métodos de detección y cuantificación del ddt y de …...54 cuadro 3.1 métodos analíticos para...

51

Métodos de detección y cuantificación del DDT y de sus productos de

degradación

En la determinación de los plaguicidas organoclorados, existen métodos basados en cromatografía de

gases, cromatografía de líquidos de alta resolución, cromatografía electrocinética capilar [Fung y Mak,

2001; Ravelo-Pérez, et al., 2008], y ensayos inmunoenzimáticos [Bashour et al., 2003]. Sin embargo, la

eficacia de dichos métodos depende en gran medida de la técnica de extracción de la sustancia que se

desea analizar (analito). Los analitos de interés para este capítulo son el DDT y sus productos de

degradación principales (DDE y DDD). En la preparación de la muestra se logra la transferencia del

analito de la matriz a un nuevo medio, el cual es compatible en naturaleza y concentración con el

instrumento analítico a ser empleado en su cuantificación. Las operaciones asociadas a la preparación

de la muestra, son usualmente la principal causa de inexactitud e imprecisión en el análisis general, y

es también la operación que más tiempo consume. A continuación, se presentan brevemente las

diferentes técnicas de extracción de plaguicidas de las matrices: agua, aire, sedimento, suelo, muestras

vegetales y muestras biológicas. Posteriormente se indican los métodos de análisis del DDT y sus

metabolitos aplicando las técnicas mencionadas y algunos resultados de validación.

3.1 Técnicas y estrategias para la preparación de muestras

Existen diversas técnicas para la preparación de muestras en el análisis de contaminantes en las

matrices aire, agua y suelo. Los propósitos de estas técnicas son: la reducción en el consumo de

disolventes orgánicos, el mejoramiento en el proceso de limpieza, la concentración del analito buscado

antes de su análisis cromatográfico, el incremento en la eficiencia y selectividad de la extracción. La

clasificación de estas técnicas [Olariu et al. 2010] se describe a continuación, al mismo tiempo que se

mencionan las aplicaciones en la extracción del DDT y sus metabolitos.

3.1.1 Técnicas de separación y enriquecimiento dominadas por los equilibrios líquido-

líquido o líquido-sólido

3.1.1.1 Extracción líquido-líquido (LLE)

Es uno de los métodos de extracción más comunes, particularmente para compuestos orgánicos que se

encuentran en matrices acuosas. La LLE (Liquid-Liquid Extraction) es un método simple y manual,

usado exclusivamente en los años ochentas. Involucra la extracción del analito en solución o de la

muestra líquida, por partición directa con un disolvente inmiscible. Sus principales desventajas son: el

uso de grandes volúmenes de disolventes orgánicos y la formación de emulsiones, por lo cual se ha ido

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reemplazando por técnicas de microextracción. Fatoki y Awofolu [2003] usaron este método para la

extracción de plaguicidas organoclorados de matrices acuosas y demostraron que los disolventes éter

de petróleo, hexano y diclorometano, pueden extraer más del 83% de DDT o de sus análogos (Cuadro

3.1). Tahboub et al. [2005] hicieron la comparación de la extracción en fase sólida (discos de

extracción en fase sólida C18) con la LLE (éter de petróleo-diclorometano) para el análisis de

plaguicidas organoclorados en muestras de agua superficial; encontraron que los porcentajes de

recuperación fueron mayores en la LLE (96-99%), permitiendo obtener límites de identificación en

GC-MS de 0.012 y 0.024 g/mL, y de detección 0.01 y 0.02 g/mL para el p,p´-DDE y p,p´-DDT,

respectivamente (Cuadro 3.1). La extracción líquido-líquido, en combinación con otras técnicas de

extracción o purificación, también se ha usado en el tratamiento de matrices complejas como suero

humano [Garrido-Frenich et al., 2003] y leche [Al-Saleh et al., 2002; Burke et al., 2003] (Cuadro 3.1).

3.1.1.2 Extracción Soxhlet

Técnica del equilibrio líquido-sólido, basada en el reflujo a temperatura de ebullición de un disolvente

y un procedimiento de sifón. Recientemente este método de extracción se ha sustituido con la

extracción asistida con microondas [Wang et al., 2008] o la extracción con ultrasonido [Herbert et al.,

2006]. En el tratamiento de muestras complejas la extracción Soxhlet ha sido la mejor opción, como es

el caso del análisis de sedimentos usando diclorometano; los porcentajes de recuperación del o,p´-

DDE, o,p´-DDD, p,p´-DDD, o,p´-DDT, p,p´-DDT fueron: 96.03, 100.61, 97.84, 99.14 y 90.19%,

respectivamente, siendo mayores que los obtenidos en la extracción asistida con microondas [Fatoki y

Awofolu, 2003]. La extracción de p,p´-DDD, p,p´-DDE y p,p´-DDT, además de otros tres plaguicidas

en muestras de pescado, se logró con este método; posteriormente el extracto se trató con un material

no poroso de grafito para su análisis por GC-ECD y GC-MS; los porcentajes de recuperación fueron de

116 a 124%.[Nardelli et al., 2004].

3.1.1.3 Extracción asistida con ultrasonido

Esta técnica es desarrollada estáticamente y utiliza energía de las ondas acústicas para acelerar el

transporte de masa de una muestra sólida inmersa en un disolvente; la desventaja es que no es adecuada

para muestras volátiles. Se ha aplicado en la extracción de o,p´-DDE, p,p´-DDE y p,p´-DDT de suelo

usando una mezcla de éter de petróleo-acetona durante 25 minutos; después del análisis en GC-ECD se

observaron para los tres analitos recuperaciones mayores del 98%; los límites de detección y

cuantificación se encontraron en los rangos de 2.1-3.0 y 6.3-9.1 g/kg, respectivamente (Cuadro 3.2)

[Tor et al., 2006]. La extracción asistida con ultrasonido se ha aplicado en combinación con la

microextracción en presencia de emulsificantes o en fase dispersa para el análisis de compuestos

53

organoclorados. Los porcentajes de recuperación para el p,p´-DDE, p,p´-DDD y p,p´-DDT fueron

mayores del 98, 95 y 75%, respectivamente [Ozcan et al., 2009].

3.1.1.4 Extracción asistida con microondas (MAE)

La MAE (Microwave Assisted Extraction) permite la extracción rápida de solutos a partir de matrices

sólidas; la disolución acelerada es producida como una consecuencia de un proceso de calentamiento

rápido, que ocurre cuando un campo de microondas es aplicado a la muestra. Se ha usado en

combinación con la microextracción en fase sólida (SPME) en el tratamiento de suelos [Herbert et al.,

2006] para el análisis de p,p´-DDT, con porcentajes de recuperación bajos (42-83%). En sedimento se

analizaron el p,p´-DDE, p,p´-DDD y p,p´-DDT, obteniéndose porcentajes de recuperación mayores del

86% (Cuadro 3.1) [Carvalho et al., 2008]. Mejores resultados en la recuperación (100.3 al 102.85%)

fueron obtenidos por Gfrerer y Lankmayr [2005] al validar el método de extracción MAE de

plaguicidas organoclorados persistentes, presentes en sedimento y material vegetal seco. Sin embargo,

observaron degradación del p,p´-DDT, sugiriendo que ésta no ocurre durante el análisis en GC, sino

con las condiciones generadas en la extracción con n-hexano-acetona (1:1) (120°C, 20 min).

3.1.1.5 Extracción con líquidos presurizados (ASE)

La ASE (Accelerated Solvent Extraction) se aplica a muestras sólidas o semisólidas; las temperaturas y

presiones elevadas características de esta técnica causan la reducción en las interacciones y puentes de

hidrógeno, incrementando la superficie de contacto entre la muestra y el disolvente. En la

cuantificación de plaguicidas organoclorados en muestras de coral, se usó la extracción acelerada con

disolvente (ASE, por sus siglas en inglés) a presión y temperatura controladas de 2000 psi y 100 °C,

respectivamente. Posteriormente, el extracto se limpia pasándolo por una columna de silica gel

modificada con H2SO4. En el análisis por GC-MS se observaron límites de cuantificación de 2.6-2.7

pg/g y porcentajes de recuperación del 62-94% para el p,p´-DDT, p,p´-DDD y p,p´-DDE [Wang et al.,

2008]. Estos mismos analitos fueron extraídos con agua subcrítica presurizada (PSWE, Pressurized

Subcritical Water Extraction) modificada con acetonitrilo, a una temperatura de 120°C y 3 ciclos de 10

min de extracción; posteriormente los analitos fueron concentrados en una barra de agitación mediante

extracción sortiva (SBSE, Stir Bar Sorptive Extraction), obteniendo recuperaciones del 95 al 124.5%

(Cuadro 3.1) [Rodil y Popp, 2006].

54

Cuadro 3.1 Métodos analíticos para la determinación del DDT, DDE y DDD en muestras de agua y suelo

Matriz Preparación de la

muestra

Método

analítico Límite de detección

Límite de

cuantificación/Rango

lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

Agua Extracción líquido-

líquido (LLE) y

limpieza con Florisil

GC-ECD 0.004 g/L (p,p´-DDE)

0.011 g/L (p,p´-DDD)

0.012 g/L (p,p´-DDT)

2.8 g/L (p,p´-DDE)

0.55 g/L (p,p´-DDD)

3.6 g/L (p,p´-DDT)

31-141 (p,p´-DDE)

30-145 (p,p´-DDD)

25-160 (p,p´-DDT)

EPA 608 (EPA,

2010)

Matrices

líquidas

Extracción en fase

sólida SPE (C18)

GC-

ECD/MS

0.59-1.0 g/L (p,p´-

DDE)

0.6-0.71 g/L (p,p´-

DDT)

0.85-1.4 g/L (p,p´-

DDD)

80-97 (p,p´-DDE)

86.6-111 (p,p´-DDT)

74.9-101.1 (p,p´-DDD)

EPA 8081A (EPA,

2010)

Agua SPE (C18) MECK* 0.076 g/L (DDT)

0.110 g/L (DDE)

0.2-40 g/L (p,p´-

DDT)

0.2-30 g/L (p,p´-

DDE)

98 (p,p´-DDT)

64 (p.p´-DDE)

Fung y Mak, 2001

Agua

corriente

Microextracción en

membrana de fibra

hueca (LPME)

GC-MS 0.028 g/L (p,p´-DDD)

0.017g/L (p,p´-DDT)

5-100 g/L (p,p´-DDD)

5-100 g/L (p.p´-DDT)

95.24±1.07 (p,p´-DDD)

94.73±0.99 (p,p´-DDT)

Basheer et al.,

2002

Reservorio de

agua 0.028 g/L (p,p´-DDD)

0.017g/L (p,p´-DDT)

5-100 g/L (p,p´-DDD)

5-100 g/L (p.p´-DDT)

92.13±3.47 (p,p´-DDD)

81.67±2.79 (p,p´-DDT)

Basheer et al.,

2002

Agua de mar 0.028 g/L (p,p´-DDD)

0.017g/L (p,p´-DDT)

5-100 g/L (p,p´-DDD)

5-100 g/L (p.p´-DDT)

87.91±8.43 (p,p´-DDD)

83.53±11.38 (p,p´-DDT)

Basheer et al.,

2002

Agua Microextracción en fase

sólida (SPME) (fibras

de polidimetilsiloxano)

