monografía de grado cjrm - uso del glifosato en cultivos
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USO DEL GLIFOSATO EN CULTIVOS AGRÍCOLAS E ILÍCITOS:
IMPACTO EN LA MICROBIOTA DEL SUELO A MEDIDA QUE AUMENTA LA TASA DE APLICACIÓN
AUTOR:
CARLOS JOSE RODRIGUEZ MANTILLA
DIRECTORA:
Ph.D., JENNY DUSSÁN GARZÓN
PROFESORA ASOCIADA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTA D.C., COLOMBIA
2020
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USO DEL GLIFOSATO EN CULTIVOS AGRÍCOLAS E ILÍCITOS: IMPACTO EN LA MICROBIOTA DEL SUELO A MEDIDA QUE AUMENTA LA
TASA DE APLICACIÓN
AUTOR:
CARLOS JOSE RODRIGUEZ MANTILLA
DIRECTORA:
Ph.D., JENNY DUSSÁN GARZÓN
PROFESORA ASOCIADA
Monografía presentada como requisito para optar al título de:
Biólogo
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTA D.C., COLOMBIA
2020
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AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer especialmente a mi familia, quienes me acompañaron en el
desarrollo de este trabajo y me infundieron tranquilidad y ánimo en los momentos
más críticos. Agradezco también profundamente a mi directora, la profesora Jenny
Dussán Garzón, quien me brindó asesoría a lo largo de todo este proceso.
Finalmente, agradezco la ayuda de mis amigos, quienes en múltiples ocasiones me
apoyaron en la realización de este trabajo. A todos gracias.
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RESUMEN
Los herbicidas a base de glifosato (HBGF) se encuentran entre los agroquímicos
más comunes y ampliamente utilizados a nivel global. En países como Colombia,
su uso no se ha limitado exclusivamente para el control de malezas en cultivos
agrícolas de pequeña y gran escala; históricamente, también se han empleado en
los programas de fumigación aérea para la erradicación de cultivos ilícitos. Frente a
la aplicación intensiva del glifosato (GF) en la agricultura y la posible reanudación
de la aspersión aérea con GF como parte de la estrategia integral para combatir el
narcotráfico, surgen numerosos interrogantes sobre el peligro que supone la
acumulación del GF en el ambiente y sus posibles efectos directos o indirectos en
los microorganismos del suelo. El propósito del presente trabajo es realizar una
revisión crítica de la literatura científica reciente sobre el uso del GF y sus diferentes
efectos sobre la microbiota en suelos agrícolas. Nuestras principales conclusiones
de este estudio son: (1) el impacto adverso del GF puede ser mayor en las
comunidades microbianas del suelo a medida que aumenta la tasa de aplicación;
(2) los HBGF pueden causar alteraciones en las defensas fisiológicas de las plantas,
haciendo que estas sean más susceptibles a enfermedades transmitidas por el
suelo; (3) los HBGF tienen el potencial de la alterar la ecología de las comunidades
microbianas, al promover el crecimiento de fitopatógenos y en suprimir
microrganismos benéficos del suelo; y (4) la aplicación intensiva de HBGF ha
provocado la emergencia de microorganismos resistentes al glifosato, con la
probabilidad de también desarrollar mecanismos de resistencia a los antibióticos.
Palabras clave: glifosato, AMPA, suelo, comunidad microbiana, biodegradación.
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TABLA DE CONTENIDOS
1. Introducción
2. Aplicación en Agricultura: Características Generales y Contexto Histórico
2.1. Características Generales del Glifosato y Modo de Acción
2.2. Contexto Histórico del Glifosato en la Agricultura Mundial
2.3. Problemática en Colombia: Erradicación de Cultivos Ilícitos
3. Presencia del Glifosato en el Suelo y Vías de Biodegradación
3.1. Destino del Glifosato en el Suelo: Adsorción, Mineralización y Lixiviación
3.2. Vías de Biodegradación del Glifosato
4. Efecto del Glifosato en los Microorganismos del Suelo
4.1. Cambios en la Estructura de las Comunidades Microbianas
4.2. Impacto en la Funcionalidad de las Comunidades Microbianas
5. Resistencia Microbiana al Glifosato y a los Antibióticos
6. Propuesta experimental
7. Discusión y Conclusiones
Referencias
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1. Introducción
Los herbicidas, son una amplia clase de compuestos fitotóxicos empleados para el
control de especies de plantas invasoras o indeseadas. Esto ocurre, a través de
mecanismos de acción que interfieren con procesos críticos fisiológicos en sitios
blanco de las plantas, los cuales, pueden llegar a comprometer la supervivencia o
el crecimiento regular vegetal (Duke, 2012). El glifosato [N-fosfonometilglicina], es
un ingrediente activo en formulaciones de herbicidas comerciales, aplicado
principalmente para la eliminación post-emergente de malezas anuales o perennes
que se encuentran próximos a cultivos (Singh & Singh, 2016; Zhan et al., 2018).
El mecanismo de acción fundamental del glifosato reside en la inhibición de la
enzima 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) perteneciente a la ruta
del ácido shikímico, el cual es requerido para la biosíntesis de amino ácidos
aromáticos y de metabolitos secundarios (van Bruggen et al., 2018). Aunque la
actividad biocida del glifosato es dirigida a plantas, la literatura demuestra que esta
ruta biosintética también está presente en algunos microorganismos, como
bacterias y hongos (Guijarro et al., 2018; Lane et al., 2012; Newman et al., 2016;
van Bruggen et al., 2018). Esto indica que el herbicida, además de su naturaleza no
selectiva (Benbrook, 2016), también puede tener efectos en el medio ambiente
afectando a especies no objetivo sensibles a este compuesto (Annett et al., 2014;
Kurenbach et al., 2018; Myers et al., 2016; Zabaloy et al., 2012; Zhan et al., 2018).
Los herbicidas a base de glifosato se encuentran entre los agroquímicos más
comunes y ampliamente utilizados a nivel global (Annett et al., 2014; la Cecilia &
Maggi, 2018). Desde la introducción del glifosato por primera vez en 1974, se
reportó que para el 2014, el volumen total de aplicación del herbicida en la
agricultura mundial fue de 747 millones de kg, y sólo en el sector agrícola de EE.UU.,
el volumen total aplicado fue de 114.4 millones de kg (Singh & Singh, 2016).
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Aunque a nivel internacional el uso del glifosato se ha centrado en torno a la
agricultura, en Colombia, se ha extendido la utilización del herbicida para la
erradicación de cultivos ilícitos (Camacho & Mejía, 2017; Oldham & Massey, 2002).
En el 2000, se implementó un acuerdo bilateral entre los gobiernos de Colombia y
Estados Unidos denominado “Plan Colombia” (Camacho & Mejía, 2017; Oldham &
Massey, 2002). Uno de los principales objetivos de esta iniciativa, fue la ejecución
de un programa antinarcóticos utilizando la aspersión aérea con glifosato, como la
estrategia fundamental para la erradicación de cultivos de coca (Erythroxylum coca
y E. novogranatense) (Oldham & Massey, 2002; Solomon et al., 2009). Se estima
que durante el Plan Colombia, el promedio de fumigación anual de cultivos ilícitos
fue de 128.000 hectáreas anuales; y para el 2006 se alcanzó un pico de 172.000
hectáreas fumigadas (Camacho & Mejía, 2017). Un problema asociado a la
estrategia de fumigación área es que se requiere una formulación de glifosato
distinta a la formulación comercial común para la agricultura; siendo
considerablemente más alta en tasa y concentración con respecto al uso estándar
de glifosato (Oldham & Massey, 2002).
El éxito comercial del glifosato es posible atribuirlo a la combinación de diferentes
aspectos: su eficacia como herbicida sistémico de amplio espectro, el desarrollo de
variedades de cultivos resistentes al glifosato y la tendencia a evitar o minimizar la
labranza en operaciones agrícolas (Duke, 2012; Gilbert, 2013). En conjunto, estos
factores favorecieron que el glifosato fuera adoptado rápidamente en la agricultura
moderna como el herbicida preferente para la remoción de malezas (Annett et al.,
2014; Cerdeira & Duke, 2006; Gilbert, 2013).
El aumento acelerado en la demanda y el uso del glifosato para la producción
agrícola, tanto en países industrializados como en vía de desarrollo (van Bruggen
et al., 2018); han ocasionado el surgimiento de numerosos interrogantes sobre el
peligro que supone la acumulación del glifosato en el ambiente y sus posibles
efectos secundarios en los organismos (Singh & Singh, 2016). Algunas fuentes
considerables de contaminación ambiental por glifosato son por causa de
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inadecuadas prácticas en el manejo del herbicida (Myers et al., 2016). Entre estos,
se encuentran la aplicación de glifosato por encima de los límites recomendados de
las tasas en campo (Druille et al., 2016) o debido a la aplicación repetitiva
anualmente del herbicida en sistemas agrícolas (Zabaloy et al., 2012). De esta
forma, cantidades significativas de glifosato caen y penetran a los suelos en
diferentes fases del ciclo de cultivo, afectando la microbiota nativa (Druille et al.,
2016; Guijarro et al., 2018; Lane et al., 2012; Newman et al., 2016; Nguyen et al.,
2016; Zabaloy et al., 2012).
Numerosos estudios han reportado que la exposición con glifosato puede tener un
impacto sobre la calidad del suelo y sus comunidades microbianas (Guijarro et al.,
2018; Newman et al., 2016). Por un lado, el glifosato puede influir en cambios sobre
la composición, diversidad y la actividad de los microorganismos del suelo (Druille
et al., 2016; la Cecilia & Maggi, 2018; Newman et al., 2016; Nguyen et al., 2016).
Las alteraciones sobre las comunidades microbianas pueden desestabilizar la
funcionalidad de los servicios ecosistémicos que cumplen en el suelo; como son los
procesos biogeoquímicos de la descomposición de la materia orgánica y el ciclado
de nutrientes (Gilbert, 2013). Por otro lado, la extensa presión de selección que ha
ejercido el glifosato, a raíz de ser el método principal para el control de malezas
(Cerdeira & Duke, 2006; Duke, 2012; van Bruggen et al., 2018), ha exacerbado la
evolución de mecanismos de resistencia al glifosato en microorganismos y en
plantas (Kurenbach et al., 2018; van Bruggen et al., 2018), e incluso, ha influido
indirectamente en la evolución de la resistencia a antibióticos en microorganismos
de importancia clínica (Kurenbach et al., 2018; van Bruggen et al., 2018).
Este trabajo presenta una revisión crítica de la literatura científica reciente sobre el
uso del glifosato y sus diferentes efectos sobre la microbiota en suelos agrícolas.
Además de enriquecer el estado del arte sobre los riesgos ambientales derivados
del uso de herbicidas a base de este compuesto, el propósito de la monografía es
poder plantear una posición con respecto al impacto en la microbiota cuando se
utilizan las tasas de aplicación de glifosato en cultivos lícitos, de tal suerte, que se
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puedan predecir las consecuencias que posiblemente se deriven cuando se utilicen
estas tasas de glifosato en cultivos ilícitos. En nuestro conocimiento, no hay
información disponible en la literatura sobre esta problemática, por lo que surge la
necesidad investigativa de evaluar los efectos ambientales potenciales derivados
de la aplicación de glifosato en la erradicación de cultivos ilícitos.
Los objetivos de esta monografía son: (I) revisar el contexto histórico del glifosato
empleado para la erradicación de plantas indeseadas en cultivos lícitos e ilícitos, (II)
analizar el destino ambiental del glifosato en el suelo; (III) precisar los procesos de
biodegradación de glifosato en el suelo por microorganismos; (IV) evaluar los
efectos del glifosato a nivel estructural, funcional y de resistencia (al glifosato y a los
antibióticos) en las comunidades microbianas de suelos agrícolas, (V) plantear un
experimento a futuro para evaluar la adición de Lysinibacillus sphaericus como
agente de biorremediación de GF en la concentración utilizada en fumigación para
la fumigación de cultivos de uso ilícito; y (VI) establecer una posición crítica frente a
los posibles efectos del glifosato sobre la microbiota del suelo, a medida que
aumenta la tasa de aplicación del herbicida en actividades agrícolas y en programas
de erradicación de cultivos ilícitos.
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2. Aplicación en Agricultura: Características Generales y Contexto Histórico 2.1. Características generales del Glifosato y Modo de Acción
El glifosato (GF), es un ácido aminofosfónico de naturaleza polar, cuya actividad
biocida fue descubierta en 1970 por la compañía Monsanto (Benbrook, 2016;
Zabaloy et al., 2012). En 1974, la fórmula comercial de este compuesto químico fue
lanzada al mercado mundial bajo el nombre de “Roundup®” (Annett et al., 2014).
Estos productos herbicidas además de contener GF como el ingrediente activo, son
formulados con agentes surfactantes y otros aditivos para mejorar la absorción del
GF en el follaje de las plantas vasculares (Wang & Liu, 2007).
Generalmente, las principal variable que se considera cuando se realiza la
aplicación de herbicidas a base de glifosato (HBGF) en campo, corresponden a la
tasa1 del producto (Martino, 1988). Sin embargo, hay diversos factores que pueden
afectar la eficacia del GF durante su aplicación foliar, como pueden ser: el tipo de
malezas y su densidad, las características superficiales de las hojas, el volumen de
agua usado, el tamaño de gota, el pH y el tipo de cationes en la solución, y las
condiciones ambientales (Martino, 1988; Wang & Liu, 2007).
