microscopia

Microscopio

Microscopio (griego, mikros=pequeo; skopein= ver): es el instrumento ms importante para la identificacin y comprensin de la estructura celular y de rganos y tejidos

El microscopio ptico es el ms comn y el primero en inventarse (Antoni Leeuwenhoek, s.XVII), desde entonces se ha perfeccionado incesantemente

Las lentes que conforman el microscopio permiten aumentar la imagen del objeto al tiempo que se mantiene el poder de resolucin

Si se trata de un instrumento con una nica lente convergente (convexa) tenemos el microscopio simple o lupa

En el caso de un sistema formado por ms de una lente convergente: el objetivo y otra ocular, tenemos el microscopio compuesto

Microscopio

El microscopio ptico comn sigue siendo el instrumento ms importante para la enseanza de la histologa, para el diagnstico clnico y anatomopatolgico e incluso en investigacin

Funciona con una lente luminosa elctrica cuyos rayos iluminan y atraviesan un preparado desde abajo (micoscopa de luz transmitida)

Partes de un microscopio ptico En esencia est compuesto por:

Una lmpara de gran intensidad (halgena, led en ms modernos) incorporada en el pie del microscopio, cuya luz atraviesa el preparado y el sistema de lentes del microscopio. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reostato.

Condensador: Es un dispositivo que contiene una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la seccin de tejido. Dispone de tornillos que lo elevan o bajan alterando el cono de luz hasta una posicin precisa

Diafragma. Se sita entre la fuente luminosa y el condensador. Su funcin es asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris est demasiado abierto, parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor de l, y no se utilizar. Al cerrar el diafragma, aumenta el contraste y los limites (lneas, membranas. etc.) son mucho ms ntidos

Objetivo: Sistemas de lentes de aumento. Generan una imagen real, invertida y aumentada del objeto. Colocados en la parte inferior del tubo en el revlver (pieza mecnica que permite

cambiarlos rpidamente). Las magnificaciones de los objetivos ms usados suelen ser de 10x,

20x, 40x y 100x. Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear

aceite de inmersin entre el objetivo y la muestra (VER)

Ocular: llamado as por estar cercano al ojo. Constituido por dos lentes simples que captan la imagen suministrada por el objetivo y la amplan ms originando una imagen virtual,

aumentada y derecha.

Tubo: elemento cilndrico y hueco en cuyos extremos estn ubicados los oculares y objetivos

Partes de un microscopio

Revlver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro.

Tornillos macro y micromtrico: son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace con movimientos largos que permiten el enfoque rpido. El micromtrico de forma lenta casi imperceptible que permite el enfoque exacto y ntido de la preparacin

Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y los tornillos laterales permiten centrar o producir movimientos circulares

Partes de un microscopio

Aumento: relacin entre el tamao de un objeto percibido a simple vista y la que obtenemos al observarlo con el microscopio (n veces que el objeto es ampliado). En el objetivo el aumento es n seguido de x (10x, 40x, 100x). El aumento total es el producto del aumento de cada lente. Ej. Si la lente del objetivo es 100x y el ocular (o lente de proyeccin) aumenta, por lo general, 10 veces, el aumento final registrado por el ojo humano es de 1.000 veces: que es la magnificacin mxima que alcanza el microscopio ptico

Poder de resolucin: Distancia mnima a la que pueden estar dos puntos para ser poder distinguirlos como tales (=D). Capacidad para revelar detalles adyacentes a un objeto. Cuanto menor sea D, mayor ser el poder de resolucin

D= 0.61/N sen

= mitad del ngulo de apertura del cono de luz que ingresa en el objetivo desde la muestra (VER)

N= ndice de refraccin del medio entre la muestra y la superficie de la lente objetivo; = longitud de onda de la luz incidente (la resolucin mejora a longitudes de onda ms cortas)

N sen = apertura numrica

Normalmente es fijo, as que la resolucin de pende de la apertura numrica

Para aumentar la apertura numrica o aumentamos (regulando el condensador y acercando el objeto al objetivo) o N

El ndice de refraccin del aceite es mayor que el del aire. Con objetivos secos N=1. Cuando se emplea aceite N=1.56 (D ser menor)

Parmetros pticos de un microscopio

objetivo

muestra

condensador

Poder de resolucin aproximado de algunos sistemas pticos:

Ojo humano: 0,2 mm.

Microscopio Fotnico/ptico: 0,2 m.

Microscopio electrnico: 0,2 nm.