GC-ECD 19 ng/L (p,p´-DDD)

12 ng/L (p,p´-DDE)

11 ng/L (p,p´-DDT

No se reporta 112 (p,p´-DDD)

97-111 (p,p´-DDE)

77-118 (p,p´-DDT)

Tomkins y

Barnard, 2002

Agua LLE

GC-ECD 7.7 ng/L (o,p´-DDE)

5.5 ng/L (o,p´-DDD)

13.4 ng/L (p,p´-DDD)

6.0 ng/L (o,p´-DDT)

18.9 ng/L (p,p´-DDT)

No se reporta 89.94±2.96 (o,p´-DDE)

83.78±8.42 (o,p´-DDD)

80.79±6.45 (p,p´-DDD)

77.16±9.22 (o,p´-DDT)

80.42±10.79 (p,p´-DDT)

Fatoki y Awofolu,

2003

55


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

Agua de

desecho

Dispersión en celita y

CC (silica) y

tratamiento con cobre

(eliminación de S)

GC-ECD 7 g/kg (p,p´-DDE)

9 g/kg (p,p´-DDD)

10 g/kg (o,p´-DDT)

9 g/kg (p,p´-DDT)

25 g/kg (p,p´-DDE)

25 g/kg (p,p´-DDD)

25 g/kg (o,p´-DDT)

25 g/kg (p,p´-DDT)

89-99 (p,p´-DDE)

89-119 (p,p´-DDD)

83-106 (o,p´-DDT)

70-117 (p,p´-DDT)

Lourencetti et al.,

2004

Agua Extracción en fase

sólida (SPE)

GC/MS 30 ng/L (p,p´-DDT) 100 ng/L (p,p´-DDT) No se reporta Brondi et al., 2005

Agua

superficial

LLE GC-MS 0.010 g/L (p,p´-DDE)

0.020 g/L (p,p´-DDT)

0.012 g/L (p,p´-DDE)

0.024 g/L (p,p´-DDT)

89-96 ±9 (p,p´-DDE)

89-97±8 (p,p´-DDT)

Tahboub et al.,

2005

Agua SPE - CLAR

(Grafito)

CLAR-UV 10 ng/L (p,p´-DDD)

17ng /L (p,p´-DDT)

24 ng/L (o,p´-DDT)

25 ng/L (p,p´-DDE)

0.05-20 g/L (p,p´-

DDD)

0.05-20 g/L (p,p´-

DDT)

0.05-20 g/L (o,p´-

DDT)

0.05-20 g/L (p,p´-

DDE)

94-122 (p,p´-DDD)

93-108 (p,p´-DDT)

89-103 (o,p´-DDT)

92-113 (p,p´-DDE)

Zhou et al., 2006a

Agua SPE

(Nanotubos de carbono)

CLAR-UV 0.004 g/L (p,p´-DDD)

0.009 g/L (p,p´-DDE)

0.005 g/L (p,p´-DDT)

0.013 g/L (p,p´-DDT)

0.2-60 g/L (p,p´-

DDD)

0.2-60 g/L (p,p´-

DDE)

0.2-60 g/L (p,p´-

DDT)

0.2-60 g/L (p,p´-

DDT)

90-110 (p,p´-DDD)

100-112 (p,p´-DDE)

95-110 (p,p´-DDT)

90-112 (p,p´-DDT)

Zhou et al., 2006b

Agua SPME

(polidimetilsiloxano/

divinilbenceno)

CLAR-UV-

DA**

1.5 ng/mL (p,p´-DDD)

0.3 ng/mL (p,p´-DDT)

1.0 ng/mL (o,p´-DDT)

0.3 ng/mL (p,p´-DDE)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDD)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDT)

1-100 ng/mL (o,p´-

88-115 (p,p´-DDD)

88-115 (p,p´-DDT)

88-115 (o,p´-DDT)

88-115 (p,p´-DDE)

Torres-Padrón et

al., 2006

56


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

DDT)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDE)

Agua SPME (carbowax/TPR-

100)

CLAR-UV-

DA

0.8 ng/mL (p,p´-DDD)

1.2 ng/mL (p,p´-DDT)

0.5 ng/mL (o,p´-DDT)

0.6 ng/mL (p,p´-DDE)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDD)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDT)

1-100 ng/mL (o,p´-

DDT)

1-100 ng/mL (p,p´-

DDE)

74-99.7 (p,p´-DDD)

74-99.7 (p,p´-DDT)

74-99.7 (o,p´-DDT)

74-99.7 (p,p´-DDE)

Torres-Padrón et

al., 2006

Agua SPE (Nanotubos de

TiO2)

CLAR-UV 0.0031 ng/mL (p,p´-

DDD)

0.0037 ng/mL (p,p´-

DDE)

0.0053 ng/mL (o,p´-

DDT)

0.0025 ng/mL (p,p´-

DDT)

0.1-20 ng/mL (p,p´-

DDD)

0.1-20 ng/mL (p,p´-

DDE)

0.1-20 ng/mL (o,p´-

DDT)

0.1-20 ng/mL (p,p´-

DDT)

83.3-105 (p,p´-DDD)

90-108 (p,p´-DDE)

81.2-102 (o,p´-DDT)

86.16-115 (p,p´-DDT)

Zhou et al., 2007

Agua SPE (C18)

GC-MS 0.5 ng/L (o,p´-DDE)

1.0 ng/L (p,p´-DDE)



20.9 ng/L (o,p´-DDT)


1.7 ng/L (o,p´-DDE)

3.3 ng/L (p,p´-DDE)



69.0 ng/L (o,p´- DDT)


109.0 ±4.8 (o,p´-DDE)

84.0±1.3 (p,p´-DDE)

96.0±0.7 (o,p´-DDD)

116.0±5.2 (p,p´-DDD)

72.0±3.6 (o,p´-DDT)

60.0±3.6 (p,p´-DDT)

Baugros et al.,

2008

Agua Microextracción

dispersiva líquido-

líquido (DLLME)

CLAR- UV 0.40 g/L (p,p´-DDD)

0.32 g/L (p,p´-DDT)

0.51 g/L (o,p´-DDT)

0.35 g/L (p,p´-DDE)

1-50 g/L (p,p´-DDD)

1-50 g/L (p,p´-DDT)

1-50 g/L (o,p´-DDT)

1-50 g/L (p,p´-DDE)

85.58-103.5 (p,p´-DDD)

95.67-110.6 (p,p´-DDT)

91-106.2 (o,p´-DDT)

86.56-119.6 (p,p´-DDE)

Zhou et al., 2009

Agua HS-SPEM (silica)

luego limpieza con C18

GC-ECD

GC-MS

0.0005 to 0.0032 μg L

(p,p´-DDD, p,p´-DDE y

No se reporta No se reporta Mmualefe et al.,

2009

57


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

p,p´-DDT)

Agua DLLME CLAR 0.24 g/L (p,p´-DDD)

0.24 g/L (p,p´-DDT)

0.45 g/L (o,p´-DDT)

0.24 g/L (p,p´-DDE)

1-100 g/L (p,p´-DDD)

1-100 g/L (p,p´-DDT)

1-100 g/L (o,p´-DDT)

1-100 g/L (p,p´-DDE)

91.3-110 (p,p´-DDD)

91.5-103.1 (p,p´-DDT)

87.4-101.1 (o,p´-DDT)

90.2-105.6 (p,p´-DDE)

Bai et al., 2009

Agua de mar SPE (C18) y SPME

(PDMS)

GC-ECD No se reporta 0.005 ng/L (p,p´-DDD)

0.008 ng/L (p,p´-DDE)

0.015 ng/L (p,p´-DDT)

37.38 (p,p´-DDD)

41.72 (p,p´-DDE)

38.20 (p,p´-DDT)

Cai et al., 2010

Agua Microextracción

líquido-líquido (LLME)

y extracción de fase

solida en membrana

microporosa MMSPE

(polipropileno)

GC-ECD 12 ng/L (p,p´DDE)

18 ng/L (p,p´-DDD)


42.9 ng/L (p,p´DDE)


26 ng/L (p,p´-DDT)

76-105.6 (p,p´DDE)

107.5-118.7 (p,p´-DDD)

96.3-112.5 (p,p´-DDT)

Bedendo y

Carasek, 2010

Suelo Extracción con

disolvente presurizado

(ASE)

GC-MS

0.57 g/kg (o,p´-DDE)

0.22 g/kg (p,p´-DDE)

0.58 g/kg (o,p´-DDD)

0.41 g/kg (p,p´-DDD)

0.34 g/kg (o,p´-DDT)

0.25 g/kg (p,p´-DDT)

2.26 g/kg (o,p´-DDE)


2.31 g/kg (o,p´-DDD)


1.23 g/kg (o,p´- DDT)


96.23 ±4.23 (o,p´-DDE)

96.18±4.00 (p,p´-DDE)

99.75±6.66 (o,p´-DDD)

96.06 ±8.58 (p,p´-DDD)

105.60±6.53 (o,p´-DDT)

102.87±6.13 (p,p´-DDT)

Lehnik-Habrink et

al., 2010

Suelo ASE GC-MS 2.7pg/g (p,p´-DDE)

2.6 pg/g (p,p´-DDD)

2.7 pg/g (p,p´-DDT)

3.2 pg/g (o,p´-DDE)

2.7 pg/g (o,p´-DDD)

2.2 pg/g (o,p´-DDT)

No se reporta 62-90 (p,p´-DDE)

64-88 (p,p´-DDD)

60-94 (p,p´-DDT)

68 (o,p´-DDE)

63 (o,p´-DDD)

55 (o,p´-DDT)

Wang et al., 2008

Suelo QuEChERS (Quick,

Easy, Cheap, Effective,

Rugged, and Safe)

GC-MS 0.3 g/kg (p,p´-DDE)






62-90 (p,p´-DDE)

75-84 (p,p´-DDD)

69-85 (o,p´-DDT)

Rashid et al., 2010

58


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

0.3 g/kg (p.p´-DDT) 0.9 g/kg (p,p´-DDT) 68-85 (p,p´-DDT)

Suelo Extracción asistida por

microondas (MAE),

HS-SPME (PDMS)

GC-MS/MS 1.7 ng/g (p,p´-DDT) No se reporta 42-83 (p,p´-DDT) Herbert et al., 2006

Suelo MAE GC-ECD 3.0 g/kg (o,p´-DDE)

2.3g/kg (p,p´-DDE)


9.1g/kg (o,p´-DDE)

6.9g/kg (p,p´-DDE)


98 ±2 (o,p´-DDE)

99 ±1 (p,p´-DDE)

98 ±2 (p,p´-DDT)

Tor et al., 2006

Suelo Extracción con agua

subcrítica presurizada

(PSWE) y extracción

sortiva en barra de

agitación (SBSE)

GC-MS 0.039 ng/g (p,p´-DDE)

0.322 ng/g (p,p´-DDD)

0.304 ng/g (p,p´-DDT)

107.9±1.8 (p,p´-DDE)

95.1 ±10.8 (p,p´-DDD)

124.5±12.9 (p,p´-DDT)

Rodil y Popp, 2006

Sedimento MAE, HS-SPME

(PDMS)

GC-MS 0.005 ng/g (p,p´-DDE)

0.04 ng/g (p,p´-DDD)