En la agricultura, las tasas de aplicación recomendadas en campo2 para el control
post-emergente de malezas anuales o perennes utilizando GF, generalmente
pueden oscilar entre 0.84 y 2.88 𝑘𝑔o𝐿 × ℎ𝑎!" (o también se maneja una
concentración recomendada entre 50 𝑚𝑔 × 𝐿𝑜𝑘𝑔!" y aproximadamente 170
𝑚𝑔 × 𝐿𝑜𝑘𝑔!" por ingrediente activo en el suelo, que representa la concentración
1 En los artículos de investigación se hace referencia a la tasa o dosis de aplicación de GF en campo, bien sea como la cantidad de herbicida por unidad de área de terreno (𝑘𝑔o𝐿 × ℎ𝑎!") o como la cantidad del ingrediente activo (GF) en el suelo (𝑚𝑔 × 𝐿!"𝑜𝑘𝑔!"). 2 Estos valores de aplicación varían según el producto comercial a base de glifosato, y también, según el tipo de maleza a tratar, su altura máxima al momento de ser rociadas, entre otros factores.
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de GF que se aplica en campo en una profundidad de interacción del suelo de 2
mm) (Duke, 2020; Zabaloy et al., 2015). Cuando el GF es asperjado en el follaje, el
compuesto inicialmente se adsorbe a la superficie foliar ya que su naturaleza soluble
le impide penetrar la cutícula cerosa (Martino, 1988; Wang & Liu, 2007). Al
encontrarse el GF en forma de depósitos acuosos sobre la superficie foliar, la
presencia de surfactantes en la mezcla de pulverización contribuyen en mejorar la
absorción del herbicida (Martino, 1988; Wang & Liu, 2007). Por un lado, al reducir
la tensión superficial, aseguran que las gotas de agua con GF estén en mayor
contacto con la cutícula. Por otro lado, retrasan el secado de las gotas por efecto
higroscópico (Wang & Liu, 2007). Se estima que compuestos hidrofílicos como el
GF, pueden atravesar la cutícula por medio de rutas polares que involucran
acuaporinas (Schönherr, 2006) o por efecto de la hidratación de la cutícula por los
surfactantes (Wang & Liu, 2007). Posteriormente, el GF es lentamente absorbido a
través del simplasto celular por mecanismos de difusión pasiva o facilitado por
sistemas de transporte de fosfato (Gomes et al., 2014).
Una vez el GF penetra en las hojas, el agroquímico es translocado por el sistema
vascular hacia sitios metabólicamente activos y en crecimiento, como son los tejidos
meristemáticos (Cakmak et al., 2009; Gomes et al., 2014). En este contexto,
órganos vegetales como nódulos y ápices de raíz y tallo, terminan siendo
considerables sumideros de este compuesto y blancos directos de su fitotoxicidad
(Cakmak et al., 2009). Como se revisará más adelante en el subíndice 3.2, el GF se
puede descomponer en uno de los metabolitos más frecuentes de degradación
conocido como aminometilfosfónico (AMPA), otro compuesto tóxico reconocido
(Reddy et al., 2004; Zhan et al., 2018). Generalmente, el GF es biodegradado en
AMPA por microorganismos en el suelo, pero este proceso también puede ocurrir
de forma similar dentro de las plantas (van Bruggen et al., 2018); por lo que es
factible la concurrencia de ambos compuestos en los tejidos vegetales y de que sus
efectos perjudiciales estén posiblemente ligados (Gomes et al., 2014).
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Es ampliamente reconocido que el mecanismo de acción principal del GF, reside en
la inhibición de la enzima 5-enolpiruvylshikimate-3-fosfato sintasa (EPSPS),
perteneciente al sexto paso de la ruta del ácido shikímico (Tohge et al., 2013; van
Bruggen et al., 2018). Esta ruta metabólica es de gran importancia para la
biosíntesis de aminoácidos aromáticos3 requeridos en la formación de proteínas
(Tzin et al., 2012). Sin embargo, esta ruta también es crucial para la síntesis de
precursores de una extensa variedad de metabolitos secundarios aromáticos que
incluyen alcaloides, glucosinolatos, flavonoides, auxinas, ligninas y compuestos
antibióticos (Gomes et al., 2014; Tohge et al., 2013). Muchos de estos metabolitos
secundarios tienen un papel fundamental en la interacción de la planta con su
entorno, ya que están involucrados en diferentes procesos fisiológicos,
estructurales, y en defensa contra estresores bióticos y abióticos (Gomes et al.,
2014; Tohge et al., 2013). De manera que la inhibición de la enzima EPSPS por
parte del GF, puede a su vez repercutir en la producción de estos compuestos
(Gomes et al., 2014).
En este orden de ideas, los mecanismos que conducen a la muerte de las plantas
no solo están asociados directamente a la inhibición de la enzima EPSPS y su
implicación en la disminución de amino ácidos. Los efectos nocivos que presentan
las plantas tratadas con GF también pueden estar relacionados con efectos
indirectos. Diferentes estudios han reportado que tanto el GF como el AMPA,
pueden tener efectos secundarios sobre procesos fisiológicos como la fotosíntesis,
el metabolismo del carbono y nitrógeno, en nutrición mineral vegetal, en
mecanismos de lignificación, en eventos de estrés oxidativo y en la alteración de las
comunidades microbianas que interactúan con las plantas (microbioma) (Gomes et
al., 2014; van Bruggen et al., 2018; Zobiole et al., 2012).
3 La ruta del ácido shikímico es el encargo de la biosíntesis de corismato, un compuesto precursor de los aminoácidos aromáticos L-triptófano, L-tirosina y L-fenilalanina.
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2.2. Contexto Histórico del Glifosato en la Agricultura Mundial
Desde la introducción del Roundup® en 1974, y durante las siguientes dos décadas,
el herbicida fue utilizado ampliamente para el control de malezas en terrenos
agrícolas o de pastoreo, y en otras actividades no relacionadas con cultivos
extensivos (Benbrook, 2016; Myers et al., 2016). Debido a la acción no selectiva y
de amplio espectro del GF, el uso del producto Roundup® se limitaría a la aplicación
antes de la siembra o pre-emergencia de cultivos tradicionales, después de la
cosecha para la remoción de malezas que crecieron en la temporada tardía, o en
situaciones a pequeña escala donde la aplicación localizada fuera posible (Annett
et al., 2014; Benbrook, 2016; Cerdeira & Duke, 2006). A causa de lo anterior, el
volumen total de GF aplicado a nivel mundial tuvo un crecimiento relativamente lento
hasta mediados de la década de los 90 (Benbrook, 2016).
La popularidad del Roundup® aumentó rápidamente desde 1996, cuando la
compañía Monsanto desarrolló la línea patentada de semillas “Roundup Ready®”
(Myers et al., 2016). Estas semillas corresponden a variedades de cultivos
genéticamente modificados para ser tolerantes a la inhibición por GF; ya que tienen
genes de resistencia a este compuesto transferidos por bacterias, como
Agrobacterium sp. cepa CP4 (gen CP4 EPSPS) y Ochrobactrum anthropi cepa
LBAA (gen GOX), o por origen artificial, producto de técnicas de mutagénesis
dirigido a sitios de EPSPS para alterar el sitio de unión del GF (Annett et al., 2014;
Cerdeira & Duke, 2006; Reddy et al., 2004). Algunos ejemplos notables de semillas
Roundup Ready® liberados al mercado, pertenecen a las variedades de cultivos de
soya, canola, algodón y maíz (Gilbert, 2013; Myers et al., 2016).
Con la adopción global de los cultivos Roundup Ready®, el volumen total de
aplicación de HBGF aumentó aproximadamente 15 veces más en la agricultura
mundial: de 51 millones de kg en 1995 a 747 millones de kg en 2014 (Benbrook,
2016). El aumento en la demanda y uso de HBGF tras el desarrollo de variedades
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de cultivos tolerantes al GF, transformó la manera en que se venía aplicando el
agroquímico en diferentes aspectos.
Primero, el desarrollo de variedades Roundup Ready® llevó a que el GF fuera
asperjado en más hectáreas con presencia de cultivos tolerantes al herbicida. Esto
ocasionó que el área de terrenos tratados con GF se incrementara rápidamente
(Benbrook, 2016). De igual forma, esto posibilitó tasas de aplicación más altas de
GF, ya que los cultivos podían ser asperjados entre 1 y 3 veces más, para así evitar
el crecimiento activo de malezas durante su crecimiento (Benbrook, 2016; Druille et
al., 2016).
Segundo, el uso de cultivos transgénicos permitió que productores y campesinos
depositaran su confianza en la efectividad del GF, como método herbicida
preferente para la remoción de malezas (Duke, 2012; Gilbert, 2013). Históricamente,
para obtener resultados comparables en el control de malezas en cultivos
convencionales, se requería la aspersión de múltiples herbicidas selectivos; de
manera que el volumen total de aplicación combinado solía ser alto y esto, a su vez,
amplificaba la toxicidad ambiental asociado a cada agroquímico utilizado (Duke,
2015). En consecuencia, esta situación favoreció a que el GF reemplazara a otros
herbicidas alternativos, disminuyendo la demanda comercial de estos y su uso
rutinario para el manejo agropecuario (Annett et al., 2014; Gilbert, 2013).
Tercero, el GF facilitó la tendencia a evitar o minimizar la labranza en operaciones
agrícolas (Duke, 2012; Gilbert, 2013). La labranza (específicamente, el arado) es
una práctica en agricultura para preparar el suelo antes de la siembra, a partir del
trazado de surcos profundos en la tierra con ayuda de herramientas tradicionales o
con maquinarias (Busari et al., 2015). El arado se realiza para facilitar la circulación
del aire y del agua en las capas superiores del suelo, y también, para destruir
mecánicamente las malezas (Duke, 2015) Sin embargo, estas operaciones tienden
a generar problemas ambientales relacionados con la erosión de los suelos, la
lixiviación de nutrientes, y a favorecer la escorrentía de agua debido a la
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compactación de la tierra (Benbrook, 2016; Duke, 2015). Por esta razón, prácticas
agrícolas de tipo labranza mínima (o conservacionista) y labranza cero (o siembra
directa), se implementaron como estrategias para proteger las propiedades del
suelo y para llevar acabo la siembra de una forma sostenible (Busari et al., 2015).
Algunos de los principios básicos en este tipo de labranzas incluyen dejar una
cobertura orgánica permanente sobre los campos (p. ej. provenientes de residuos
vegetales de temporadas pasadas), minimizar la perturbación mecánica del suelo,
y procurar la diversificación de plantas sembradas (Busari et al., 2015). Con la
adopción de los cultivos tolerantes al GF en las prácticas de labranza mínima o cero,
el uso de HBGF se volvió más intensivo y frecuente, ya que la remoción mecánica
de las malezas no era una opción en este tipo de operaciones agrícolas (Annett et
al., 2014; Duke, 2015; Gilbert, 2013).
Pese al incremento en la dependencia de HBGF, algunos autores sostienen que la
reducción en la labranza concedida por los cultivos tolerantes al GF tuvo impactos
positivos para el medio ambiente (Duke, 2015). Por ejemplo, la labranza mínima o
cero posibilitó un mayor secuestro de carbono (CO2) en los campos, debido a una
menor alteración de las capas superiores del suelo (como ocurría previamente en
las prácticas de labranza tradicional). De igual forma, hubo una disminución en el
consumo de combustibles fósiles ya que se limitaba la utilización de maquinaría
agrícola. Por último, los altos rendimientos obtenidos con los cultivos tolerantes al
GF, implicaron que posiblemente menos área de zonas naturales fueran convertidas
en terrenos para agricultura (Duke, 2015).
Cuando la compañía Monsanto perdió la patente global del GF en el 2000, cientos
de empresas biotecnológicas entraron al mercado para desarrollar nuevos
productos genéricos a base GF, dirigidos para ser aplicados en un rango de
condiciones específicas (Annett et al., 2014; Benbrook, 2016). Aunque estos
herbicidas modernos mantienen el GF como el ingrediente activo, sus formulaciones
son distintas, ya que incluyen variaciones particulares con respecto a la
concentración de GF, o frente a la identidad y concentración de los surfactantes
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añadidos (Annett et al., 2014). Esta gran variedad de fórmulas comerciales no solo
dificulta la realización de estudios toxicológicos para evaluar el impacto ambiental
que tiene cada uno de los componentes individuales en estos herbicidas (Annett et
al., 2014), sino también dificulta la elaboración de reportes para establecer
correctamente las tasas de aplicación de estos HBGF en campo (Annett et al.,
2014).
El cultivo prologando de variedades transgénicas tolerantes al GF combinado con
el aumento en la producción de HBGF genéricos, provocó un incremento
significativo de las aplicaciones de GF a nivel mundial en las últimas décadas
(Annett et al., 2014). La dependencia y el uso excesivo de GF, conllevó al
surgimiento de múltiples problemáticas ambientales relacionadas con resistencia a
herbicidas y antibióticos (ver índice 5) (Kurenbach et al., 2018; Myers et al., 2016) y
a daños colaterales en especies no objetivo sensibles al GF (ver subíndice 4.1 y
4.2) (Nguyen et al., 2016; Zabaloy et al., 2012; Zhan et al., 2018).
2.3. Problemática en Colombia: Erradicación de Cultivos Ilícitos
El uso de HBGF no sólo se ha limitado al contexto agrícola. Este compuesto químico
también se ha utilizado bajo otros propósitos en la eliminación de plantas
indeseadas. En Colombia, el uso de GF se ha extendido a la erradicación de cultivos
ilícitos (Oldham & Massey, 2002). A raíz del aumento en el sembrado de cultivos de
coca que tuvo el país a mediados de 1995, y debido a la participación de grupos
armados organizados en este negocio ilegal, los gobiernos de Colombia y Estados
Unidos implementaron un acuerdo bilateral en el año 2000 conocido como “Plan
Colombia” (Camacho & Mejía, 2017). Uno de los principales objetivos del Plan
Colombia, fue desarrollar un programa antinarcóticos para reducir la producción de
coca, y combatir el procesamiento y tráfico de drogas (Camacho & Mejía, 2017;
GAO, 2008). La aspersión aérea con GF se estableció como la estrategia primordial
para socavar la producción de coca (Camacho & Mejía, 2017; Oldham & Massey,
2002; Solomon et al., 2009).
