultrasonido

Buffer fosfato 50mM pH 7,7 ciclos de 10 minutos (on: 2 seg, off:5 seg), amplitud de 20%, 1800W, 60KHz,

baño de hielo

(Grimi et al., 2014; Lee et al., 2017; R. Zhang

et al., 2018)

La hidrólisis enzimática con celulasa se hizo a partir de 10 gramos de biomasa

proveniente de la extracción con etanol, en una solución al 10% (p/v) en buffer acetato pH

4,8 con la enzima Acellerase 1500 de Novozyme®. La reacción se llevó a cabo a 50°C

durante 4 horas. Posteriormente, la biomasa se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos y

se neutralizó el sobrenadante (C Safi et al., 2017; R. Zhang et al., 2018).

Se implementó congelación y descongelación de la biomasa antes de realizar la

etapa de ultrasonido. 10 gramos de biomasa previamente hidrolizada se congelaron a -

20°C, se descongelaron a temperatura ambiente y se sometieron a ultrasonido en un

equipo BIOBASE® Ultrasonicator cell disruptor UCD-650, por 7 ciclos de 10 minutos (on: 2

segundos, off: 5 segundos) a 1800W y una amplitud de 20%, manteniendo la solución en

baño de hielo para evitar sobrecalentamiento.

La biomasa se centrifugó a 10.000 rpm por 10 minutos y se analizó el sobrenadante

de la muestra. Como criterio para determinar la efectividad de los tratamientos se midió la

proteína soluble presente en el sobrenadante de cada muestra y se relacionó con el

porcentaje de proteína crudo presente en la biomasa inicialmente.

Adicionalmente, se evaluó un método mecánico por homogenización con un

equipo ULTRA TURRAX IKA T25 DIGITAL. Inicialmente se evaluó el número de ciclos de

homogenización a una velocidad de 6000 rpm, donde cada ciclo constaba de 5 minutos de

Metodología 35

funcionamiento y 2 minutos de intervalo. Se analizaron los ciclos 2, 4,8,10,12 y 16, para lo

cual se utilizó 1 gramo de biomasa seca en 10 mL de buffer fosfato 50mM pH 7. La biomasa

se dejó incubando en buffer durante 15 minutos en baño de hielo antes de iniciar los ciclos.

Después de cumplir el número de ciclos asignados, se tomó una alícuota de 5 mL

y se centrifugó a 10.000 rpm por 10 minutos. Se separó el sobrenadante del pellet.

A partir del pellet obtenido, se determinó el porcentaje de lisis celular, mediante

recuento de células intactas en cámara de Neubauer (Pan, Huang, Wang, & Wu, 2017).

Se calculó el porcentaje de lisis mediante la ecuación 1:

𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝐿𝑖𝑠𝑖𝑠 (%) =

𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 1

−𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 𝑥

𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜1

∗ 100 (1)

Donde:

𝐶𝑒𝑙/𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 1: Número de células intactas por mililitro, al inicio del tratamiento.

𝐶𝑒𝑙/𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 𝑥: Número de células intactas por mililitro, al final del tratamiento.

Si bien 1 gramo de biomasa no es suficiente para obtener la cantidad de proteína

necesaria para llevar a cabo los demás objetivos de este trabajo, se decidió aumentar la

cantidad de biomasa, manteniendo la concentración anterior. Para ello se tomaron 60

gramos de biomasa y se mezclaron con 600 mL de buffer fosfato de sodio 50 mM, pH 7.

Se dejó reposar la mezcla durante 15 minutos a 4°C. Posteriormente, se sometió al

homogenizador, a una velocidad de 6000 rpm, durante 20 ciclos de 5 minutos con

intervalos de 2 minutos. La mezcla se mantuvo en baño de hielo, para evitar su

calentamiento.

Una vez transcurrido el tiempo de lisis, se centrifugó la mezcla a 10.000 rpm por 10

minutos y se filtró al vacío con filtro de membrana de celulosa de 0,2 µm de diámetro de

poro. Por último, el sobrenadante obtenido se sometió a diálisis por 24 horas, con una

membrana con tamaño de poro de 3,5 KDa de Spectra/Por de Spectrum laboratories.

En este segundo procedimiento se cuantificó el porcentaje de células lisadas en los

ciclos 10 y 20 del proceso.


antimicrobiano

3.2.1 Cuantificación de proteína

Para la determinación de proteína cruda en la biomasa, se midió el porcentaje de

nitrógeno total por el método de Kjendhal, utilizando como factor de conversión a proteína

5,2 (C Safi et al., 2017).

Para la determinación de la proteína soluble se empleó el método de Lowry (Lowry,

Rosebrough, Lewis Farr, & Randall, 1951) en el sobrenadante en los diferentes

tratamientos. Este método consiste en la formación de un complejo de color azul al entrar

en contacto con el enlace peptídico de las proteínas, siendo la intensidad de color,

proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución.

Se construyó previamente una curva de calibración, usando sueroalbúmina bovina

(BSA). La absorbancia de la muestra se midió a 750 nm en un espectrofotómetro UV-Vis

Spectronic Genesys 2PC.

3.3 Hidrólisis enzimática empleando proteasas

Para llevar a cabo este procedimiento, se adquirieron dos proteasas comerciales.

La primera es una Papaína grado alimenticio referencia Papaína 4.000 DB, distribuida por

la empresa Proenzimas. La Papaína 4000 DB, es una proteasa (E.C. 3.4.22.2) extraída del

látex de la Papaya Carica, esta enzima posee un amplio espectro de aplicaciones en la

industria alimenticia, como en la producción de hidrolizados de soya, ablandadores para

carne, en el sector cervecero y pesquero. Es un polvo seco, ligero, de color crema con un

rango de temperatura de 10 a 90°C.

La segunda enzima es una Pancreatina porcina, grado farmacéutico, referencia

CREON® 25000, distribuida por la empresa Abbott. Es un complejo enzimático compuesto

por Amilasa (18000 Unidades FIP), Lipasa (25000 Unidades FIP), Proteasas (1000

Unidades FIP) y se formula como minimicroesferas con cubierta esférica (ácido resistente)

en capsulas de gelatina. Las fichas técnicas de las enzimas se presentan en el Anexo D.

3.3.1 Actividad enzimática de proteasas

Para determinar la actividad de la enzima, se elaborará una gráfica sobre el

comportamiento de la enzima en el tiempo, para seleccionar el área donde su

Metodología 37

comportamiento es lineal. Para ello, se empleó como sustrato caseína (Sigma-Aldrich)

0,65% (p/v) sobre buffer fosfato 50 mM a pH 7,5, a una temperatura de 37°C y una relación

E/S de 1% (p/p), previa cuantificación de la cantidad de proteína presente en el extracto

enzimático por el método de Lowry (1956). Se tomaron muestras en los siguientes tiempos

de hidrólisis: 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. Para detener la reacción se agregó

900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6,25% (p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra,

(Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante 30 minutos a 4°C.

La muestra se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y

se determinó la cantidad de proteína soluble por el método de Lowry (1956). Por último, se

construyó una curva de concentración de proteína liberada vs tiempo y se determinó la

región lineal de la curva, para cada enzima estudiada. Las mediciones se realizaron por

duplicado.

Para determinar la actividad enzimática específica de las dos enzimas se

implementó el protocolo de Sigma-Aldrich (2014) con algunas modificaciones. Se asumió

una unidad proteolítica como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la liberación

de 1µmol de tirosina por minuto, a las condiciones del ensayo. Para ello, se construyó una

curva de calibración con diferentes concentraciones de L-tirosina 1,1 mM, como se muestra

en la tabla 10.

Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración de Tirosina.

Volumen de Solución madre de Tirosina (mL)

Volumen de agua destilada (mL) µMoles de Tirosina

0,05 0,95 0,06

0,08 0,92 0,09

0,10 0,90 0,11

0,12 0,88 0,13

0,15 0,85 0,17

0,17 0,82 0,19

0,20 0,80 0,22

0,22 0,78 0,24

0,25 0,75 0,28

0,30 0,70 0,33

De acuerdo al procedimiento anterior se determinó la actividad específica de las

enzimas con la ecuación 2:


antimicrobiano

𝑼𝒏𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆𝒔𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂⁄ =

(𝜇𝑀𝑜𝑙 𝑡𝑖𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎)

(𝑉𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎) ∗ ( 𝑇) ∗ (𝐶𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎) ∗ (𝐶𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎) (2)

Donde:

𝑉𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 = 𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎( 𝑚𝐿)

𝑇 = 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜 ( 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠)

𝐶𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 (𝑚𝑔/𝑚𝐿)

𝐶𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜 (𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

𝑚𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜)

3.3.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura

Para validar las condiciones óptimas en cuanto a temperatura y pH, se llevó a cabo

un diseño central compuesto de superficie respuesta con tres puntos centrales y dos

puntos estrella, con ayuda del Software estadístico STATGRAPHICS CENTURION XVI,

en el cuál se evaluaron las condiciones que se muestran en la tabla 11. Estas condiciones

se evaluaron para ambas enzimas.

Tabla 11. Condiciones experimentales en el diseño de superficie respuesta para ambas

enzimas.

Experimento Temperatura (°C) pH

1 35 8

2 47,1 7

3 45 8

4 40 8,4

5 40 7

6 32,9 7

7 40 7

8 45 6

9 35 6

10 40 5,6

Para la realización del experimento, se utilizó como sustrato proteico, caseína

(Sigma-Aldrich) 0,65% (p/v), una relación enzima-sustrato de 10 U/g de proteína y 45

minutos de reacción.

Se emplearon 3 buffers para los diferentes pH requeridos, como se indica en la tabla 12.

Metodología 39

Tabla 12. Tipos de soluciones buffer empleadas en el experimento de acuerdo al pH del

tratamiento.

Tipo de solución buffer Concentración (mM) pH

Fosfato 50 6 ; 7; 8

Tris-HCl 50 5,6

Acetato 50 8,4

Para detener la reacción se agregó 900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6,25%

(p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra, (Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante

30 minutos a 4°C. Se centrifugó la muestra a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el

sobrenadante y se determinó la cantidad de proteína soluble en éste por el método de

Lowry (1956).