0.04 ng/g (p,p´-DDT)

0.02 ng/g (p,p´-DDE)



97.0 (p,p´-DDE)

92.3 (p,p´-DDD)

86.7 (p,p´-DDT)

Carvalho et al.,

2008

Lodos Extracción por

dispersión en matriz de

fase sólida (MSPD),

SPE (C18)

GC-MS-

SIM







102.3-104.1 (p,p´-DDE)

90.4-91.5 (p,p´-DDD)

93.1-103.8 (p,p´-DDT)

Sánchez-Brunete

et al., 2008

*MECK Cromatografía electrocinética capilar; **CLAR-UV-DA = CLAR con detección UV y de Arreglo de diodos

59

Cuadro 3.2 Métodos analíticos para la determinación del DDT, DDE y DDD en alimentos y muestras biológicas


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

Huevos de

gallina

MSPD, limpieza con

Florisil

EG-ECD 0.6 g/kg (p,p´-DDE)






83 (p,p´-DDE)

96 (p,p´-DDD)

84 (p,p´-DDT)

Valsamaki et al.,

2006

Vegetales SPME (PMPS-OH) GC-ECD 0.23 ng/g (p,p´-DDE)


1.4 ng/g (o,p´-DDT)


0.5-100 ng/g (p,p´-

DDE)

0.5-100 ng/g (p,p´-

DDD)

2-100 ng/g (o,p´-DDT)

2-100 ng/g (p,p´-DDT)

57-84 (p,p´-DDE)

46-84 (p,p´-DDD)

45-84.1 (o,p´-DDT)

50-105.3 (p,p´-DDT)

Zheng et al., 2008

Fresa LLME y MMSPE

(polipropileno)

GC-ECD 0.73 g/kg (p,p´DDE)


2.46 g/kg (p,p´DDE)


74.4±9.4 (p,p´DDE)

104.9±6.7 (p,p´-DDT)

Bedendo y

Carasek, 2010

Tomate 4.06 g/L (p,p´DDE)

6.2 g/L (p,p´-DDD)

3.88g/L (p,p´-DDT)

13.53g/L (p,p´DDE)

20.66g/L (p,p´-DDD)

12.93g/L (p,p´-DDT)

95.8 ±8.1 (p,p´DDE)

100.1±5 (p,p´-DDD)

116.9±11.6 (p,p´-DDT)

Alimentos

con alto

contenido en

grasas

Diálisis en membrana

semipermeable

(polietileno) y CC

(SiO2)

GC-ECD 4.06 g/L (p,p´DDE)

6.2 g/L (p,p´-DDD)

3.88g/L (p,p´-DDT)

13.53g/L (p,p´DDE)

20.66g/L (p,p´-DDD)

12.93g/L (p,p´-DDT)

95.8 ±8.1 (p,p´DDE)

100.1±5 (p,p´-DDD)

116.9±11.6 (p,p´-DDT)

Surma-Zadora y

Grochowalski,

2008

Suero Cromatografía de

permeación de gel

GC-ECD y

MS

No se reporta 0.25 ng/mL (p,p´-

DDT)

0.36 ng/mL (p,p´-

DDE)

>64 (p,p´-DDT)

>75 (p,p´-DDE)

Goñi et al., 2009

Suero Extracción en disco-

fase sólida (SPDE) y

paso por Florisil

GC-ECD 15 pg/mL (o,p´-DDE)

15 pg/mL (p,p´-DDE)

15 pg/mL (o,p´-DDD)

15 pg/mL (p,p´-DDD)

15 pg/mL (o,p´-DDT)

15 pg/mL (p,p´-DDT)

50 pg/mL (o,p´-DDE)

50 pg/mL (p,p´-DDE)

50 pg/mL (o,p´-DDD)

50 pg/mL (p,p´-DDD)

50 pg/mL (o,p´-DDT)

50 pg/mL (p,p´-DDT)

0.32-8 ng/mL

73-81 (o,p´-DDE)

75-88 (p,p´-DDE)

68-82 (o,p´-DDD)

71-86 (p,p´-DDD)

75-80 (o,p´-DDT)

75-91 (p,p´-DDT)

Manirakiza et al,

2002

60


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

Suero LLE y CLAR-DAD

(SiO2)

GC-MS 1.2 g/L (p,p´-DDE)

0.1 g/L (o,p´-DDT)

0.5 g/L (p,p´-DDT)

3.6 g/L (p,p´-DDE)

0.25 g/L (o,p´-DDT)

1.25 g/L (p,p´-DDT)

110 (p,p´-DDE)

102 (o,p´-DDT)

91 g/L (p,p´-DDT)

Garrido-Frenich et

al., 2003

Leche LLE y CC (C18) GC-ECD 1.038 g/mL (p,p´-

DDE)

0.611 g/mL (p,p´-

DDD)

0.378 g/mL (p,p´-

DDT)

No se reporta 94.5-111.7 (p,p´-DDE)

100.4-118.5 (p,p´-DDD)

95-9-126.1 (p,p´-DDT)

Al-Saleh et al.,

2002

Leche LLE y SPE (Florisil) GC-ECD No se reporta 0.01 mg/kg (p,p´-DDE)

0.01 mg/kg (p,p´-

DDT)

60-100 (p,p´-DDE)

80-98 (p,p´-DDT)

Burke et al., 2003

Leche Centrifugación y CC

(no se indica el soporte)

GC-ECD No se reporta 0.5 ng/g (o,p´-DDE)


1.0 ng/g (o,p´-DDD)


1.0 ng/g (o,p´-DDT)


86.96 (o,p´-DDE)

97.09 (p,p´-DDE)

87.58 (o,p´-DDD)

100.16 (p,p´-DDD)

104.70 (o,p´-DDT)

105.49 (p,p´-DDT)

Armendáriz et al.,

2004

Leche SPME (PDMS-

divinilbenceno) GC-ECD 0.060 ng/mL (p,p´-

DDE)

0.015 ng/mL (p,p´-

DDD

0.16 ng/mL (p,p´-

DDT)

0.20 ng/mL (p,p´-

DDE)

0.051ng/mL (p,p´-

DDD

0.52 ng/mL (p,p´-

DDT)

94-97 (p,p´-DDE)

81-95 (p,p´-DDD

76-119 (p,p´-DDT)

Fernández-Álvarez

et al., 2008

Tejido graso Cromatografía de

permeación de gel, CC

(Florisil)

GC-MS No se reporta 8.9-3229 ng/g (p,p´-

DDE)

1.7-55 ng/g (p,p´-DDT)

1.4-48 ng/g (p,p-DDD)

No se reporta Smeds y Saukko,

2001

Grasa animal MSPD (carbón

activado)

CLAR-UV No se reporta ≤0.14 g/g (p,p´-DDT)

≤0.18 g/g (o,p´-DDT)

84-93 (p,p´-DDT)

90-93 (o,p´-DDT)

Furusawa, 2005

61


muestra

Método


Límite de


lineal

Porcentaje de

recuperación

%

Referencia

≤0.15 g/g (p,p´-DDE)

≤0.09 g/g (p,p´-DDD)

84-93 (p,p´-DDE)

58-70 (p,p´-DDD)

Vinos SPE (Resina Hyspher) GC-MS/MS 5 g/L (p,p´-DDE)

7 g/L (p,p´-DDD)

3 g/L (p,p´-DDT)

46 g/L (p,p´-DDE)

57 g/L (p,p´-DDD)

20 g/L (p,p´-DDT)

78-88.2 (p,p´-DDE)

76.9-98.1 (p,p´-DDD)

75.6-97.6 (p,p´-DDT)

Pérez-Serradilla et

al., 2010

62

3.1.1.6 Microextracción en fase sólida (SPME)

Este método es simple, rápido, sensible y libre de disolvente. El analito en aire o agua es extraído hacia

la cubierta polimérica de una fibra. El mecanismo se basa en el equilibrio de partición de los analitos

entre la muestra o el espacio adyacente sobre la muestra, y una fibra de sílica fundida y recubierta con

una fase estacionaria adecuada. La cantidad del analito extraído por la fibra es proporcional a la

concentración inicial de analito en la muestra y depende del tipo de fibra. Después del muestreo, el

analito puede ser térmicamente desorbido de la fibra hacia el inyector de un cromatógrafo de gases o

ser desorbido por la fase móvil en el sistema del cromatógrafo de líquidos. La microextracción en fase

sólida (SPME, Solid Phase MicroExtraction) combina muestreo, enriquecimiento del analito,

separación de la matriz e introducción de la muestra en una sola etapa.

Para el análisis de plaguicidas organoclorados existen las fibras de carbowax-divinilbenceno,

polidimetilsiloxano (PDMS), carboxen-polidimetilsiloxano, divinil-benceno-carboxen-

polidimetilsiloxano y poliacrilato [Hwang y Lee, 2000; López et al., 2001; Pérez-Trujillo et al., 2002].

En el análisis de estos contaminantes en suelos, se ha demostrado una mejor eficiencia de extracción

con fibras de PDMS (100 µm) que con aquellas de PDMS-divinilbenceno (65 µm) o poliacrilato (85

µm), con tiempos de equilibrio de 60 minutos [Zambonin et al., 2002]. El uso de la fibra de PDMS ha

permitido recuperaciones mayores del 77% y límites de cuantificación de 17-26 ng/L del DDT y sus

metabolitos, presentes en muestras de agua subterránea (Cuadro 3.1) [Tomkins y Barnard, 2002].

En el análisis por GC-MS de compuestos organoclorados, el DDT y sus metabolitos presentes en agua,

son adsorbidos por la fibra en un tiempo de 60 a 150 min, dependiendo de la temperatura (50-90°C); la

desorción ocurre a temperaturas mayores de 200 °C. Se encontraron límites de detección de 3-5 ng/L

de p,p´DDT, o,p´-DDT, p,p´-DDD y o,p´-DDD, mientras que en el método EPA 508 son de 3-10 ng/L

[Zambonini et al., 2002].

El desarrollo de nuevas cubiertas para una mejor y eficiente recuperación de los plaguicidas se ha

logrado con la tecnología sol-gel, en la cual los compuestos conteniendo diferentes grupos funcionales

pueden ser escogidos para adicionarlos a una solución sol-gel preparando así una cubierta especial para

SPME (Figura 3.1). Ejemplos de cubiertas poliméricas para la extracción de plaguicidas

organoclorados son: 3,5´,3´´-trisbenzil-oxi-2-dodecil-oxi-(1,1´,4´,1´´)-terfenil-2,´5´-bisbenzil-oxi-

(1,1´,4´,1´´)-terfenil, preparado a partir de tetra-etoxisilano [Kumar et al. 2008] y el

polimetilfenilsiloxano-hidroxilado (PMPS-OH, hydroxyl-terminated PolyMethylPhenylSiloxane)

(Figura 3.2).

63

Figura 3.1 Dispositivo para el muestreo de plaguicidas mediante SPME usando fibras recubiertas

(izquierda). Fibra cubierta con cerámica-carbono, fotografía obtenida por microscopia

electrónica de barrido (derecha). Tomada de Zeng et al. [2008]

La fibra recubierta con PMPS-OH se usó para la extracción del p,p´-DDT, o,p´-DDT, p,p´-DDE y p,p´-

DDD de diversos vegetales. Una vez analizado el contenido de la fibra mediante GC-ECD, los datos

obtenidos demostraron la aplicación de estas fibras en el análisis cualitativo y semicuantitativo del

DDT y sus metabolitos contenidos junto con otros plaguicidas en muestras vegetales [Zeng et al.,

2008a].