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Un aspecto alarmante relacionado con el proceso de fumigación, radica en la forma
como se han manejado las tasa de aplicación del GF en campo (Vargas, 2005). De
acuerdo con Solomon et al. (2007), en las operaciones de fumigación aérea se
realizan entre dos o más rondas de aspersión desde aeronaves, usualmente a una
altura de 30 m sobre los cultivos de coca, y se tiende a liberar 10.64 𝐿 × ℎ𝑎!" de GF
mezclado con otros adyuvantes (como Cosmo-Flux 411F) para mejorar la
penetración del ingrediente activo en el follaje vegetal.
Lo anterior quiere decir que, a diferencia del uso estándar de herbicidas (como
Roundup Original®) bajo las tasas recomendadas en agricultura, en los programas
de fumigación área, los cultivos ilícitos son asperjados con herbicidas en mayores
tasas que los niveles máximos recomendados por el fabricante (Oldham & Massey,
2002; Vargas, 2005). Dentro de este contexto cabe mencionar que el riesgo
ambiental se puede amplificar con las fumigaciones áreas, ya que por acción del
viento y las condiciones meteorológicas, el GF se puede desplazar hacia zonas que
no son objetivos del programa, perjudicando así a cultivos legales, fuentes hídricas
u otros ecosistemas cercanos (Solomon et al., 2007).
Históricamente, la efectividad de los programas antidrogas apoyados en la
fumigación aérea con GF, han sido fuertemente cuestionados en Colombia
(Camacho & Mejía, 2017; Rincón-Ruiz & Kallis, 2013; Vargas, 2005). En primer
lugar, según Rincón-Ruiz & Kallis (2013), el gobierno Colombiano reportó que entre
el 2000 y el 2008, los cultivos de coca en el país se redujeron de un área de 163,000
hectáreas a 81,000 hectáreas; no obstante, los autores declaran que un informe del
Centro de Delitos y Narcóticos de la CIA indicó que en el periodo entre 2000 y 2007,
el área cultivada de coca se mantuvo en alrededor de 170,000 hectáreas (GAO,
2008). En segundo lugar, para evitar las campañas de fumigación, los campesinos
reemplazaron las grandes plantaciones de coca por plantaciones más pequeñas y
las reubicaron en diferentes zonas con menor probabilidad de ser rociados
(Camacho & Mejía, 2017; Vargas, 2005). Esto indica que las políticas de fumigación
conllevaron a difundir la producción de coca a través del territorio nacional,
18
particularmente, hacia nuevas municipalidades; pues de acuerdo con Rincón-Ruiz
& Kallis (2013), “el número de municipalidades con cultivos de coca dentro de sus
territorios aumentó de 164 en el 2001 a 202 en el 2008” (p.8). En consecuencia, la
expansión de las plantaciones de coca suscitó el incremento de nuevos esfuerzos
de aspersión con GF sobre los nuevos territorios, e incluso, en áreas previamente
fumigadas por causa del retorno de cultivos a esas zonas (Rincón-Ruiz & Kallis,
2013). En tercer lugar, los campesinos responsables de sembrar los cultivos ilícitos,
desarrollaron diferentes estrategias para mitigar los efectos directos del GF. Algunas
de estas incluyeron el rocío de las hojas de coca con melaza para evitar que el GF
penetre en el follaje, la siembra de los cultivos bajo sombra, o el corte de los tallos
de las plantas horas después de la aspersión del herbicida para atenuar su
fitotoxicidad sistémica (Camacho & Mejía, 2017; Rincón-Ruiz & Kallis, 2013). A partir
de lo anterior, se puede afirmar que las acciones de fumigación con GF no sólo son
ineficientes para erradicar los cultivos declarados ilícitos, sino además, plantean un
alto riesgo ambiental en diferentes zonas geográficas que son blancos de aspersión.
Toda esta situación despertó en Colombia un debate con respecto al cumplimiento
del principio de precaución, ante las sospechas de que la fumigación con GF
pueden generar riesgos potenciales para la salud pública y el hábitat local. Frente a
las mismas, la evidencia científica ha demostrado cómo el glifosato tiene efectos
negativos sobre el medio ambiente (Annett et al., 2014; Guijarro et al., 2018; Myers
et al., 2016; van Bruggen et al., 2018) y sobre las comunidades humanas (Camacho
& Mejía, 2017; Rincón-Ruiz & Kallis, 2013; Solomon et al., 2009). A pesar de esto,
actualmente se discute en Colombia sobre autorizar el retorno de los programas de
erradicación aérea con GF para hacer frente a la expansión de los cultivos ilícitos
manejados por organizaciones criminales4.
El reinicio de estas actividades generaría afectaciones ambientales en los territorios
del país con mayor presencia de cultivos en uso ilícito. Muchos de los cuales se
4 Según el proyecto de decreto publicado por el Ministerio de Justicia colombiano en el 2019, el cual busca retomar la fumigación aérea con glifosato contra cultivos de uso ilícito.
19
encuentran en ecosistemas de especial importancia ecológica, como son la región
Amazónica o de la Orinoquía (Rincón-Ruiz & Kallis, 2013). De manera que urge la
necesidad de evaluar las posibles implicaciones que pueden tener la reactivación
de los programas de fumigación área con GF, con el objetivo de establecer criterios
técnicos y científicos para proteger la biodiversidad en el país.
3. Presencia del Glifosato en el Suelo y Vías de Biodegradación 3.1. Destino del Glifosato en el Suelo: Adsorción, Mineralización y Lixiviación La aplicación de HBGF para el control de malezas o en programas de erradicación
de cultivos ilícitos, pueden contaminar los suelos y las áreas tratadas circundantes.
Esto ocurre porque una fracción del GF asperjado a nivel foliar puede ser
interceptado por otras plantas cercanas (Mamy et al., 2016). El material vegetal
contaminado con GF puede retornar en cantidades significativas al suelo por efecto
del ciclo de senescencia de las plantas, por residuos después de las labores de
cosecha o por exudación de las raíces (Doublet et al., 2009; Gomes et al., 2014).
La contaminación del suelo con restos vegetales es común en prácticas de
conservación de labranza, a causa de la continua cobertura orgánica en los suelos
(Busari et al., 2015; Mamy et al., 2016). Otra fracción del GF rociado sobre el follaje
puede caer directamente a los suelos (la Cecilia & Maggi, 2018; Maqueda et al.,
2017). Este escenario es frecuente cuando se realiza la aspersión del GF en
diferentes fases del ciclo de cultivos: en los periodos previos a la plantación, durante
las etapas de crecimiento de los cultivos tolerantes al GF o en aplicaciones
posteriores a la cosecha (Zabaloy et al., 2012).
Al margen de esto, con el uso generalizado actual de los HBGF, existen múltiples
fuentes de contaminación con GF que suponen un riesgo para las comunidades
microbianas del suelo. Aunque el GF puede ser degradado naturalmente, su tiempo
20
de persistencia y remoción en el ambiente pueden variar considerablemente. Según
Bento et al. (2016):
El GF puede tener una vida media en el suelo entre 1 y 197 días, y el tiempo
requerido para que el 90% del glifosato aplicado inicialmente desaparezca
del suelo, oscila entre 40 y 280 días. Se ha encontrado que el AMPA es más
persistente en el suelo que el glifosato, con una vida media que oscila entre
23 y 958 días. (p.302)
Esto implica que la persistencia del GF o el AMPA en las capas superiores del suelo,
incrementan la posibilidad de contaminación hacia otros ambientes, ya que estos
compuestos bien pueden alcanzar horizontes del suelo más profundos, migrando a
través de poros del suelo o por medio de canales radiculares (Gomes et al., 2014);
o también porque pueden terminar en aguas superficiales o fuentes hídricas
subterráneas (Zhan et al., 2018).
Cuando el GF está presente en el suelo, el compuesto puede sufrir procesos de
adsorción, mineralización o lixiviación (ver Figura 1.) (Bai & Ogbourne, 2016;
Borggaard & Gimsing, 2008). La adsorción es un proceso que se refiere a la
retención del GF en las partículas del suelo. El incremento en la adsorción (o
inmovilización) del GF puede ser beneficioso ambientalmente, ya que regula la
liberación del GF para su degradación biológica y evita que se traslade a otros
entornos, pero, también tiende ser negativo, ya que esto puede llevar a una eventual
saturación del GF en los ecosistemas causando que sus efectos ecotoxicológicos
se amplifiquen (Bai & Ogbourne, 2016).
En comparación con otros compuestos químicos herbicidas, el GF posee
características únicas que lo hacen tener un elevado coeficiente de adsorción con
las partículas del suelo (Annett et al., 2014). Por un lado, la presencia de varios
grupos funcionales polares en el GF (grupo carboxilo, amino y fosfonato), facilitan a
que el compuesto se adsorba fuertemente a los minerales de suelo (Gimsing et al.,
21
2007; Gimsing & Borggaard, 2002). Por otro lado, al ser un ácido poliprótico, el GF
puede formar complejos estables con cationes divalentes (Ca2+, Cu2+ y Zn2+)5 o
trivalentes (Al3+ y Fe3+)6 en los suelos (Borggaard & Gimsing, 2008). Dado que los
fosfatos también pueden formar complejos con estos cationes (debido a similaridad
química), tanto el glifosato como el fosfato compiten por sitios de unión superficial a
estas partículas del suelo (Borggaard & Gimsing, 2008). En este orden de ideas, en
suelos enriquecidos con fósforo, particularmente por la adición exógena de
fertilizantes de fosfato, la adsorción del GF disminuye o se suprime (Hébert et al.,
2019; Gimsing et al., 2007); mientras que suelos enriquecidos calcio o con aluminios
y óxidos de hierro (minerales de cargas variables), la adsorción del GF aumenta
(Maqueda et al., 2017).
Asimismo, el pH del suelo está correlacionado negativamente con la capacidad de
adsorción del GF (Borggaard & Gimsing, 2008). En otras palabras, la inmovilización
del GF es menor en pH altos. Esto ocurre porque a medida que el aumenta el pH,
la desprotonación del GF también aumenta, conllevando a una modificación de la
carga neta de la molécula7 y por lo tanto, reduciendo la interacción electrostática
entre el GF y las partículas del suelo (Borggaard & Gimsing, 2008). De acuerdo a lo
anterior, la textura del suelo tiene una influencia importante en la inmovilización del
GF, ya que la materia orgánica y las partículas de arcilla presentes en suelo, están
negativamente cargadas (Bai & Ogbourne, 2016). De este modo, suelos con pH
ácidos y que contienen una proporción relativa mayor de partículas de arcilla y
materia orgánica, presentan un incremento en la adsorción del GF.
La mineralización hace referencia al proceso de degradación biológica del GF. En
términos generales, la combinación de la diversidad y actividad microbiana, junto
con las propiedades fisicoquímicas del suelo, son los factores que conducen a la
mineralización del GF (Bai & Ogbourne, 2016) Sin embargo, algunos estudios
5 La unión del GF con estos cationes generalmente ocurre en suelos con pH alcalino. 6 La unión del GF con estos cationes generalmente ocurre en suelos con pH ácido. 7 La desprotonación del GF conduce al aumento de más cargas negativas libres.
22
afirman que las propiedades del suelo son los predictores más importantes de la
tasas de disipación del GF, ya que estas propiedades determinan que tan
biodisponible está el compuesto para que sea atacado por las enzimas de los
microorganismos (Borggaard & Gimsing, 2008; Guijarro et al., 2018; Maqueda et al.,
2017). La biodisponibilidad del GF dependerá entonces de la reversibilidad del
equilibrio de adsorción (Guijarro et al., 2018). Entre menor sea la adsorción del GF,
más biodisponible es el compuesto a la degradación por microorganismos.
La lixiviación hace referencia al transporte del GF causado por el movimiento de
agua en el suelo. El desplazamiento del GF puede ocurrir en forma de solución o en
suspensión (p. ej. por unión a coloides de suelo) (Borggaard & Gimsing, 2008).
Aunque el GF es un compuesto altamente soluble en agua, algunos autores afirman
que el riesgo de contaminación en aguas es limitado, debido al elevado coeficiente
de adsorción que tiene el GF con las partículas de los suelos y a las rápidas tasas
de su degradación por las comunidades microbianas (Annett et al., 2014; Maqueda
et al., 2017). No obstante, otros autores afirman que el riesgo de contaminación de
las fuentes hídricas puede aumentar a largo plazo en suelos que presentan una alta
capacidad de adsorción y bajas tasas de biodegradación (Al-Rajab & Schiavon,
2010). Así mismo, hay artículos que reportan que la lixiviación del GF puede
aumentar en tipos de suelos que no son uniformes y presentan macroporos (p. ej.
esto es característico en suelos que tienen una proporción relativa mayor de
partículas de arena) (Borggaard & Gimsing, 2008).
23
Figura 1. Destino del glifosato en el suelo: adsorción, mineralización y lixiviación.
