MONITOREO DE LA FOTOSINTESIS EN PLANTAS MEDIANTE TECNICAS FOTOTERMICAS

Clave: 2006-1425 ECU: CICATA Legaria Director: Dr. José Antonio Calderón Arenas 1.- RESUMEN

Por las características que presenta el lirio acuático, éste se ha logrado establecer en los diferentes cuerpos de agua de regiones tropicales y sub-tropicales del mundo como una maleza, con consecuencias sumamente desfavorables tanto para el hábitat en el que se propaga así como para las diferentes actividades humanas que están relacionadas y que dependen de este medio. Es por ello que se reporta la aplicación de la Técnica Fotoacústica en el monitoreo de la evolución de oxígeno fotosintético en lirio acuático (Eicchornia Crassipes) con la perspectiva de utilizar este sistema en el monitoreo del efecto del ultrasonido y radiaciones de alta energía en la evolución y propagación del lirio acuático.

En este trabajo se realiza la implementación de la Técnica Fotoacústica resuelta en tiempo para el monitoreo de la fotosíntesis en plantas en el laboratorio de Técnicas Fototérmicas del CICATA Unidad Legaria. Además, se presenta el diseño y construcción de una celda fotoacústica apropiada para la medición de fotosíntesis en plantas con la ventaja de una base amplia a la entrada de la cámara para mejorar la adherencia de la hoja durante la medición, y por consiguiente una disminución en la razón ruido-señal.

También, en este trabajo de tesis, se diseñó y construyó un acuario-invernadero, en el laboratorio de Física Aplicada de CICATA Unidad Legaria, con control de los parámetros más significativos como: temperatura, humedad, iluminación, nutrición, ventilación y flujo de agua. Finalmente, se realizó el monitoreo de la evolución de las contribuciones fototérmica y fotobárica a diferentes frecuencias de modulación para incidencias en el haz y el envés. Se presentó un estudio de la evolución del oxigeno fotosintético y el almacenamiento de energía. Asimismo, se presentan los resultados de la medición del espectro de absorción óptico en las hojas de lirio acuático mediante la técnica de Espectroscopia Fotoacústica.

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2.- INTRODUCCIÓN

LAS TÉCNICAS FOTOTÉRMICAS.

El Efecto Fotoacústico (FA) es la base de la técnica que lleva su nombre y que forma parte de un conjunto de técnicas experimentales que se conocen como fototérmicas. En estas técnicas, la energía luminosa se hace incidir de forma periódica sobre el material investigado (en estado sólido, líquido o gaseoso) siendo parte de ella absorbida y parcialmente transformada en calor como resultado de procesos de desexcitación a escala atómica y molecular, como se muestra esquemáticamente en la figura 1.1. La temperatura del material varía entonces con la misma periodicidad que lo hace la radiación incidente, induciendo cambios en los parámetros del material (y/o del medio en el que se encuentra) dependientes de ella. La detección de estas variaciones es la base de los diferentes esquemas experimentales.

Figura. 1. Algunos efectos fototérmicos. En la técnica FA (Fig. 1), la muestra a investigar es colocada en una celda cerrada que contiene aire u otro gas. Como resultado de la absorción de radiación modulada, el material se calienta, transmitiéndose el calor a una capa de gas adyacente a la superficie iluminada de la muestra. Esta capa de gas se calienta entonces periódicamente, expandiéndose y contrayéndose, y actuando como un pistón sobre el resto del gas contenido en la celda. Se genera así una onda acústica o de presión que puede ser detectada con un micrófono colocado también dentro de la celda. Las técnicas fototérmicas, pueden ser utilizadas para medir diferentes propiedades de materiales o para estudiar diferentes procesos fisicoquímicos que tienen lugar en ellos. Para comprender por qué esto es posible, basta observar que el proceso de generación de una señal fototérmica consta de tres pasos fundamentales, que dependen a su vez de un grupo particular de estas propiedades:

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Figura 2. Representación esquemática de una celda fotoacústica utilizada en la técnica basada en el efecto del mismo nombre.

1- Absorción de la radiación luminosa: Este proceso depende de las propiedades ópticas de la muestra, por ejemplo del llamado coeficiente de absorción óptico, que determina cuánta energía luminosa puede ser absorbida para luz de determinado color. 2- Transformación de la energía luminosa en calor. Este mecanismo depende de aquellos mediante los cuales los átomos y moléculas que componen el material investigado realizan dicha transformación, y por lo tanto de las propiedades que los caracterizan. La eficiencia de conversión, es decir, la razón o cociente entre la energía total absorbida y la porción de ella transformada en calor, es una de estas propiedades. 3- Difusión del calor generado a través de la muestra, proceso que depende de propiedades que caracterizan este proceso, como la conductividad térmica, k, la capacidad calorífica, C=ñc, donde ñ es la densidad y c el calor específico, la difusividad térmica, α=k/C, y la efusividad térmica, ε=(kC)1/2.

EL LIRIO ACUÁTICO (EICHHORNIA CRASSIPES) Esta planta recibe el nombre vulgar de jacinto de agua o lirio acuático por su vistosa inflorescencia de flores violeta que le asemejan hasta cierto punto a las flores del jacinto. De nombre científico Eichornia Crassipes es una planta libre flotadora, una hidrophyta emergente, perteneciente a la familia de las Pontederiáceas. Originaria de América del Sur (Amazonas), la que por la belleza de su flor se ha diseminado a casi todas las áreas tropicales y sub-tropicales del mundo. Su rápida reproducción, así como la ausencia de enemigos naturales en los nuevos lugares de su introducción, además de su excelente capacidad de adaptación a casi cualquier cuerpo de agua, han provocado la rápida diseminación de la planta, convirtiéndose así en una maleza. Esto ha traído como consecuencia que actividades económicas importantes, como la navegación en ríos y lagos, la pesca, reducción del área hidráulica, incremento en el coeficiente de rugosidad (factor que interviene en la velocidad de escurrimiento en conductos abiertos), desarrollo de poblaciones de mosquitos vectores de enfermedades y la irrigación en la agricultura se han afectado sensiblemente en las áreas invadidas por la maleza. Una extensa cobertura del jacinto o lirio acuático provoca una evapotranspiración tres-cuatro veces superior a la que normalmente