Obtención del grado de hidrólisis

Para estimar el grado de hidrólisis de la muestra (Lisboa et al., 2016) como variable

respuesta, se utilizó la ecuación 3:

% 𝐺𝐻 =𝑃𝑆0 − 𝑃𝑆𝑡

𝑃∗ 100 (3)

Donde:

%GH: Grado de hidrólisis de la reacción (Porcentaje).

PSo: Cantidad de proteína soluble en TCA 6.25% (p/v), antes de la adición de

enzima.

PSt: Cantidad de proteína soluble en TCA 6.25% (p/v), después de la adición de

enzima, en un tiempo t.

P: Cantidad total de proteína determinada inicialmente

Dado que el objetivo de este trabajo es implementar las proteasas como un

complejo enzimático, mediante el estudio estadístico de ambas enzimas empleadas, se

definirán las condiciones de operación en las cuales la eficiencia de ambas fuera

significativa.

3.3.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico

Empleando las condiciones de operación del coctel enzimático, de acuerdo con el

numeral anterior, se llevó a cabo la hidrólisis enzimática del extracto de proteínas de

Nannochloropsis sp. Para tal fin, se prepararon soluciones madre de las enzimas a una

concentración de 100 mg/mL para papaína y 10 mg/mL para pancreatina en buffer fosfato


antimicrobiano

50 mM, pH 7. La relación enzima-sustrato implementada para cada enzima fue de 10 U/g

proteína (Humberto Joaquín Morris et al., 2001), es decir, que se empleó una cantidad total

de 20 U/g proteína.

Se tuvieron en cuenta dos controles, el primero fue una solución de caseína a la

misma concentración del extracto proteico de microalgas, y el segundo, fue una solución

de biomasa al 10% (p/v) (Humberto Joaquín Morris et al., 2008) de Nannochloropsis sp.

sin tratamiento alguno, ambos sobre buffer fosfato 50mM, pH 7.

La reacción se llevó a cabo durante 6 horas y se tomaron muestras en los siguientes

tiempos para determinar el curso de la reacción: antes de agregar las enzimas, a los 30

minutos, a la 1, 2, 4 y 6 horas.

La reacción se detuvo agregando 900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6.25%

(p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra, (Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante

30 minutos a 4°C.

Se centrifugó la muestra a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y

se determinó la cantidad de proteína soluble en éste por el método de Lowry (1956). El

grado de hidrólisis se determinó por la ecuación 3. Las mediciones se realizaron por

triplicado.

Por último, el extracto de proteínas hidrolizado se hizo pasar por un filtro de

centrífuga AMICON de 3 KDa, para probar su efectividad contra los microoganismos

Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans.

3.3.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Para determinar el tamaño molecular de las proteínas presentes en el extracto

obtenido antes y después de la hidrólisis enzimática, las muestras debieron ser

concentradas de acuerdo con Gallardo (2006), agregando a 10 mL de éstas, 10 mL de

TCA 20%(p/v) y se dejaron a 4°C durante toda la noche. Posteriormente, se centrifugaron

a 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Los pellets obtenidos se lavaron con 300 µL de acetona

fría y se dejaron reposar durante 30 minutos en baño de hielo. Se centrifugaron

nuevamente a 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Se retiró el sobrenadante y se evaporó

la acetona residual sometiendo la muestra a 30°C durante 30 minutos. El pellet resultante

Metodología 41

se resuspendió en 60 µL de Buffer de solubilización (Tris 100 mM, EDTA 100 mM y Urea

8M) pH 8,5.

Las muestras se mezclaron con 20 µL de una solución compuesta por: 10 µL de 2-

mercaptoetanol y 90 µL de solución colorante (SDS, Azul de Coomasie R-250, glicerol) y

se dejaron en incubación por 5 minutos a 80°C. Se sembraron 15 µL de las muestras en

el gel de tris-tricina SDS al 14% de concentración y se llevó a cabo la electroforesis a 150

V, durante 1 hora y 15 minutos.

Se sometió el gel a una solución de tinción de Azul de Coomasie R-250, seguido

por una solución de desteñido, ambas por 12 horas a agitación constante. El marcador

molecular utilizado fue el Blue Prestained Protein Standard de Biolabs® Inc., con un rango

entre 11-190 kDa.

3.3.5 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier

Se analizaron dos muestras de extracto en diferentes etapas del proceso de

extracción, antes y después de la diálisis y otra después del proceso de proteólisis. Para

ello se concentraron por evaporación a 50°C en un horno WTC BINDER, durante 20 horas.

Adicionalmente, se analizó la muestra de biomasa original, para lo cual se mezcló 50 mg

de ésta en 500 µL de agua destilada y se sometió a baño de ultrasonido por 15 minutos.

Los experimentos se realizaron en un equipo FT-IR Bruker Tensor II con ATR de

diamante (Bruker Optics, Alemania) en el Grupo de investigación de Bioquímica Estructural

de Macromoléculas, del Instituto de Química de la Universidad de Antioquia. El

espectrómetro está equipado con un detector MCT fotovoltaico enfriado con nitrógeno

líquido. Las muestras se analizaron con una resolución de 4 cm-1 entre un rango de número

de onda de 4000 a 700 cm-1. El curve fitting fue analizado usando el Software OPUS

(Bruker Optics, Almania). La línea base de los espectros fue corregida y analizada en cada

región seleccionada.

3.4 Actividad antimicrobiana

Para determinar la actividad antimicrobiana del extracto hidrolizado, inicialmente se

preparó la solución de extracto mediante filtración al vacío con un filtro de celulosa de

0,22µm, para eliminar posibles contaminantes.


antimicrobiano

En este procedimiento se realizó el método de dilución en caldo (Bustamante, 2015;

Ramírez & Marin Castaño, 2009), para lo cual se implementaron los siguientes

microorganismos: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

y Candida albicans (ATCC 90028).

Las cepas se activaron en caldo TSB (bacterias) y Sabouraud (levadura) por 24

horas a 36°C y se ajustaron con un patrón de McFarland de 0,5.

En tubos de 5 mL, se dispusieron 1233 µL de caldo (TSB o Sabouraud) y 3

diferentes concentraciones de extracto hidrolizado, 33,35% (v/v), 20% (v/v) y 10% (v/v),

correspondientes a 153 µg/mL, 92 µg/mL y 46 µg/mL de proteína, a los cuales se les

agregó 100 µL del inóculo respectivo. Los ensayos se hicieron por triplicado.

Adicionalmente, se hizo un control de viabilidad, que no contenía extracto.

Figura 3. Protocolo de actividad antimicrobiana

Las muestras se dejaron en incubación por 24 horas a 36°C. Una vez trascurrido

este tiempo se hicieron diluciones seriadas de cada muestra en solución salina 0,9% (p/v)

y se sembraron 10 µL de éstas en placa (TSA o PDA) por la técnica de microgota

(Herigstadab, Hamilton, & Heersink, 2001) por triplicado. Las muestras se incubaron a

36°C, 24 horas para las bacterias y 48 horas para la levadura. Por último, se hizo un

recuento de las colonias presentes en cada dilución sembrada. En la figura 3, se explica

de forma sintetizada el procedimiento anterior.

Metodología 43

3.4.1 Porcentaje de inhibición

El porcentaje de inhibición en el crecimiento de las cepas tratadas con el extracto

hidrolizado, se calculó con la ecuación 4 (Mayorga & Parra, 2009).

𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 (%) =(𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

−𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜

)

𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

∗ 100 (4)

Donde:

𝑈𝐹𝐶

𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙: 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑖𝑙𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑.

𝑈𝐹𝐶

𝑚𝐿 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜: 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑖𝑙𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜.

3.5 Análisis estadísticos

En muchos de los casos experimentales se realizaron tratamientos unifactoriales y

para el análisis del pH y Temperatura de las enzimas evaluadas se realizó un diseño central

compuesto de superficie respuesta con tres puntos centrales y dos puntos estrella.

La comparación estadística de los diferentes tratamientos propuestos se realizó

mediante análisis de varianza (ANOVA), con el software STATGRAPHICS CENTURION

XVI. Los resultados que presentaron valores de (p-value) < 0,05 fueron interpretados como

variables estadísticamente significativas en comparación a las demás (ver anexo B).

Resultados y discusión 45

4. Resultados y discusión

4.1 Lisis celular y extracción de proteína

La concentración de nitrógeno total y proteína cruda de la biomasa inicial de la

microalga utilizada, cuantificada mediante el método de Kjendhal, se muestra en la tabla

13.

Tabla 13. Concentración de Nitrógeno total y proteína cruda en la biomasa inicial de Nannochloropsis sp.

Muestra Biomasa original

Nitrógeno total (%) 1,7

Proteína cruda (%) 8,84

La importancia de estos valores radica en el cálculo del rendimiento de extracción

de los métodos evaluados.

En este trabajo se implementaron variadas metodologías de lisis, algunas

adaptadas de la literatura, como se aprecia en la tabla 9. Se evaluó la eficiencia de

tratamientos químicos, como extracción con etanol; biológicos, como uso de celulasas

comerciales; y físicos como ultrasonido, congelación/descongelación y diferentes

combinaciones de estos.

De acuerdo con los datos de la tabla 14, se podría decir que la poca eficiencia en

el caso de los tratamientos enzimáticos se debe a la sinergia en la que se encuentran la

celulosa y la hemicelulosa dentro de la pared. La presencia de hemicelulosa en las

microfibrillas de celulosa, reduce el área superficial del sustrato, lo que impide el contacto

con las enzimas. Además, la estructura cristalina de la celulosa es altamente resistente a

la degradación (Zuorro, Miglietta, Familiari, & Lavecchia, 2016). Los tratamientos químicos


antimicrobiano

como el tratamiento con etanol, disuelven parcialmente la hemicelulosa de la pared celular,

sin embargo, esto no es suficiente para la liberación de la mayor parte de proteínas

intracelulares (Ursu et al., 2014).

Tabla 14. Rendimiento de extracción de los métodos de lisis celular.