SiH3C O

CH3

O

Si

CH3

CH3

O Si

CH3

CH3

O Si CH3

CH3

CH3

p q

SiO OSi

O

O

Si O

O

Si

CH3

CH3

Si O

CH3

CH3

Si O Si

CH3

CH3

Ph

Ph

OH

m n

O Si O

CH3

CH3

Si O Si

CH3

CH3

Ph

Ph

OH

m n

SiH3C O

O

CH3

Si

CH3

CH3

O Si

CH3

CH3

O Si CH3

CH3

CH3

p q

superficie de la fibra

Figura 3.2 Estructura del polimetilfenilsiloxano-hidroxilado, Ph = fenilo (C6H5). Tomada de Zeng et

al. [2008b]

64

La SPME combinada con la extracción micelar asistida por microondas (MAME, Microwave-Assisted

Micellar Extraction) se usó para el análisis de sedimentos; la muestra es suspendida en una solución

surfactante durante algunos minutos, posteriormente es filtrada para introducir la fibra de SPME. Las

condiciones de extracción son agitación a 700 rpm y temperatura ambiente. La desorción se hizo con

metanol durante 8 min para su análisis en CLAR; los porcentajes de recuperación y el límite de

detección fueron mayores del 98% y 28-84 ng/g, respectivamente [Vega et al., 2008b].

En el muestreo de aire para la determinación de compuestos semi volátiles clorados, se ha usado la

SPME con fibras de carbowax-divinilbenceno, las cuales una vez expuestas son analizadas en las

siguientes 24 horas. Este método de muestreo resultó igual de conveniente que el uso de dispositivos

de membrana semipermeable [Paschke et al., 2006].

3.1.1.7 Extracción sortiva con agitación de barra (SBSE)

Es una herramienta para la preparación de la muestra, basada en la extracción sortiva de analitos que

pueden ser posteriormente removidos por desorción térmica en el puerto de inyección del cromatógrafo

o por elución con un disolvente grado cromatográfico. La extracción sortiva con agitación de barra

(SBSE, Stir Bar Sorptive Extraction), es una variación dinámica de SPME, en la cual un agitador/barra

de agitación (cubierta con polidimetilsiloxano) es usado para sorber los analitos. Es empleada para

matrices complejas semisólidas o líquidas. Esta técnica puede ser más efectiva que la extracción PDMS

debido a los volúmenes relativos mayores de la fase PDMS (20-125 µL) comparados con la de SPME

(0.5 µL). Se ha usado en combinación con otros métodos como la extracción con fluidos presurizados

[Rodil y Popp, 2006].

3.1.1.8 Extracción con fibra de membrana hueca (HF-LPME)

La demanda para la automatización en la extracción líquido-líquido (LLE) combinada con la reducción

del uso de disolventes orgánicos o su eliminación, ha conducido a desarrollar la microextracción en

fase líquida basada en fibras huecas desechables (HF-LPME, Liquid-Phase Hollow Fibre Membrane

Microextraction). El analito es extraído a partir de muestras acuosas a través de una pequeña capa de

disolvente orgánico inmovilizado dentro del poro de una fibra hueca, es decir la solución aceptora se

encuentra dentro del lumen (luz) de la fibra hueca (Figura 3.3). Posteriormente, la solución aceptora se

somete directamente a análisis final mediante cromatografía capilar de gases, cromatografía de líquidos

de alta resolución (CLAR), electroforesis capilar o espectrometría de masas, sin ningún esfuerzo

adicional. En la determinación de p,p´-DDD y p,p´-DDT se aplicó este procedimiento usando una

membrana de polipropileno hueca; de diámetro interno, espesor y tamaño de poro de 600, 200 y 0.64

µm, respectivamente.

65

Figura 3.3 Representación del diseño experimental para extraer plaguicidas organoclorados de una

matriz acuosa, usando una fibra de membrana hueca. Modificado de Basheer et al. [2002]

En la Figura 3.3 se observa el diseño experimental de la extracción de los analitos con la membrana de

fibra hueca. Con la jeringa se mide el disolvente (5 L), posteriormente se sumerge la membrana en la

muestra de agua (5 mL), la fibra se llena con el disolvente y la extracción del analito ocurre de la

muestra hacia los poros que contienen el disolvente durante 30 minutos y con agitación continua. El

tolueno y n-nonano han demostrado ser buenos disolventes en la extracción del p,p´-DDD y p,p´-DDT,

con porcentajes de recuperación mayores a 94% (Cuadro 3.1) [Basheer et al., 2002]. El disolvente

orgánico inmovilizado en los poros de la membrana como aceptor de la fase, es utilizado para la

extracción sin generar mayores pérdidas, usando la misma configuración y basado en el hecho de que

la red de los microporos de la membrana también puede trabajar como un adsorbente de analitos.

Se ha reportado la aplicación de membranas de polipropileno porosa seca para la extracción y

concentración de analitos. Este modo de extracción recibe el nombre de extracción en fase sólida y en

membrana microporosa (MMSPE, Microporous Membrane Solid-Phase Extraction); fue aplicada en

combinación con la HF-LPME para extraer 13 plaguicidas organoclorados, incluyendo el p,p´-DDT,

p,p´-DDE y p,p´-DDD [Bedendo y Carasek, 2010], obteniendo porcentajes de recuperación de 76 a

118.7%, y límites de cuantificación 100 veces menores que los reportados por Basher et al. [2002]

(Cuadro 3.1).

3.1.2 Técnicas de separación y enriquecimiento dominadas por los equilibrios gas-líquido

o gas-sólido

3.1.2.1 Técnica de Headspace estático y dinámico

Esta técnica está basada en el muestreo de analitos volátiles desde un espacio cerrado en un sistema

estático o dinámico (agitación), usando una delgada jeringa para gases. Los analitos de interés son

equilibrados en un vial cerrado a una temperatura y presión específicas. El uso de la jeringa o de un

66

sistema de auto muestreo, es una de las técnicas usadas para transferir el analito ubicado en el espacio

adyacente superior del nivel de la muestra hacia el cromatógrafo de gases. La microextracción

headspace en fase sólida (HS-SPME, Head Space Solid Phase MicroExtraction) es otra variación del

headspace estático, que atrapa los componentes volátiles hacia una fibra de SPME sujeta sobre la

muestra. Este modo de extracción está basado en el equilibrio entre tres fases: matriz de la muestra,

fase vapor y la fibra. En la cuantificación del DDT y sus metabolitos entre otros plaguicidas

organoclorados presentes en muestras de suelo, se utilizó esta técnica en combinación con la extracción

asistida por microondas (MAE). Para la extracción HS-SPME se usaron fibras de polidimetilsiloxano

de 100 µm, la fibra se introdujo a un vial de 22 mL que contenía 10 mL de muestra y una barra de

agitación cubierta con PTFE (material inerte). La fibra quedó a 1.8 cm de la superficie del líquido, el

vial fue sellado y sometido a calentamiento (80°C) y agitación (60 minutos, 250 rpm). Los límites de

detección y cuantificación para el DDT y sus metabolitos fueron de 0.005-0.04 ng/g y 0.02-0.11 ng/g,

respectivamente [Carvahlo et al., 2008]. La HS-SPME del p,p´-DDT también se ha logrado a

temperaturas menores (65°C) en el mismo tiempo y tipo de fibra [Herbert et al., 2006].

3.1.2.2 Extracción en fase sólida (SPE)

Esta técnica se emplea para la separación selectiva y concentración de analitos contenidos en matrices

líquidas y gaseosas y a menudo se usa para limpiar y concentrar extractos líquidos, por lo que también

se incluye en las técnicas de la sección 3.1.1. La SPE (Solid Phase Extraction) es una técnica referida a

la remoción exhaustiva (sin alcanzar el equilibrio) de analitos semi volátiles y no volátiles, de una

muestra líquida por retención sobre una fase sólida mediante un disolvente apropiado. La desorción de

los analitos de la fase sólida puede ser bajo tratamiento térmico o elución con disolvente. La SPE está

basada en la distribución de los analitos entre la muestra y la fase sólida, la cual usualmente está

contenida en un cartucho. Los sorbentes que son aplicables en SPE se pueden clasificar de acuerdo a su

naturaleza no polar (C8, C18, fenil, diol, amino), polar (silica gel, Florisil o silicato de magnesio, óxido

de aluminio) e intercambio iónico. Los sorbentes usados en la extracción de plaguicidas

organoclorados a partir de agua son de C18 [Fung y Mak, 2001; Brondi et al., 2005; Baugros et al.,

2008] y en combinación con otras técnicas como la SPME [Cai et al., 2010] y extracción por

dispersión en matriz de fase sólida (MSPD, Matrix Solid-Phase Dispersion) [Sánchez-Brunete et al.,

2008]. Usando estas combinaciones se han obtenido mejoras en la extracción a partir de matrices más

complejas como el agua de mar y lodos. Una revisión exhaustiva sobre los avances en esta técnica de

extracción es proporcionada por Picó et al. [2007].

La extracción en fase sólida para la determinación de niveles traza de DDT en muestras de agua, se ha

efectuado con grafito expandido (EG, Expanded Graphite) acoplado en línea a CLAR. El grafito

67

expandido es un material parecido a un tubo o gusano, altamente poroso y muy ligero, con densidades

típicas aparentes de 0.002-0.01 g/cm3. Los espacios absorbentes del EG se pueden dividir en dos tipos:

uno es el espacio de absorción de la envoltura (WAS) construido por el apilamiento de las unidades de

EG, y el segundo es el poro en cada segmento de tubo. Este soporte es un buen absorbente debido a su

estructura reticular, a su baja polaridad, y a la naturaleza lipofílica e hidrofílica con alta capacidad

selectiva de sorción hacia compuestos orgánicos grandes con débil polaridad en agua (Figura 3.4)

[Zhou et al., 2006a].

Figura 3.4 Grafito expandido, fotografía obtenida en microscopio electrónico de barrido. Tomado de

Zhou et al. [2006a]

Zhou et al. [2006a] desarrollaron un método de análisis para p,p´-DDD, p,p´-DDT, o,p´-DDT y p,p´-

DDE en muestras de agua, usando la SPE acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (CLAR),

reduciendo los tiempos de análisis a 8 minutos y obteniendo límites de detección de 17-25 ng/L. En la

Figura 3.5 se presenta el esquema del sistema SPE-CLAR-UV.