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ocurre en superficies de agua libre, lo que genera también pérdida de agua, sobre todo en el período de sequía. No menos dañino es el efecto que ocasiona la maleza cuando ésta llega a los generadores de las estaciones hidroeléctricas, lo que provoca cortes eléctricos de determinada duración hasta que los generadores son limpiados de tejidos de la planta. El problema más serio es el de la adopción de medidas de control (ya sea físico o mecánico, químico y biológico) que sean técnicamente efectivas, económicamente viables y que resulten ambientalmente compatibles. Es por estas razones que surge la necesidad de incorporar al estudio de estas medidas de control nuevas tecnologías, siendo en este caso, la técnica fotoacústica, que por sus propiedades no invasivas, destructivas ni dejenerativas, además de que se basen en muy sólidos principios y que la mayoría de sus esquemas experimentales no sean en extremo complejos, sea idónea para aplicarla a esta problemática. El objetivo de este trabajo es llevar a cabo la implementación de la TFA resuelta en tiempo para el monitoreo de la fotosíntesis en plantas en el laboratorio de física aplicada de CICATA Unidad Legaria, así como, mostrar la aplicación de esta técnica al estudio de la fotosíntesis en el lirio acuático. 3.- METODOS Y MATERIALES DISEÑO Y FABRICACIÓN DE LA CELDA FOTOACUSTICA

Se llevó a cabo el diseño y fabricación de la celda FA adecuada para la realización de las mediciones de fotosíntesis. En la figura se muestra una fotografía de dicha celda terminada. La principal diferencia radica en la amplitud de la base de la abertura donde se coloca la hoja de la planta a medir, ya que en las celdas ordinarias dicha base tiene un área muy pequeña que provoca una hermiticidad en la cámara FA poco confiable, lo cual conduce a una disminución de la intensidad de la señal detectada y por consiguiente valores altos de la razón ruido/señal.

base

cámara FA electreto

interruptor

conector BNC

soporte

Figura 3. Fotografías de la celda FA terminada

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En la figura 4 se muestra un esquema de la celda FA, en la configuración de difusión. La hoja se adhiere con grasa de vacío en la entrada de la cámara, de manera que una de las caras de la muestra esta en contacto con el aire en la cámara y la otra descansa en un portaobjetos que la mantiene rígida sobre la base como se ilustra. Si se hace pasar radiación modulada a través de la ventana de cuarzo de manera que incida en la cara trasera de la muestra, entonces, la energía luminosa absorbida por ésta genera una señal FA a la salida del transductor acústico acoplado a la celda, la cual es la suma de dos contribuciones: 1.- La respuesta fototérmica, que resulta de la conversión total o parcial de la luz (modulada) absorbida a calor modulado (ondas térmicas) la cual es luego transformada a una señal acústica. 2.- La respuesta fotobárica, debida a la evolución de oxigeno fotosintético modulado, generado por la excitación periódica del aparato fotosintético.

Figura 4. Esquema de la Celda Fotoacústca. (a) Celda FA, (b) ventana de cuarzo, (c) cámara FA, (d) detector, (e) hoja, (f) portaobjetos, (g) luz, (h)respuestas fototérmica y fotobárica .

ESQUEMA DE MEDICIÓN

En la figura 5 se muestra el montaje experimental de la TFA para medición de fotosíntesis en plantas. El haz de luz blanca continua, proveniente de una lámpara de xenón, pasa por un modulador mecánico (chopper), cuya señal se encuentra en referencia con el amplificador lock-in; posteriormente, el haz modulado emergente se hace pasar por un monocromador, el cual selecciona la longitud de onda a la que deseemos trabajar; así, la luz modulada guía incide sobre la CFA donde previamente se ha colocado la muestra; por otro lado, la luz continua incide directamente sobre la CFA; ambos haces de luz inciden simultáneamente sobre la muestra vía una fibra óptica bifurcada; el monocromador se encuentra en interfase con el computador; una vez obtenida la señal de la CFA, esta se dirige hacia el amplificador lock-in, el cual filtra las señales que no se encuentren a la frecuencia de referencia y amplifica la señal proveniente de la CFA; finalmente, la amplitud y fase de la señal es registrada y almacenada en un computador en función del tiempo de exposición. La Fig. 6 muestra una fotografía del montaje de medición.

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lámpara de xenon

chopper monocromador CFA +

interfacefiltro IR

de

agua

computador gráficoluz

señal de referencia

señal de la CFA

lámpara de xenon

Luz chopper monocromador CFA +

muestra

interface filtro IR

de agua

amplificador Lock - in

amplificador Lock - in computador gráfico

luz

continua

Figura 5. Esquema de medición de la TFA para monitoreo de la tasa fotosintética.

Figura 6. Fotografía del montaje de la TFA para monitoreo de la tasa fotosintética

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COMPONENTES DEL SISTEMA Fuentes Luminosas Como fuente de radiación a la entrada del monocromador se utilizó la fuente de Xenón que se muestra en la Fig. 7, la cual consiste de una lámpara de Xenón de 1000 W alimentada de una fuente de poder, ambas de la marca Oriel Instruments.

Fig. 7 Fotografía de la lámpara de Xenón alimentada de su fuente de poder

Se utilizó una fuente de radiación de halógeno para generar la luz continua de fondo, que consiste de una lámpara de halógeno de 1000 W alimentada de su fuente de poder, ambas de Oriel Instrumens. La Fig. 7 es también representativa de la fuente de halógeno. Además, se utilizó un láser de helio-neón de 35 mW de potencia a una longitud de onda de 633 nm como fuente de radiación monocromatrica, el cual se mostra en la Fig. 8.

