levaduras vÍnicas transgÉnicas
TRANSCRIPT
Daniel Ramón VidalUniversitat de València-IATA (CSIC)
LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS
EL AROMA DEL VINO
Terciario
Primario
Secundario
PARED CELULAR VEGETAL: UNA DIANA ENZIMÁTICA
CelulosaHemicelulosa
Pectina
CelulosaHemicelulosaPectinasas
UNA CUESTIÓN ENZIMÁTICAG Ar
G R
G Ar
G R
G Ap
G ApG Ar
G ApG Ar
G Ar
G Ap
G Ar
G RG R
AROMA AFRUTADO
Alcoholes superiores
Ésteres
Terpenos
TERPENOS DE RELEVANCIA ENOLÓGICA
Linalol Nerol Geraniol
CH3
CH2OH
CH2
CH2
HC
HC
C
C
CH3
CH3
CH3
CH2
CH2
CH2
HC
HC
C
C
CH3
CH3HO
CH3
CH2OH
CH2
CH2
C
HC
C
C
CH3
CH3
H
T G A Terpenos ligados (sin aroma)
T Terpenos libres (aroma)
USO DE ENZIMAS PARA INCREMENTAR EL AROMA AFRUTADO
O O
OCH2O
HOOH
OH
CH2OH
OH OHApiofuranosil-glucósido
Arabinofuranosil-glucósido
O O
OCH2O
HOOH
OHHOH2C
OH
OH
O
OCH2O
O
HOOH
OHOH OH
CH3
HO
Ramnopiranosil-glucósido
TT
T
MICROORGANISMO ENZIMA GEN
Aspergillus aculeatus Ramnosidasa A rhaARamnosidasa B rhaB
Aspergillus nidulans α-L-Arabinofuranosidasa abfBRamnosidasa NCXilanasa X22 xlnAXilanasa X24 xlnBXilanasa X34 xlnCβ-xilosidasa xlnD
Aspergillus niger α-L-Arabinofuranosidasa B abfBAspergillus terreus α-L-Arabinofuranosidasa A NC
α-L-Arabinofuranosidasa B NCα-L-Arabinofuranosidasa C NC
Ramnosidasa NCCandida molischiana β-glucosidasa bglNFusarium solani Pectato liasa pelATrichoderma longibrachiatum β-(1,4)-endoglucanasa egl1
RAMNOSIDASAS DE Aspergillus aculeatus
CARACTERÍSTICAS Rha A Rha B
Mw 92 kDa 85 kDa
Glicosilación 24% 15%
pH 4,5-5 4,5-5
Km 2,8 mM 0,3 mM
Vmax 24 U/mg 14 U/mg
Rha A/rhaARha B/rhaB
CEPAS DE LABORATORIO CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA
cDNA rhaAGPDp PGKt
pG1 W303-1A
TRP+
pNP-R+
muF-R+
PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RhaA
Mw 70 kDapH 4,5-5
Km 2,8 mMVmax 24 U/mg
EtOH 15% (45%)EtOH 20% (35%)
SO2 (150 mg/l) (100%)Glc (0,15 M) (41%)Glc (0,5 M) (16%)
Glc (1 M) (7 %)YR6
Intercambio catiónico
48 µg/ml of rRhaA liberan 46 nmoles de L-ramnosa
CONSTRUCCIÓN DE CEPAS DE T73 CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA
cDNA rhaAGPDp PGKt
YEpCR21 T73
CHXr
pNP-R+
muF-R+
T73T73/YEpCR21
T73::bglNT73::rhaA
T73::bglN + T73::rhaAYR8
YR6 (100 mU/ml) vs YR8 (600 mU/ml)
LIBERACIÓN DE TERPENOS
CONSTRUCCIÓN DE CEPAS T73 GRAS CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA
cDNA rhaAGPDp PGKtURA3L URA3RKANrloxP loxP
T73
KANr
URA+
KANspNP-R+
muF-R+ YR58YEp351-cre-CYH
PROPIEDADES DE LA CEPA YR58
Una copia del cDNA del gen rhaA en el locus URA3Mejor crecimiento que la cepa YR8 La mitad de la actividad RhaA¿Cual es la situación en el vino?
LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS GRAS
T73::abfBT73::bglNT73::egl1T73::pelAT73::ramAT73::xlnAT73::xlnBT73::xlnC
ACT1p xlnA
0,3
0,4
0,5
Lina
lol(
ppm
)
YR13wt Rha Bgl Rha/Bgl
INCREMENTO DE RESVERATROL
OH
OH
OH
AnticolesterémicoAntitumoral
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
t-piceido c-piceido t-resveratrol c-resveratrol
T73 abfB bglN abfB+bglN
¿ES POSIBLE COMERCIALIZAR VINOSPRODUCIDOS POR LEVADURAS TRANSGÉNICAS?