68

Figura 3.5 Pre-concentración de la muestra por extracción en fase sólida en línea acoplada con CLAR-

DAD. Modificado de Zhou et al. [2006a]

Los nanotubos de carbono como soporte en SPE también se han usado en la pre-concentración de DDT

y sus metabolitos en muestras de agua. Los nanotubos son hechos de hojas perfectas de grafito

enrolladas dentro de un cilindro y cubiertas con dos tapas. Estos se dividen en nanotubos de carbono de

pared simple (SWNT, por sus siglas en inglés) y los de paredes múltiples (MWNT, por sus siglas en

inglés). La gran área superficial y la única estructura tubular lo hacen un material con gran potencial

adsorbente; el arreglo hexagonal del carbono en las hojas de grafito de los MWNT tiene una fuerte

interacción con varias clases de compuestos orgánicos. El material de soporte en la SPE con MWNT

fue usado para retener el DDT y sus metabolitos; se pasaron volúmenes de 500 mL de muestra, se

eluyó con diclorometano para recuperar y concentrar la solución, y posteriormente los analitos fueron

analizados por CLAR. Se obtuvieron límites de detección de 0.004-0.013 µg/L y un rango lineal de

trabajo de 0.2-60 µg/L [Zhou et al., 2006b]. Los mismos autores proponen el uso de nanotubos de

dióxido de titanio (Figura 3.6) como material de soporte en la SPE, para la extracción de plaguicidas

organoclorados. Los nanotubos de TiO2 pueden alcanzar un área superficial de 400 m2/g, la cual es

superior a la que poseen los nanotubos de carbono MWNT (200 m2/g). Los resultados experimentales

69

demostraron que en el enriquecimiento del DDT y sus metabolitos, los nanotubos de TiO2 poseen

propiedades adsorbentes comparables a las de los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWNT) y

superiores a la C18. Los límites de detección del DDT y metabolitos usando los nanotubos de TiO2

fueron 1.5 veces más bajos que los obtenidos cuando el soporte en la SPE está formado por los

nanotubos de carbono (Cuadro 3.1). Se encontró que el uso de este material de soporte aún tiene

limitaciones para su estabilidad y repetitividad, las cuales serían mejoradas con el incremento del área

superficial y controlando el tamaño de poro [Zhou et al., 2007].

Figura 3.6 Nanotubos de TiO2 fotografía de microscopía electrónica de barrido. Tomado de Zhou et al.

[2007]

La SPE también es usada para la eliminación de interferencias en los análisis de plaguicidas

organoclorados; para este tipo de extracción existen diversos soportes, los cuales pueden ser de fase

normal, reversa e incluso de permeación de gel [Goñi et al., 2009]. Así, se ha usado Florisil en el

tratamiento de muestras de huevo [Valsamaki et al., 2006], suero [Manirakiza et al., 2002] y leche

[Burke et al., 2003]; la sílica gel para eliminar interferencias de tejido graso [Smeds y Saukko, 2001],

suero [Garrido-Frenich et al., 2003] y alimentos con alto contenido de grasas [Surma-Zadora y

Grochowalski, 2008]; mientras que la C18 ha permitido la preparación de muestras a partir de leche

[Al-Saleh et al., 2002] y miel de abeja [Blasco et al., 2003]. Los porcentajes para el DDT y sus

análogos han sido mayores del 60% y los límites de cuantificación han sido desde ng/L hasta mg/L

(Cuadro 3.2).

Un tipo de SPE que ha logrado dar buenos resultados en la extracción de analitos de muestras

complejas, como los lodos provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales, es la extracción

por dispersión en matriz de fase sólida (MSPD = Matrix Solid-Phase Dispersion). En el análisis de

plaguicidas organoclorados, una muestra viscosa o sólida se muele con un soporte sólido (alúmina)

para aislar los compuestos orgánicos mediante adsorción sobre la alúmina. La dispersión tiene la

función de homogeneizar la muestra, provocar la disrupción celular, el fraccionamiento y la

70

purificación, todo en un solo proceso. Posteriormente, la desorción ocurre con una pequeña cantidad de

diclorometano y sonicación (MAE). El disolvente conteniendo los analitos es sometido a extracción en

fase sólida (SPE) con alúmina y los organoclorados son recuperados con acetonitrilo; luego del análisis

por GC-MS se reportaron porcentajes de recuperación mayores de 90.4% y límites de cuantificación de

0.1, 0.17 y 1.3 ng/g para el p,p´-DDE, p,p´-DDD y p,p´-DDT, respectivamente [Sánchez-Brunete et al.,

2008]. La dispersión en matriz de fase sólida también se ha efectuado con Florisil, con porcentajes de

recuperación mayores del 83% para los mismos analitos a partir de muestras de huevo de gallina

(Cuadro 3.1) [Valsamaki et al., 2006]. Otro soporte usado en la extracción de estos compuestos a partir

de grasa animal, son las fibras de carbón activado que poseen un área superficial de 1000-1600 m2/g, y

tienen una estructura microporosa que hace que la velocidad de adsorción sea de 10 a 100 veces más

rápida que la de otros soportes. Sin embargo, los porcentajes de recuperación fueron menores que los

observados en los soportes antes mencionados (58-93%) [Furusawa, 2005], probablemente por

desorciones ineficientes, dada la compleja naturaleza del soporte que requiere mayores tiempos para

alcanzar los equilibrios de sorción-desorción.

Un aplicación de la MSPD es el desarrollo del método rápido, fácil, económico, efectivo, robusto y

seguro llamado QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) [Anastassiades et al.,

2003], el cual se usó en la determinación de plaguicidas. El procedimiento involucra una extracción

inicial en 10 g de muestra con 10 mL de acetonitrilo, seguido por una partición líquido-líquido en

presencia de 4g de MgSO4 anhidro y 1g de NaCl. La remoción del agua residual del extracto líquido es

efectuada simultáneamente mediante el uso de un procedimiento llamado extracción dispersiva en fase

sólida (dispersive-SPE), en la cual 150 mg de sulfato de magnesio anhidro (MgSO4) y 25 mg del

sorbente, que es una amina primaria y secundaria (PSA, por sus sigla en inglés), son mezclados con 1

mL del extracto de acetonitrilo. La extracción dispersiva remueve efectivamente los componentes

polares de la matriz como son los ácidos orgánicos, pigmentos polares y azúcares. Rashid et al. [2010]

utilizan una modificación de este método para la extracción de los plaguicidas organoclorados de suelo.

La modificación fue sustituir la extracción dispersiva con la PSA por una extracción líquido-líquido

(LLE) (hexano:agua) para obtener extractos más concentrados y limpios. Los límites de detección y

cuantificación, así como los porcentajes de recuperación una vez analizados (GC-MS) los extractos,

fueron mayores de 0.3 mg/kg, 1.1-1.4 g/kg y del 62-90%, respectivamente (Cuadro 3.1).

Bai et al. [2009] desarrollaron un método de microextracción líquido dispersivo-líquido iónico, que

combina la microextracción líquido-líquido (LLME, Liquid-Liquid MicroExtraction) y la

microextracción en fase líquida de gota simple. El método llamado microextracción dispersiva en fase

líquido-líquido iónico a temperatura controlada (DLLME, Liquid Dispersive Liquid Phase

Microextraction) usa un líquido iónico simple como disolvente. El surfactante usado fue el 1-hexil-3-

71

metil-imidazolium-hexafluorofosfato (C6MIM)(PF6). El reactivo (C6MIM)(PF6) se adiciona a las

muestras de agua y la mezcla es calentada, así los analitos migran hacia la fase líquida iónica debido a

su mayor solubilidad en la fase polar; cuando las mezclas son enfriadas en hielo, se vuelven turbias y

entonces se centrifugan. La fase acuosa que contiene los analitos se analizó por CLAR; los límites de

detección y los porcentajes de recuperación fueron 0.24-0.45 ng/L y mayores del 87.4%,

respectivamente, para p,p´-DDD, p,p´-DDT, o,p´-DDT y p,p´-DDE (Cuadro 3.1).

Una técnica de extracción de plaguicidas organoclorados que se encuentra fuera de la clasificación de

Olariu et al. [2010] y que ha sido usada en el tratamiento de alimentos con alto contenido graso, es la

extracción mediante el uso de membranas semipermeables (SPM, SemiPermeable Membrane). La

muestra es sometida a diálisis durante 48 h en hexano, y posteriormente el extracto es sometido a

cromatografía en columna de silica; los eluatos obtenidos con diclorometano-hexano son analizados

por GC-ECD. Los porcentajes de recuperación se encuentran entre el 89 y 96% para p,p´-DDT, p,p´-

DDE y p,p´-DDD (Cuadro 3.2) [Surma-Zadora y Grochowalski, 2008]. Los límites de detección y

cuantificación son comparables a otros métodos de extracción; sin embargo, el tiempo invertido y el

número de operaciones necesarias para la extracción y limpieza de las muestras, lo hace inconveniente

cuando se requiere analizar un gran número de muestras, aunque no hay opción cuando la matriz es

muy compleja. Por ejemplo, en la extracción y eliminación de interferencias para el análisis de

compuestos organoclorados en tejido graso, se requiere pasar la muestra por una columna de alúmina,

luego efectuar una pre-purificación por CLAR y finalmente, analizar el extracto en GC-MS (Figura

3.7) [Moreno-Frías et al., 2004].

72

Figura 3.7 Método para la extracción de compuestos organoclorados de tejido graso. Modificado de

Moreno-Frías et al. [2004]

En el caso de análisis de muestras de aire, Ding et al. [2009] muestrearon volúmenes entre 1215 a 3030

m3 (0°C y 1 atm) a una velocidad de flujo de 1 m

3/min, para monitorear el DDT y otros 5 compuestos

análogos. El aire fue aspirado a través de un filtro de fibra de cuarzo para colectar el material

suspendido, y los compuestos gaseosos fueron atrapados sobre una pieza circular de espuma de

poliuretano (6.5 cm diámetro x 8 cm altura) contenida en un cilindro de aluminio. Los analitos fueron

recuperados por extracción Soxhlet con diclorometano y los extractos fueron analizados por GC-MS-

SIM. Los muestreadores mencionados son conocidos como muestreadores pasivos de aire (PAS,

Passive Air Samplers); el poliuretano también fue usado en el estudio de He y Balasubramanian

[2009], para evaluar muestreadores pasivos y activos en el monitoreo de compuestos semivolátiles

organoclorados en la atmósfera de zonas tropicales. Otros materiales usados en los PAS son fibra de

vidrio cubierta de triestearina (triglicérido) o polietileno. Kosikowska y Biziuk [2010], publicaron

recientemente una revisión sobre las metodologías usadas en el análisis de plaguicidas en el aire, y

mencionan los tipos de muestreo, sorbentes, la extracción del analito y las técnicas de determinación.

Algunas de las técnicas de tratamiento de muestras para el análisis de plaguicidas organoclorados son

recomendadas en los métodos EPA, tal como la extracción Soxhlet (EPA 3540, EPA 3541); uso de

fluidos presurizados (EPA 3545); MAE (EPA 3550); extracción líquido-líquido (EPA 3510);

73

extracción en fase sólida (SPE) usando alúmina (EPA 3610), Florisil (silicato de magnesio)(EPA 3620)

y silica (EPA 3630); discos de permeación de gel (EPA 3640). y el tratamiento para la remoción de

azufre para evitar interferencias en la determinación simultánea con otros plaguicidas (EPA3660)

[EPA, 2010]. Sin embargo, los métodos aquí presentados representan el avance en las mejoras de

recuperación, tiempos de análisis, límites de detección y selectividad para la cuantificación del DDT y

sus análogos.