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Figura. 8. Fotografía de láser de He-Ne de 35 mW con fuente. Modulador mecánico EL modulador electromecánico o chopper es utilizado para modular la luz continua y se controla por medio de una de las salidas de voltaje del lock-in, Fig. 9. Este modulador consta de un disco rasurado con 6 aspas a través del cual se hace pasar la luz láser incidente sobre la muestra. Al variar el voltaje de alimentación del modulador se cambia la frecuencia de giro del disco ranurado y se pueden obtener diversos valores para la señal producida en las muestras.

Figura 9. Fotografía del modulador mecánico mod. 340CD de Stanford Research Inc..

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Monocromador Un monocromador es un dispositivo para obtener radiación monocromática a partir de una fuente policromática. Su función principal es proporcionar un haz de energía radiante con una longitud de onda nominal y una anchura de banda dada. La salida espectral de cualquier monocromador usado con una fuente de radiación continua, independientemente de su distancia focal y anchura de rendijas, consiste de una gama de longitudes de onda con un valor promedio de longitud que se presenta en el indicador del monocromador. La función secundaria de un monocromador consiste en el ajuste del rendimiento de energía. Este puede aumentarse, aumentando el ancho de la rendija de salida, a costa de una mayor anchura de banda espectral que puede introducir desviaciones a la ley de Beer, porque ésta exige radiación monocromática. Sin embargo, los anchos de rendijas excesivamente pequeños provocan rendimientos de baja energía en la señal del detector, afectando la sensibilidad analítica como resultado de la degradación de la relación señal-ruido. Un sistema monocromador consiste básicamente de lo siguiente:

- Una rendija de entrada que proporciona una imagen óptica estrecha de la fuente de radiación. - Un lente colimador que hace paralela la radiación procedente de la rendija de entrada. - Una red de difracción o un prisma para dispersar la radiación incidente. - Un segundo lente colimador para reformar las imágenes de la rendija de entrada sobre la rendija de salida.

- Finalmente, una rendija de salida para aislar la banda espectral deseada, bloqueando toda la radiación dispersada excepto la del intervalo deseado. El funcionamiento de un monocromador comprende tres aspectos correlacionados: pureza de la radiación de salida, resolución y poder de captación de luz. La pureza la determina principalmente la cantidad de radiación dispersada mientras que la resolución depende de la dispersión y perfección en la formación de la imagen. Se requiere un poder de dispersión grande y un alto poder resolutivo en un monocromador, para medir con precisión las líneas discretas en los espectros de emisión o absorción atómica y para obtener los espectros de bandas angostas de absorción molecular.

Figura 10. Esquema Óptico del Monocromador Cornerstone 130 1/8

El monocromador que se utilizó durante este trabajo (Fig. 11) fué uno tipo Cornerstone 130 de 1/8 m marca Oriel Instruments.

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Figura 11. Fotografía del monocromador de 1/8 de m.

Amplificador Lock-in Los amplificadores Lock-in son utilizados para detectar y medir señales muy pequeñas de CA, muchas veces en el rango de nanovolts. Con este tipo de amplificadores se pueden lograr mediciones muy precisas aun cuando la señal se encuentre en presencia de fuentes de ruido externas de magnitudes aun mayores a la misma señal. Estos amplificadores usan una técnica conocida como detección sensible a la fase, con la cual separan la componente de la señal a una fase y frecuencia de referencia especificas. Las señales de ruido con frecuencias que difieren de la frecuencia de referencia son rechazadas. Un amplificador Lock-in tiene la capacidad, además, de generar señales de voltaje, por lo que en pocas palabras se le considera un convertidor analógico-digital-analógico. Esta característica es utilizada en nuestro sistema para controlar el modulador electromecánico a través de una de las cuatro salidas de voltaje con las que se cuenta. En este trabajo se utilizó un amplificador Lock-in SR850 de Stanford Research Systems cuyo esquema se muestra en la Fig. 12.

Figura 12. Panel frontal del Amplificador SR 850

Esencialmente, un amplificador lock in es un filtro con un ancho de banda arbitrariamente chico, que es sintonizado a la frecuencia de la señal. Este filtro rechazará la mayor parte del ruido no deseado y permitirá la medición de la señal. Además del filtrado, un lock-in provee una amplificación muy elevada.

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Tarjeta de adquisición de datos GPIB Bus es un anglicismo que regularmente se utiliza como sinónimo de autobús, sin embargo, en informática se interpreta como “transporte”. Bus significa enlace o vía de interconexión común. Un bus es un sistema de interconexión que permite la transferencia de información entre componentes del ordenador y con otros dispositivos externos. A diferencia de una conexión punto-a-punto, un bus puede conectar mediante lógica varios periféricos utilizando el mismo conjunto de conexiones. En el bus todos los nodos reciben los datos aunque no se dirijan a todos los nodos, los nodos a los que no van dirigidos simplemente lo ignoran. El original bus de interfase de propósitos generales, denominado GPIB por sus siglas en ingles General Purpose Interface Bus, tuvo su inicio en al final de los años 60 cuando Hewlett-Packard desarrollo un bus estándar de datos digital de corto rango, llamado HP-IB por sus siglas del inglés Hewlett Packard Instrument Bus, para conectar dispositivos de test y medida que HP fabricaba (como multímetros, osciloscopios, etc ) con dispositivos que los controlaban, como un ordenador. Con la introducción de controladores digitales y de equipo de prueba programable, la necesidad se presentó para un interfaz estándar, de alta velocidad de comunicación entre los instrumentos y controladores de varias firmas. En 1975, el Instituto de Ingeniería Eléctrica y Electrónica (IEEE) desarrolló la ANSI/IEEE 488-1975 estándar, una interfaz estándar digital para la instrumentación programable, que contenía las especificaciones eléctricas, mecánicas, y funcionales de un sistema de interconexión. La original IEEE 488-1975 fue revisada en 1978, sobre todo para la clarificación editorial y la adiciones. Este bus ahora se utiliza por todo el mundo y es conocido con tres nombres:

