Centro de lnvestluaclón en Allnnentaclón v Desarrollo, A. C.

IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES GENÉTICAS DE β-LACTOGLOBULINA

EN LECHE POR ELECTROFORESIS CAPILAR Y CROMATOGRAFÍA

ACOPLADAS A ESPECTROMETRÍA DE MASAS/MASAS

PRESENTADA POR:

HECTOR ARMANDO OLGUIN ARREDONDO

TESIS APROBADA POR LA

DIRECCIÓN DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS

HERMOSILLO, SONORA. FEBRERO DE 2005.

RESUMEN

La presente investigación muestra los resultados del estudio en aspectos metodológicos para

el desarrollo de un nuevo protocolo analítico, consistente en la obtención, separación,

aislamiento y mapeo de péptidos trípticos, aplicable a la identificación de variantes genéticas

(VG) de la β-lactoglobulina (β-LG) en leche de bovino. Para lograr el objetivo, primero se

estudiaron las condiciones de separación y purificación de proteínas por electroforesis capilar

en zona (CZE), utilizando una mezcla de las variantes A y B de la β-LG. El peso molecular de

cada variante aislada se determinó por CZE y espectrometría de masas con ionización por

electroespreado (ESI-MS) en línea (CZE-ESI-MS). Posteriormente, la proteína aislada fue

sujeta a digestión tríptica para llevar a cabo el mapeo de péptidos. Así, las condiciones de

digestión y de mapeo se determinaron comparando los perfiles electroforéticos generados, Los

péptidos aislados se identificaron por cromatografía capilar acoplada a espectrometría de

masas-masas con ionización por electroespreado (CC-ESI-MS/MS). Los patrones de

fragmentación generados por espectrometría de masas se compararon con bases de datos de

proteínas, determinando el grado de homología y elucidando la secuencia de aminoácidos que

identificaron a la proteína. Las variantes de β·LG se separaron utilizando capilares no

recubiertos, en una solución de boratos 0.05 M (0.1% de Tween 20) a pH 8.0, aplicando 20 kV

(+ -). La proteína separada se colectó aplicando presión al capilar por un rango de tiempo

definido. Posteriormente, la proteína se hidrolizó con tripsina en una proporción enzima-

sustrato (E/S) de 1/20, incubando por 20 hrs a 37°C.

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capilr1r por un rEHl[JO de tiernpo definido. Posteriormt,nle, la protelna se hidrolizó

con tripsina en una proporción enzi111a .. sustrato (E/S) de ·1120, incubando por 20

hrs a :lT'C. L.os péptidos trípticos fuernn se¡Jl3rados utlliz.ando capilares no

recubiertos, en una solución de ácido fórmico 0."15 M, pH 2 .. 3, aplicando 2!l kV

(+ ..... , "). La metodologla de CZF:. establecida parr:i la obtención de mapas

peptldicos presentó coeficientes d,i variación menores a 0.!39'½, (tiernpos dt)

migración) y 5.42%, (áreas). L.os péptidos separados se colectaron �lll una

solución de bicarbonato de amonio 0,05 M a pH 3,0. Los péptidos aislados

fueron analiz.ados por cc .. 1:Sl·MS/MS en modo de escaneo con ionización

positiva, para un ranuo de masa/carga (rnlz) de 300 a 2200. Asl, el protocolo

analltico clesarrollado permitió identificar lm; péptidos que con1prencien los

r�.!Siudos e 1-70 y ·¡ 02-124 de 1:, molécula de f.l-LG, permitiendo identificar las

vari:,ntes genética:, A y 8. El rnapeo y la deterrninaci6n de la secuencia

especifica de aminoécldos en péptidos trlplicos por espectrometria de

masas/mm,as, permitió la identificación de variantes ¡Jenéticas especificas en

las muestras de leche analiz.adas.