(esquema inspirado por Hébert et al. [2019])
3.2. Vías de Biodegradación del Glifosato
El GF es un compuesto organofosforado sintético, propenso a la degradación por
vías bióticas o por reacciones abióticas (p. ej. a través de procesos como termólisis,
fotodegradación u oxidación catalizada por iones de manganeso contenidos en
minerales de birnessita) (Bento et al., 2016; la Cecilia & Maggi, 2018). Sin embargo,
la degradación del GF en los suelos es principalmente atribuido a los
microorganismos (Singh & Singh, 2016; Zhan et al., 2018), dado que el papel de los
factores abióticos en su disipación es insignificante (Zhan et al., 2018). De esta
manera, se ha establecido que la biodegradación es el método más eficiente, rápido
y ambientalmente sostenible para la remoción de GF en los ecosistemas (Seneff &
Orlando, 2018). Los trabajos de Zhan et al. (2018), Sviridov et al. (2015) y Singh &
24
Walker (2006), presentan una lista extensa de especies de bacterias y hongos
capaces de degradar el GF (y otros compuestos organofosforados de herbicidas
comerciales); ya que estos microorganismos son los principales agentes
responsables de este proceso y en los cuales se tiene un mayor conocimiento sobre
sus mecanismos de biodegradación (Bai & Ogbourne, 2016; Singh & Walker, 2006).
Químicamente, el GF es un análogo de glicina con un grupo metilfosfonilo unido a
su átomo de nitrógeno (Seneff & Orlando, 2018). Esto es relevante, porque significa
que la estructura del GF presenta enlaces directos de carbono a fósforo (C-P) y de
carbono a nitrógeno (C-N); los cuales son susceptibles a la ruptura química por
mecanismos biológicos (la Cecilia & Maggi, 2018). Actualmente, se han identificado
dos principales vías para la biodegradación de GF (ver Figura 2.) (Singh & Walker,
2006). De acuerdo con Bai & Ogbourne (2016), la ruta más común involucra el
clivaje del enlace C-N, catalizado por la enzima glifosato oxidoreductasa. El
resultado de este proceso es la liberación de AMPA (el cual conserva un enlace C-
P) y de glioxilato, siendo este último metabolizado como fuente de carbono en los
microorganismos (Guijarro et al., 2018). En caso de romperse el enlace C-P en el
AMPA, el compuesto puede ser metabolizado como fuente de nitrógeno (Singh &
Walker, 2006). La segunda ruta involucra el clivaje del enlace C-P, catalizado por la
enzima C-P liasa (Zhan et al., 2018). El resultado de este proceso es la liberación
de sarcosina y fosfato, siendo este último metabolizado como fuente de fósforo
(Sviridov et al., 2015; Zhan et al., 2018). La sarcosina puede ser subsiguientemente
disociado en glicina y formaldehído, mediante la enzima sarcosina oxidasa (Sviridov
et al., 2015; Zhan et al., 2018). Estos sustratos pueden ser fácilmente incorporados
en los ciclos bioquímicos de los microorganismos (Sviridov et al. 2015).
De acuerdo a lo anterior, ambas rutas de biodegradación pueden utilizar la enzima
C-P liasa para el clivaje del enlace C-P en el AMPA. Esto explica porqué algunos
microorganismos al degradar GF, liberan sarcosina y AMPA al ambiente (Sviridov
et al., 2015). No obstante, la ruta de degradación por C-P liasa es menos frecuente
que ocurra en el ambiente. Por un lado, porque el enlace C-P es química y
25
térmicamente más estable, lo que implica que el complejo C-P liasa debe ser
altamente específico al GF para que ocurra su degradación (Zhan et al., 2018). Por
otro lado, ésta ruta es inducida por concentraciones intracelulares deficientes en
fósforo inorgánico (Pi), y esta situación no es típica en suelos agrícolas que son
ricos en fósforo (Zhan et al., 2018). De manera que la conversión metabólica de
glifosato a sarcosina puede estar regulado por las concentraciones de Pi (Zhan et
al., 2018). Esta regulación no se evidencia para la biodegradación de glifosato al
AMPA (Zhan et al., 2018).
Figura 2. Degradación biológica del glifosato por la vía AMPA o sarcosina
(esquema basado de Zhan et al. [2018]).
26
4. Efecto del Glifosato en los Microorganismos del Suelo La extensiva aplicación de HBGF en la agricultura y en actividades no agrícolas, ha
resultado en la contaminación de los ecosistemas del suelo y de otros ambientes
naturales conectados. Los suelos son sistemas biológicos dinámicos y complejos,
que albergan una amplia diversidad de comunidades microbianas (Thiour-
Mauprivez et al., 2019). Dado que esta microbiota cumple un papel esencial en
muchos servicios ecosistémicos como en el ciclado de nutrientes, el control de
enfermedades patógenas o la regulación del clima (ver artículo de Saccá et al.,
2017); constituyen así un importante indicador biológico sobre el estado de la
calidad del suelo en los ecosistemas (Thiour-Mauprivez et al., 2019). Sin embargo,
debido a que algunos microrganismos son sensibles al GF (van Bruggen et al.,
2018), los cambios en las características estructurales8 y funcionales9 de estas
comunidades pueden tener un impacto en su capacidad de mantener el suelo en un
estado óptimo y estable (Saccá et al., 2017).
Para evaluar las respuestas de la microbiota del suelo frente a la exposición del GF
y sus posibles implicaciones ecológicas, se requiere de una variedad de métodos
de monitoreo y metodologías para cuantificar los efectos ocasionados por el
herbicida. Por lo anterior, en la actualidad hay una gran disponibilidad de
metodologías dependientes o independientes de microorganismos para estudiar las
respuestas de estos bajo diferentes niveles de detalle estructural (p. ej. desde la
composición de la comunidad hasta la identificación particular de especies) o
funcional (p. ej. desde análisis robustos sobre estados nutricionales o fisiológicos
8 En ecología, la estructura (o composición) de una comunidad biológica, hace referencia a los tipos de organismos que están presentes en un entorno dado y en qué proporción relativa se encuentran en relación al total de especies que conforman la comunidad. 9 Las características funcionales hacen referencia a la diversidad de procesos o actividades metabólicas que realizan los microorganismos asociados a una comunidad, y que pueden influir en diferentes aspectos del funcionamiento del ecosistema.
27
hasta el análisis específico de la actividad de ciertas enzimas) (Imfeld & Vuilleumier,
2012; Saccá et al., 2017).
Algunos métodos dependientes de cultivo efectuados en ensayos de microcosmos,
como pueden ser los análisis de ácidos grasos microbianos (por PFLA) y los perfiles
de actividad metabólica, permiten la cuantificación in situ de la respuesta microbiana
bajo condiciones controladas (Imfeld & Vuilleumier, 2012). Un inconveniente en
estos métodos radica en que en solo una fracción de la diversidad de
microrganismos del suelo es cultivable en el laboratorio, lo que limita el alcance de
los resultados obtenidos. En contraste, métodos independientes de cultivo como la
metagenómica y la secuenciación de marcadores filogenéticos, efectuados en
muestras de suelo recolectadas en campo, permiten la obtención de una gran
cantidad de información sobre la estructura, dinámica y actividad de los
microorganismos en el ambiente; facilitando la estimación de la diversidad alfa y la
identificación de taxones particulares (Imfeld & Vuilleumier, 2012; Li et al., 2016).
Aunque el tratamiento de grandes volúmenes de datos y la falta de estandarización
metodológica pueden dificultar el análisis de estos estudios y su comparación
directa con otras investigaciones, estas limitantes pueden ser paulatinamente
superadas debido al constante desarrollo tecnológico y al aumento en la
recopilación de datos relevantes usando estas técnicas (Imfeld & Vuilleumier, 2012).
Sin embargo, para tener una comprensión más completa sobre las características y
procesos microbianos, es recomendable la combinación sistemática de métodos
dependientes e independientes de cultivo (Imfeld & Vuilleumier, 2012; Marx, 2016;
Saccá et al., 2017). De esta manera, la integración de aproximaciones “meta-
ómicas” moleculares y de técnicas bioquímicas y de cultivo tradicional (denominado
“cultur-ómicas”, por Marx, [2016]), permiten describir y comprender mejor la
magnitud de la respuesta de la microbiota frente a la exposición con herbicidas
(Imfeld & Vuilleumier, 2012).
28
En las siguientes dos secciones, se realiza una revisión de literatura científica sobre
los impactos del GF en los microorganismos rizosféricos y no-rizosféricos de suelos
agrícolas. Aunque el microbioma del suelo alberga una gran variedad de
microrganismos como bacterias, hongos, algas, protistas y arqueas; este artículo se
centra únicamente en el estudio de bacterias y hongos (y Oomycetes), ya que son
los grupos con mayor representación en el suelo (en términos de biomasa
microbiana total) y tienen una gran influencia en las dinámicas nutricionales de estos
ecosistemas (Six et al., 2006).
4.1. Cambios en la estructura de las Comunidades Microbianas
La gran diversidad de microorganismos del suelo puede estar localizada en distintos
microambientes, como son la rizósfera y la no-rizósfera (Li et al., 2016) La rizósfera
es la porción del suelo que está directamente influenciada por las raíces de las
plantas, y se considera que estos microambientes son importantes reservorios de
biodiversidad y de interacciones microbianas, ya que los exudados radiculares
estimulan las dinámicas poblaciones y funcionales de estas comunidades (Bais et
al., 2006; Raaijmakers et al., 2009). Se ha reportado ampliamente que los
microrganismos asociados a la rizósfera cumplen un papel fundamental en el
crecimiento y la salud de las plantas, por ejemplo, en actividades de promoción de
la defensa vegetal por modulación del sistema inmune del hospedero (Berendsen
et al., 2012; Raaijmakers et al., 2009). En contraste, la no-rizósfera hace referencia
a la mayor porción del suelo que no está influenciado por los exudados radiculares
(Li et al., 2016). Las comunidades microbianas presentes en la rizósfera pueden
diferir en estructura y en actividad de aquellas comunidades presentes en la no-
rizósfera, posiblemente, porque en el microambiente de la rizósfera hay mayor
disponibilidad de nutrientes liberados por las raíces de las plantas (Praeg et al.,
2019).
La ruta del ácido shikímico es una vía metabólica altamente conservada, y se
encuentra en organismos como plantas, hongos y bacterias (Tohge et al., 2013; Tzin
29
et al., 2012) Teniendo en cuenta que esta vía es importante para la biosíntesis de
amino ácidos aromáticos y de metabolitos secundarios (ver subíndice 2.1); la
exposición con GF puede hacer que muchos taxones de bacterias y hongos del
suelo, que no cuentan con la capacidad para mineralizar este compuesto, se vean
afectados por su toxicidad (van Bruggen et al., 2018). Sin embargo, la sensibilidad
al GF parece variar entre los microorganismos en función del tipo de enzima EPSPS
intracelular que producen: la EPSPS clase I es una isoforma sensible, mientras que
la EPSPS clase II, es una isoforma no sensible al herbicida (Kremer & Means, 2009;
Tohge et al., 2013). Por lo tanto, diferencias en la sensibilidad de los
microorganismos del suelo frente al GF pueden conllevar a cambios en la
composición o diversidad de las comunidades microbianas; con efectos más
pronunciados sobre algunos phyla o géneros específicos, y no a nivel de toda la
comunidad (Kremer & Means, 2009).
La investigación sobre el impacto del GF en las comunidades microbianas ha
suscitado que numerosos estudios evalúen los factores que pueden explicar (en
mayor o en menor medida) los cambios en la estructura de la microbiota del suelo
por la aplicación del herbicida. Por ejemplo, varios autores se han centrado en
determinar el efecto que puede tener el manejo de distintas tasas de aplicación de
GF en los microorganismos del suelo (Liu et al., 2018; Zabaloy et al., 2015; Liu et
al., 2018). Mientras que otros autores se han centrado en evaluar el efecto que
puede tener la aplicación repetitiva de GF en la composición de las comunidades
microbianas (Druille et al., 2016; Guijarro et al., 2018; Newman et al., 2016; Schlatter
et al., 2017).
Algunos trabajos indican que la aplicación de GF a una inferior o igual tasa a la
recomendada en campo, supone un riesgo menor para los microorganismos de
suelos agrícolas, debido a que ejerce un impacto leve o insignificante en la
composición o diversidad de estas comunidades. Por ejemplo, utilizando
pirosecuenciación para amplificar la región V6 del ADN bacteriano, Barriuso &
Mellado (2012) monitorearon el cambio en la composición de la comunidad de
30
rizobacterias de maíz NK603 genéticamente modificado, tras la aplicación de una
tasa de GF de 0.74 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!" (Roundup Plus®). Aunque los autores señalaron que
el herbicida provocó una leve disminución de la diversidad de bacterias en la
rizósfera en comparación con el cultivo de maíz no tratado (después de seis meses
del ensayo), la proporción relativa de los phylum más abundantes, Proteobacteria y
Actinobacteria, no diferían notablemente entre el tratamiento y el control. Así mismo,
el filo Acidobacteria no difería significativamente entre el tratamiento y el control tras
la aplicación de GF. En otro estudio, al analizar por DGGE la estructura de la
comunidad de Eubacteria y de las bacterias oxidantes de amoníaco (BOA), Zabaloy
et al (2015) revelaron que no hubo cambios significativos en la estructura y
abundancia de Eubacteria y BOA luego de su exposición a GF (como sal de
isopropilamina) a la tasa recomendada en campo de 2.5𝐿 × ℎ𝑎!".
Sin embargo, hay otros investigadores que han manifestado que, cuando se usan
las tasas recomendadas de GF en campo o por debajo del mismo, sí es posible
esperar impactos perjudiciales en la comunidad microbiana del suelo. Zobiole et al.
(2010) sostienen que las aplicaciones de GF (Roundup Weather Max®, en tasas de
0.8, 1.2 y 2.4 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!") en diferentes etapas de crecimiento de cultivos de soya
resistentes al GF, redujeron selectivamente el crecimiento poblacional de
Pseudomonas fluorescens reductoras de manganeso y otras rizobacterias
productoras de ácido indolacético (AIA). También, Nicolas et al. (2016) reportaron
que la aplicación de GF (Roundup® R450) a tasas muy inferiores a las
recomendadas en campo, podían afectar la germinación, crecimiento y desarrollo
de hongos filamentosos no-rizosféricos de la especie Aspergillus nidulas (un
bioindicador del estado del ecosistema de suelos agrícolas).