Método Proteína

soluble (%) Desviación estándar

Rendimiento de extracción (%)

Extracción con etanol 0,17 0,00043 1,92

Hidrólisis enzimática 0,14 0,0051 1,62

Congelación/descongelación-Ultrasonido

0,23 0,021 2,53

Por otro lado, Ursu et al. (2014), pudieron concluir, después de estudiar la

extracción de proteínas de Chorella vulgaris, usando un equipo de disrupción de alta

presión bajo condiciones de pH 7 y 12, que si bien los tratamientos llevados a cabo a pH

básicos, pueden lograr un porcentaje de extracción elevado, también pueden modificar las

propiedades funcionales de las proteínas, mientras que los tratamientos a pH neutro

pueden no lograr tanta eficiencia de extracción, pero las propiedades funcionales de las

proteínas no se ven modificadas. Es por esto que, como parte del procedimiento realizado

en este trabajo, siempre se tuvo en cuenta el pH de los extractos obtenidos,

manteniéndolos en 7.

En vista que, en ningún caso se obtuvo un rendimiento de extracción satisfactorio,

el cual puede estar en gran medida atribuido a la morfología de la pared celular de

Nannochloropsis sp., se propuso una metodología, basada en las experiencias anteriores

y que su combinación o secuencia permitiera lograr como requerimiento la disponibilidad

de las proteínas para su adecuado tratamiento. El método de homogenización presentó

buenos resultados en las experimentaciones propuestos como se observa en la tabla 15,

a pesar de que no se encontraron referencias bibliográficas empleando esta metodología

en Nannochloropsis sp.

En los experimentos anteriores de lisis celular se cuantificó proteína soluble en el

sobrenadante como criterio para determinar la efectividad del método en primera instancia,

sin embargo, en el método de homogenización, al aplicar este criterio, se encontró que los

métodos colorimétricos de Lowry (1951), Bradford (1976) y Biuret (Gornall, Bardawill, &

David, 1949), eran afectados por interferencias presentes en la muestra, debido a la


liberación de compuestos del interior de la célula. Es por esto que se implementó el

recuento de las células para determinar la disrupción de las mismas.

Tabla 15. Porcentaje de lisis celular bajo diferentes ciclos de homogenización.

Número de ciclos % Lisis celular Desviación estándar

2 25,44 6,18

4 52,20 12,47

8 58,93 6,00

12 80,28 2,67

16 86,66 2,12

Ahora bien, a una mayor cantidad de biomasa, manteniendo constante la velocidad

y la concentración de la solución de biomasa, se evaluaron dos ciclos de homogenización,

10 y 20, alcanzando un porcentaje de lisis celular de 53,9% y 60,1%, respectivamente, tal

y como se aprecia en la tabla 16.

Tabla 16. Porcentaje de células lisadas en el método de homogenización.

Numero de ciclos Porcentaje de Lisis celular Desviación estándar

10 53,9 6,8

20 60,1 3,3

En la figura 4 se muestra el esquema del procedimiento que se realizó. El objetivo

de la diálisis fue eliminar los compuestos que pudieron causar las interferencias en los

métodos de cuantificación, lo que permitiría determinar el rendimiento de extracción.

Figura 4. Protocolo de lisis celular y extracción de proteínas por homogenización.


antimicrobiano

En la figura 5, se visualizó la muestra al inicio y al final del tratamiento con un

microscopio Olympus CX21 con un objetivo de 40X (parte superior) y mediante

microscopía electrónica de barrido a 8.000X (parte inferior). Se aprecia la disrupción de las

células de la microalga, al presentar irregularidades en su forma y trozos de tamaños

variados. El aspecto rugoso en la superficie de la biomasa sometida al proceso de

homogenización demuestra que el procedimiento limita la compactación de las células

entre sí, haciéndolas más susceptibles a la disrupción celular. La heterogeneidad en los

tamaños puede deberse a los diferentes esfuerzos mecánicos aplicados, como impacto y

cizalla.

Figura 5. Células de Nannochloropsis sp. al inicio y al final del tratamiento de lisis celular

El porcentaje de proteína soluble en el sobrenadante después del proceso de lisis

y extracción fue de 0,88%, lo cual equivale a un rendimiento total de extracción de 9,93%,

alrededor de 5 veces mayor que los procedimientos realizados previamente. Zhang et al.

(2017) presentaron un resultado similar al lisar biomasa en polvo de Chorella pyrenoidosa,

en un sistema de homogenización, donde tomaron 1 g de ésta en 10 mL de agua destilada

y lo sometieron a 8.000 rpm por 10 minutos, en intervalos de 2 minutos. Los investigadores

obtuvieron un rendimiento de 12,1%. Sin embargo, se resalta que la cantidad de biomasa


sometida a ruptura en este trabajo es 60 veces mayor. Algunos métodos tienen buena

efectividad con pequeñas cantidades de biomasa, pero si se quiere escalar el proceso,

existen variables a tener en cuenta, además de la eficiencia de ruptura, como consumo

energético y mínima degradación de los productos (Pan et al., 2017).

Otros métodos mecánicos sobre biomasa de diferentes especies de

Nannochloropsis como la homogenización de alta presión y el uso de molinos de bolas han

presentado mayores eficiencias de extracción. Safi et al. (2017) reportaron un porcentaje

de lisis de 95% al utilizar un homogenizador de alta presión sobre biomasa de

Nannochloropsis gaditana, con una liberación de proteínas aproximada de 50% (p/p). Pan

et al. ( 2017) obtuvo un porcentaje de desintegración de células mayor al 98%, utilizando

un molino de bolas de turbina en la disrupción de biomasa de Nannochloropsis sp. Si bien

algunos autores emplean una combinación de diferentes métodos de extracción para

incrementar la lisis celular, no hay garantía que estos tratamientos produzcan mayor

eficiencia de extracción (R. Zhang et al., 2018).

4.2 Hidrólisis enzimática

4.2.1 Actividad enzimática de proteasas

Como se explicó en la sección anterior, se realizó un ensayo previo para determinar

en qué tiempo el comportamiento de la enzima es lineal, y de esta manera determinar la

actividad enzimática dentro de la región donde la velocidad es inicial. Este comportamiento

lineal se encuentra en el intervalo de 2-15 min y 2 – 20 min para la papaína y pancreatina

respectivamente, por lo tanto, se tomó para ambas enzimas, un tiempo de 10 minutos para

llevar a cabo el ensayo de actividad enzimática (ver gráficas en anexo A).

En la tabla 17, se especifican los valores de concentración de proteína y actividad

específica para cada enzima empleada, según las condiciones del ensayo, nombradas en

el capítulo de metodología. Las curvas de calibración se muestran en el anexo C.

Tabla 17. Concentración de proteína y actividad específica de los extractos enzimáticos

empleados de acuerdo a la metodología de Sigma-Aldrich (2014).

Enzima Concentración de proteína (mg/mL)

Actividad específica (U/mg proteína)

Papaína 0,020 1,53

Pancreatina 0,363 1,18


antimicrobiano

4.2.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura

Las figuras 6 y 7 muestran los diagramas del diseño de superficie respuesta para

papaína y pancreatina respectivamente, en lo intervalos de pH y temperatura definidos en

el diseño experimental.

La actividad enzimática de la papaína incrementa hasta una temperatura cercana

a los 37°C y un pH aproximado de 6,5 y a partir de ese punto empieza a disminuir,

formando una parábola en el caso de ambos factores evaluados.


temperatura de la papaína sobre caseína.

Teniendo en cuenta los coeficientes de regresión del modelo obtenido para la

papaína, se obtuvo la ecuación 5:

𝐺𝐻 (%) = −79,18 + 2,65 ∗ 𝑇 + 9,88 ∗ 𝑝𝐻 − 0,03 ∗ 𝑇2 − 0,75 ∗ 𝑝𝐻2 (5)

𝑅2 = 76,92%

En el caso de la pancreatina, no se presentó una parábola en la actividad

enzimática con respecto a los diferentes niveles de temperatura evaluados, es decir, no

hubo un valor máximo de actividad, sino que fue incrementando gradualmente, como una

línea recta. Por ese motivo, se evaluó también una temperatura de 50°C para esta enzima.

Por otro lado, la actividad de la enzima presentó un pico cuando el pH se aproximaba a 7

y a partir de este punto, empezó a disminuir.



temperatura de la pancreatina sobre caseína.

El modelo obtenido para pancreatina se muestra en la ecuación 6:

𝐺𝐻 (%) = −73,77 + 0,65 ∗ 𝑇 + 17,84 ∗ 𝑝𝐻 − 0,08 ∗ 𝑇 ∗ 𝑝𝐻 − 0,99 ∗ 𝑝𝐻2 (6)

𝑅2 = 95,32%

Teniendo en cuenta los resultados anteriores, las condiciones de temperatura y pH

que maximizan el grado de hidrólisis, de acuerdo con los modelos planteados en las

ecuaciones 5 y 6, se muestran en la tabla 18.

Tabla 18. Condiciones de temperatura y pH que maximizan el grado de hidrólisis de

acuerdo a las condiciones planteadas para cada enzima.

Enzima Temperatura (°C) pH

Papaína 38,59 6,58

Pancreatina 50 6,92

En la literatura se encuentra reportado un amplio rango de condiciones óptimas

para estas enzimas, especialmente de temperatura, como se muestran en la tabla 19. Sin

embargo, cabe resaltar, que los valores obtenidos en el experimento realizado se

encuentran dentro de los rangos reportados, a excepción de la temperatura óptima de

papaína, que si bien, no pertenece al rango, se encuentra muy próximo del límite inferior.


antimicrobiano

Tabla 19. Condiciones de temperatura y pH óptimas reportadas en la literatura para las

enzimas empleadas.

Tipo de enzima

Temperatura óptima (°C)

pH óptimo

Referencias

Papaína 40-65 6-7 (Garcia & Roldan, 2005; Kilara, Shahani, & Wagner, 1977; Pinto et al., 2007)

Pancreatina 37-50 6-8 (Humberto Joaquín Morris et al., 2008, 2001; Villa, 2016)

Como primer paso se determinaron las condiciones que maximizan el grado de

hidrólisis de las enzimas de manera individual, posteriormente el objetivo es buscar una

condición que maximice el grado de hidrólisis sobre el extracto de microalga, al emplear el

coctel enzimático Papaína-Pancreatina. En este sentido, teniendo en cuenta experimentos

previos de proteólisis de biomasa microalgal con las enzimas estudiadas, además que los

intervalos de pH y temperatura son similares, se decidió emplear las siguientes condiciones

para llevar a cabo la hidrólisis con este complejo: pH 7 y 44°C, bajo las cuales se obtiene

un grado de hidrolisis (GH %) esperado de 4,42 y 6,14 para la papaína y la pancreatina

respectivamente al emplear las ecuaciones 5 y 6, utilizando como sustrato de referencia

caseína.