3.2 Detección y análisis

Los métodos oficiales para la detección y cuantificación del DDT y sus metabolitos son el 8081A y

608 de la EPA [EPA, 2010], los cuales consideran el análisis en cromatografía de gases (GC) con

detección de captura de electrones (ECD) y de masas (MS). El método 608 es usado para cuantificar

compuestos organoclorados y bifenilos policlorados en matrices líquidas. La técnica de extracción es

líquido-líquido y el análisis es por GC-ECD, y se recomienda la confirmación siguiendo el método

625, el cual contempla en el análisis la detección por MS. Los porcentajes de recuperación y límites de

cuantificación del p,p´-DDT, p,p´-DDE y p,p´-DDD, no son uniformes y son mayores que los

reportados en el método EPA 8081A (Cuadro 3.1). El método 8081A es usado para determinar las

concentraciones de 28 plaguicidas organoclorados, estando el p,p´-DDT, p,p´-DDE y p,p´-DDD,

contenidos en matrices líquidas. En este método se recomiendan las técnicas de extracción de los

analitos según la naturaleza de la matriz para su posterior análisis en GC-ECD.

En los siguientes párrafos se describen las técnicas de análisis y detección usadas en el análisis del

DDT y sus análogos.

3.2.1 Cromatografía de gases (GC)

En esta técnica analítica, la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna

cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil, que es un gas inerte, y que

transporta la muestra a través de la columna en donde ocurrirá la separación de los analitos de interés y

al salir de ella, llegan a un detector. En la Figura 3.8 se presenta un esquema general del sistema de

cromatografía de gases: la muestra es introducida al sistema en un puerto de inyección, viaja a través

de la columna donde es separada, y llega al detector. Los detectores usados en los análisis de DDT son

el de captura de electrones (ECD, Electron Capture Detector) y el espectrómetro de masa (MS, Mass

Spectrometer), los cuales serán comentados más adelante.

74

Figura 3.8 Sistema de cromatografía de gases. Modificado de Quian et al. [2010]

Existen dos tipos de cromatografía de gases; la cromatografía gas-sólido y gas-líquido, siendo esta

última la que se usa en la separación de plaguicidas organoclorados. Las columnas de sílica están

recubiertas con fases líquidas no polares; así, la separación del analito se basa en su distribución entre

la fase gaseosa y la fase líquida inmovilizada en el soporte inerte. La composición de las fases

estacionarias que recubren la sílica y que son las más usadas en la separación de compuestos

organoclorados se presentan en la Figura 3.9.

Las columnas usadas en los diferentes análisis del DDT y sus metabolitos son distribuidas en el

comercio bajo diferentes nombres dependiendo del proveedor; así se ha usado la columna capilar DB-5

[Chuang et al., 2001; Basheer et al., 2002; Kamarianos et al., 2003; Armendariz et al., 2004; Moreno-

Frias et al., 2004; Tahboub et al., 2005; Valsemaki et al., 2006; Goñi et al., 2007; 2009; Rantakokko et

al., 2009] que es equivalente a la Quatrex-Metil-5%-fenilsilicona [Fatoki y Awofolu, 2003] y a la CP-

Sil 8CB [Gonçalves y Alpendurada, 2004]; estas columnas corresponden a la fase mostrada en la

Figura 3.9, y contienen 5% de fenilpolisiloxano y 95% metilpolisiloxano. Cuando la detección se hace

por MS se usan columnas llamadas de bajo sangrado, o que durante el análisis el gas acarreador no

lleve rastros de la fase estacionaria al detector. Estas columnas se han usado bajo el nombre de CP-

Sil8CB Low Bleed [Tahboub et al., 2005; Herbert et al., 2006; Carvahlo et al., 2008; Perez-Serradilla

et al., 2010], aunque también se ha utilizado con éxito una fase estacionaria con mayor porcentaje de

fenilo, Zebron ZB-50 (50% fenil, 50% metilpolisiloxano), para la separación de 19 compuestos

75

organohalogenados, estando entre ellos p,p´-DDE, p,p´-DDD, o,p´-DDT y p,p´-DDT [Rashid et al.,

2010].

Si O

CH3

CH3

Si O

C6H5

C6H5

5% fenil 95% dimetilpolisiloxano

Si O

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

O

n

Para análisis en MS

SiSi OO

CH3

CH3 CH3

CH3

Si

CH3

*

x y

C6H5 =

Figura 3.9 Composición de las fases estacionarias usadas en la separación de compuestos

organoclorados en GC

La introducción de la muestra en el análisis del DDT y sus metabolitos puede ser de manera directa, así

los volúmenes de inyección en el sistema de GC normalmente son de 1 a 2 L, o pueden ser volúmenes

de hasta 100 L cuando existe un cartucho de SPE acoplado en línea [Brondi et al., 2005], o la muestra

es inyectada en volúmenes de 10 L pasando primero a la pre-columna para favorecer la evaporación

del disolvente [Concha-Graña et al., 2009]. Pérez-Serradilla et al. [2010] desarrollaron un método para

el análisis en línea de vinos, se adaptó un sistema SPE al sistema CLAR y se desarrolló un método de

análisis donde las muestras previamente filtradas son cargadas directamente al sistema cromatográfico.

La muestra es cargada y soportada en el cartucho de fase reversa (SPE); el lavado se programa para

eliminar interferencias, adsorber y desorber los analitos (mediante acetato de etilo); posteriormente, se

descargan 10 µL del extracto hacia la columna (Figura 3.10). Los porcentajes de recuperación fueron

mayores del 70%, y los cartuchos de SPE fueron reusables hasta 10 veces.

76

Figura 3.10 Sistema Prospekt. UDD, Unidad de dosificación del disolvente; SPE, cartucho de

extracción en fase sólida. Modificado de Pérez-Serradilla et al. [2010]

Cuando la extracción se efectúa con fibras de SPME, una vez que éstas han sido expuestas a la muestra

y adsorbido los analitos de interés, son introducidas al sistema GC para la desorción a temperatura

elevada (Figura 3.11).

Figura 3.11 Fibras de microextracción y su aplicación en los sistemas GC. Modificado de Quian et al.

[2010]

77

3.2.1.1 Detector de captura de electrones (ECD)

Este detector opera del mismo modo que un contador proporcional para la medida de rayos-X; contiene

una lámina radioactiva de 63

Ni que emite electrones como parte de su descomposición. Los electrones

son colectados en el ánodo, generándose una corriente continua que es monitoreada por instrumentos

electrónicos. El analito pasará entre la lámina radioactiva y el ánodo cuando sale de la columna, y si

captura electrones provocará la reducción de la corriente generando una respuesta medible (Figura

3.12). Los compuestos halogenados o que contienen grupos funcionales muy electronegativos

(peróxidos, quinonas, nitro), así como aquellos con conjugación de dobles enlaces, provocan las

respuestas de detección más altas.

Figura 3.12 Detector de captura de electrones (ECD). Modificado de Qian et al. [2010]

En la gran mayoría de los análisis del DDT y sus metabolitos en GC, se ha usado el detector ECD

dando resultados muy confiables y cercanos a los obtenidos cuando se emplea el detector de masas

(MS), el cual es utilizado para confirmar la identidad de los analitos [Al-Saleh et al., 2002; Valsamaki

et al., 2006; Carvahlo et al., 2008]. También se ha descrito el uso de microdetectores de captura de

electrones, que tienen un volumen de celda más pequeño y pueden dar mayor resolución, empleándose

en el análisis simultáneo de más de 30 plaguicidas, entre ellos p,p´-DDE, p,p´-DDD y p,p´-DDT

[Fernández-Alvarez et al., 2008].

78

3.2.1.2 Ionización de llama (FID)

Es el detector más común y por lo general, uno de los más aplicables en GC. Cuando los compuestos

eluyen de la columna son quemados en una llama de hidrógeno (Figura 3.13). Un potencial es aplicado

(300 V) por encima de la llama entre el extremo del quemador y un electrodo colector, de tal manera

que en la zona de la llama existe corriente eléctrica que se modificará si hay formación de iones en el

medio. Los iones son producidos cuando los analitos se pirolizan en la llama; el número de iones será

proporcional a los átomos de carbono presentes en la muestra (Figura 3.13).

Figura 3.13 Detector de ionización de llama (FID). Modificado de Qian et al. [2010]

El detector FID no es sensible a compuestos con halógenos porque no se generan o se generan muy

pocos iones en la llama; sin embargo, Engelmann et al. [2003] lo usaron en el análisis del DDT y

bifenilos policlorados. La detección se logró previa desclorinación de los analitos en presencia de

hierro, magnesio y pequeñas cantidades de paladio (menos de 0.1%), de tal manera que los compuestos

que llegan a la llama pudieran pirolizarse e ionizarse ya sin la presencia del cloro. Los resultados

experimentales reflejaron que este método tiene ventajas sobre los métodos 8081 y 8082 de la EPA en

cuanto a exactitud y precisión.

79

3.2.1.3 Espectrometría de masa por ionización electrónica (MS-EI)

Es un detector universal con límites de detección muy inferiores a cualquier otro método; está basado

en el análisis de masa de iones del analito en fase gaseosa, los cuales fueron previamente formados por

una corriente de electrones (70 eV), y en la determinación de las relaciones masa/carga de los iones

generados (m/z), siendo m = masa del ion proveniente del analito y z = carga del ión. Un espectrómetro

de masas es un instrumento que mide la relación m/z de los iones formados a partir de la sustancia en

análisis, e incluye los siguientes elementos (Figura 3.14):

a. Una fuente de iones donde la muestra es transformada a fase gaseosa, las moléculas son ionizadas

y los iones se descomponen (fragmentan).

b. Un analizador capaz de clasificar los iones de acuerdo a su relación m/z.

c. Un detector que cuantifica los iones para cada valor de m/z.

d. Un dispositivo de registro que procesa la señal y visualiza el espectro.

e. Un sistema de calibración para correlacionar la cantidad medida con la relación m/z.

Figura 3.14 Componentes del espectrómetro de masas

Los resultados son espectros de masa característicos para un grupo de compuestos o grupos

funcionales, que hacen posible una identificación completa del analito. En el Cuadro 3.3 se presentan

los iones característicos del DDT y sus metabolitos; estos iones son generalmente formados y sirven

80

para su identificación inequívoca. Los datos subrayados se refieren a los iones usados en la

cuantificación del analito.

Cuadro 3.3. Iones característicos del DDT y sus productos de degradación formados en MS por EI

Compuesto Ion molecular

m/z

Iones característicos

m/z

Referencias

o,p´-DDD 320.1 237, 235, 199, 165 Manirakiza et al., 2002; Basheer et

al., 2002; Zambonini et al., 2002; Al-

Saleh et al., 2002; Valsemaki et al.,

2006; Sánchez-Brunete et al., 2008;

Lehnik-Habrink et al., 2010 ; Baugros

et al., 2008

p,p´-DDD 320.1 237, 235, 237.165,

o,p´-DDE 318.1 248, 246,

p,p´-DDE 318.1 246, 248, 176, 316, 318

o,p´-DDT 354.5 237, 235, 165

p,p´-DDT 354.5 237, 235, 165.176 Los datos en subrayados se refieren a los iones usados en la cuantificación del analito.

Diversas estrategias para incrementar la selectividad del detector de masa, se han usado en el análisis

de compuestos organoclorados [Gonçalves y Alpendurada, 2004; Hayward y Wong, 2009], como la

selección de un ión determinado para generar otro espectro de masa (MS/MS masa/masa), el cual es

característico del compuesto en cuestión. Por ejemplo, se selecciona el ión m/z 235 del o,p´-DDE y se

aplica de nuevo energía para lograr que se fragmente y origine otro espectro de masa (Figura 3.15), en

el cual se observará el ión mayoritario m/z 176 que es característico del compuesto [Wang et al., 2008].