Por otro lado, Liu et al. (2018) encontraron que tanto la concentración de PLFA
fúngico como el número de hongos cultivables, disminuyeron significativamente en
dos tasas de aplicación con GF (fórmula comercial sin especificar) de: 50 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"
(tasa recomendada) y 500 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!" (10 veces por encima del límite
recomendado). Adicionalmente, señalaron que la mayor tasa de aplicación de GF
31
conllevó al aumento en la dominancia de bacterias Gram negativas (principalmente
Ralstonia sp., Gamma proteobacterium, Burkholderia sp. y Devosia sp.), pero
también disminuyó la riqueza de la comunidad bacteriana. De acuerdo a los autores,
esto sugiere que las bacterias Gram negativas pueden tener un rol importante en la
degradación del GF como mecanismo para hacer frente al estrés ambiental dado la
presencia del pesticida. Estos resultados son consistentes con el meta-análisis
realizado por Nguyen et al. (2016), el cual muestra que el aumento en las tasas de
aplicación de GF en el suelo es un factor importante para determinar la respuesta
de la microbiota, particularmente, de las poblaciones microbianas más sensibles al
herbicida que pueden ser inhibidas al incrementar la dosis de GF.
Aunque la evidencia sobre los efectos deletéreos que puede tener el manejo de
distintas tasas de aplicación de GF han sido contradictorios, especialmente en
relación al manejo de dosis por debajo o igual a las recomendadas en campo, en
términos generales, hay una tendencia de que el impacto del GF es mayor en las
comunidades microbianas al aumentar la tasa de aplicación (Liu et al., 2018; Meriles
et al., 2006; Nguyen et al., 2016). Esto implica que si bien hay microorganismos del
suelo que pueden tener la capacidad de tolerar el GF a las dosis recomendadas
(Barriuso & Mellado, 2012; Mijangos et al., 2009; Zabaloy et al., 2016), el aumento
en la tasa de aplicación del herbicida puede potencialmente incrementar la
sensibilidad de ciertos taxones en específico. Se ha sugerido que el impacto
toxicológico directo que puede tener el GF en los microorganismos, es debido a su
efecto en la inhibición de la síntesis de amino ácidos aromáticos y/o en conllevar a
una acumulación potencial de intermediarios perjudiciales en la ruta del ácido
shikímico (Gomes et al., 2014).
Otro de los factores que se ha evaluado en gran medida para entender el impacto
del GF en las comunidades microbianas, corresponde al efecto que puede tener la
aplicación repetitiva del herbicida en los microorganismos del suelo. La razón de lo
anterior es que algunos autores concuerdan en que lo más probable es que una
sola aplicación de GF, incluso a una tasa superior a la recomendada en campo,
32
puede generar efectos pequeños o transitorios en las comunidades microbianas a
lo largo del tiempo (Mijangos et al., 2009; Zabaloy et al., 2012; Schlatter et al., 2017).
Por ejemplo, al realizar ensayos de microcosmos con suelos de campo con
diferentes historias de manejo agrícola, Zabaloy et al. (2012) reportaron que al
incubar los suelos durante 7 días a diferentes tasas de GF (Nidera, 95% de grado
técnico, a 0, 12 y 150 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"), se obtuvieron cambios mínimos en la estructura
de las comunidades microbianas tras una sola aplicación de GF en los suelos.
Bajo este contexto, hay numerosos estudios que han investigado la respuesta de
los microrganismos a la exposición repetitiva con HBGF a corto plazo (Allegrini,
2017; Zabaloy, 2015). Arango et al. (2014) encontraron que después de dos
aplicaciones de GF (Roundup®) a nivel foliar, algunas especies específicas de la
rizósfera pertenecientes como Burkholderia spp., disminuyeron significativamente
en abundancia de T-RF10, mientras que otras bacterias no cultivables de la especie
Gemmatimonas.sp., aumentaron significativamente en abundancia de T-RF.
Adicionalmente, los autores señalaron que la comunidad bacteriana asociada con
las raíces de cultivos de soja después de la aplicación de GF, presentó tanto
resistencia efectiva después de la perturbación, como también un aumento en la
diversidad de T-RF en comparación con las muestras control sin tratar con GF. Así
mismo, al estudiar los efectos a corto plazo del GF en las comunidades microbianas
rizosféricas de dos composiciones vegetales diferentes (Triticosecale spp. y Pisum
sativum) mediante PCR-DGGE, Mijangos et al. (2009) reportaron que treinta días
después del tratamiento con GF (Roundup Plus®, 50 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!" y 500 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"),
la diversidad de la comunidad microbiana del suelo rizosférico presentó una
respuesta inconsistente frente a la adición del herbicida.
Ahora bien, existe un menor número de investigaciones que han tratado de evaluar
los efectos a largo plazo sobre los efectos del GF. Por ejemplo, por medio de análisis
10 T-RF son fragmentos cortos de restricción, pertenecientes a la técnica de biología molecular de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal, el cual es utilizado para monitorear la diversidad y estructura de comunidades microbianas en el ambiente.
33
de FAME, Lancaster et al. (2010) reportaron que bacterias gram-negativas,
particularmente b-Proteobacterias del género Burkholderia spp.11, estuvieron
presentes en el suelo en concentraciones más altas después de cinco aplicaciones
de GF (RoundUp WeatherMAX®, a una tasa de 50 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!") en comparación con
una, dos, tres o cuatro aplicaciones. A su vez, los autores afirmaron que el
incremento poblacional de estos microorganismos pudo haber estado
correlacionado positivamente con su capacidad de biodegradar el herbicida. Por
otro lado, Druille et al. (2016) afirmaron que tras cuatro aplicaciones anuales de GF
(Glacoxan®), en dosis recomendadas de 3 𝐿 × ℎ𝑎!" o en dosis subletales de 0.8
𝐿 × ℎ𝑎!", hubo un impacto en los microorganismos benéficos del suelo en pastizales
temperados; ya que la viabilidad de esporas de micorrizas arbusculares y las
densidades de diazótrofos de vida libre, se redujeron en un 56% y un 82%
respectivamente. De manera similar, aunque los cambios no fueron significativos,
Newman et al. (2016) reportaron que miembros de g-Proteobacteria
(Xanthomonadaceae) incrementaron en abundancia relativa tras la exposición
repetitiva con GF (en tasas recomendadas), mientras que la abundancia relativa de
miembros del phylum Acidobacteria decreció.
Con respecto a las aplicaciones repetitivas del herbicida, algunos autores plantean
que las poblaciones microbianas en suelos con antecedentes de exposición al GF,
se han adaptado mejor para tolerar este compuesto o para degradarlo más
rápidamente, de manera que se esperaría observar respuestas diferenciales de
estas comunidades entre ambientes agrícolas con y sin una larga historia de
exposición al GF conocida (Lancaster et al., 2010; Lane et al., 2012). No obstante,
al investigar comunidades bacterianas en suelos sembrados con trigo, Schlatter et
al. (2017) reportaron que menos del 1% de todos los taxones de microorganismos
de la rizósfera y no-rizósfera se vieron afectados por aplicaciones repetitivas de GF
(fórmula comercial sin especificar) bajo la tasa recomendada en campo de 1.68
𝑘𝑔 × ℎ𝑎!"; en mayor medida, en suelos con una larga historia de uso del herbicida,
11 Según los autores, posiblemente reasignados en el género Pseudomonas spp. debido a los cambios en la taxonomía que ha tenido este género en los últimos años (Staub et al., 2012).
34
y más de estos taxones aumentaron en abundancia relativa en comparación con los
que disminuyeron. Esto quiere decir que no se encontró evidencia de que el historial
de uso de GF impactara significativamente la estructura y la diversidad bacteriana
a la adición con GF. Frente a estos resultados, los autores del artículo exponen dos
ideas: primero, que es probable que los débiles o insignificantes patrones de
respuesta microbiana al GF sean por causa de la alta diversidad e interconexión
que presentan las comunidades microbianas, dado que esto favorece una rápida
recuperación frente a pequeñas perturbaciones (como la exposición a GF en bajas
concentraciones). Y segundo, que el pequeño porcentaje de bacterias que fueron
influenciados por el GF (pertenecientes a los phyla Proteobacteria y Bacteroidetes),
fueron estimulados posiblemente por la liberación de exudados radiculares o por la
presencia de restos vegetales de raíces muertas; ya que varios miembros de estos
phyla son considerados copiotróficos (Fierer et al., 2007; Schlatter et al., 2017).
Un resultado comparable se obtuvo en otro estudio de Schlatter et al. (2017), en el
cual encontraron que un gran número de grupos fúngicos, principalmente saprófitos
y colonizadores potenciales de raíces de trigo, respondieron a adiciones de GF (de
3.36 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!"); en suelos con una larga historia de uso del herbicida. A pesar de
no haber divisado grandes cambios en la estructura de la comunidad bacteriana
después del tratamiento con GF (DuPont® Premium HL, a una tasa de 3 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"),
Guijarro et al. (2018) detectaron un incremento en la abundancia relativa de
Bacteroidetes de las familias Flammeovigaceae y Saprospiracea en suelos que no
tenían exposición previa al herbicida.
Con respecto a todo lo anterior, a raíz de la evidencia conflictiva entre los diferentes
estudios, no hay información concluyente que establezca que la aplicación repetitiva
de GF tenga un impacto notable en la microbiota del suelo, dado que hay
investigaciones que sugieren que el herbicida puede tener efectos estimulatorios
(Lancaster et al., 2010; Mijangos et al., 2009), perjudiciales (Zobiole et al., 2010;
Newman et al., 2016; Druille et al., 2016) o mínimos (Zabaloy et al., 2012; Schlatter
et al., 2017; Guijarro et al., 2018) en los microorganismos del suelo. No obstante,
35
es factible que la aplicación prolongada con GF en el ambiente, ocasione que las
comunidades microbianas del suelo estén más expuestas a los efectos
toxicológicos directos (e indirectos, como se revisará más adelante) de este
herbicida (Druille et al., 2016).
Un interrogante que surge en respuesta al uso intensivo de GF, especialmente en
los ecosistemas agrícolas, corresponde al impacto que puede tener el herbicida en
los microbiomas del suelo asociados a las plantas, y de cómo esto puede provocar
cambios importantes en las interacciones planta-patógeno (Johal & Huber, 2009;
Kremer & Means, 2009; van Bruggen et al., 2018; Zobiole et al., 2010). Se ha
registrado ampliamente en la literatura, que las plantas tienen la capacidad de atraer
microorganismos de la rizósfera por mediación de los exudados radiculares (Bais et
al., 2006). Esto ha permitido el reclutamiento de consorcios microbianos específicos
para que influencien positivamente el crecimiento y la supervivencia vegetal (Bais
et al., 2006; Zobiole et al., 2010). En este contexto, la aplicación de GF en el suelo
puede afectar a microorganismos benéficos que son sensibles a este compuesto
(Druille et al., 2016; Newman et al., 2016; Zobiole et al., 2010); y esta situación
puede repercutir indirectamente en la salud de las plantas (Hammerschmidt, 2018;
van Bruggen et al., 2018).
Como se revisó en el subíndice 2.1, las plantas tratadas con GF12 o que están
expuestas al GF y al AMPA por la contaminación del suelo, presentan alteraciones
en el crecimiento regular vegetal, y también, sufren una reducción en la biosíntesis
de metabolitos secundarios asociados con defensa (p. ej. las fitoalexinas
microbianas) y en el proceso de lignificación de la celulosa (Gomes et al., 2014).
Por consiguiente, esta exposición al herbicida puede inducir un aumento en la
susceptibilidad frente a enfermedades patogénicas al debilitar las defensas
fisiológicas innatas (Hammerschmidt, 2018; Powell & Swanton, 2008; Schlatter et
al., 2017).
12 Bien sea en programas de erradicación de cultivos lícitos o ilícitos.
36
En la literatura frecuentemente se expone que una vez el GF entra en contacto con
el suelo después de ser aplicado, este compuesto permanece adherido a las
partículas del terreno, lo que limita su dispersión hacia otros ambientes en forma de
solución y también, el potencial de causar daño a las plantas y/o microorganismos.
(Guijarro et al., 2018; Annett et al., 2014; Maqueda et al., 2017). No obstante, se ha
demostrado que la proporción de GF en el suelo que está sujeto a procesos de
adsorción o mineralización, puede variar considerablemente dependiendo de
factores como: las propiedades del suelo, la diversidad y actividad microbiana local,
las condiciones climatológicas en campo, las prácticas agrícolas, y la presencia de
fertilizantes de fosfato, entre otros (Martínez et al., 2018; Gomes et al., 2014;
Gimsing et al., 2007; Borggaard & Gimsing, 2008; Bai & Ogbourne, 2016). En
consecuencia, una cantidad del GF asperjado que penetra en el suelo, puede servir
como una fuente nutricional alternativa para diferentes microorganismos que tienen
la capacidad de metabolizarlo (Haney et al., 2000; Lancaster et al., 2010; Mijangos
et al., 2009; Kremer et al., 2005). Adicionalmente, se ha reportado que otra cantidad
substancial de GF que se acumula en los tejidos radiculares, puede ser liberado
directamente a la rizósfera bien sea por la descomposición de raíces dañadas o a
través de exudados de raíces vivas (Martínez et al., 2019; Hébert et al., 2019).