Como se observa en la figura 8, si bien estas condiciones favorecen la acción de

ambas enzimas, no es el punto matemáticamente ideal, sin embargo, debido a que en

trabajos experimentales anteriores (resultados no mostrados), donde se evaluaron las

enzimas individualmente sobre el extracto de proteínas, la pancreatina demostró un

desempeño superior con respecto a la papaína, se buscó resaltar un poco más la acción

del complejo de proteasas presente en la primera enzima, esto debido probablemente a

los demás componentes de la pancreatina empleada (CREON® 25000) (Amilasas y

lipasas).


Figura 8. Gráfico de contornos para ambas enzimas utilizadas a diferentes niveles de temperatura y pH.

4.2.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico

Como se mencionó anteriormente, se llevó a cabo la hidrólisis con el cóctel

enzimático sobre tres sustratos diferentes (Caseína, biomasa microalgal sin tratamiento y

extracto de proteínas). El objetivo de incorporar los dos controles (caseína y biomasa

microalgal sin tratamiento) fue comparar el grado de hidrólisis del extracto proteico con una

proteína de referencia, de fácil digestión (caseína) y con un sustrato que posee una

resistencia importante para las enzimas, es decir, la pared celular de la biomasa original o

biomasa microalgal sin tratamiento de lisis celular. En la figura 9, se observan estos

sustratos, después de ser sometidos a hidrólisis con el complejo enzimático.


antimicrobiano

Figura 9. Sustratos sometidos a hidrólisis proteica con el complejo enzimático.

El grado de hidrólisis de cada sustrato trabajado a diferentes tiempos, se observa

en la figura 10. Las muestras con una letra en común (del mismo color) no difieren

significativamente al 5% (ver anexo B).

Se alcanzó un mayor grado de hidrólisis sobre el extracto de proteína (>80%) que

sobre la biomasa original (<25%), como se suponía, debido básicamente a la presencia de

la pared celular, que sirve como barrera para las enzimas y limita sus funciones hidrolíticas

sobre la proteína.

No se presentaron diferencias estadísticamente significativas en el grado de

hidrólisis alcanzado en los diferentes tiempos de reacción para el extracto de proteína y la

caseína, es decir, que después de la media hora de reacción, el número de enlaces

peptídicos rotos por la acción enzimática no incrementó significativamente.

En el caso de la biomasa original, se observaron diferencias estadísticamente

significativas antes y después de las dos horas de tratamiento, lo cual puede explicarse

por el hecho de que, durante las primeras dos horas, las enzimas actúan sobre la proteína

soluble de la microalga. Después de este tiempo, las enzimas entran en contacto con la

proteína insoluble intracelular (Humberto Joaquín Morris et al., 2008).


Figura 10. Grado de hidrólisis en el tiempo obtenido después de proteólisis enzimática

de papaína-pancreatina a 44oC y pH 7 sobre caseína, biomasa microalgal sin tratamiento

y extracto de proteínas de Nannochloropsis sp

Wang & Zhang ( 2012), evaluaron la acción de tres proteasas diferentes sobre

extracto de proteínas de la microalga Chlorella pyrenoidosa, alcanzando grados de

hidrólisis de 18,31%, 14,33% y 8,47% para alcalasa, papaína y tripsina, respectivamente.

Morris et al. (2001), obtuvieron grados de hidrólisis superiores al 50%, al implementar

combinaciones enzimáticas sobre suspensiones al 10%(p/v) en agua de biomasa

despigmentada de Chlorella vulgaris. Las mezclas de enzimas que lograron estos

resultados fueron papaína-tripsina y papaína-pancreatina. Lo que corrobora los resultados

de este estudio, el uso de mezclas enzimáticas permite obtener hidrólisis más completas,

debido a la especificidad de las enzimas. Vale la pena aclarar que hasta ahora en la

revisión bibliográfica realizada en las diferentes bases de datos analizadas no se presenta

casos de tratamientos enzimáticos con extractos proteicos de Nannochloropsis.

4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Con el propósito de determinar los tamaños de los péptidos y/o proteínas después

de los tratamientos enzimáticos, se realizaron pruebas de electroforesis en un gel de

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,5 1 2 4 6

Gra

do

de

hid

róls

is (

%)

Tiempo (h)

Biomasa original Caseína Extracto de proteínas

a a

a a

a

a

a ab b b

a a a

a a


antimicrobiano

poliacrilamida (SDS-PAGE). En la figura 11, se puede ver el resultado de la acción de las

enzimas sobre las proteínas de la microalga y el marcador molecular M (Blue Prestained

Protein Standard). En la columna 1, se muestran las proteínas presentes en el extracto

proteico antes de someterse a hidrólisis enzimática. Se evidencia la presencia de varias

bandas, lo que permite deducir que existe una variedad de proteínas en el extracto. Las

bandas más prominentes se observan entre 25-32 KDa y entre 32-46KDa.

En la columna 2, se muestra el extracto de proteínas sometido a hidrólisis

enzimática. Como se puede observar, desaparecen algunas bandas presentes en la

columna 1, como aquella de aproximadamente 100 KDa; se atenúan otras, como la de 32-

46 KDa y la de 46-58 KDa, y sobresalen otras, como la de 58-75KDa, haciendo evidente

el efecto de las enzimas, al reducir el tamaño molecular de algunas proteínas.

Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). M) Marcador molecular utilizado. 1) Muestra de extracto antes de hidrólisis. 2) Muestra del extracto después de

someterse a hidrólisis enzimática.

Adicionalmente, mediante el método de Lowry (1956), se midió la proteína soluble

en el extracto antes y después de ser filtrada por la membrana de 3KDa, para determinar

la proporción de los péptidos de bajo peso molecular en el hidrolizado obtenido. Los

resultados se muestran en la tabla 20, los cuales son producto de tres mediciones.


Tabla 20. Concentración de proteína en las fracciones obtenidas del extracto hidrolizado.

Muestra Concentración de proteína (g/L)

Desviación estándar

Extracto hidrolizado 0,80 0,03

Extracto hidrolizado <3kDa 0,46 0,02

El porcentaje de proteína presente en la fracción menor a 3 KDa corresponde al

58,16%, lo cual indica que la mayor cantidad de proteína del extracto hidrolizado

corresponde a péptidos de bajo peso molecular, resultados complementarios a los

expuestos en el gel de electroforesis.

4.2.5 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier

Se analizaron diferentes muestras con el fin de hacer un seguimiento del proceso

de extracción e hidrólisis de proteínas microalgales. Como se observa en la figura 12, la

muestra de biomasa original de Nannochloropsis sp. presenta dos bandas entre 2954-2850

cm-1 y entre 1710-1740 cm-1. La primera correspondiente a las cadenas alifáticas de lípidos

y la segunda a ésteres de ácidos grasos y cetonas de clorofila (Mecozzi, Pietroletti, &

Tornambé, 2011). En contraste, las muestras de los extractos crudo sin dializar, dializado

e hidrolizado, presentan una banda entre 3000 y 2850 cm-1, con una menor intensidad que

la de la biomasa original de microalga y la banda relacionada con la clorofila desaparece

completamente, lo cual sugiere que en el proceso de extracción por homogenización la

cantidad de compuestos ligados a lípidos y pigmentos de la clorofila tuvieron una baja

remoción. Lo anterior indica que el proceso de extracción realizado fue selectivo a

proteínas y carbohidratos.

La banda en la región comprendida entre 1700 y 1510 cm-1 presenta una ligera

modificación entre los extractos crudo sin dializar y dializado con respecto al extracto

hidrolizado. Si bien las bandas con mayor intensidad en las tres muestras (entre 1600-

1660 cm-1) corresponden a amida I (Kong & Yu, 2007), la muestra de extracto hidrolizado

presenta una banda en 1536 cm-1, atribuida a amida II (CN 18-40%, NH 40-60%) (Dean,

Sigee, Estrada, & Pittman, 2010; Kong & Yu, 2007; Mecozzi et al., 2011), que no presentan

las demás muestras, lo cual podría ser consecuencia del efecto hidrolítico de las enzimas

sobre los enlaces peptídicos de las proteínas.

Por otro lado, en las tres muestras de extracto crudo sin dializar, dializado e

hidrolizado, se presentan los picos típicos de estructuras secundarias (Barth, 2007; Kong


antimicrobiano

& Yu, 2007): láminas-β (1635, 1632 y 1637 cm-1), hélices-α (1663, 1659, 1661 cm-1), giros-

β (1687, 1683, 1681 cm-1), respectivamente, demostrando que el método de extracción y

el manejo de los extractos durante el proceso fue lo suficientemente delicado como para

mantener las proteínas plegadas, garantizando su estabilidad biológica.

Los espectros de las muestras de extracto crudo sin dializar y dializado presentan

mucha similitud entre las bandas que la componen, es decir, que los compuestos que se

eliminaron en este proceso fueron básicamente las sales presentes en la biomasa de

microalga, especialmente de sodio por haber sido cultivada en un ambiente marino. Estas

sales no solo interfieren en el método de cuantificación de proteínas, sino también en el

proceso de hidrólisis.

Adicionalmente en la figura 12, se observan los espectros de Buffer fosfato 50 mM,

pH 7, el cual estuvo presente tanto en el proceso de extracción, como de hidrólisis y la

solución de enzimas, es decir, el complejo enzimático papaína-pancreatina, con el fin de

ratificar que ninguno de los dos interfiere en los espectros de los extractos de proteína.

Figura 12. Espectros FTIR de biomasa de Nannochloropsis sp. y los diferentes extractos de proteína obtenidos.


4.3 Actividad antimicrobiana

Existen una gran variedad de métodos para determinar la actividad antimicrobiana

de un compuesto. En este trabajo, dado que el extracto hidrolizado de proteínas

presentaba cierta turbidez, se decidió emplear un método de dilución en caldo con recuento

de células en placa por microgota.