La probabilidad de que se genere el mismo patrón (mismos iones en iguales proporciones) para dos

compuestos diferentes en análisis MS/MS es prácticamente nula a niveles traza, aún en presencia de

interferencias.

Figura 3.15 Espectros de masa (MS) y masa/masa (MS/MS) del o,p´-DDE. Modificado de Wang et al.

[2008]

Las estrategia de monitorear fragmentos específicos como los análisis MS/MS, SIS (Selected Ion

Storage) y SIM (Selected Ion Monitoring) resultan en mejorar la especificidad, selectividad y exactitud

en la determinación del DDT y sus metabolitos. El uso de los modos SIS en comparación con el

análisis del espectro total de iones (Full Scan), provocó una disminución en el nivel de detección del

p,p´-DDT de 0.013 a 0.002 g/L (Gonçalves y Alpendurada, 2004). Los patrones de masas para una

81

gran cantidad de compuestos existen en bibliotecas que acompañan el software del equipo de masas, y

hacen muy práctica la identificación del analito. Por ejemplo, en el cromatograma de un análisis GC-

MS/MS de plaguicidas organoclorados, no se sabe qué compuesto es el marcado con una flecha

(Figura 3.16); entonces, este compuesto se selecciona para volver a ser energizado y observar su patrón

de fragmentación (Figura 3.16A, debajo del cromatograma); el patrón (Figura 3.16B) se busca en la

biblioteca y coincide con el correspondiente a la fragmentación del p,p´-DDE, por lo tanto, el pico del

cromatograma ha sido identificado sin necesidad de una sustancia de referencia [Tahboub et al., 2005].

Figura 3.16 Cromatograma de una mezcla de plaguicidas organoclorados (superior), (A) espectro de

masa del pico no identificado (↓) y (B) espectro de masa del p,p´-DDE obtenido de la

librería del software. Modificado de Tahboub et al. [2005]

3.2.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR)

La muestra es inyectada al sistema cromatográfico donde es separada en sus componentes a través de

su paso por una columna gracias al flujo de la fase móvil. La separación de los plaguicidas

organoclorados ocurre esencialmente por el mecanismo de partición entre el soporte de la columna

(fase estacionaria) y la fase móvil, porque se utilizan columnas de fase reversa. Cuando la muestra sale

de la columna, entra al detector donde es analizada para generar posteriormente el cromatograma

(Figura 3.17).

82

Esta técnica de separación es usada ampliamente en el análisis de una gran cantidad de contaminantes,

pero no en el análisis de compuestos organoclorados como el DDT, lo que se revisará más adelante.

Figura 3.17 Sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR)

Existen solo algunos reportes del uso de CLAR en el análisis del DDT y sus productos de degradación;

entre ellos se encuentra el análisis de p,p´-DDT, o,p´-DDT, p,p´-DDE y p,p´-DDD provenientes de

grasas animales, donde los analitos fueron extraídos en MSPD (Matrix Solid-Phase Dispersion). En el

sistema CLAR se usó una columna C1-metil-SiO2, una fase móvil de etanol acuoso (47%), detector

UV ( 231-245 nm), y volumen de inyección de 20 µL [Furusawa, 2005]. En el análisis de los

mismos compuestos se han usado las columnas C18 (150 x 4.6 mm), con fase móvil de metanol-agua y

detección en UV [Zhou et al., 2006b; Zhou et al., 2007; 2009; Vega et al. 2008b].

El acoplamiento en línea al cromatógrafo de líquidos del sistema de extracción SPE o SPME, se ha

reportado en el análisis del DDT y sus metabolitos [Zhou et al., 2006a; Torres-Padrón et al., 2006]. Un

ejemplo es el análisis de una mezcla de 6 plaguicidas organoclorados (p,p´-DDD, p,p´-DDT, p,p´-

DDE, o,p´-DDT, aldrin y dieldrin). La fibra de la SPME con los analitos sorbidos, se acopló en línea al

sistema cromatográfico; después de un tiempo de desorción de 8-10 minutos y a temperaturas de 45 a

50°C, dependiendo del recubrimiento de la fibra, la muestra se dirige a la columna C18 para su

separación. La detección se efectuó a dos longitudes de onda (), porque el máximo de absorción (max

83

= 238 nm) del DDT y sus análogos es diferente al correspondiente del aldrin y dieldrin (max = 220

nm). En la Figura 3.18 se observan ambos cromatogramas [Torres-Padrón et al., 2006].

Figura 3.18 Cromatograma de una mezcla de plaguicidas organoclorados analizados en una columna

C18. 1 = p,p´-DDD; 2 = dieldrin; 3 = p,p´-DDT; 4 = o,p´-DDT; 5 = p,p´-DDE; 6 = aldrin. a)

= 238 nm; b) = 220 nm. Modificada de Torres-Padrón et al. [2006]

La baja aplicación del CLAR en el análisis de plaguicidas, es debido a que las muestras ambientales

requieren la determinación simultánea de un gran número de contaminantes, existiendo métodos que

funcionan para la detección simultánea de hasta 33 plaguicidas [Baugros et al., 2008]. La CLAR con

detectores de ultravioleta o arreglo de diodos, no puede ser usada para detectar tantos compuestos de

diferentes estructuras moleculares y, por lo tanto, con diferentes máximos de absorción, a menos que

solo se busque un grupo de compuestos que compartan el mismo máximo de absorción, como en la

determinación del DDT y sus metabolitos [Bai et al., 2009]. La detección es más versátil con detectores

ECD y MS, razón por la que la GC-ECD y GC-MS son las técnicas preferidas para el análisis del DDT

y sus metabolitos.

3.2.2.1 Detector de UV

Los detectores más simples son fotómetros de filtro con una lámpara de mercurio como fuente. En el

detector de UV, la luz UV es dirigida hacia una celda donde la muestra llega de la columna (Figura

3.19) y ocurre la absorción de luz. La luz no absorbida es dirigida hacia un transductor de señal para

obtener el cromatograma correspondiente. Lo más común es el trabajo con longitudes de onda de 254

nm; sin embargo, en el caso del DDT y sus metabolitos, se trabaja en el máximo de absorción de 238

nm [Zhou et al., 2006a; Torres-Padrón et al., 2006].

84

Figura 3.19 Celda de cuarzo de un detector de UV en el análisis CLAR

3.2.3 Métodos inmunoenzimáticos

Los inmunoensayos son técnicas analíticas basadas en la especificidad y alta afinidad de anticuerpos

con antígenos particulares. En un inmunoensayo, los antígenos y anticuerpos son usados como

moléculas blanco o moléculas que capturan. En otras palabras, un antígeno en particular puede ser

usado para capturar su anticuerpo específico, o un anticuerpo específico puede ser usado para atrapar

un antígeno en una muestra. Un antígeno es una molécula que induce la formación de anticuerpos y se

puede unir a ellos. Los anticuerpos son inmunoglobulinas (Ig), proteínas producidas por animales en

respuesta a un antígeno, secretados por las células B activadas del sistema inmune que se unen a los

antígenos responsables de su inducción. Generalmente, una molécula deberá ser mayor a 5000 Daltons

para percibirse como un antígeno en el sistema inmune de los mamíferos. Sin embargo, muchas de las

moléculas analizadas en los alimentos o muestras ambientales son pequeñas, y para inducir la

formación de anticuerpos específicos que reconozcan y se unan a pequeñas moléculas blanco

(hapteno), se deberá unir covalentemente otra molécula de alto peso molecular o proteína acarreadora

antes de usarse como inmunógeno. El hapteno unido a la proteína acarreadora es llamado antígeno

conjugado. Acarreadores típicos son la albúmina y las hemocianinas. Cualquier inmunoensayo que use

una enzima marcada para revelar la unión antígeno-anticuerpo primaria es llamado inmunoensayo

enzimático y un tipo de este ensayo es el ensayo de la enzima unida a un inmunosorbente o ELISA

(Enzime-Linked Immuno-Sorbent Assay). El ensayo ELlSA involucra la unión de un anticuerpo o

antígeno soluble a un soporte sólido (inmunosorbente), típicamente en una placa de 96 pozos y las

moléculas unidas, las moléculas no unidas pueden ser separadas por lavado. Las enzimas más usadas

son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano. El protocolo ELISA comprende: a) soporte del

anticuerpo o antígeno sobre una fase sólida, b) bloqueo de la superficie no cubierta en la fase sólida

85

con un regulador que contienen una proteína no específica como la albúmina sérica bovina (para

minimizar las interacciones no especificas y proteger el antígeno o anticuerpo de la desnaturalización),

c) incubación con diferentes reactivos del inmunoensayo a tiempos y temperaturas determinados, d)

lavado de la superficie cubierta para separar moléculas no unidas y libres, de las moléculas unidas y e)

detección del desarrollo de color. El formato general del ensayo ELISA o tipo doble capa se muestra en

la Figura 3.20 [Peggy-Hsieh, 2010].

Figura 3.20 Formato del ensayo ELISA tipo doble capa. Modificado de Peggy-Hsieh [2010]

Todos los inmunoensayos pueden ser detectados de manera directa o indirecta; en el ensayo directo, la

enzima marcada está directamente unida a la molécula de detección primaria y mayor cantidad de

reactivos inmuno purificados son necesarios en el procedimiento de conjugación de la enzima.

Mientras, que en el ensayo indirecto se usa un intermediario comercial, que está unido a la molécula de

captura, con una molécula secundaria conjugada con la enzima. Este ensayo requiere menos inmuno

reactivos y un paso adicional con respecto al modo directo, pero puede ser más sensible. Ambos

ensayos pueden ser competitivos y no competitivos, el inmunoensayo competitivo se usa para

pequeñas moléculas y el desarrollo de color tiene una relación inversa con la cantidad de antígeno

presente en la muestra (Figura 3.21) [Peggy-Hsieh, 2010].

86

Figura 3.21 Relación del incremento de color en los inmunoensayos competitivo y no competitivo.

Modificado de Peggy-Hsieh [2010]

Hochel et al. [2003] reportan el análisis del DDT mediante el inmunoensayo enzimático competitivo

indirecto (ELISA en dos etapas) usando los conjugados: ácido 4-{4-[1-(4-clorofenil)-2,2,2-

tricloroetil]fenil}butanóico-albúmina sérica bovina (BSA-DDT5) como inmunógeno y ácido 4-{4-[1-

(4-clorofenil)-2,2,2-tricloroetil]fenil}butanóico-ovoalbúmina (OVA-DDT5) como el antígeno unido (a

la superficie del plástico). La detección se efectúo por quimioluminiscencia, en donde los límites de

detección y cuantificación fueron 0.3 y 4.2 nmol/L, respectivamente. Se observó reactividad cruzada

con el p,p´-DDE (186%) y el metoxiclor (36%), así como interacciones débiles con el o,p´-DDT, p,p´-

DDD y o,p´-DDD (Figura 3.22).