En general, un tipo de radiacin determinada no puede utilizarse para examinar detalles estructurales mucho ms pequeos que su propia longitud de onda. As pues el lmite mximo de resolucin de un microscopio ptico est determinado por la de la luz visible, que abarca desde 0.4m para el violeta hasta 0.7m para el rojo lejano. En la prctica, las bacterias y las mitocondrias que tienen aproximadamente 0.5 m de dimetro son las estructuras ms pequeas que se pueden observar ntidamente al microscopio ptico

Preparacin del tejido De forma general todos los tejidos de origen animal son incoloros salvo que

contengan algn pigmento (ej. piel melanina de color marrn, o en la sangre la hemoglobina de color rosada)

Para poder ser visualizados, los tejidos y clulas han de ser teidos. la tincin radica en la propiedad de los tejidos para incorporar y fijar diversas sustancias coloreadas (colorantes)

Antes de ser teidas, las clulas han de ser tratadas con un fijador que las inmovilice, las mate y conserve su estructura

Los compuestos fijadores establecen puentes entre las molculas de modo que quedan estabilizadas y bloqueadas en su posicin original. Adems hace que las clulas sean permeables a los colorantes.

La fijacin se lleva acabo con solventes orgnicos: antiguamente alcohol, actualmente, soluciones con formaldehdo que forma enlaces covalentes entre grupos amino de protenas formando puentes cruzados entre protenas adyacentes. Un fijador frecuente es el formol (=formalina) al 4-10%

Formol=disolucin acuosa de formaldehdo al 37-50% con hasta un 15% de metanol

Portaobjetos o porta: lmina de vidrio donde se coloca la muestra objeto de estudio (26x76mm y grosor de 1mm)

Cubreobjetos: lmina muy fina de vidrio con la que se cubre la muestra

Manejo

Micorscopio debe estar colocado en una mesa slida evitando vibraciones El objetivo adecuado al inicio es el de poco aumento y luego se pasa a otro superior

enfocando con el micromtrico

La luz debe estar a una intensidad media para que no se funda la lmpara Situar el condensador:

Bajo: si se utiliza un objetivo con poco poder de ampliacin Mitad de recorrido: objetivo 40x Alto: si se usa objetivo de inmersin (100x)

Mirando por fuera de los oculares, la platina ha de ascenderse con el tornillo macromtirco hasta que el objetivo est muy cercano a la preparacin, pero sin tener contacto con ella, a continuacin se contina ascendiendo lentamente mirando por los oculares

Con el objetivo de inmersin (100x) hay que usar aceite y baja intensidad de luz. El objetivo ha de estar en contacto con la gota. Limpiar objetivo tras el uso (ter si el aceite se ha secado pero retirarlo para que no disuelva el pegamento de lente)

Ajustar la distancia interpupilar Afinar el enfoque con el tornillo micromtrico. La mano derecha ha de estar moviendo

contnuamente el tornillo micromtrico para enfocar los distintos planos de la estructura sucesivamente

Tipos de microscopio: Clasificacin

Principio en que se basa para la amplificacin de la imagen

Microscopio pticos o de luz Microscopios electrnicos

Microscopio ptico

Microscopio simple o lupa: una sola lente

Microscopio compuesto: sistema de lentes

Microscopio de campo claro

Microscopio de campo oscuro

Microscopio de polarizacin

Microscopio de contraste de fases

Microscopio de contraste interdiferencial

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de barrido confocal

Microscopa ptica normal El material a observar se colorea con colorantes especficos que

aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera el microscopio compuesto comn o convencional

Microscopa de campo brillante El material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se

aprecian detalles

Dado que no se tien, las clulas pueden observarse vivas

En la observacin de clulas vivas es frecuente el uso de microscopios invertidos

Microscopio invertido

Como su nombre indica un microscopio invertido tiene una disposicin inversa de sus componentes respecto a un microscopio convencional.

La fuente de luz y el condensador estn sobre la plataforma apuntando hacia abajo

Los objetivos estn debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Los nicos componentes que estn en la misma posicin son los oculares, as mismo la muestra es colocada sobre la platina mecnica.

Con esta disposicin hay espacio para colocar

recipientes que ocupen cierto volumen que contengan organismos y as observar organismos vivos y el medio necesario para que as se mantengan. Ej. control de cultivos celulares

Microscopio de campo oscuro

Es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados

De tal modo que la luz incidir sobre la muestra de forma oblicua y slo aquella luz que sea reflejada por la muestra llegar a los objetivos

A causa de esta disposicin, la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro

Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal

Hace posible la observacin en estado vivo de partculas y clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de resolucin del microscopio ptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales.

Ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeas clulas mviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sfilis, que es invisible con la microscopa ptica ordinaria

Mic. Campo oscuro-Foraminfero=Protozoo

2-MICROSCOPIO-OPT-1_.pdf


Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear

Es ideal para especimenes delgados, o clulas aisladas

La velocidad con la que la luz atraviesa un cuerpo transparente depende de la cantidad de materia presente y determina el ndice de refraccin. A mayor densidad, mayor ndice de refraccin y menor velocidad de la luz (se producen retrasos de las ondas) (VER)

Las ondas que atraviesan una zona ms espesa se retrasan y cambian de fase en relacin a las ondas que atraviesan una regin ms delgada

Estos cambios de fase son invisibles al ojo humano, sin embargo

El microscopio incorpora un filtro en el condensador y otro entre las lentes del objetivo (placa de fases), de manera que este sistema permite hacer visibles pequeos cambios en el ndice de refraccin traducindolos en cambios de intensidad (brillo)

Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas.


Facilita el estudio de objetos transparentes y no coloreados. Clulas vivas (cultivos, protozoos)

Aplicaciones: Fisiologa, parasitologa, farmacologa (procesos celulares, identificacin y cuantificacin de microorganismos y parsitos en fluidos y tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las clulas y sus procesos de motilidad, digestin, entre otros).

Microscopio de polarizacin

La luz natural, la procedente del sol, vibra en cualquier momento en todas las direcciones del espacio

Un polarizador deja pasar nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada)

Son microscopios a los que se les han aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre el objetivo y el ocular)

Los dos polarizadores estn dispuestos con sus eje perpendiculares en el microscopio, de manera que el campo aparece oscuro

Sin embargo, si entre ambos filtros hay estructuras que contienen molculas orientadas (con un alto grado de organizacin ej. fibras de colgeno con disposicin paralela, filamentos de miosina, microtbulos o microfilamentos), estas estructuras aparecern brillantes sobre un fondo oscuro

Slo sirven para observar estructuras con una disposicin espacial ordenada. Esto ocurre porque las molculas orientadas son anisotrpicas o birrefringentes: capaces de desdoblar un rayo de luz incidente en dos rayos linealmente polarizados de manera perpendicular entre s

Los componentes con orden irregular son istropos (monorefringentes) y no se observan

Permite observar estructuras ordenadas teidas

Mic. Luz polarizada- Queratina y Microfilamentos

Microscopio de contraste por interferencia diferencial

DIC por sus siglas en ingls u ptica Nomarski

Permite obtener informacin sobre la densidad ptica de la muestra y observar detalles que de ordinario son invisibles

Los objetos se ven oscuros o claros en un fondo gris, de manera semejante a las imgenes del microscopio de contraste de fases, pero sin halos de difraccin

Emplea luz polarizada la cual pasa por dos prismas birrefringentes que la fraccionan la luz dos rayos cuyos trayectos e ndices de refraccin son diferentes (VER)

Tras este recorrido, la luz pasa por el muestra y las diferencias de densidad del tejido provocarn alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos, los cuales transformarn esas diferencias en cambios en la luminosidad

El resultado es una imagen del espcimen en 3D o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad ptica de la muestra con nfasis en lneas y bordes

Se caracteriza por su buena resolucin y contraste que ayudan a discernir tanto detalles superficiales como estructuras internas

Adems, el uso de prismas permite obtener imgenes de colores brillantes sin necesidad de aplicar protocolos de tincin, ni de preparacin de muestras.

Optica Nomarsky. Paramecio y Nematodo

Microscopa de fluorescencia

Las molculas fluorescentes absorben luz de una determinada y emiten a una superior (de menor energa)

Las molculas fluorescentes empleadas son aquellas capaces de emitir en el espectro visible

Si un componente es iluminado a la que absorbe y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la a la que emite, este aparecer brillante sobre un fondo oscuro

De esta forma la deteccin con colorantes fluorescentes (fluorocromos) es mucho ms sensible que con un colorante ordinario

Para ello se necesita un microscopio de fluorescencia que es similar al convencional, salvo que la luz incidente procede de una potente fuente que normalmente emite luz ultravioleta y atraviesa dos filtros (VER):

El primero slo permite el paso de la que excita al fluorocromo

El segundo slo permite el paso de las a las que emite


Fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin

Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta

Problema: las preparaciones no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia.