Frente a esto, el trabajo de Kremer et al. (2005) demostró que plantas tratadas con
GF (Roundup Ultra®, en una tasa de 0.84 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!"), liberan al suelo residuos de
este compuesto herbicida y, además, descargan grandes concentraciones de
carbohidratos y amino ácidos (productos metabólicos solubles) a través de los
exudados radiculares.
Esta disponibilidad de nutrientes en exceso estimula dinámicas de competición
entre las comunidades microbianas del suelo, lo que puede conllevar a pequeños
cambios de la abundancia relativa de ciertos taxones (Kremer & Means, 2009;
Schlatter et al., 2017, 2018). Como se revisó previamente, algunos de estos taxones
corresponden a microorganismos copiotróficos (Guijarro et al., 2018; Schlatter et al.,
2017, 2018). Pero también hay evidencia de que este escenario favorece el
crecimiento y la propagación de microorganismos oportunistas y patógenos
37
pertenecientes a la rizósfera; por lo que esta problemática aumenta el riesgo de
enfermedad en las plantas (van Bruggen et al., 2018; Martínez et al., 2019). De
hecho, en estudios donde se cultivó aislamientos de fitopatógenos directamente en
exudados de plantas tratadas con GF, se encontró, por un lado, que cepas de
Fusarium spp. desarrollaron significativamente mayor biomasa en comparación con
los controles (Kremer et al., 2005), y por otro lado, que la germinación y el desarrollo
de tubos germinales de Pythium ultimum mejoraron significativamente en contraste
con los controles (Liu et al., 1997).
En este orden de ideas, se ha demostrado de que el GF puede modular las
dinámicas de enfermedad en las plantas, ya que la aplicación de HBGF estimulan
la población y la virulencia de algunas especies de fitopatógenos (Martinez et al.,
2018). Por ejemplo, en ensayos in vitro con plántulas de fríjol, Meriles et al. (2006)
detectaron el incremento proporcional de poblaciones de Fusarium spp. y Pythium
spp. en el suelo a medida que aumentaba la concentración de GF. Un resultado
similar obtuvieron Zobiole et al. (2010) al registrar una alta colonización de raíces
con Fusarium spp. en cultivos de soya tolerantes al GF. Y también Kremer & Means
(2009), al evidenciar que raíces de soja y maíz tolerantes al GF al ser tratados con
el herbicida, fueron fuertemente colonizados por Fusarium spp. Incluso Powell &
Swanton (2008), desarrollaron una representación esquemática sobre las vías y los
efectos pronosticados por los cuales el GF podría potenciar las enfermedades en
cultivos asociadas con Fusarium spp.
En conclusión la exposición con GF hace más propenso a que las plantas mueran
por infecciones radiculares (Nivelle et al., 2018; Saccá et al., 2017), y asimismo,
puede hacer que su microbioma asociado sufra afectaciones en términos de
supresión de microorganismos benéficos (Zobiole, 2010; Newman, 2016) y de
estimulación de antagonistas de patógenos y oportunistas (Schlatter, 2017; Bais et
al., 2006; Kremer & Means, 2009; Powell & Swanton, 2008)
38
Según Schlatter et al. (2017), la predisposición de algunos taxones de
microorganismos para responder diferencialmente al tratamiento con GF, puede
deberse a que “mayores densidades de unos pocos taxones tienen la capacidad
para tolerar o crecer mejor en presencia de GF” (p.12). Por ejemplo, este argumento
es consistente con que algunas poblaciones microbianas en suelos con larga
historia de exposición al GF, estén mejor adaptados para tolerar el herbicida (p. ej.
por mecanismos de biodegradación) (Lancaster et al., 2010; Lane et al., 2012;
Schlatter et al., 2017). De manera que hay algunas investigaciones que sugieren
que el GF puede ocasionar efectos transitorios agudos en la microbiota del suelo, y
esto posiblemente, conlleva a que las comunidades microbianas se recuperen
rápidamente de perturbaciones sin que haya implicaciones mayores en la estructura
de la comunidad (Schlatter, 2017; Guijarro et al., 2018; Zabaloy et al., 2015). Incluso,
hay autores que sugieren que las estrategias de supervivencia bajo estados de
dormancia o la ocupación de micronichos en estratos más profundos del suelo,
pueden hacer que los microorganismos escapen de los efectos ecotoxicológicos del
herbicida (Schlatter et al., 2017; ).
4.2. Impacto en la Funcionalidad de las Comunidades Microbianas
Los microorganismos del suelo son esenciales para el funcionamiento sostenible de
los ecosistemas terrestres (Saccá et al., 2017). Esto se debe a que muchos
fenómenos ecológicos sobre el suelo (p. ej. la productividad primaria vegetal) están
relacionados directa o indirectamente con los procesos y servicios ecosistémicos
que cumplen las comunidades microbianas bajo el suelo (Nivelle et al., 2018; Saccá
et al., 2017). De hecho, varios estudios han documentado cómo los efectos de la
actividad microbiana subterránea pueden beneficiar el rendimiento y la fisiología de
las plantas. Verseix et al. (2016), publicó que la colonización de micorrizas
arbusculares en cultivos de trigo, bajo condiciones de labranza cero, favorecía el
incremento de la biomasa vegetal y la captura de nitrógeno aún en la ausencia de
fertilizantes inorgánicos. Por otro lado, el trabajo de Heinen et al (2018) expone
cómo la microbiota del suelo puede moldear las interacciones biológicas entre
39
plantas e insectos herbívoros, a partir de su contribución en actividades de
mineralización de nutrientes o por efectos de competición mutualista y antagonista.
De acuerdo con Thiour-Mauprivez et al. (2019), aunque la liberación de herbicidas
al mercado requiere del cumplimiento de diferentes reglamentaciones ambientales
para garantizar efectos mínimos ecotoxicológicos en el ecosistema13, la aplicación
de pesticidas en la agricultura ha sido identificado como una amenaza para la
biodiversidad que habita en el suelo y para los servicios ecosistémicos que cumplen.
Frente a esta problemática, recientemente autoridades científicas como la EFSA14
han establecido que se deben definir metas y garantías de protección específica
para salvaguardar organismos clasificados como no objetivo (que no son blancos
de los pesticidas), como son los microorganismos del suelo (Thiour-Mauprivez et
al., 2019).
En este contexto, diferentes estudios se han centrado en evaluar el impacto que
puede tener el GF en la calidad del suelo y en las características funcionales de las
comunidades microbianas. Por ejemplo, Romano-Armada et al. (2019) diseñaron la
construcción de un indicador combinado del suelo (CSQI, por sus siglas en inglés)
para analizar la calidad de suelos sujetos a la aplicación de GF. Entre las 26
variables analizadas (biológicas, químicas y físicas), los autores encontraron que la
biomasa microbiana y la concentración de AMPA en suelo, fueron las variables más
sensibles para discriminar la calidad de muestras de suelo. Mientras que otros
estudios se han enfocado en evaluar específicamente distintos cambios en la
actividad microbiana tras la exposición con GF, como pueden ser la tasa de
respiración (liberación de CO2)15, las tasas de mineralización de nitrógeno o perfiles
fisiológicos de la comunidad (por medio de Biolog Ecoplates) (Araújo et al., 2003;
13 Por ejemplo, el autor cita las reglamentaciones solicitadas por la Unión Europea (2009). Disponible en línea en la página oficial: https://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2009/1107/oj 14 Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) (2010). Disponible en línea en la página oficial: https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.2903/j.efsa.2010.1821 15 Una medida indirecta de estrés fisiológico o de la degradación del GF.
40
García-Orenes et al., 2010; Guijarro et al., 2018b; Jenkins et al., 2017; Lane et al.,
2012; Lupwayi et al., 2007; Mijangos et al., 2009).
Como se revisó en el subíndice 3.2, dependiendo de la textura y las propiedades
fisicoquímicas del suelo, el GF es un sustrato que puede ser degradado por los
microorganismos del suelo para la obtención de nitrógeno (N), carbono (C) y fósforo
(P). A raíz de lo anterior, diferentes estudios plantean que la metabolización del GF
puede conducir a una respuesta a nivel de comunidad relacionado con los procesos
de biomasa microbiana y de respiración (Duke et al., 2012; Haney et al., 2000;
Kremer & Means, 2009). En suelos expuestos con GF (estándar analítico de GF, de
2.16 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"), Araújo et al. (2003) registraron un incremento en la actividad
microbiana del 10-15% en la evolución de CO2 y un incremento entre 9-19% en los
ensayos de hidrólisis de FDA16. Asimismo, después de 32 días de incubación del
ensayo, detectaron un aumento en el número de colonias de actinomicetos y
hongos. Por otro lado, Mijangos et al. (2009) afirmaron que tras 15 días de
tratamiento con GF (Roundup Plus®, con 50 y 500 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"), el herbicida estimuló
cambios en la actividad funcional de microorganismos heterotróficos del suelo
(posiblemente por la adición del GF como nueva fuente nutricional); pero a los 30
días después de la aplicación del GF, la actividad y diversidad de las comunidades
microbianas disminuyeron, mostrando una respuesta inconsistente frente a la
adición de GF (posiblemente por cambios en las dinámicas nutricionales). Por
último, Haney et al. (2000) encontraron que si bien la adición de GF (Roundup
Ultra®, a tasas de 47, 94, 140 y 234 𝑚𝑔 × 𝑘𝑔!"), estimuló significativamente la
actividad microbiana del suelo de acuerdo a mediciones de la mineralización de C
y N, no hubo alteración (por efecto de inhibición o estimulación) de la biomasa
microbiana. Frente a este escenario, los autores sugieren que el GF al estar
biodisponible para los microorganismos, el compuesto puede ser rápidamente
mineralizado sin causar afectaciones a la actividad microbiana.
16 Una análisis indirecto para medir actividad enzimática.
41
Teniendo en cuenta los artículos revisados para la presente revisión, no es posible
establecer que la aplicación de GF, incluso a tasas superiores a las recomendadas
en campo, tenga efectos perjudiciales en indicadores que describen las dinámicas
a nivel de comunidad como pueden ser la biomasa y la respiración celular; debido
a los resultados inconsistentes obtenidos por las diferentes investigaciones (Nguyen
et al., 2017; Haney et al., 2000; Lancaster et al., 2010; Gomez et al., 2009).
Se ha reportado extensamente que el GF puede influir en el metabolismo del N en
las plantas, bien sea por afectación directa a nivel de la fisiología vegetal o por
efectos indirectos del herbicida en los microorganismos asociados a la rizósfera
encargados de los procesos de la fijación y asimilación del N (p.ej. simbiontes del
género Rhizobium) (Gomes et al., 2014). Sin embargo, cabe mencionar que los
resultados mencionados en la literatura aún son inconsistentes con respecto a los
efectos del GF en el metabolismo de N en los microorganismos del suelo (Rose et
al., 2018; Nivelle et al., 2017). Por ejemplo, Jenkins et al. (2017) indicaron que la
aplicación de GF (Roundup Weathermax®, a la tasa de 0.84 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!"), puede tener
efectos inhibitorios inconsistentes en los procesos de nitrificación en
microorganismos de la rizósfera y no-rizósfera. Por otro lado, Zhang et al. (2018)
reportaron que el GF (Yates Zero®, a una tasa de 2.88 𝑘𝑔 × ℎ𝑎!"), podía disminuir
las tasas brutas de nitrificación y desnitrificación en el suelo posiblemente al inhibir
la abundancia de genes funcionales microbianos relacionados con estos procesos.
Hay autores que expresan que al ser la degradación del GF un proceso
cometabólico, esto no provee un beneficio significativo adaptativo para aquellos
microorganismos que lo metabolizan (Singh & Walker, 2006). No obstante, esta
capacidad puede ser adaptativa en comunidades microbianas que se encuentren
en ambientes con baja disponibilidad de nutrientes de N y P o que están expuestas
a altas concentraciones de GF (en cuyo caso, podría haber una fuerte presión de
selección hacia especies degradadoras de GF) (Schlatter et al., 2017).
42
5. Resistencia Microbiana al Glifosato y a los Antibióticos
Desde su introducción en 1996, los cultivos tolerantes al GF (CTGF) representaron
un gran éxito comercial debido a que simplificaron las prácticas del control de
malezas en la agricultura mundial (Duke, 2015; Gilbert, 2013). La efectividad y el
beneficio económico que otorgó la aspersión de GF sobre los CTGF, permitió que
los campesinos utilizaran este herbicida frecuentemente sin que hubiese la
implementación de otros métodos para el manejo de plantas indeseadas, como son
la rotación de cultivos y la variación de productos agroquímicos aplicados (Duke,
2020). Por consiguiente, esto conllevó a una acelerada evolución de resistencia al
GF en géneros de malezas como Amaranthus, Lolium, Echinochloa y Conyzia; unas
plantas herbáceas con distribución global que han sido catalogadas entre las peores
plagas de cultivos en las últimas décadas (Duke, 2015; Heap, 2014).
Ante esta problemática, los agricultores combatieron la proliferación de plantas
resistentes mediante la aspersión de más GF, complementando con la aplicación
de otros herbicidas y retornando al uso de prácticas de labranza tradicional (Gilbert,
2013; Duke et al. 2020). Aún bajo estas medidas, la fuerte presión evolutiva en las
malezas condujo al desarrollo de novedosos mecanismos de resistencia al GF y
hacia o otra amplia variedad de pesticidas comerciales en múltiples sitios de acción
(Heap, 2014; van Bruggen et al., 2018).