Primera etapa ELISA

Antígeno (Ag) ausente en la muestra

Ag + Ab1 E Ag Ab1 E

Antígeno presente en la muestra

Ag + Ab1 E Ag Ab1 E+ Agm Agm+

Segunda etapa ELISA

Antígeno (Ag) ausente en la muestra

Ag + Ab1 Ag Ab1+ Ab2 E Ag Ab1 Ab2

E

Antígeno presente en la muestra

Ag + Agm Ag + Ab1 Ag Ab2E+ Ab1

Agm + Ag

Figura 3.22 Etapas del inmunoensayo competitivo indirecto para la determinación de DDT. -Ag =

antígeno unido; Ags = antígeno libre; Ab1-E = anticuerpo del antígeno marcado con la

enzima; Ab1 = anticuerpo antiAg; Ab2-E = anticuerpo anti Ab1 marcado con la enzima.

Modificado de Hochel et al. [2003]

87

En el análisis del p,p´-DDT, p,p´-DDE, p,p´-DDD y o,p´-DDT usando el ensayo inmunoenzimático

competitivo (ELISA), se reporta la detección electroquímica mediante el uso de una celda transductora

de capa fina para cromatografía electroquímica [Valentini et al., 2003], así como polarización de

fluorescencia, que monitorea los cambios en el tamaño aparente de moléculas que son inherentemente

fluorescentes o marcadas con reveladores fluorescentes [Eremin et al., 2002].

En la cuantificación de p,p´-DDT, p,p´-DDE y p,p´-DDD en muestras de suelo mediante análisis

inmunoenzimático competitivo (ELISA), se usó el kit comercial EnviroLogix DDT Plate Kit® y los

resultados se compararon con los obtenidos mediante análisis GC-ECD. Se observó una buena

correlación entre ambos resultados y se concluyó que la técnica del inmunoensayo es tan confiable

como la GC-ECD para analizar los residuos de estos plaguicidas, además de ser económica y rápida

[Bashour et al., 2003] (Figura 3.23).

Figura 3.23 Correlación de las cuantificaciones de DDT efectuadas mediante ELISA y GC-ECD.

Modificado de Bashour et al. [2003]

Inmunoensayo enzimático competitivo directo (EIA)

Una variable en estos ensayos es el tipo de anticuerpo, si se usan anticuerpos del suero de un animal,

existirán diferentes anticuerpos que unen diferentes epítopes sobre el antígeno. Esta colección de

diferentes anticuerpos son llamados anticuerpos policlonales. Mientras que los anticuerpos

monoclonales son idénticos y tienen solo un epítope o un solo tipo de sitio de unión con el antígeno. Se

conoce como epítope a la región externa y específica del antígeno a la que se une el anticuerpo y el

DDT es una molécula pequeña con un PM < 5000 Daltons y representa un solo epítope o parte de él. El

inmunoensayo competitivo fue desarrollado para resolver el problema observado en el ELISA, en

donde se requieren dos epítopes diferentes para los dos anticuerpos que participan; el libre y el unido a

88

la enzima. El formato de este ensayo en su modalidad de antígeno unido a la superficie del plástico se

muestra en la Figura 3.24. En esta modalidad de ensayo, se crea una competencia entre el hapteno

unido a la enzima y las pequeñas moléculas de antígeno presentes en la muestra. Después del lavado

final, el desarrollo de color determinará la cantidad de enzima unida al hapteno y existirá una relación

inversa del desarrollo de color y la cantidad de las pequeñas moléculas que funcionan como antígenos.

Figura 3.24 Formato de inmunoensayo competitivo. Modificado de Peggy-Hsieh [2010]

En el inmunoensayo competitivo directo (EIA) para cuantificar el DDT, Hirano et al. [2008]

prepararon el conjugado del hapteno marcado que se muestra en la Figura 3.25. Para generar los

anticuerpos policlonales, el p,p´-DDT fue conjugado con tiroglobulina porcina para inmunizar conejo.

Las IgG obtenidas se usaron como los anticuerpos unidos a la pared del plástico.

CCl3

Cl Cl

HN

CO(CH2)2CO-Arg-Arg-NHNHCO(CH2)3CH2

S

HN

HN

O

Figura 3.25 Estructura del antígeno marcado con biotina [Hirano et al., 2008]

La curva estándar en este ensayo fue de 0.137 a 100 ng/mL y los límites de cuantificación de 0.41

ng/mL. Los porcentajes de recuperación fueron del 105.13-118.48% y los coeficientes de variación de

5.42-10.53%. No se observó reactividad cruzada con los metabolitos del DDT: o,p´-DDT, p,p´-DDD,

o,p´-DDD, p,p´-DDE, o,p´-DDE, p,p´-DCB (diclorobenzofenona) o o,p´-DCB [Hirano et al., 2008].

89

Una aplicación adicional que tienen las técnicas inmunoenzimáticas, es el desarrollo de un sensor

reusable para monitorear contaminantes-orgánicos-persistentes, entre ellos el DDT. Se basa en el

formato de inhibición de la unión donde se usan dos anticuerpos monoclonales con diferente

selectividad, y la detección es mediante resonancia de plasmón superficial, el cual es un método para el

análisis cinético de las interacciones entre antígenos peptídicos y anticuerpos monoclonales

inmovilizados. Los límites de detección observados para el DDT fueron en el rango de los ng/L

[Mauriz et al., 2007].

3.2.4 Otros métodos

3.2.4.1 Método enzimático

Una glutatión-S-transferasa (GST) del mosquito Aedes aegypti (aagste2) fue seleccionada en el campo,

como una enzima de resistencia metabólica de este vector parásito. La enzima se usó para producir un

ensayo altamente específico en la determinación de DDT. La detección se basa en el cambio de pH que

ocurre en un sistema regulador apropiado por la liberación de H+, durante la reacción de

deshidrocloración catalizada por la enzima (aagste2) y es monitoreada con un potenciómetro o

colorímetro en presencia de un indicador de pH (Figura 3.26). El límite teórico de detección del ensayo

resultó de 3.8 g/mL y el rango lineal de cuantificación fue de 12 a 250 g/mL. Este método no

reconoce los análogos biológicamente inactivos (como insecticidas) o los principales productos de

fotodegradación, y es altamente específico para el p-p‟-DDT. El biosensor fue validado con un gran

número de paños de limpieza usados en superficies rociadas con DDT y se encontró que es un método

confiable y reproducible como la CLAR (coeficiente de correlación de 0.98) [Morou et al., 2008].

90

Figura 3.26 Ensayo de cambio de pH basado en la recombinante GST para la determinación de DDT.

Modificado de Morou et al. [2008]

3.2.4.2 Electroforesis micelar

La cromatografía electrocinética capilar micelar (MEKC,Micellar ElectroKinetic Chromatography)

utiliza un campo eléctrico como fuerza directora para la migración de analitos, de una manera similar a

la electroforesis capilar de zona, la diferencia es que los analitos son particionados entre la fase acuosa

y una fase micelar (fase pseudoestacionaria). En la electroforesis capilar, la instrumentación consiste de

un tubo capilar con los extremos sumergidos en una solución reguladora y cada solución reguladora

contiene un electrodo, un detector y un sistema de adquisición de datos. En el caso de MEKC, la

solución reguladora es una solución micelar y se pueden separar compuestos iónicos y no iónicos al

mismo tiempo. Esto sucede porque el orden de migración de los compuestos no iónicos, y algunas

veces los iónicos, está determinado por el grado de interacción entre micelas y analitos. El mecanismo

de separación es más parecido a CLAR en fase reversa que a la electroforesis, con la ventaja de que en

MEKC se pueden alcanzar más de 100,000 platos teóricos para la mayoría de los compuestos

analizados. El mecanismo de separación se muestra en la Figura 3.27; un surfactante iónico se disuelve

en una solución reguladora, a una concentración mayor que la concentración micelar crítica para que

forme micelas, las cuales contendrán, en el caso de dodecilsulfato de sodio, aproximadamente 60

moléculas. Las micelas se dirigirán hacia el electrodo positivo (Ánodo) mediante electroforesis y

debido a la carga negativa de la pared interna de la sílica, el flujo electro osmótico (flujo del disolvente

debido a los desplazamientos de los iones solvatados bajo los efectos del campo y de las cargas) será

en dirección al cátodo.

91

Figura 3.27 Mecanismo de separación en MEKC. Modificado de Matsubara y Terabe [1996]

La adecuada manipulación de las polaridades en los extremos del tubo, puede concentrar las micelas en

un extremo del tubo y entonces comenzar la separación del analito con el flujo electro-osmótico y de

electroforesis en un solo sentido [Matsubara y Terabe, 1996]. Esta técnica se aplicó al análisis de agua

potable para la cuantificación de p,p´-DDT, p,p´-DDE y 12 plaguicidas más, los cuales fueron

previamente extraídos mediante SPE. El sistema de detección fue UV a una longitud de onda de 202

nm. Se observó repetitividad en los tiempos de migración y en las áreas de los picos con una

desviación estándar de 0.66 a 13.6% [Fung y Mak, 2001].

Siglas, abreviaturas y acrónimos

ASE (Accelerated Solvent Extraction), Extracción acelerada con disolvente

CLAR Cromatografía de líquidos de alta resolución

DLLME (Liquid Dispersive Liquid Phase MicroExtraction), Microextracción dispersiva en fase

líquido-líquido iónico

ECD (Electron Capture Detector), Detector de captura de electrones

EG (Expanded Graphite), Grafito expandido

EIA (Enzyme ImmunoAssay), Inmunoensayo enzimático

ELISA (Enzime-Linked ImmunoSorbent Assay), Ensayo inmunosorbente unido a enzima

FID (Flame Ionization Detector), Detector de ionización de llama

GC (Gas Chromatography), Cromatografía de gases

92

HF-LPME (Liquid-Phase Hollow Fibre Membrane Microextraction), Microextracción en fase

líquida en fibra hueca

HS-SPME (Head Space Solid Phase MicroExtraction), Microextracción headspace en fase sólida

LLE (Liquid-Liquid Extraction), Extracción líquido-líquido

MAE (Microwave Assisted Extraction), Extracción asistida con microondas

MAME (Microwave-Assisted Micellar Extraction), Extracción micelar asistida por microondas

MEKC (Micellar ElectroKinetic Chromatography), Cromatografía electrocinética capilar

micelar

MMSPE (Microporous Membrane Solid-Phase Extraction), Extracción en membrana

microporosa en fase sólida

MS (Mass Spectrometry), Espectrometría de masas

MS-EI (Mass Spectrometry-Electron Impact), Espectrometría de masas por ionización

electrónica

MSPD (Matrix Solid-Phase Dispersion), Extracción por dispersión en matriz de fase sólida

MWNT (Multi-Walled Carbon NanoTubes), Nanotubos de carbono de paredes múltiples

PDMS (PolyDiMethylSiloxane), Polidimetilsiloxano

PMPS-OH (Hydroxyl-terminated PolyMethylPhenylSiloxane), Polimetilfenilsiloxano-hidroxilado

PSWE (Pressurized Subcritical Water Extraction), Extracción con agua subcritical presurizada

QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), Método rápido, fácil, económico,

efectivo, robusto y seguro para la extracción de pesticidas

SBSE (Stir Bar Sorptive Extraction), Extracción sortiva con agitación de barra

SPE (Solid Phase Extraction), Extracción en fase sólida

SPME (Solid Phase MicroExtraction), Microextracción en fase sólida

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