- General Purpose Interface Bus (GPIB) - Hewlett-Packard Interface Bus (HP-IB) - IEEE 488 Bus

Figura 13. Fotografía de la tarjeta de adquisición de datos GPIB del tipo insertable

de National Instruments. En 1990, la especificación de IEEE 488.2 incluyó los Comandos Estándares para la Instrumentación Programable (SCPI). SCPI define los comandos específicos que cada clase del instrumento (que incluye generalmente los instrumentos de varias marcas) debe obedecer. Así,

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SCPI garantiza compatibilidad y la flexibilidad de configuración completas del sistema entre estos instrumentos. No requiere de un largo aprendizaje el diverso sistema de comandos para cada instrumento en un sistema de SCPI-compliant, y es fácil sustituir un instrumento de una marca por un instrumento de otra. Ahora, las GPIB se encuentran en casi todos los instrumentos de más de $1000 usd. Los instrumentos del bajo costo utilizan los interfaces RS232. Mientras que el índice de transferencia había sido de 1 Mbyte, más que suficiente en los últimos 25 años, las computadoras de hoy y algunos instrumentos alcanzan el límite del sistema del bus. No obstante, para cerca de 98% de los usos, la velocidad no es una preocupación. El 2% restante pudieran beneficiarse de velocidades más altas de transferencia. Programa de control LabView LabVIEW es una herramienta gráfica de programación, esto significa que los programas no se escriben sino que se dibujan, que incluye funciones integradas para la realización de adquisición de datos, control de instrumentos, análisis de mediciones y presentaciones de datos. El lenguaje que usa se llama lenguaje G. Este programa fue creado por National Instruments (1976) para funcionar sobre máquinas MAC, salió al mercado por primera vez en 1986. Ahora está disponible para las plataformas Windows, UNIX, MAC y Linux y va en la versión 8.0 (Dic. 2005). Los programas hechos con LabVIEW se llaman VI (Virtual Instrument), lo que da una idea de uno de sus principales usos: el control de instrumentos. El lema de LabVIEW es: "La potencia está en el Software". Ésto no significa que la empresa haga únicamente software, sino que busca combinar este software con todo tipo de hardware, tanto propio -tarjetas de adquisición de datos, PAC, Visión, y otro Hardware- como de terceras empresas. Un programa se divide en Panel Frontal y Diagrama de bloques. El Panel Frontal es el interfaz con el usuario, en él se definen los controles e indicadores que se muestran en pantalla. El Diagrama de Bloques es el programa propiamente dicho, donde se define su funcionalidad, aquí se colocan iconos que realizan una determinada función y se interconectan. Es usado principalmente por ingenieros y científicos para tareas como:

• Adquisición de datos • Control de instrumentos • Automatización industrial o PAC (Controlador de Automatización Programable) • Diseño de control: prototipaje rápido y hardware-en-el-bucle (HIL)

Su principal característica es la facilidad de uso, personas con pocos conocimientos en programación pueden hacer programas relativamente complejos, imposibles para ellos de hacer con lenguajes tradicionales. También es muy rápido hacer programas con LabVIEW y cualquier programador, por experimentado que sea, puede beneficiarse de él. Para los amantes de lo complejo, con LabVIEW pueden crearse programas de miles de VIs (páginas de código) para aplicaciones complejas, programas de automatizaciones de decenas de miles de puntos de entradas/salidas, etc. Incluso existen buenas prácticas de programación para optimizar el rendimiento y la calidad de la programación.

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LapView presenta facilidades para el manejo de interfaces de comunicaciones: puerto serie, puerto paralelo, GPIB, USB, etc., capacidad de interactuar con otras aplicaciones: ActiveX, Matlab, Simulink...etc., herramientas para el procesado digital de señales, visualización y manejo de gráficas con datos dinámicos, adquisición y tratamiento de imágenes, control de movimiento, tiempo real estrictamente hablando, programación de FPGAs, sincronización. LabVIEW está altamente integrado con el hardware de medida, con lo que se puede configurar y usar rápidamente cualquier dispositivo de medida que se tenga. LabVIEW puede conectarse a miles de instrumentos de medida para construir sistemas de medida completos, incluyendo desde cualquier tipo de instrumento autónomo hasta dispositivos de adquisición de datos, controladores de movimiento y sistemas de adquisición de imagen. Además LabVIEW trabaja con más de 1000 librerías de instrumentos de cientos de fabricantes, y muchos fabricantes de dispositivos de medida incluyen también herramientas de LabVIEW con sus productos. Celda Fotoacústica Las características de la celda fotoacústica CFA se describieron en la sección 5.2, por lo cual en esta parte solo se mencionará el tipo de transductor acústico más utilizado como detector en este tipo de celda.

Micrófono de Electreto En la Fig. 14 se muestra un esquema típico de un micrófono de electreto. El radio interno de la cámara es de 3.5 mm y su espesor de 1 mm. La abertura donde ingresan las ondas acústicas tiene un radio aproximado de 1.5 mm. La variación de la presión en la cámara da lugar a una flexión en el diafragma de electreto, la cual origina un voltaje V a través del resistor R. Este voltaje después alimenta a un pre-amplificador FET (field efect transistor) ya incluido en el micrófono. La ventaja de este transductor es su bajo costo (∼ 2-3 USD) y alta sensibilidad, sin embargo presenta una pobre amplificación de la señal, frágil estructura física y un diafragma (y por tanto una señal de respuesta) inestable a condiciones ambientales no optimas (humedad, temperatura, presión, ambientes corrosivos, etc.)