En términos generales, Sammons & Gaines (2014) proponen que los mecanismos
básicos de resistencia a herbicidas en plantas pueden agruparse en cuatro
categorías: (1) resistencia en el sitio de acción, a través de cambios puntuales en la
secuencia del gen codificante de la enzima blanco, causando la alteración de su
interacción con el herbicida; (2) resistencia a nivel metabólico, por medio de la
modificación química o por degradación enzimática del herbicida; (3) exclusión del
herbicida del sitio de acción, ya sea físicamente por barreras estructurales (p . ej.
con mayor lignificación) o fisiológicamente por cambios en los canales
43
transportadores activos; y (4) evasión del herbicida, mediante estrategias
bioquímicas para manejar el agroquímico y evitar una amplificación de su toxicidad,
por ejemplo, a través de la sobreexpresión de enzimas superóxido dismutasas para
evitar el estrés oxidativo.
Con respecto al GF, se ha reportado un gran número de mecanismos de resistencia
a este compuesto en las malezas (Sammons & Gaines, 2014; van Bruggen et al.,
2018). Uno de ellos corresponde a la sobreexpresión de EPSPS debido al aumento
en el número de copias de este gen, lo que dificulta el bloqueo de tantos blancos
por parte del GF (Gaines et al., 2010; Sammons & Gaines, 2014). Se asume que
este rasgo pudo haber evolucionado de forma independiente en las plantas (p. ej.
por eventos de duplicación cromosomal) o se ha transferido mediante hibridación
interespecífica (p. ej. por elementos genéticos transponibles) (Zhang, 2003). Otro
mecanismo de resistencia es la modificación de genes transportadores (p. ej.
transportadores-ABC) resultando en una reducción de la translocación del GF
dentro de la plantas (Tani et al., 2016). De hecho, se ha encontrado que las vacuolas
vegetales cumplen activo en este tipo de mecanismo de exclusión molecular, ya que
son capaces de secuestrar el GF y por tanto, limitar su translocación (Ge et al.,
2010). Como es indicado en diferentes estudios, las malezas pueden combinar
distintas estrategias de resistencia al GF tanto a nivel poblacional (intraespecífico)
como en individual (Sammons & Gaines, 2014).
Además de las métodos practicados por los campesinos para lidiar con el control de
malezas resistentes, la agroindustria ha tratado de dar solución a estos problemas
mediante el desarrollo de nuevas variantes de cultivos transgénicos al GF, que
puedan tolerar altas tasa de aplicación del herbicida y que funcionen
apropiadamente (en términos de resistencias apiladas) en presencia de otros
productos agroquímicos (Gilbert, 2013). Pero como puntualizan Tranel et al. (2011),
es probable que en sitios en donde previamente se había reportado resistencia
múltiple a herbicidas, la efectividad en la siembra de estos nuevos CTGF sea
reiteradamente superada; una situación que podría convertirse en un inconveniente
44
inmanejable con las estrategias actualmente disponibles en el control integral de
plagas (Sammons & Gaines, 2014; Tranel et al., 2011).
Otra opción que ha desarrollado la agroindustria, ha sido la formulación de nuevas
mixturas de GF con adyuvantes, para así mejorar la actividad biocida en estos
productos (Annett et al., 2014; Benbrook, 2016). Sin embargo, la mayoría de estos
herbicidas tienen los mismos modos de acción, que antiguamente se han conocido
desde hace más de 30 años (Duke, 2012). Por lo tanto, a pesar de la inversión
económica que se ha hecho en el descubrimiento de pesticidas, ha habido un
innegable retrasado en la introducción de nuevos modos de acción para controlar la
evolución de resistencia en malezas frente a los herbicidas existentes (Bomgardner,
2011; Duke, 2012). Una de las razones que explican esta dilación, se debe a que
los CTGF hicieron que gran parte del mercado estuviera enfocado en la manufactura
de HBGF, ocasionando que históricamente hubiese una disminución en el estímulo
de investigación hacia distintos herbicidas (Duke, 2012).
Actualmente es reconocido que el GF puede tener impactos negativos en la
microbiota del suelo (Druille et al., 2016; Kremer et al., 2005; Newman et al., 2016;
Zobiole et al., 2010). Como es el caso de cualquier presión selectiva fuerte, es
predecible que en este contexto los microorganismos desarrollen distintos grados
de tolerancia al herbicida (Schlatter et al., 2017). Teóricamente, se ha planteado
que los genes asociados con resistencia al GF se pueden transferir de plantas (p.
ej. de CTGF o de malezas) hacia los microorganismos del suelo por medio de
transferencia horizontal génica (Li et al., 2015). No obstante, hasta el momento no
se encontrado resultados concluyentes de que este tipo de movimiento genético
ocurra por medios naturales en campo (van Bruggen et al., 2018; Wagner et al.,
2008). Por ejemplo, Wagner et al. (2008) estudiaron la probabilidad de transferencia
horizontal desde cultivos Roundup Ready® de soya hacia bacterias rizosféricas
Bradyrhizobium japonicum, en condiciones naturales de campo. Si bien los autores
detectaron dentro de los nódulos de las raíces la presencia transgénica del gen
epsps; al cultivar los aislamientos bacterianos (del nódulo) durante varias rondas en
45
presencia de altas dosis de GF, el gen epsps ya no se detectó, lo que puede indicar
que este tipo transferencia horizontal no fue estable en condiciones ambientales
(Wagner et al., 2008).
También se ha propuesto que los microorganismos han desarrollado
independientemente diferentes estrategias de resistencia al GF, que son similares
a los que presentan las plantas tolerantes al herbicida (van Bruggen et al., 2018).
Un mecanismo que ha sido ampliamente estudiado, corresponde a la capacidad
que tienen algunas especies de bacterias y hongos en degradar el GF, a través de
las enzimas glifosato oxidoreductasa o C-P liasa (Singh & Walker, 2006; Zhan et al.,
2018). Otra estrategia que se ha reportado para conferir resistencia al GF, concierne
a la sobreexpresión de genes que codifican para transportadores de membrana de
tipo MFS17, en bacterias gram (-) como Escherichia coli y Pseudomonas sp. (Staub
et al., 2012).
La resistencia microbiana a los antibióticos no solo ha representado un problema
para la salud pública, sino también, ha planteado un desafío para la productividad
agrícola; ya que varios de estos compuestos químicos, como la estreptomicina y la
oxytetraciclina, han sido útiles para el control de enfermedades bacterianas en
cultivos cítricos u ornamentales (McManus et al., 2002). Frente a este escenario,
Kurenbach et al. (2018) proponen que puede haber una relación entre la resistencia
a los herbicidas y a los antibióticos en los microorganismos, ya que estos al estar
expuestos a compuestos químicos no antibióticos, pueden estar más predispuestos
a desarrollar estrategias adaptativas que indirectamente conllevan a la resistencia
a antibióticos. Posiblemente, porque en la exposición de ambas sustancias, los
microorganismos enfrentan un estrés similar de tipo osmótico, ácido u oxidativo (Fei
et al., 2013).
17 La superfamilia de facilitadores principales (MFS, por sus siglas en inglés), corresponde a una superfamilia de transportadores de membrana proteico, que facilitan el movimiento (intra y extra celular) de pequeños sustratos (Staub et al., 2012).
46
En este orden de ideas, recientemente se ha presentado evidencia de que los
mecanismos que confieren tolerancia al GF también pueden conferir resistencia a
los antibióticos en microorganismos, particularmente, en bacterias de importancia
clínica (Kurenbach et al., 2018; Liu et al., 2013). Un estudio realizado por Fei et al.
(2013), identificó una cepa de Enterobacter transmitida por el suelo (NRS-1) que
podía tolerar concentraciones de GF de hasta 60 𝑔𝑥𝐿!", debido a que desarrolló
una mutación puntual en el gen epsps. Por otro lado, Kurenbach et al. (2015)
demostraron que la exposición de unas cepas de E. coli y Salmonella enterica
serovar Typhimurium a concentraciones de GF de aproximadamente 10 ppm,
indujeron un incremento en la resistencia a los antibióticos kanamicina y
ciprofloxacina. Por último, a través de ensayos de complementación de mutantes
deficientes de MSH en el organismo modelo Corynebacterium glutamicum, Liu et al.
(2013) encontraron que esta bacteria podía ser resistente al GF (en concentraciones
de 2.4 y 4.8 mM) y a múltiples antibióticos como gentamicina, eritromicina y
estreptomicina.
De acuerdo a todo lo anterior, el hecho de que los microorganismos tengan la
capacidad de desarrollar estrategias de tolerancia al GF y que indirectamente, esto
pueda llevar a la resistencia de antibióticos, significa que hay un potencial riesgo de
transmisión a lo largo de la cadena alimentaria: por la transmisión de
microorganismos resistentes en animales de granja (que consumen plantas
contaminadas en suelos agrícolas) hacia la población humana (Smith et al., 2005).
47
6. Propuesta experimental
En Colombia el uso del GF no se ha limitado exclusivamente al control de las
malezas - bajo las tasa recomendadas- en cultivos agroalimentarios; también, se ha
establecido como el agroquímico esencial para la erradicación de cultivos ilícitos, mediante la aspersión aérea, en la cual se utiliza a mayores concentraciones que la
tasa recomendada por las casas productoras de GF (Rincón-Ruiz & Kallis, 2013;
Solomon et al., 2007).
Al margen de esto, existe evidencia de que la aplicación generalizada de HBGF
puede conllevar a la contaminación de las capas superiores del suelo (Mamy et al.,
2016; Maqueda et al., 2017; Hébert et al., 2019); un escenario que incrementa la
posibilidad de que el GF o su principal producto de degradación tóxico, el ácido
aminometilfosfónico (AMPA), se acumulen en el entorno o alcancen otros ambientes
(p. ej. horizontes más profundos del suelo o también fuentes hídricas superficiales
y subterráneas) (Zhan et al., 2018; Gomes et al., 2014). Lo anterior, subraya la
importancia de evaluar estrategias ecológicas para degradar el glifosato sin dejar
que subproductos perjudiciales persistan en el medio ambiente.
Uno de los destinos del GF en el suelo es la mineralización por parte de los
microorganismos (Singh & Singh, 2016; Zhan et al., 2018), y actualmente es
reconocido que este es el mecanismo más eficiente, rápido y ambientalmente
sostenible para la remoción de GF en los ecosistemas (Seneff & Orlando, 2018). La
ruta más común en la biodegradación de este herbicida, involucra el clivaje del
enlace C-N por la enzima glifosato oxidoreductasa. El resultado de este proceso es
la liberación de AMPA y de glioxilato, que luego pueden ser metabolizados por los
microorganismos como fuentes de nitrógeno y carbono respectivamente (Guijarro
et al., 2018; Zhan et al., 2018). Una ruta alternativa involucra el clivaje del enlace C-
P, catalizado por la enzima C-P liasa (Zhan et al., 2018). El resultado de este
proceso es la liberación de fosfato y sarcosina, siendo el primero metabolizado
48
como fuente de fósforo, y el segundo, puede ser disociado en glicina mediante la
enzima sarcosina oxidasa (Sviridov et al., 2015; Zhan et al., 2018). En este contexto,
se ha demostrado que la ruta de la sarcosina oxidasa está presente en bacterias
como Lysinibacillus sphaericus (Gómez-Garzón et al., 2016; González & Dussán,
2017; Villegas & Dussán, 2018; Pérez & Dussán, 2019).
Lysinibacillus sphaericus es un bacilo Gram-positivo con espora terminal, cuyas
capacidades de promover el crecimiento vegetal (mediante la producción de ácido
indolacético) y de mejorar nutricionalmente el suelo (por su habilidad de solubilizar
el fósforo y fijar el nitrógeno), han sido ampliamente reportadas (Martínez & Dussán,
2018; Rojas-Tapias & Dussán, 2012; Aguirre-Monroy et al., 2019). Inicialmente, un
estudio in silico de Gómez-Garzón et al. (2016) sugirió la existencia del gen
sarcosina oxidasa en el genoma de L. sphaericus. Posteriormente, en ensayos in
vitro con medios mínimos de sales (MMS) en ausencia de fósforo, se reportó que L.
sphaericus podía degradar el GF por la vía metabólica de sarcosina oxidasa
(González & Dussán, 2017). Finalmente, en estudios en campo, se demostró la
capacidad de biodegradación de L. sphaericus en suelos rociados con 1.69
𝑚𝑔𝑥𝑚𝐿!" de GF (la concentración que corresponde en cultivos agrícolas en
Colombia) (Pérez & Dussán, 2019).
Dado que recientemente se discute en Colombia sobre autorizar el retorno de los
programas de fumigación aérea con GF para combatir la expansión de los cultivos
ilícitos; surgen interrogantes sobre los impactos a largo plazo que puede tener el GF
en la microbiota del suelo cuando se utilizan las concentraciones empleadas en
estos programas (generalmente, asperjados en una concentración de 5.07
𝑚𝑔𝑥𝑚𝐿!" de GF, es decir, 3 veces más que la concentración utilizada en cultivos
agrícolas). Con el objetivo de implementar una estrategia ecológica para mitigar los
efectos que puede tener el GF en las comunidades bacterianas (en concentración
de 5.07 𝑚𝑔𝑥𝑚𝐿!"), planteamos un experimento para evaluar la adición de
Lysinibacillus sphaericus como agente de biorremediación en suelos agrícolas del
Meta (Colombia) irrigados con Roundup747®.
49
6.1. Metodología
6.1.1. Sitio de estudio
En el Municipio de Acacías, Meta, ubicado en los Llanos Orientales de Colombia,
se plantea realizar un experimento de biorremediación de GF -en concentraciones
empleadas en erradicación de cultivos ilícitos - en suelos agrícolas, debido a que
este es uno de los departamentos del país en los cuales se busca reanudar la
fumigación aérea con este herbicida. El tipo de suelo en este territorio se caracteriza
por ser de textura fina y por tener un alto porcentaje de arena en su composición
granulométrica. También, son suelos que presentan un pH fuertemente ácido, con
una alta concentración de aluminio y con niveles medios de fósforo disponible.