El crecimiento de S. aureus y E. coli, presentó diferencias estadísticamente

significativas, con un nivel de confianza del 95%, entre la muestra control (medio e inóculo)

y las tres concentraciones de extracto hidrolizado. Adicionalmente, existen diferencias

entre la mayor concentración (C1: 33,35%(v/v)) y la menor concentración (C3:10%(v/v)) de

hidrolizado sobre el crecimiento celular de ambos microorganismos. En la figura 13, se

aprecia que los porcentajes de inhibición de las bacterias analizadas son ligeramente

mayores en el tratamiento al cual se les agregó la mayor concentración de hidrolizado. Es

decir que, en estos casos, el efecto inhibidor de los compuestos presentes en el

hidrolizado, probablemente péptidos antimicrobianos, es proporcional a la concentración

del mismo dentro del cultivo.

Figura 13. Crecimiento de S. aureus, E. coli y C.albicans con diferentes concentraciones de extracto hidrolizado (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)).

Por su parte, C. albicans no presentó un comportamiento similar. Existen

diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento control y los tratamientos

con extracto hidrolizado, sin embargo, con un nivel de confianza del 95%, no se observaron


antimicrobiano

diferencias en el crecimiento de la levadura entre aquellos tratamientos con

concentraciones diferentes del hidrolizado enzimático.

Es evidente que el efecto inhibidor también influye el crecimiento de la levadura, sin

embargo, su acción se logró en menor medida comparado con las bacterias, pues el

porcentaje máximo de inhibición fue del 14,46%, mucho menor que 93,14% y 96,65%,

porcentajes máximos de inhibición de S.aureus y E. coli respectivamente, como se aprecia

en la figura 14.

En este trabajo, los porcentajes de inhibición para bacterias, indican que los

compuestos presentes en el hidrolizado son prometedores por su efecto antibacteriano.

Posiblemente, a mayor concentración podrían presentar incluso capacidad bactericida.

Figura 14. Porcentaje de inhibición de E.coli, S.aureus y C.albicans a diferentes

concentraciones de hidrolizado enzimático (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)).

El efecto bacteriostático del extracto fue levemente mayor en E. coli, lo cual podría

deberse a la producción de proteasas y liberación al medio por parte de Staphyococcus

aureus, dificultando la acción de los compuestos proteicos presentes en el extracto (Oñate,

Manrique, Patiño, & González, 2017). Aunque el efecto antimicrobiano de péptidos

provenientes de proteína microalgal ha sido comprobado para diversos microorganismos

en este y otros trabajos (El-Baz et al., 2013; Sedighi et al., 2016; Sun et al., 2016), sus

mecanismos de acción no han quedado claros y hace falta investigación al respecto.

Sedighi et al. (2016), mostraron importantes resultados frente a la acción

antimicrobiana de Chorella vulgaris contra E. coli. Después de 16 horas de incubación, la

biomasa de C. vulgaris, proteína purificada con un peso molecular de 62 KDa y el

96,65 95,77 95,1593,14 91,19 90,08

13,25 9,64 14,46

0102030405060708090

100

C1 C2 C3Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

(%)

Tratamientos

E. coli S. aureus C. albicans


hidrolizado de ésta con pepsina, presentaron porcentajes de inhibición de 4%, 21,2% y

34,1% respectivamente. Porcentajes menores que los obtenidos en este estudio.

El-Baz et al. (2013), pusieron a prueba la actividad antimicrobiana de un extracto

proteico de Spirulina platensis, por el método de difusión en disco, reportando halos de

inhibición para Enterococcus faecalis y Candida albicans. Las bacterias E. coli y

Staphylococcus aereus, no se vieron afectadas por el extracto. Es decir, que el extracto

tuvo efecto inhibidor sobre una bacteria Gram positiva y una levadura, pero su acción no

fue eficaz contra bacterias Gram negativas.

Sun et al.(2016), probaron que la fracción peptídica aislada de proteína de Spirulina

platensis SP-1, tuvo efecto antimicrobiano contra E. coli y S.aureus, sin embargo, la

bacteria Gram negativa fue más sensible que la Gram positiva, al presentar un halo de

inhibición de 16 mm, mientras que el halo de inhibición de S. aureus tuvo un diámetro de

12mm.

Aunque este estudio suministró información importante en cuanto a la extracción,

transformación y funcionalidad biológica de las proteínas presentes en la biomasa de

Nannochloropsis sp., aún hace falta mucha investigación en cuanto a las características

de los péptidos obtenidos como hidrofobicidad, cationicidad y anfipaticidad, la secuencia

de aminoácidos en su estructura o su efecto antimicrobiano de forma individual. Cabe

resaltar que los resultados obtenidos abren una brecha al estudio de compuestos

bioactivos de microalgas a nivel regional y nacional y su implementación como compuestos

de origen biológico a nivel industrial.

Conclusiones y recomendaciones 63

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

Se evaluaron variadas metodologías de lisis celular y extracción, algunas

adaptadas de los reportes encontrados en la literatura, sin embargo, los mejores

resultados obtenidos se lograron mediante el uso de ciclos de homogenización para

la morfología y requerimientos de la microalga utilizada.

Para Nannochloropsis sp., los métodos mecánicos de lisis celular para la extracción

de proteínas, presentan mejores eficiencias en cuanto al rompimiento celular, que

algunos métodos químicos y biológicos, debido a la rigidez de la pared celular.

Al mejorar el grado de hidrólisis del extracto, mediante tratamiento enzimático

Papaína-Pancreatina, aumentan las posibilidades de producir péptidos de bajo

peso molecular con potencial antimicrobiano.

El extracto de proteínas presentó mayor grado de hidrólisis que la biomasa original,

con el complejo enzimático papaína-pancreatina, debido a que éstas actúan sobre

el sustrato directamente y no enfrentan la resistencia de la pared celular. La

proteólisis sobre el extracto permitió lograr un porcentaje de péptidos de bajo peso

molecular (<3KDa) aproximadamente del 58%.

El extracto hidrolizado presentó actividad bacteriostáctica y fungistática contra los

microorganismos E. coli, S.aureus y C. albicans, inhibiendo el crecimiento de los

mismos en 96,65%, 93,14% y 14,46% respectivamente.


antimicrobiano

5.2 Recomendaciones

Como complemento a este estudio, se recomienda hacer un análisis de hemólisis

al extracto hidrolizado para determinar si éste puede presentar efectos tóxicos sobre el

organismo. Así mismo, para determinar los compuestos involucrados en la actividad

antimicrobiana, se sugiere hacer una purificación del extracto hidrolizado y determinar la

secuencia de aminoácidos presente en su estructura.

El hecho de encontrar actividad bacteriostática permite inferir posibilidades de

investigación en el área nutracéutica de forma prometedora. Como parte de la actividad

antimicrobiana, se sugeriría evaluar las funciones inmunorreguladora, antiparasitaria y

antitumoral del extracto hidrolizado.

Bibliografía 65

6. Bibliografía

Aguado, J. M., Ruiz-Camps, I., Muñoz, P., Mensa, J., Almirante, B., Vázquez, L., … Cuenca-

Estrella, M. (2011). Recomendaciones sobre el tratamiento de la candidiasis invasiva y otras

infecciones por levaduras de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica (SEIMC). Actualización 2011. Enfermedades Infecciosas y

Microbiologia Clinica, 29(5), 345–361. http://doi.org/10.1016/j.eimc.2011.01.008

Allevato, M. A. J., Negroni, R., & Galimberti, R. (2007). Antifúngicos Ayer, hoy y mañana.

Actualizaciones Terapeuticas Dermatologicas, 30(1), 8–19. Retrieved from

http://www.atdermae.com/pdfs/atd_30_01_02.pdf

Banchon, C. (2005). Inmovilización de papaína en soporte de quitosano. Universidad de

Guayaquil. Retrieved from http://repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/413/1/TESIS 955.pdf

Barth, A. (2007). Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics,

1767(9), 1073–1101. http://doi.org/10.1016/j.bbabio.2007.06.004

Benitez, R., Ibarz, A., & Pagan, J. (2008). Hidrolizados de proteína: Procesos y aplicaciones. Acta

Bioquímica Clínica Latinoamericana, 42(2), 227–236. Retrieved from

https://www.researchgate.net/publication/262552066_Hidrolizados_de_proteina_Procesos_y

_aplicaciones

Bermudez, F. D. R., & Lipe, R. G. (2005). Estudio preliminar de la actividad proteolitica de la

enzima papaina sobre cicatrices de tipo queloides y estrias. Universidad de El Salvador.

Retrieved from http://ri.ues.edu.sv/5158/1/10129290.pdf

Bernaerts, T. M. ., Gheysen, L., Kyomugasho, C., Jamsazzadeh Kermani, Z., Vandionant, S.,

Foubert, I., … Van Loey, A. M. (2018). Comparison of microalgal biomasses and functional

food ingredients: Focus on the composition of cell wall related polysaccharides. Algal

Research, 32, 150–161. Retrieved from https://ac-els-cdn-

com.ezproxy.unal.edu.co/S2211926417310421/1-s2.0-S2211926417310421-

main.pdf?_tid=22346376-dd77-4906-a026-

5e780feae1e4&acdnat=1523914520_788c8a9be7b1bcf9fd4b2ab3e34086bf


antimicrobiano

BIOZYM. (2016). Data Sheet-Pancreatin. Retrieved from

http://www.biozym.de/datasheets/pancreatin.php

Bleakley, S., & Hayes, M. (2017). Algal Proteins: Extraction, Application, and Challenges

Concerning Production. Foods, 6(33). http://doi.org/10.3390/foods6050033

Bradford, M. M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities

of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 72,

248–254. Retrieved from http://hoffman.cm.utexas.edu/courses/bradford_assay.pdf

Bustamante, S. I. (2015). Protocolo Para La Evaluación/Comparación De La Actividad

Antimicrobiana Antibióticos Genéricos Y Antibióticos Innovadores, Frente a Patógenos

Clínicos. Pontificia Universidad Javeriana. Retrieved from

https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/16662/BustamanteOjedaSergioIva

n2015.pdf?sequence=1

Cabrera Alaix, C. E., & Mejía Otero, C. (2008). Los mecanismos de resistencia a antibióticos:

¿Podremos lograr un equilibrio entre el uso – abuso de los antibióticos y así lograr la

disminución de la resistencia bacteriana a estos medicamentos? Salud Libre, 3(1), 83–104.