(b) (a)

Figura 14. (a) Esquema y (b) fotografía de un típico micrófono de electreto

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AUTOMATIZACIÓN DEL SISTEMA Para llevar a cabo la automatización del sistema, fue necesario elaborar un programa a través de instrumentos virtuales para trabajos de investigación mediante la Técnica Fotoacústica y emplea el lenguaje de programación LabVIEW que usa íconos en lugar de líneas de texto para crear aplicaciones. El sistema inicia detectando la correcta comunicación entre la tarjeta GPIB y el software LabVIEW así como el encendido del sistema. Igualmente detecta la comunicación con el amplificador lock-in configurando el sistema para recibir datos externos. Se definen el intervalo de lectura (3seg.) y el rango de frecuencia (64hz); se realiza un ajuste matemático (intervalo de lectura x 1000) + 500 = 350 y rango de frecuencia x intervalo de lectura = 192. El primer módulo (inicitialize.vi) envía el intervalo de lectura a la función de ajuste donde se ingresarán los datos de lectura. El otro dato, rango de frecuencia, se envía al modulo de lectura de datos (read_trace.vi) esperando los resultados de la función de ajuste. El módulo Trace scan.vi configura el tipo de datos a capturar así como el intervalo de lectura y rango de frecuencia. El tipo de datos seleccionado identifica algún error o advertencia (I32) y se determinan tres de cuatro datos posibles configurados de la siguiente manera: Trace 1: 300, Trace 2: 400, Trace 3: 1200, Scan Mode: false. Una vez configurado el modo de captura de datos, el módulo Config_input.vi determina el canal por el cual el amp. Lock-in enviará los datos, en este caso será por el canal A. El módulo Config.signal_conditioning.vi determina el valor de la sensitividad (20mV/nA), la Cte. de tiempo (1 seg.) y la ganancia (off). Hasta este momento la captura de datos del sistema no ha dado inicio, todo se ha concentrado en la configuración del sistema. Ya configurado el sistema el módulo de la función de ajuste determina el número de datos a capturar combinando este con los datos obtenidos. A partir de este momento el sistema manda instrucciones al chopper para que gire a la frecuencia indicada y así cortar el haz de luz incidente en la muestra para calentarla de manera intermitente. Debido a la conversión de energía luminosa en calor dentro de la muestra y a la subsecuente difusión de calor y conversión en fluctuaciones de la celda, el micrófono detectará las variaciones de presión y la transformará en una señal eléctrica que es enviada al amplificador lock-in y registrada en amplitud y fase. El amplificador lock-in enviará a través del Canal A los datos registrados por el micrófono filtrando el ruido de la señal enviada. El módulo se detiene automáticamente al concluir con los datos capturados. Mientras, a la misma función de ajuste se le determina el número de aspas del chopper. Este dato se combina con el

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intervalo de tiempo de captura de datos correspondiente. Dentro de este módulo hay una subrutina Run_stop.vi (start/continue) que es la que da el tiempo de espera para la captura de datos y es regida por el intervalo de tiempo definido. Terminada la captura de un dato, se envía a las subrutinas Read_trace.vi junto al rango de frecuencia el valor de la captura. Hay tres módulos read_trace.vi (Trace 1, Trace 2, Trace 3). Uno de estos tres módulos controla los datos que grafican la amplitud vs frecuencia ; otro módulo grafica la fase vs frecuencia y el tercer módulo controla el almacenamiento de datos en un archivo. Este proceso se realiza dato por dato. Al concluir el proceso y no haberse detectado ningún error en el transcurso de la captura de datos el módulo Close.vi cierra el sistema. DISEÑO Y FABRICACIÓN DE ACUARIO-INVERNADERO Se construyo un acuario-invernadero para simular y controlar las condiciones naturales del lirio acuático en el laboratorio. Para lo cual fue necesario implementar una serie de insumos, como se observa en la Fig. 15, que nos permitieran tener al lirio acuático en las mismas condiciones en las que se encuentra en su hábitat natural.

Filtro de Agua con Carbón Activado

Lámpara Fluorescente

Temporizador

Toma de Corriente

Calentador

Acuario - Invernadero Termómetro -Higrómetro

Ventana y Ventilador

Figura 15. Acuario-Invernadero de Simulación

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Dicho acuario-invernadero esta fabricado en fibra de vidrio y cuenta con las siguientes dimensiones:

60 cm

120 cm

60 cm Volumen total = 432 lt.

Hemos tomado como base lo citado en el presente capítulo, en el punto 4.2, para diseñar una estrategia de adaptación para el lirio acuático, para realizar dicha estrategia nosotros necesitamos controlar todos los parámetros de los cuales se sirve dicha planta para sobrevivir en su entorno natural. Es por ello, que tener bajo control los parámetros fisicoquímicos del agua, así, como la concentración de nutrientes (proporcionados mediante un fertilizante líquido) y la intensidad y tiempo de luz es de vital importancia para lograr este objetivo. Y es por ello que hemos llegado a tomar los siguientes parámetros, después de haber realizado una serie de pruebas y de estar probando con las diferentes variables posibles, llegando a encontrar que las siguientes son las mejores condiciones en las que el lirio acuático puede sobrevivir in-vitro.

Parámetros físico-químicos Concentración de Nutrientes pH 6.05 Fertilizante líquido universal

Temperatura 25° 15N-30P-15k * Conductividad 61.34gr / 180lt ° 477

Cloro 0.5 mg/l Intensidad de la luz 5000 lux * basado en una [] hidropónica

Tiempo de iluminación 13 hrs. / día ° 180lt = volumen de llenado

Tabla 1. Parámetros físico-químicos y concentración de nutrientes. Tomando entonces, estos parámetros como los idóneos para la estrategia de adaptación, fue que así fueron utilizados, obtenido una buena respuesta por parte de los lirios, que mostraron una adaptación favorable y un buen desarrollo fisiológico; esto se observó durante un periodo de 2 meses, que fue cuando se introdujeron los lirios al acuario, éstos, procedentes de los canales de Cuemanco, México D.F., se introdujeron 43 individuos juveniles (dimensiones: Hoja = 5cm, Pecíolo = 10 cm, Raíz = 11 cm; medidas promedio de los 43 Ind.) y pudimos observar que no se presentó necrosis de ningún tipo, y que además, presentaban nuevos brotes de estolones para así desarrollar más pecíolos. Con esta adecuada adaptación, nosotros pudimos llevar a cabo las medidas requeridas in-vivo e in-situ, del lirio acuático para observar el monitoreo de la evolución de O2 y el almacenamiento de energía.