Adicionalmente, suelen presentar escasa fertilidad debido a su bajo contenido de
materia orgánica.
6.1.2. Diseño experimental
El suelo será recolectado de un terreno agrícola en el Municipio de Acacias, Meta,
sin historia de uso previo con GF. Se realizará inicialmente un análisis fisicoquímico
y agrológico del suelo. Para el diseño experimental, se utilizarán recipientes
plásticos de 1.30 x 1.30 x 1.50 m, con los tratamientos que se presentan en la Tabla
1. Cada tratamiento tendrá 3 réplicas, para un total de 9 réplicas de tratamientos y
3 réplicas controles. Los 12 recipientes plásticos serán llenados con 5 kg de suelo
bien homogenizado y cernido, y posteriormente serán distribuidos aleatoriamente
en campo abierto. En caso de presentarse lluvias, los recipientes se taparán
temporalmente con plásticos transparentes. La concentración de GF utilizado en el
estudio corresponderá a 5.07 𝑚𝑔𝑥𝑚𝐿!", que es tres veces la concentración de
aspersión en cultivos lícitos. El experimento tendrá una duración total de 120 días.
A los días 0 y 60 del estudio, se aplicarán 500 mL de cada tratamiento
correspondiente en los montajes. En el caso del control, se aplicará 500 mL de agua
de la misma fuente utilizada para los demás tratamientos.
50
Tabla 1. Descripción de los tratamientos experimentales.
6.1.3. Cepas de L. sphaericus y preparación del inóculo
Para los tratamientos con L. sphaericus, se realizará un inóculo con una mezcla de
cinco cepas bacterianas: III(3)7, OT4b49, OT4b31, CBAM5 y 2362 (ver Tabla 2).
Cada cepa será cultivada en Agar de Recuento en Placa (en inglés Plate Count
Agar, PCA) (2 L), incubados a 30ºC por 48 h. Después de este periodo, las bacterias
se colectarán en 100 mL de agua destilada estéril, y serán conservadas a 4ºC hasta
su uso. Siguiendo lo planteado en el trabajo de Pérez et al. (2019), para la aplicación
de las bacterias en el suelo, las cinco cepas serán combinadas en único volumen
final de 100 mL de agua destilada estéril para obtener una concentración bacteriana
esperada entre 1𝑥10"" y 1𝑥10"# unidades formadoras de colonia (UFC)/mL.
Tabla 2. Cepas de L. sphaericus.
6.1.4. Determinación de nitrato y amonio
De acuerdo a la metodología seguida por Pérez et al. (2019), la concentración de
nitratos y amonio de muestras de suelo será determinado mediante test
colorimétricos comerciales utilizando el espectrofotómetro Spectroquant® . En el día
0 se recolectarán al azar cuatro muestras compuestas de suelo (100 g);
posteriormente, cada 40 días durante cuatro meses se tomarán a una profundidad
Tratamiento Ls G Ls + G C
DescripciónMezcla de las cinco
cepas de Lysinibacillus sphaericus
5.07 mg x mL de solución acuosa de
glifosato
Mezcla de las cinco cepas de Lysinibacillus sphaericus y 5.07 mg x mL de solución
acuosa de glifosato
Agua de la misma fuente utilizada para los otros tratamientos
Cepa Fuente de aislamiento Referencia L. sphaericus III(3)7 Suelo de bosque de roble (Rey et al., 2016)
L. sphaericus CBAM5 Suelo contaminado con hidrocarburos (Peña-Montenegro et al., 2015)L. sphaericus OT.4b31 Larvas de coleópteros (Peña-Montenegro & Dussán, 2013)L sphaericus OT.4b49 Larvas de coleópteros (Gómez-Garzón et al., 2016)
L sphaericus 2362 Cepa de referencia entomopatogénica de la OMS (Hernández-Santana et al., 2016)
51
de 15 cm, 100 g de suelo de cada uno de los montajes. Las muestras serán
refrigeradas a 4ºC hasta el procesamiento.
6.1.5. Determinación de glifosato y AMPA
El análisis de GF y AMPA será determinado usando UHPLC-MS/MS en la
Universidad de los Andes o en una compañía privada acreditada en análisis químico
de herbicidas. Los estándares que se utilizarán para la calibración del método
cromatográfico, corresponderán a isotopos marcados (13C) de GF y AMPA. El
análisis se realizará para las tres réplicas de los siguientes tratamientos: suelo con
GF y suelo con L. sphaericus más GF. Las muestras para la determinación química
(~5 g de tierra), serán tomados cada 40 días. Únicamente el tratamiento del suelo
con GF, será analizado el día 0 por triplicado.
6.1.6. Amplificación de la subunidad alfa del gen sarcosina oxidasa (soxA)
Para determinar la presencia del gen sarcosina oxidasa (soxA) en los montajes, se
realizarán amplificaciones por PCR utilizando los primers específicos de la
subunidad alfa del gen sarcosina oxidasa (SarF y SarR), propuestos en el trabajo
de Pérez et al. (2019). Los parámetros de temperatura y ciclos de PCR, se siguieron
de acuerdo a la metodología de de González & Dussán (2017). Para esto, se
recolectarán muestras de suelo (1 g) cada 40 días durante cuatro meses, de las tres
réplicas de los siguientes tratamientos: suelo con L. sphaericus y suelo con L.
sphaericus más GF. Para la extracción de ADN en las muestras del suelo, se usarán
kits comerciales según las especificaciones del fabricante. El ADN obtenido será
cuantificado por un espectrofotómetro NanoDrop. La electroforesis de los productos
de PCR (con un tamaño aproximado de 70 pb) serán visualizados en geles de
agarosa al 1.2% de concentración. Posteriormente, los productos de PCR serán
purificados y secuenciados por el método Sanger en el Laboratorio de
Secuenciación de ADN de la Universidad de los Andes. Los productos de
secuenciación se analizarán en el Servidor BLASTn (NCBI) para confirmar la
identidad del gen sarcosina oxidasa.
52
6.1.7. Determinación de Unidades Taxonómicas Operativas (UTOs)
De las mismas muestras anteriores de suelo, se realizará la amplificación de la
región V1-V3 del gen 16S RNAr en paralelo con su secuenciación en la plataforma
Illumina MiSeq. Para la determinación de UTOs, se seguirán los parámetros
propuestos por Schlatter et al. (2017). De los resultados obtenidos en la
secuenciación, la taxonomía se asignará a las secuencias representativas de UTO
utilizando bases de datos de referencia como Greengene Database. Las UTOs
serán filtradas para eliminar cualquier UTO no bacteriana y para aquellas
clasificadas como mitocondrias o cloroplastos. Posteriormente, para comparar las
comunidades microbianas obtenidas, se calcularán las distancias UniFrac después
de que las UTOs se alinearan con las referencias de 16S RNAr en las bases de
datos (utilizando herramientas de alineación de secuencias como PyNAST).
6.1.9. Análisis de datos
Para el análisis datos de amonio, nitrato, GF y AMPA, se seguirán los parámetros
propuestos por Pérez et al. (2019). Las concentraciones de amonio, nitrato, GF y
AMPA serán analizados por análisis de varianza (ANOVA), seguido por los tests de
Tukey-Kramer (HDS). Antes de realizar los análisis estadísticos, se evaluará el
supuesto de normalidad de los datos por el test de Shapiro. La agrupación de los
tratamientos se realizará de acuerdo con la diferencia significativa entre las medias
de tratamiento y el grupo control. Todas las pruebas estadísticas se realizarán
utilizando un valor de significancia (α) de 0.05 para rechazar la hipótesis nula. Los
análisis estadísticos serán llevado a cabo en el software R del R Core Team (2013).
Para el análisis de UTOs, se seguirá los parámetros propuestos por Schlatter et al.
(2017). En términos generales, se realizarán análisis de PERMANOVA (para
analizar si los clústeres de comunidades difieren entre tratamientos) utilizando
distancias UniFrac ponderadas para evaluar la importancia del GF en la estructura
de las comunidades bacterianas. Seguido, se realizarán tests de Kruskal Wallis. Las
53
medidas de riqueza y diversidad en los tratamientos (Índice de Shannon e inverso
de Simpson) se estimarán a partir de los UTOs obtenidos, y se evaluaran mediante
análisis de ANOVA. Por último, utilizando herramientas como DEseq2, se
identificarán taxones bacterianos diferencialmente abundantes que fueron impactos
por el tratamiento con GF. Todas las pruebas estadísticas se realizarán utilizando
un valor de significancia (α) de 0.05 para rechazar la hipótesis nula. Los análisis
estadísticos serán llevado a cabo en el software R del R Core Team (2013).
6.2. Resultados esperados
1. Efectos del glifosato en la estructura y diversidad de las comunidades
bacterianas: Se espera encontrar clústeres distintos de comunidades bacterianas
entre suelos tratados con GF y suelos sin tratar con GF (en concentraciones tres
veces la usada para cultivos agrícolas). En contraste, se espera encontrar clústeres
similares de comunidades bacterianas en suelos con presencia de L. sphaericus
(con y sin aplicación de GF). Adicionalmente, se espera que los patrones de riqueza
y diversidad de especies sean mayores en suelos no tratados con GF. La razón
detrás de esto es que posiblemente L. sphaericus al degradar el GF y el AMPA,
permiten que otros microorganismos más sensibles al GF puedan ser resilientes a
la perturbación generada por el herbicida.
2. Disminución de GF y AMPA en el suelo: Dado que las características del suelo
(en el sitio de estudio) favorecen que el GF esté biodisponible, y además, teniendo
en cuenta que L. sphaericus tiene la ruta metabólica de sarcosina oxidasa; se
espera encontrar una disminución significativa de estos compuestos en suelos
tratados con L. sphaericus y GF. Así mismo, se espera una amplificación positiva
para el gen de sarcosina oxidasa (soxA) únicamente en el tratamiento de L.
sphaericus con GF, ya que la presencia del herbicida induce la activación de esta
vía de biodegradación.
54
3. Concentraciones de nitrato y amonio en el suelo: Dado que L. sphaericus es una
bacteria fijadora de nitrógeno, se espera encontrar un aumento significativo en las
concentraciones de estos compuestos en los tratamientos con L. sphaericus. Este
resultado indicaría que el GF no interfiere con el papel de nitrificación de L.
sphaericus.
8. Discusión y Conclusiones
El uso intensivo de HBGF para el control de malezas en operaciones agrícolas, o
para la erradicación de cultivos ilícitos en programas de fumigación aérea, ha
conllevado a la contaminación de los suelos y de las áreas circundantes; lo cual
pone en riesgo la diversidad y funcionalidad de las comunidades microbianas que
habitan en estos ambientes. Si bien, aunque un gran número de los trabajos
consultados para este artículo establecen que la aplicación de GF a las tasas
recomendadas en campo o por debajo de las mismas suponen un riesgo menor
para los microorganismos del suelo; es importante aclarar que existe gran
variabilidad entre los resultados obtenidos por estas investigaciones, lo que dificulta
llegar a conclusiones más precisas. Algunos de los factores identificados que
contribuyen a esta variabilidad, son los siguientes: (1) la compleja interacción entre
los microorganismos y el GF, que dependen en gran medida de las propiedades del
suelo; (2) existe una variación inherente al microbioma asociado a las plantas, por
diferencias en el tipo de cultivo y las características del suelo; (3) el uso limitado
técnicas de alta resolución para evaluar la respuesta de los microorganismos frente
a la exposición con GF, dificulta la obtención de datos bajo un nivel de detalle más
específico (a nivel taxonómico y funcional); y (4) los HBGF varían
considerablemente en la formulación comercial, lo que puede inducir una respuesta
diferencial en la microbiota del suelo según los ingredientes presentes en estos
productos.
55
No obstante las limitaciones señaladas, es posible establecer unas conclusiones
puntuales de esta revisión de literatura: primero, hay una tendencia de que el
impacto adverso del GF puede ser mayor en las comunidades microbianas del suelo
a medida que aumenta su tasa de aplicación. Dado que en la agricultura se suelen
utilizar tasas altas de GF, y teniendo en cuenta que en los programas de fumigación
de cultivos ilícitos, el GF asperjado es más concentrado y en mayores dosis que los
niveles máximos establecidos por el fabricante; es prudente afirmar que para
prevenir daños directos o indirectos en la biodiversidad del suelo, la recomendación
es utilizar este herbicida en las tasas estrictamente prescritas y reconsiderar su
aplicación generalizada en contextos agrícolas y no agrícolas. Segundo, se ha
demostrado que los HBGF pueden causar alteraciones en las defensas fisiológicas
de las plantas, haciendo que estas sean más susceptibles a enfermedades
transmitidas por el suelo. Tercero, los HBGF tienen el potencial de la alterar la
ecología de las comunidades microbianas, al promover el crecimiento de
fitopatógenos y en suprimir microrganismos benéficos del suelo. Y cuarto, la
aplicación intensiva de HBGF ha provocado la emergencia de microorganismos
resistentes al glifosato, con la probabilidad de también desarrollar mecanismos de
resistencia a los antibióticos.
Los resultados de este trabajo señalan que el impacto del GF no se limita
únicamente a la inhibición de la enzima EPSPS en plantas objetivo indeseadas (bien
sea en cultivos agrícolas o ilícitos), sino que puede tener implicaciones ambientales
en una escala mucho mayor, consiguiendo afectar la estructura de las comunidades
microbianas del suelo y el papel que pueden cumplir en distintos servicios
ecosistémicos. Estos resultados brindan la oportunidad para el desarrollo de nuevos
estudios interdisciplinares que permitan consolidar más evidencia científica
respecto de las conclusiones de la presente revisión.
56
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