Retrieved from http://revistasojs.unilibrecali.edu.co/index.php/rcslibre/article/view/213

Cañavate, J. P. (2011). Funciones de las microalgas en acuicultura. In C. T. del M.-F. CETMAR

(Ed.), Las algas como recurso. Valorización. Aplicaciones industriales y tendencias (pp. 193–

205).

Casal, C. (2010). Caracterización de la radiación ultravioleta en la provincia de Huelva e incidencia

en la productividad y el valor biotecnológico de cultivos de interés comercial. Universidad de

Huelva. Retrieved from

http://rabida.uhu.es/dspace/bitstream/handle/10272/2713/b15236572.pdf?sequence=1

Castañeda, J., Gómez, K., Corrales, L., & Cortés, S. (2016). Perfil de resistencia a antibióticos en

bacterias que presentan la enzima NDM-1 y sus mecanismos asociados: una revisión

sistemática. Nova, 13(25), 95–111. http://doi.org/10.22490/24629448.1733

Castañeda, J., Ortega, J. A., Vanegas, A. M., Aquino, A., Serafín, J., Estrada, S., & Estrada, I.

(2009). Péptidos antimicrobianos: péptidos con múltiples funciones. Alergia, Asma e

Inmunología Pediátricas, 18(1), 16–29. Retrieved from

http://www.medigraphic.com/pdfs/alergia/al-2009/al091d.pdf

Catalá, L. (2013). Contribución al estudio del crecimiento y las posibilidades del aprovechamiento

termoquímico de las microalgas Nannochloropsis gaditana y Nannochlorpsis oculata.

Universidad de Alicante. Retrieved from

http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/36415/1/tesis_catala_esteve.pdf

Centrón, D. (2015). Antibióticos. Retrieved from

http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/teor8_2c.pdf

Cho, H.-S., Oh, Y.-K., Park, S.-C., Lee, J.-W., & Park, J.-Y. (2013). Effects of enzymatic hydrolysis

Bibliografía 67

on lipid extraction from Chlorella vulgaris. Renewable Energy, 54, 156–160.

http://doi.org/10.1016/j.renene.2012.08.031

Dean, A. P., Sigee, D. C., Estrada, B., & Pittman, J. K. (2010). Using FTIR spectroscopy for rapid

determination of lipid accumulation in response to nitrogen limitation in freshwater

microalgae. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2010.01.065

Egas, C. I., & Tinajero, M. El. (2016). Aislamiento de microorganismos capaces de producir

antibióticos, a partir de suelos en las regiones naturales de Ecuador. Universidad Politécnica

Salesiana. Retrieved from https://core.ac.uk/download/pdf/84704028.pdf

Ejike, C. E. C. C., Collins, S. A., Balasuriya, N., Swanson, A. K., Mason, B., & Udenigwe, C. C.

(2017). Prospects of microalgae proteins in producing peptide-based functional foods for

promoting cardiovascular health. Trends in Food Science and Technology, 59, 30–36.

http://doi.org/10.1016/j.tifs.2016.10.026

El-Baz, F. K., El-Senousy, W. M., El-Sayed, A. B., & Kamel, M. M. (2013). In vitro antiviral and

antimicrobial activities of Spirulina platensis extract. Journal of Applied Pharmaceutical

Science. http://doi.org/10.7324/JAPS.2013.31209

Enzyme Educational Institute. (2018). Pancreatin. Retrieved from

https://enzymeeducationinstitute.com/enzymes/pancreatin/

Fernández, R. (2015). Hidrólisis enzimática de seroalbúmina bovina. Producción de péptidos

bioactivos. Universidad de Oviedo. Retrieved from

http://digibuo.uniovi.es/dspace/bitstream/10651/32167/1/TFM_RebecaFernándezAlonso.pdf

Gallardo, J. (2006). Precipitacion de proteinas con ATC para PAGEs. Retrieved from http://labtox-

02.blogspot.com/2006/02/precipitacion-de-proteinas-con-atc.html

Garcia, V. A., & Roldan, E. D. (2005). Ensayo de actividad de la enzima papína inmovilizada y su

aplicación en aguas residuales de la industria alimenticia. Universidad de El Salvador.

Retrieved from http://ri.ues.edu.sv/5208/

Gerde, J. A., Wang, T., Yao, L., Jung, S., Johnson, L. A., & Lamsal, B. (2013). Optimizing protein

isolation from defatted and non-defatted Nannochloropsis microalgae biomass. Algal

Research, 2(2), 145–153. http://doi.org/10.1016/j.algal.2013.02.001

Glass, N. (2018). Porcine elastase. Retrieved from

https://collab.its.virginia.edu/access/content/group/f85bed6c-45d2-4b18-b868-

6a2353586804/2/Ch14_Glass_N_Elastase-_-/Ch14_Glass_N_Elastase_Elastase.html

Gornall, A. G., Bardawill, C. J., & David, M. M. (1949). Determination of serum proteins by means

of the biuret reaction. J. Biol. Chem., 177, 751–766. http://doi.org/10.1098/rspa.1963.0204

Grimi, N., Dubois, A., Marchal, L., Jubeau, S., Lebovka, N. I., & Vorobiev, E. (2014). Selective

extraction from microalgae Nannochloropsis sp. using different methods of cell disruption.

Bioresource Technology, 153, 254–259. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2013.12.011

Guadix, A., Guadix, E. M., Páez, M. P., González, P., & Camacho, F. (2000). Procesos


antimicrobiano

tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Ars Pharmaceutica, 41(1),

79–89. http://doi.org/10.4067/S0718-09342007000200003

Herigstadab, B., Hamilton, M., & Heersink, J. (2001). How to optimize the drop plate method for

enumerating bacteria. Journal of Microbiological Methods, 44(2), 121–129. Retrieved from

https://www-sciencedirect-com.ezproxy.unal.edu.co/science/article/pii/S0167701200002414

Hernández, A., & Labbé, J. I. (2014). Microalgas, cultivo y beneficios, 157(2), 157–173.

http://doi.org/10.4067/S0718-19572014000200001

Hirahashi, T., Matsumoto, M., Hazeki, K., Saeki, Y., Ui, M., & Seya, T. (2002). Activation of the

human innate immune system by Spirulina: Augmentation of interferon production and NK

cytotoxicity by oral administration of hot water extract of Spirulina platensis. International

Immunopharmacology, 2(4), 423–434. http://doi.org/10.1016/S1567-5769(01)00166-7

Ibañez, E., Herrero, M., Mendiola, J. A., & Castro-Puyana, M. (2012). Extraction and

Characterization of Bioactive Compounds with Health Benefits from Marine Resources:

Macro and Micro Algae, Cyanobacteria, and Invertebrates. In Marine Bioactive Compounds.

http://doi.org/10.1007/978-1-4614-1247-2_2

James, C. M., Al-Hinty, S., & Salman, A. E. (1989). Growth and ω3 fatty acid and amino acid

composition of microalgae under different temperature regimes. Aquaculture, 77(4), 337–351.

http://doi.org/10.1016/0044-8486(89)90218-4

Jenssen, H., Hamill, P., & Hancock, R. E. W. (2006). Peptide Antimicrobial Agents. Clinical

Microbiology Reviews, 19(3), 491–511. http://doi.org/10.1128/CMR.00056-05

Jeong, S. W., Nam, S. W., Hwangbo, K., Jeong, W. J., Jeong, B.-R., Chang, Y. K., & Park, Y.-I.

(2017). Transcriptional Regulation of Cellulose Biosynthesis during the Early Phase of

Nitrogen Deprivation in Nannochloropsis salina. Scientific Reports, 7.

http://doi.org/10.1038/s41598-017-05684-4

Kashima, A., Inoue, Y., Sugio, S., Maeda, I., Nose, T., & Shimohigashi, Y. (1998). X-ray crystal

structure of a dipeptide-chymotrypsin complex in an inhibitory interaction. European Journal

of Biochemistry, 255(1), 12–23. http://doi.org/10.1046/j.1432-1327.1998.2550012.x

Kilara, A., Shahani, K. M., & Wagner, F. W. (1977). Preparation and properties of immobilized

papain and lipase. Biotechnol. Bioeng., 14, 1703–1714.

Kong, J., & Yu, S. (2007). Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary

structures. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 39(8), 549–559.

http://doi.org/10.1111/j.1745-7270.2007.00320.x

Lee, S. Y., Show, P. L., Ling, T. C., & Chang, J. S. (2017). Single-step disruption and protein

recovery from Chlorella vulgaris using ultrasonication and ionic liquid buffer aqueous

solutions as extractive solvents. Biochemical Engineering Journal, 124, 26–35.

http://doi.org/10.1016/j.bej.2017.04.009

Lisboa, C. R., Pereira, A. M., Alberto, J., & Costa, V. (2016). Biopeptides with antioxidant activity

Bibliografía 69

extracted from the biomass of Spirulina sp . LEB 18. African Journal of Microbiology

Research, 10(3), 79–86. http://doi.org/10.5897/AJMR2015.7760

Lisboa, C. R., Pereira, A. M., Ferreira, S. P., & Costa, J. A. V. (2014). Utilisation Of Spirulina sp .

And Chlorella pyrenoidosa Biomass For The Production of Enzymatic Protein Hydrolysates.

International Journal of Engineering Research and Applications, 4(5), 29–38. Retrieved from

https://core.ac.uk/download/pdf/26985879.pdf

Liu, X., & Kokare, C. (2016). Microbial Enzymes of Use in Industry. Biotechnology of Microbial

Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. Elsevier Inc.

http://doi.org/10.1016/B978-0-12-803725-6.00011-X

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Lewis Farr, A., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with

the folin phenol reagent. Readings, 193(1), 265–275. http://doi.org/10.1016/0304-

3894(92)87011-4

Lupatini, A. L., de Oliveira Bispo, L., Colla, L. M., Costa, J. A. V., Canan, C., & Colla, E. (2017).