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4.- RESULTADOS MICROSCOPÍA ÓPTICA

Se realizó microscopía óptica de la hoja de diferentes plantas de lirio acuático, estas fueron elegidas al azar, tomando en cuenta el estado morfológico en el cual se encontraban. Al realizar este tipo de estudio, podemos entender de mejor manera algunos de los puntos descritos con anterioridad; así como también, tener una base de dicho estudio para aplicaciones futuras. Dicho estudio fue llevado a cabo con un microscopio estereoscópico, el cual tiene un máximo aumento de 1000 X; ocular = 10 X, objetivos: 10 X, 25 X, 40 X y 100 X respectivamente. Los cortes realizados para poder ser observados, fueron hechos longitudinal y transversalmente; debido a la morfología de la hoja y su delicadeza que presenta esta para ser manipulada, se tuvieron que realizar con sumo cuidado, utilizando para ello el equipo adecuado, en este caso se utilizó un estuche de disección y un microtomo, así los cortes realizados quedaron adecuadamente para ser observados.

Las figuras 16-18 muestra la toma del corte longitudinal en la epidermis del lado del haz con una magnificación de 10x, 25x y 40x. En estas tomas se observa ya la estructura física externa de los estomas. Observamos un enfoque del estoma en el cual podemos apreciar mejor su estructura física externa, sin embargo por el grado de magnificación se aprecia un poco borrosa la toma.

Figura 16. Fotografía de un corte longitudinal. Epidermis-haz (10x)

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Figura 17 Fotografía de un corte longitudinal. Epidermis-haz (25x)

Figura 18. Fotografía de un corte longitudinal. Epidermis-envés (25x)

CONTRIBUCIONES FOTOTÉRMICA Y FOTOBARICA La figuras 19 y 20 muestran las gráficas de la amplitud de la señal FA en función del tiempo de exposición para el caso de una iluminación sobre el envés y sobre el haz, respectivamente. En estas mediciones se utilizó únicamente la iluminación con el láser de HeNe de 35mW, ópticamente atenuado al 70% y con un dispersor de haz para abrir el diámetro del haz incidente a un valor de 8 mm. El haz de luz láser se modulo periódicamente a una frecuencia de modulación fija, se corrieron 4 mediciones a las frecuencias fijas de 50, 40, 30 y 20 hz, respectivamente, en cada caso. Para cada un de las ocho mediciones se alternó la exposición a la luz láser, con una obstrucción de la iluminación cada 3 minutos, como se muestra en los gráficos.

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Del análisis de las gráficas deducimos lo siguiente:

• La amplitud de la señal FA crece cuando disminuye la frecuencia de modulación, como consecuencia del incremento de la energía por pulso de radiación y el consecuente incremento de las contribuciones fototérmica y fotobárica en la muestra.

• Se presenta in incremento mucho mayor de la amplitud de la señal FA al pasar de 30 a 20 hz que al pasar de 50 a 40 hz y de 40 a 30 hz, en ambas gráficas. Este comportamiento indica que a 50, 30 y 20 hz la señal FA está formada por la superposición de las contribuciones fototérmica y fotobárica, sin embargo, a la frecuencia de 20 hz la cantidad de energía por pulso se ha incrementado de tal manera que se presenta una saturación de los centros de reacción y una consecuente inhibición de la componente fotobárica de la señal FA, luego toda la energía luminosa absorbida se canaliza a la contribución fototérmica alcanzando su máximo la señal FA.

• La amplitud de la señal FA para la incidencia sobre el haz es un 75% mayor que la amplitud de la señal FA para la incidencia sobre el envés. Esto debido a la presencia de una mayor concentración de cloroplastos del lado del haz que del lado del envés, y por consiguiente a una mayor contribución de las componentes fototérmica y fotobárica para la iluminación por el haz que por el envés.

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Figura 19. Intensidad vs Tiempo. Incidiendo el haz de luz en la parte inferior de la hoja con una frecuencia constante

20 hz

30 hz

40 hz50 hz

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Corte transversal de la hoja.

Incidencia del haz de luz

Fig. 20. Intensidad vs Tiempo. Incidiendo el haz de luz en la parte superior de la hoja con una frecuencia

constante

20 hz

30 hz

40 hz

50 hz

20

Corte transversal de la hoja.

ncidencia del haz de luz

MEDICIÓN DE LA EVOLUCIÓN DE O2 En este caso utilizamos una lámpara de fondo continua de luz blanca suministrada por la lámpara de halógeno (30 mW/cm2) y la iluminación suministrada por el láser de HeNe de 35mW, ópticamente atenuado al 70% y con un dispersor de haz para abrir el diámetro del haz incidente a un valor de 8 mm (12.2 mW/cm2). El haz de luz láser se modulo periódicamente a una frecuencia de modulación fija. En las figuras 21 y 22 se muestran los gráficos de la amplitud y fase de la señal FA en función del tiempo de exposición. Se utilizó la incidencia por el lado del haz de la hoja a una frecuencia de modulación de fija sobre el haz del láser de HeNe y alternando la exposición y bloqueo de la luz de fondo continúa cada 50 seg. Para llevar a cabo el monitoreo de la evolución de O2 se mide el llamado “efecto negativo” de la señal FA. Para esto fue necesario determinar la frecuencia de modulación con la cual se presenta dicho efecto en este caso. Después de correr una serie de muestras a diferentes frecuencias de modulación, encontramos dicho efecto a la frecuencia de 100 hz. Considerando el valor de 1.2 x 10-3 cm2/s, para la difusividad térmica en la hoja [Y. S. Touloukuian, 1973], podemos determinar la longitud de difusión térmica para f = 100 hz, esto es:

fπαμ /= = 19.5 μm Por tanto, la onda térmica se amortigua casi completamente a una profundidad de:

== 3/23/ πμλ 40.8 μm

21

La hoja tiene un espesor aproximado de 100 μm. Iniciando desde la superficie del haz hacia el interior encontramos al parénquima en empalizada, con un espesor aproximado de 30 μm, seguido del haz vascular con un espesor aproximado de 40 μm, y finalmente el parénquima esponjoso, de un espesor aproximado de 30 μm, ver Fig.6.10.