Evaluación sanitaria
Evaluación ambiental
Aceptación por el consumidor
Glándulassalivares
Hígado
Pulmón
Riñón
Hoy no hay mercado para los vinos
transgénicos, pero...
Australian Institutefor Wine Research
INRA-Montpellier
IATA-UVEGValencia
University ofStellenbosch
SITUACIÓN LEGAL
Reglamento CE 1830/2003Reglamento CE 65/2004
GMO
GMO
Ingeniería genética
Ingeniería genética
Ingeniería genética
http://europe.eu.int/comm/dgs/health_consumer/library/press/press298_en.pdf
EL COMPLEJO XILANOLÍTICO DE A. nidulans
X34
X24
X22
XIlano
β-xilosidasaXilosa
X22
X24
X34
β-xilosidasa
xlnA
xlnB
xlnC
xlnD
Vino
Panadería
Piensos
Vino
ENZIMA GEN APLICACIÓN
...VUELTA A LOS HONGOS
Conocimiento básico
Planta Piloto
Glucosa pH (H+/OH- )
CreA
Xilosa
+XlnR
PacC+/-
Xilosa
-xln
Sistema xilanolíticoXilano
Glucosa pH (H+/OH- )
CreA
Xilosa
+XlnR
PacC+/-
Xilosa
-xln
Xilano Sistema xilanolítico
EL GEN xlnR DE A. nidulans
Región rica en P Dominio
centralMotivo
RRRNLS
NH2 COOH
DominioZn(II)2Cys6
A C1 D Q C2 N Q L RT K C3 D G Q N P C4 A H C5I E F G L T C6
TRANSFORMANTES SOBREPRODUCTORES
acnA
xlnB
rRNA
xlnC
xlnA
xlnD
acnA
rRNA
F F1 1 1 1 1 14 4 4 4 4 4
X XG G X XG G
(gpdAp::xlnR)(xlnRp::xlnR)
Glucosa pH (H+/OH- )
CreA
Xilosa
+XlnR
PacC+/-
Xilosa
-xln
Xiylano Sistema xilanolítico
REPRESIÓN POR CATABOLITO
Cepa silvestre creAd30
xlnAxlnBxlnCxlnDacnA
F F1 12 24 46 6
Xilosa + glucosa (inducción + represión)Xilosa (inducción)FructosaF
MUTACIONES PUNTUALES EN xlnAp
0
20
40
60
80
100
120
Act
ivid
ad G
OX
rela
tiva
X XG
sVAL0
39
sVAL0
39-m
C2
sVAL0
39-m
C1
sVAL0
39-m
C2mC1
GTGGagG CTGGgG
aa-mC1-mC2
sVAL0
39
sVAL0
39-m
C2
sVAL0
39-m
C1
sVAL0
39-m
C2mC1
ATG
GOX
CEPA
sVAL039
sVAL039-mC2
sVAL039-mC1
sVAL039-mC2mC1
5.05
5.5
2.14
2.09
X/XG
C3 C2 C1- 660
Glucosa pH (H+/OH- )
CreA
Xilosa
+XlnR
PacC+/-
Xilosa
-xln
Xilano Sistema xilanolítico
REGULACIÓN POR pH DE LA EXPRESIÓN DE GENES xln
pH
F 4 6 8 4 6 8 4 6 8 4 6 8
1 2 4 6
xlnAxlnBxlnCxlnD
acnA
MUTANTES DE pH Y REGULACIÓN DELA EXPRESIÓN DE GENES xln
F F F F1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6
silvestre pacCc14 palA1pacC+/-
20205
xlnA
xlnB
xlnC
xlnD
acnA
Glucosa pH (H+/OH- )
CreA
Xilosa
+XlnR
PacC+/-
Xilosa
-xln
Xilano Sistema xilanolítico
H
Glucosa
L
? SorA
CreB
CreC
CreA
PREDICCIÓN DE ESTRUCTURAS DELAS PROTEÍNAS Mst
PRODUCCIÓN ESPECÍFICA DE LA XILANASA X22
xlnA
XlnR
+
CreA
PacCGlucosa
XIlanoXilosa
-+
pH ácido
xlnAp*
X22
Biopolis S.L.
http://www.biopolis.es/
José María CentenoMichel FlipphiMaría Enrique
Josep Vicent FormentSalvador GenovésJosé Vicente GilOscar HerreroEncarna Ibañez
Andrew MacCabePaloma Manzanares
Marga OrejasPepa Ortiz
Juan Antonio Tamayo Luisa VenturaDaniel Ramón
Salvador VallésAdela Villanueva
Marian Vila