Protein and carbohydrate extraction from S. platensis biomass by ultrasound and mechanical

agitation. Food Research International, 99, 1028–1035.

http://doi.org/10.1016/j.foodres.2016.11.036

Martín, J., Lorenzo, A., Muñoz, R., Blanco, S., & Bolado, S. (2016). Saccharification of microalgae

biomass obtained from wastewater treatment by enzymatic hydrolysis. Effect of alkaline-

peroxide pretreatment. Bioresource Technology, 218, 265–271.

http://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.06.087

Martínez, N., Martínez, A., & Dávila, G. (2015). Determination of antioxidant and chelating activity

of protein hydrolysates from Spirulina(Arthrospira maxima) obtained by simulated

gastrointestinal digestion. Revista Mexicana de Ingeniería Química, 14(1), 25–34. Retrieved

from http://www.scielo.org.mx/pdf/rmiq/v14n1/v14n1a3.pdf

Mayorga, M. T., & Parra, C. M. (2009). Efecto antimicrobiano in vitro de cinco soluciones

multipropósito para lentes blandos contra Cándida albicans y Aspergillus fumigatus 1.

Ciencia & Tecnología Para La Salud Visual y Ocular, 7, 25–36.

http://doi.org/https://doi.org/10.19052/sv.1073

Mecozzi, M., Pietroletti, M., & Tornambé, A. (2011). Molecular and structural characteristics in toxic

algae cultures of Ostreopsis ovata and Ostreopsis spp. evidenced by FTIR and FTNIR

spectroscopy. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,

78(5), 1572–1580. http://doi.org/10.1016/j.saa.2011.02.002

Morris, H. J., Almarales, A., Carrillo, O., & Bermúdez, R. C. (2008). Utilisation of Chlorella vulgaris

cell biomass for the production of enzymatic protein hydrolysates. Bioresource Technology,

99(16), 7723–7729. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.01.080

Morris, H. J., Arceo, A. A., Farnes, O. C., & Abdala, R. T. (2001). Combinaciones enzimáticas en la

obtención de hidrolizados proteicos a partir de Chlorella vulgaris. Rev Cubana Aliment Nutr,


antimicrobiano

15(2), 85–89. Retrieved from http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol15_2_01/ali01201.htm

Morris, H. J., Borges Quintana, L., Martínez Manrique, C., & Carrillo Farnés, O. (2003).

Restauración de la inmunocompetencia en ratones malnutridos con la administración de un

hidrolizado de microalgas. Revista Cubana de Farmacia, 37(3). Retrieved from

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-75152003000300007

Morris, H. J., Carrillo, O., Almarales, A., Bermúdez, R. C., Lebeque, Y., Fontaine, R., … Beltrán, Y.

(2007). Immunostimulant activity of an enzymatic protein hydrolysate from green microalga

Chlorella vulgaris on undernourished mice. Enzyme and Microbial Technology, 40(3), 456–

460. http://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2006.07.021

Morris, H. J., Carrillo, O. V., Almarales, Á., Bermúdez, R. C., Alonso, M. E., Borges, L., …

Hernández, M. (2009). Protein hydrolysates from the alga Chlorella vulgaris 87/1 with the

potentialities in immunonutrition. Biotecnologia Aplicada, 26(2), 162–165. Retrieved from

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1027-28522009000200009

Murugesh Babu, K. (2013). The dyeing of silk. In Silk Processing, Properties and Applications (pp.

117–139). http://doi.org/https://doi.org/10.1533/9781782421580.117

Oñate, J. F., Manrique, M., Patiño, E., & González, E. P. (2017). Actividad antimicrobiana de

péptidos catiónicos diseñados a partir de un péptido neutro. Acta Biológica Colombiana,

22(2), 35. http://doi.org/10.15446/abc.v22n2.59665

Pan, Z., Huang, Y., Wang, Y., & Wu, Z. (2017). Disintegration of Nannochloropsis sp. cells in an

improved turbine bead mill. Bioresource Technology, 245(July), 641–648.


PDBsum. (2018a). Hydrolase(serine proteinase)-3est. Retrieved from

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl

PDBsum. (2018b). Hydrolase (sulfhydryl proteinase) 9pap. Retrieved from

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl

Pérez, H., & Robles, A. (2013). Aspectos básicos de los mecanismos de resistencia bacteriana.

Revista Médica, 4(04), 186–191. Retrieved from

http://www.medigraphic.com/pdfs/revmed/md-2013/md133i.pdf

Pinto, C. A. S. O., Green, D., Baby, A. R., Ruas, G. W., Kaneko, T. M., Marana, S. R., & Velasco,

M. V. R. (2007). Determination of papain activity in topical dosage forms: Single laboratory

validation assay. Latin American Journal of Pharmacy, 26(5), 771–775.

Quintana, M. M., Hernández Nazario, L., Morris, H. J., & Fernandez Gonzalez, M. (1999).

Contenido de algunas vitaminas en cultivos de microalga chlorella sp. Revista Cubana de

Alimentacicon y Nutricion, 13(1), 9–13. Retrieved from

http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol13_1_99/ali02199.pdf

Ramírez, L. S., & Marin Castaño, D. (2009). Metodologías para evaluar In vitro la actividad

antibacteriana de compuestos de origen vegetal. Scientia et Technica, 15. Retrieved from

Bibliografía 71

http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=84916714049

Ridner, E. (2006). Soja. Propiedades nutricionales y su impacto en la salud. Buenos Aires.

Retrieved from http://www.sanutricion.org.ar/files/upload/files/soja.pdf

Rocha, J. M. S., Garcia, J. E. C., & Henriques, M. H. F. (2003). Growth aspects of the marine

microalga Nannochloropsis gaditana. Biomolecular Engineering, 20(4–6), 237–242.

http://doi.org/10.1016/S1389-0344(03)00061-3

Rojo, A. H., Morales, M. E., Ibarra, L., Martínez, J. M., & Medina, M. A. (2016). Floculación de

Nannochloropsis sp . inducida por hidróxido de sodio : eficiencia de floculación , efecto sobre

la viabilidad microalgal y su uso como alimento para rotíferos efficiency , viability effect on

microalgae and their use as food for rotifers. Latin American Journal of Aquatic Research,

44(4), 662–670. http://doi.org/10.3856/vol44-issue4-fulltext-1

Romero, L. D. los Á., Guevara, M., Gómez, B., Arredond, B., Cortez, R., & Licet, B. (2017).

Producción de pigmentos procedentes de Arthrospira maxima cultivada en fotobiorreactores.

Revista Colombiana de Biotecnología, 19(1), 108.

http://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v19n1.59671

Safi, C., Cabas Rodriguez, L., Mulder, W. ., Engelen-Smith, N., Spekking, W., Van den Broek, L.

A. ., … Sijtsma, L. (2017). Energy consumption and water-soluble protein realease by cell

wall disruption of Nannochloropsis gaditana. Bioresource Technology, 239, 204–210.


Safi, C., Ursu, A. V., Laroche, C., Zebib, B., Merah, O., Pontalier, P.-Y., & Vaca-Garcia, C. (2014).

Aqueous extraction of proteins from microalgae: Effect of different cell disruption methods.

Algal Research, 3, 61–65. http://doi.org/10.1016/j.algal.2013.12.004

Samarakoon, K., & Jeon, Y. J. (2012). Bio-functionalities of proteins derived from marine algae - A

review. Food Research International, 48(2), 948–960.

http://doi.org/10.1016/j.foodres.2012.03.013

Sánchez, M. L. (2016). Mecanismos de acción de péptidos antimicrobianos y mecanismos de

resistencia de los patógenos. Bioquímica y Patología Clínica, 80(1), 36–43.

Sánchez, Y. (2015). Diseño de Péptidos Antimicrobianos Derivados de Dermaseptina S4.

Universidad Nacional de Colombia. Retrieved from

http://bdigital.unal.edu.co/51164/1/1020399030.2016.pdf

Santhosh, S., Dhandapani, R., & Hemalatha, N. (2016). Bioactive compounds from Microalgae and

its different applications-a review. Pelagia Research Library Advances in Applied Science

Research, 7(4), 153–158. Retrieved from www.pelagiaresearchlibrary.com

Schmidt, A., Jelsch, C., Ostergaard, P., Rypniewski, W., & Lamzin, V. S. (2003). Trypsin Revisited:

Crystallography at (SUB) atomic resolution and quantum chemistry revealing details of

catalysis. Journal of Biological Chemistry, 278(44), 43357–43362.

http://doi.org/10.1074/jbc.M306944200


antimicrobiano

Scholz, M. J., Weiss, T. L., Jinkerson, R. E., Jing, J., Roth, R., Goodenough, U., … Gerken, H. G.

(2014). Ultrastructure and composition of the Nannochloropsis gaditana cell wall. Eukaryotic

Cell, 13(11), 1450–1464. http://doi.org/10.1128/EC.00183-14.

Schwenzfeier, A., Wierenga, P. A., & Gruppen, H. (2011). Isolation and characterization of soluble

protein from the green microalgae Tetraselmis sp. Bioresource Technology, 102, 9121–9127.