0 30 60 90 120 150 180 210

0.246

0.2480.250

0.2520.254

0.256

0.2580.260

0.262

0.2640.266

0.2680.270

0.272

0.274

offon

Fotosíntesis (Efecto Negativo)

Inte

nsid

ad (m

V)

Tiempo (s)

f = 100 hz

Figura 21. Efecto Negativo Fotosintético. Fuentes de iluminación: Láser He-Ne 633nm y Lámpara de halógeno a 300 w.

0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 2 1 0

1 1 2 0 0 0

1 1 4 0 0 0

1 1 6 0 0 0

1 1 8 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 2 2 0 0 0

1 2 4 0 0 0

Fotosín tes is (E fecto N egativo )

Fase

(gra

d)

T iem po (s )

f = 1 0 0 h z

Figura 22. Efecto Negativo Fotosintético. Fuentes de iluminación: Láser He-Ne 633nm y Lámpara de Halógeno a 300 w.

Corte transversal de la hoja.

Incidencia del haz de luz

on off on off

offon on off

22

De esta manera, las ondas térmicas generadas en el haz por efecto de la incidencia del haz de luz modulado tienen una penetración que cubre la totalidad del parenquima en empalizada y parte importante del haz vascular. Por lo anterior, de la Fig. 21 deducimos lo siguiente:

1. Durante los primeros 50 seg la lámpara está encendida, “on”. No se presenta el efecto fotobárico por la saturación de los centros de reacción producida por la luz blanca continua y la señal FA es debida únicamente al efecto fototérmico.

2. En este caso, la totalidad de la luz láser modulada absorbida por la hoja es transformada íntegramente en calor, una parte del cual se transmite hacia el haz vascular y el resto se difunde hacia la cámara FA.

3. En los siguientes 50 seg se suprime la luz continua de la lámpara, “off”. Aparece la contribución fotobarica que se suma a la contribución fototérmica, y la señal FA se incrementa como se muestra en la gráfica. La evolución de oxigeno fotosintético se hace presente.

4. En este caso, la luz láser modulada absorbida por la hoja es en primer lugar utilizada en el proceso fotosintético que da lugar como uno de sus productos a la emisión de O2, y el resto de la energía absorbida se canaliza en la generación de calor que da lugar a la contribución fototérmica.

5. En los siguientes 50 seg se enciende la lámpara y continúa el proceso.

MEDICIÓN DEL ALMACENAMIENTO DE ENERGÍA Se utilizaron las mismas condiciones que en el caso 7.3 anterior de la medición de la evolución de O2, excepto en la frecuencia de modulación, cuyo valor fue de 200 hz. En las figuras 23 y 24 se muestran los gráficos de la amplitud y fase de la señal FA en función del tiempo de exposición. Se utilizó la incidencia por el lado del haz de la hoja a una frecuencia de modulación de fija sobre el haz del láser de HeNe y alternando la exposición y bloqueo de la luz de fondo continúa cada 50 seg.

0 30 60 90 120 150 180 210

0.086

0.088

0.090

0.092

0.094

0.096

0.098

0.100

0.102

0.104

Fotosíntesis (Efecto Positivo)

offon

Inte

nsid

ad (m

V)

Tiempo (s)

f = 200 hz

Corte transversal de la hoja.

Incidencia del haz de luz

on off on off

Figura 23 Efecto Positivo Fotosintético. Fuentes de iluminación: Láser He-Ne 633nm y Lámpara de Xenón a 300 w.

23

0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 2 1 01 1 0 0 0 0

1 1 2 0 0 0

1 1 4 0 0 0

1 1 6 0 0 0

1 1 8 0 0 0

1 2 0 0 0 0

F o to s ín te s is (E fe c to P o s it iv o )

Fase

(gra

d)

T ie m p o (s )

f = 2 0 0 h z

on offon off

Figura 24. Efecto Positivo Fotosintético. Fuentes de iluminación: Láser He-Ne 633nm y Lámpara de Xenón a 300 w.

Se llevó a cabo el monitoreo del almacenamiento de energía, donde ahora fue necesario encontrar el “efecto positivo” de la señal FA, para lo cual fue necesario encontrar la frecuencia de modulación a la cual ocurre dicho efecto. Después de correr una serie de muestras a diferentes frecuencias de modulación, encontramos el mencionado efecto a la frecuencia de 200 hz. Considerando el valor de 1.2 x 10-3 cm2/s, para la difusividad térmica en la hoja [Y. S. Touloukuian, 1973], podemos determinar la longitud de difusión térmica para f = 200 hz, esto es:

fπαμ /= = 13.8 μm Por tanto, la onda térmica se amortigua casi completamente a una profundidad de:

== 3/23/ πμλ 28.9 μm De esta manera, las ondas térmicas generadas en el haz por efecto de la incidencia del haz de luz modulado tienen una penetración solo en el parénquima en empalizada. Por lo anterior, de la Fig. 7.5 deducimos lo siguiente:

6. Durante los primeros 50 seg. la lámpara está encendida, “on”. No se presenta el efecto fotobárico por la saturación de los centros de reacción producida por la luz blanca continua y la señal FA es debida únicamente al efecto fototérmico.

7. En este caso, la totalidad de la luz láser modulada absorbida por la hoja es transformada íntegramente en calor, una parte del cual se transmite hacia el parénquima en empalizada y el resto se difunde hacia la cámara FA.

8. En los siguientes 50 seg. se suprime la luz continua de la lámpara, “off”. La luz láser modulada absorbida por la hoja es en primer lugar utilizada en el proceso fotosintético y el resto de la energía absorbida se canaliza en la generación de calor.