Se suele usar para detectar especficamente protenas u otras molculas en clulas y tejidos

Una tcnica es acoplar de forma covalente molculas fluorescentes a anticuerpos que se unen especficamente a determinadas protenas

Fluorocromos: fluorescena que cuando es excitada por luz azul emite en verde y la rodamina que cuando es excitada por luz verde emite en rojo (VER). Acoplando a una molcula fluorescena y a otra rodamina, se puede comparar la distribucin de diferentes molculas en la misma clula (cambiando las dos series de filtro de cada vez)

DAPI: absorbe en el uv (360nm) y emite en azul. Tie el ADN Anticuerpos: protenas producidas por el sistema inmunitario. El

antgeno que se desea reconocer (ej. una zona de los microtbulos) de inyecta a una cabra o conejo que desarrolla anticuerpos. Estos se purifican del suero y se unen a colorantes fluorescentes

Normalmente se usan dos anticuerpos: el primario es el que por un lado reconoce la protena diana o antgeno (creado por ej. en conejo)

El secundario es el que est marcado con el fluorocromo y es creado en otro animal distinto al que se le inocula antgeno de conejo

In this composite micrograph of a cell in mitosis, three different fluorescent probes have been used to stain three different cellular components. The spindle microtubules are revealed with a green fluorescent antibody, centromeres with a red fluorescent antibody and the DNA of the condensed chromosomes with the blue fluorescent dye DAPI. (Courtesy of Kevin F. Sullivan.)

Microscopa confocal o Microscopio lser de barrido

En la microscopa ptica (fotnica) clsica el tejido debe cortarse finamente para ser examinado y mientras ms delgado sea, ms ntida ser la imagen

Pero con este mtodo se pierde la informacin tridimensional durante el corte Si una muestra gruesa es observada al microscopio ptico la imagen que se enfoca

se ve contaminada por la superposicin de los elementos del tejido que estn fuera de foco, tanto por encima como por debajo del plano enfocado. La imagen enfocada se deteriora

Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un instrumento que permite realizar cortes pticos finos a muestras de tejidos ms o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados

Fue inventado en el ao 1955 por el cientfico estadounidense Marvin Minsky (116) al estudiar neuronas

Este instrumento utiliza como fuente de luz un lser, que permite enfocar nicamente una regin en un plano determinado del espcimen (dado que el lser no se dispersa como la luz), eliminando la luz (fluorescencia) procedente de las regiones que no estn en el plano de enfoque

Los detalles de la ptica del microscopio confocal son complejos y complementado por mtodos computacionales que superponen los planos altamente ntidos obtenidos generando la imagen tridimensional


Generalmente utiliza ptica fluorescente, pero en lugar de iluminar toda la muestra, en cada instante un laser enfoca un pequeo punto luminoso en una profundidad determinada de la muestra

Hay un diafragma en el detector que es confocal con el punto luminoso que slo recoge la luz procedente de ese punto y no la de que est fuera del plano focal (la luz procedente de otros planos est fuera del foco del diafragma


Si se retratan de forma sucesiva los distintos planos que integran la muestra, el microscopio puede hacer una reconstruccin completa del espcimen que lo muestre en sus tres dimensiones. Esta reconstruccin tridimensional podr incluso ser rotada para estudiar la muestra desde un ngulo distinto a aquel desde el cual se retrat


Nmero de diapositiva 1Nmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18Nmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Mic. Campo oscuro-Foraminfero=ProtozooNmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24Nmero de diapositiva 25Nmero de diapositiva 26Nmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Mic. Luz polarizada- Queratina y MicrofilamentosNmero de diapositiva 31Nmero de diapositiva 32Optica Nomarsky. Paramecio y NematodoNmero de diapositiva 34Nmero de diapositiva 35Nmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Nmero de diapositiva 38Nmero de diapositiva 39Nmero de diapositiva 40Nmero de diapositiva 41Nmero de diapositiva 42Nmero de diapositiva 43Nmero de diapositiva 44Nmero de diapositiva 45Nmero de diapositiva 46Nmero de diapositiva 47Nmero de diapositiva 48Nmero de diapositiva 49Nmero de diapositiva 50Nmero de diapositiva 51Nmero de diapositiva 52Nmero de diapositiva 53Nmero de diapositiva 54Nmero de diapositiva 55Nmero de diapositiva 56

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