Sedighi, M., Jalili, H., Ranaei-Siadat, S. O., & Amrane, A. (2016). Potential Health Effects of

Enzymatic Protein Hydrolysates from Chlorella vulgaris. Applied Food Biotechnology, 3(3),

160–169. Retrieved from http://journals.sbmu.ac.ir/afb/article/view/11306/Online publication

Seija, V., & Vignoli, R. (2006). Principales grupos de antibióticos. Temas de Bacteriología y

Virología Médica, 631–647. Retrieved from

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/BacteCEFA34.pdf

Sheih, I.-C., Wu, T.-K., & Fang, T. J. (2009). Antioxidant properties of a new antioxidative peptide

from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems. Bioresource Technology,

100, 3419–3425. Retrieved from https://ac-els-cdn-

com.ezproxy.unal.edu.co/S0960852409001151/1-s2.0-S0960852409001151-

main.pdf?_tid=4adaaf38-cfe9-11e7-8444-

00000aab0f6c&acdnat=1511398835_1cce2031eb4abba5791f4a9329958e55

Sheih, I. C., Wu, T. K., & Fang, T. J. (2009). Antioxidant properties of a new antioxidative peptide

from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems. Bioresource Technology,

100(13), 3419–3425. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2009.02.014

Sigma-Aldrich. (2014). Universal Protease Activity Assay: Casein as a Substrate. Retrieved from

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/learning-center/life-science-video/universal-

protease.html

Sigma-Aldrich. (2018a). Chymotripsin. Retrieved from https://www.sigmaaldrich.com/life-

science/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/chymotrypsin.html

Sigma-Aldrich. (2018b). Elastase. Retrieved from

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/e0127pis.pdf

Sigma-Aldrich. (2018c). Tripsin. Retrieved from https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/t7168pis.pdf

Suarez, D. C. (2010). Obtención de un hidrolizado de proteína de pescado a partir de tilapia roja

(Oreochromis sp.). Univeridad Nacional de Colombia. Retrieved from

http://www.bdigital.unal.edu.co/2786/1/107411.2010.pdf

Sun, Y., Chang, R., Li, Q., & Li, B. (2016). Isolation and characterization of an antibacterial peptide

from protein hydrolysates of Spirulina platensis. European Food Research and Technology,

242, 685–692. http://doi.org/10.1007/s00217-015-2576-x

Bibliografía 73

Téllez, G. A., & Castaño, J. C. (2010). Péptidos antimicrobianos. Infectio, 14(1), 55–67. Retrieved

from http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf

Tibbetts, S. M., Bjornsson, W. J., & McGinn, P. J. (2015). Biochemical composition and amino acid

profiles of Nannochloropsis granulata algal biomass before and after supercritical fluid CO2

extraction at two processing temperatures. Animal Feed Science and Technology, 204, 62–

71. http://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2015.04.006

Tibbetts, S. M., Whitney, C. G., MacPherson, M. J., Bhatti, S., Banskota, A. H., Stefanova, R., &

McGinn, P. J. (2014). Biochemical characterization of microalgal biomass from freshwater

species isolated in Alberta, Canada for animal feed applications. Algal Research.

http://doi.org/10.1016/j.algal.2014.11.011

Ursu, A. V., Marcati, A., Sayd, T., Sante-Lhoutellier, V., Djelveh, G., & Michaud, P. (2014).

Extraction, fractionation and functional properties of proteins from the microalgae Chlorella

vulgaris. Bioresource Technology, 157, 134–139.


Villa, S. (2016). ESTUDIO DE LA CINETICA DE DIGESTIÓN DE LA GRASA DE LA LECHE BAJO

DISTINTAS CONDICIONES GASTROINTESTINALES SIMULADAS. Universidad Politécnica

de Valencia. Retrieved from https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/68953/VILLA -

ESTUDIO DE LA CINETICA DE DIGESTIÓN DE LA GRASA DE LA LECHE BAJO

DISTINTAS CONDICIONES GA....pdf?sequence=4

Vioque, J., & Millán, F. (2005). Los hidrolizados proteicos en alimentación: Suplementos

alimenticios de gran calidad funcional y nutricional. Agrocsic, 2–8. Retrieved from

http://hdl.handle.net/10261/5750

Wang, X., & Zhang, X. (2012). Optimal extraction and hydrolysis of Chlorella pyrenoidosa proteins.

Bioresource Technology, 126, 307–313. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2012.09.059

Watanuki, H., Ota, K., Tassakka, A. C. M. A. R., Kato, T., & Sakai, M. (2006). Immunostimulant

effects of dietary Spirulina platensis on carp, Cyprinus carpio. Aquaculture, 258(1–4), 157–

163. http://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2006.05.003

Wishvajith Samarakoon, K., O-Nam, K., Ko, J.-Y., Lee, J.-H., Kang, M.-C., Kim, D., … Jeon, Y.-J.

(2013). Purification and identification of novel angiotensin-I converting enzyme (ACE)

inhibitory peptides from cultured marine microalgae (Nannochloropsis oculata) protein

hydrolysate. J Appl Phycol, 25, 1595–1606. http://doi.org/10.1007/s10811-013-9994-6

Worthington Biochemical Corporation. (2016). Papain. Retrieved from http://www.worthington-

biochem.com/pap/default.html

Zeriouh, O. (2013). Diseño de una biorrefinería de microalgas a nivel planta piloto. Universidad de

Almería. Retrieved from http://repositorio.ual.es/handle/10835/2468

Zhang, R., Chen, J., & Zhang, X. (2018). Extraction of intracellular protein from Chlorella

pyrenoidosa using a combination of ethanol soaking, enzyme digest, ultrasonication and


antimicrobiano

homogenization techniques. Bioresource Technology, 247, 267–272.


Zhang, Z., & Volkman, J. K. (2017). Algaenan structure in the microalga Nannochloropsis oculata

characterized from stepwise pyrolysis. Organic Geochemistry, 104, 1–7.

http://doi.org/10.1016/j.orggeochem.2016.11.005

Zhu, M., Liu, P., & Niu, Z.-W. (2017). A perspective on general direction and challenges facing

antimicrobial peptides. Chinese Chemical Letters, 28, 703–708.

http://doi.org/10.1016/j.cclet.2016.10.001

Zuorro, A., Miglietta, S., Familiari, G., & Lavecchia, R. (2016). Enhanced lipid recovery from

Nannochloropsis microalgae by treatment with optimized cell wall degrading enzyme

mixtures. Bioresource Technology, 212, 35–41. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.04.025

Anexos 75

A. Anexo: Perfil de proteína soluble en el tiempo para papaína y pancreatina.

Figura 15. Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Papaína (E/S 1%

p/p) sobre caseína.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 10 20 30 40 50 60 70

Pro

teín

a so

lub

le (g

/L)

Tiempo (minutos)


antimicrobiano

Figura 16. . Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Pancreatina (E/S

1%p/p) sobre caseína.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 10 20 30 40 50 60 70

Pro

teín

a so

lub

le (g

/L)

Tiempo (minutos)

Anexos 77

B. Anexo: Análisis estadísticos

En este anexo se especifican las tablas obtenidas en los análisis estadísticos de los

experimentos realizados en los objetivos 2 y 3 de este trabajo.

Condiciones óptimas de papaína

Tabla ANOVA

Condiciones óptimas de pancreatina

Tabla ANOVA


antimicrobiano

Hidrólisis sobre biomasa original

Tabla ANOVA

Dado que el valor p calculado (0,0068) es menor a 0,05, se demuestra estadísticamente

que existe una diferencia entre las medias del grado de hidrólisis sobre biomasa original

entre los diferentes niveles de tiempo, con una confianza del 95%. Para determinar cuáles

son esas diferencias se procedió a realizar la prueba de Múltiples rangos.

Tabla LSD

Empleando el método de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher, se identificaron

dos grupos homólogos, como se muestra en la tabla superior. No existen diferencias

estadísticamente significativas en los niveles de tiempo que compartan una misma

Anexos 79

columna de X. Con este método hay un riesgo del 5% al decir que cada par de medias es

significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.

Hidrólisis sobre caseína

Tabla ANOVA

Dado que el valor p calculado (0,8531) es mayor a 0,05, no existen diferencias

estadísticamente significativas entre las medias de los grados de hidrólisis sobre caseína,

para los diferentes niveles de tiempo, con un nivel de confianza del 95%.

Hidrólisis sobre Extracto de proteínas

Tabla ANOVA

Dado que el valor p calculado (0,2226) es mayor a 0,05, no existen diferencias

estadísticamente significativas entre la mediana de los grados de hidrólisis sobre extracto

de proteínas, para los diferentes niveles de tiempo, con un nivel de confianza del 95%.

Análisis de varianza para crecimiento de E. coli expuesto al hidrolizado enzimático

Tabla ANOVA

El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0) es menor que 0,05, por lo

tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias del

Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en E. coli. Por ello, se precisó de un análisis

de Múltiples rangos.


antimicrobiano

Tabla LSD

Según el método de análisis empleado, LSD de Fisher, se encontraron dos grupos

homólogos según la alineación de las X en la columna. No existen diferencias

estadísticamente significativas entre aquellos tratamientos que comparten una misma

columna de X, con un 95% de confianza.

Análisis de varianza para crecimiento de S. aureus expuesto al hidrolizado

enzimático

Tabla ANOVA

El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0) es menor que 0,05, por lo

tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de

Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en S. aureus. Por ello, se precisó de un

análisis de Múltiples rangos.

Tabla LSD





Anexos 81

Análisis de varianza para crecimiento de Candida albicans expuesto al hidrolizado

enzimático

Tabla ANOVA

El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0,0157) es menor que 0,05, por

lo tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias del

Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en Candida albicans. Por ello, se precisó

de un análisis de Múltiples rangos.

Tabla LSD





Anexos 82

C. Anexo: Curvas de calibración

Figura 17. Curva de calibración para actividad enzimática de proteasas.

Curva de calibración Lowry:

Dado que los reactivos utilizados en el método de Lowry son fotosensibles, se hizo una

curva de calibración cada vez que se iba a llevar a cabo el método. Sin embargo, la

siguiente gráfica es un ejemplo de ello.

y = 2,84x + 0,0112R² = 0,995

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

Ab

sorb

anci

a (6

60 n

m)

µmol tirosina

Curva patrón tirosina

Anexos 83

Figura 18. Curva de calibración de BSA para el método de Lowry.

y = 0,527x - 0,0435R² = 0,9972

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

sorb

anci

a( 7

50 n

m)

Concentración de proteína (mg/mL)

Curva patrón BSA

Anexos 84

D. Anexo: Especificaciones de las enzimas empleadas.

CREON 25000®

Laboratorios Abbott

Sustitutivo enzimático pancreático.

Composición: Cada cápsula con microesferas gastrorresistentes contiene: Pancreatina

(polvo de páncreas: Amilasa: 18.000 U. de F. Eur., Lipasa: 25.000 U. de F. Eur., Proteasa

1.000 U. de F. Eur.) 300,00 mg. Excipientes: Macrogol 4000, 75,00 mg; Ftalato de

Hipromelosa 112,68 mg; Alcohol etílico 2,37 mg; Citrato de Trietilo 6,26 mg; Dimeticona

1000, 2,69 mg. Composición de la cápsula: Gelatina, 95,08 mg; Óxido de Hierro (111)

E172, 0,46 mg; Hidróxido de Hierro (III) E 172, 0,08 mg; Dióxido de Titanio, 0, 19 mg;

Dodecilsulfato de sodio, 0.19 mg.

Anexos 85

Figura 19. Ficha dada por el fabricante de la enzima Papaína 4000 DB.

obtenciÓn de un hidrolizado enzimÁtico bioactivo de...

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