9. En este caso, la intensidad de la señal FA decrece ya que la hoja utiliza la mayor parte de la energía luminosa modulada incidente en desarrollar el proceso fotosintético, uno de cuyos

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productos es la generación de O2, y la parte sobrante es transformada en calor, sin embargo, la contribución fotobárica a la señal FA es pequeña comparada con la contribución fototérmica.

10. En los siguientes 50 seg. se enciende la lámpara y continúa el proceso. Espectro de absorción del Lirio Acuático Se aplicó la Espectroscopia Fotoacústica (EFA) a las hojas de las plantas de lirio acuático que se tenían en el acuario-invernadero, esto para poder observar el espectro de absorción de dicha planta; las hojas fueron seleccionadas al azar, siempre y cuando estuvieran en condiciones óptimas para realizar las medidas, es decir, que no presentaran necrosis parcial o total, que no estuvieran mutiladas, que no presentaran descoloramiento y que no estuvieran quemadas. Para poder aplicar EFA, se tuvo primero que calibrar la lámpara con un cuerpo totalmente oscuro, en este caso se utilizó grafito puro, donde encontramos que la mejor mejor señal la obteníamos a una modulación de 50 hz. Posteriormente las curvas obtenidas de las muestras eran calibradas con las obtenidas de la calibración previa. En la fig. 25 y 26 se muestran tanto las gráficas de los espectros de absorción de la planta, así como las de la calibración de la lámpara de halógeno. Comparando con la Fig. 3.8, observamos que en el espectro de absorción de las hojas del lirio acuático, Fig. 7.7, aparecen las bandas de absorción en el visible correspondientes a las clorofilas “a” y “b”. En esta Fig. 25 se hace notar que a la longitud de onda de 633 nm, correspondiente a la emisión del láser de HeNe, las hojas de lirio acuático presentan una importante absorción óptica, motivo por el cual se eligió esta fuente luminosa en las mediciones de actividad fotosintética.

5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 3 0 00 .0

0 .3

0 .6

0 .9

1 .2

1 .5

6 3 3 n m

* I lu m in a n d o e n e l h a z d e la h o ja

E s p e c tro d e a b s o rc ío n d e E ic h h o rn ia C ra s s ip e s

Ampl

itud

FA (m

V)

L o n g u itu d d e O n d a (n m )

f = 5 0 h z

Figura 25 Espectro de Absorción de Lirio Acuático. Fuente de iluminación: Lámpara de halógeno a 600 w.

25

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 13001E -3

0 .01

0 .1

C alibración de la lam para con grafito puro

Inte

nsid

ad

longuitud de onda (nm )

1 7 hz 1 17 hz 5 0 hz

Figura 26. Calibración Lámpara de halógen

Discusión Se logró encontrar el efecto negativo de la fotosíntesis (evolución del O2 ), donde la frecuencia que nos permitió observar este fenómeno fue de 100 hz. Se logró encontrar el efecto positivo (almacenamiento de energía), donde, ahora, la frecuencia que nos permitió observar este fenómeno fue de 200 hz. Se aplicó espectroscopia fotoacústica (EFA) para obtener los espectros de absorción del Lirio Acuático, donde la frecuencia de modulación utilizada fue de 50 Hz. Se realizó la implementación de la técnica fotoacústica resuelta en tiempo para el monitoreo de la

fotosíntesis en plantas en el laboratorio de técnicas fototérmicas del CICATA Unidad Legaria.

26

5.- CONCLUSIONES e IMPACTO Se efectúo el diseño y construcción de una celda fotoacústica apropiada para la medición de fotosíntesis en plantas con la ventaja de una base amplia a la entrada de la cámara para mejorar la adherencia de la hoja durante la medición, y por consiguiente una disminución en la razón ruido-señal. Se diseñó y construyó un acuario-invernadero, en el laboratorio de Física Aplicada de CICATA Unidad Legaria, con control de los parámetros más significativos como: temperatura, humedad, iluminación, nutrición, ventilación y flujo de agua. Se llevo a cabo microscopía óptica de hojas de diferentes plantas de lirio acuático, con lo cual, además de obtener imágenes de la anatomía y morfología de la hoja para así entender de mejor manera los procesos fotosintéticos y los diferentes organelos que intervienen en este, servirán como una base para futuros trabajos que estén relacionados con el lirio acuático, ya que estas imágenes obtenidas son inéditas. Se realizó el monitoreo de la evolución de las contribuciones fototérmica y fotobárica a diferentes frecuencias de modulación para incidencias en el haz y el envés. Se presentó un estudio de la evolución del oxigeno fotosintético y el almacenamiento de energía. Finalmente, se presentan los resultados de la medición del espectro de absorción óptico en las hojas de lirio acuático mediante la técnica de espectroscopia fotoacústica. Como perspectiva a trabajos futuros, la medición del espectro de absorción óptico en las hojas del lirio acuático nos proporciona una manera de monitorear el efecto de la irradiación ultrasónica en el lirio, estudiando el efecto en las bandas del espectro de absorción medido mediante la EFA. Como una ventaja al uso de la EFA, el monitoreo de la fotosíntesis en plantas mediante la técnica fotoacústica resuelta en tiempo nos permite realizar el monitoreo del lirio acuático al mismo tiempo que se realizan las irradiaciones sobre la planta. Esta es la perspectiva para el trabajo a un futuro inmediato en el lirio acuático. Los resultados de este trabajo impactan en el ámbito del medio ambiente. La metodología desarrollada permitirá determinar las condiciones bajo las cuales se podría inhibir la fotosíntesis en plantas contaminantes como el lirio acuático y por lo tanto su polución. En particular, se utilizara el sistema implementado en este trabajo para monitorear la fotosíntesis en lirio acuático irradiado por ultrasonido y determinar las frecuencias características a las cuales ocurre la reducción de la taza fotosintética y la destrucción celular..

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