microbios y molØculas - uni kiel

Microbios ymoléculas

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Equipo de desarrolloEckhard R. Lucius (Coordinador de la Unidad)Catherine Adley, Jan Frings, Cecily Leonard, Dean Madden, Marcus Müller, UtaNellen, Patricia Nevers, John Schollar, Marleen van Strydonck, Paul Wymer.

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IDA

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European Initiative for Biotechnology Education

2 EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1999

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Coordinadores de EIBEHorst Bayrhuber, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften an der Universität Kiel, Olshausen-straße 62, D-24098 KIEL, Germany.Telephone: + 49 (0) 431 880 3166 (EIBE Secretary: Ute Harms). Facsimile: + 49 (0) 431 880 3132.

BELGIË / BELGIQUE❙ Vic Damen / Marleen Van Strydonck, R&D Groep VEO,Afdeling Didactiek en Kritiek, Universiteit Antwerpen,Universiteitsplein 1, B-2610 WILRIJK.

BULGARIA❙ Raytcho Dimkov, Faculty of Biology, University of Sofia“St. Kliment Ohridski”, Dr. Tzankov blvd. No.8, 1421 SOFIA.

CZECH REPUBLIC❙ Hana Novàkova, Pedagprogram, Faculty of Education UK,Pedagogical Centre, Prague, Konevova 241, CZ-13000PRAGUE 3

DANMARK❙ Dorte Hammelev, Biotechnology Education Group, Foreningenaf Danske Biologer, Sønderengen 20, DK-2860 SØBORG.❙ Lisbet Marcussen, Biotechnology Education Group, Foreningenaf Danske Biologer, Lindevej 21, DK-5800 NYBORG.

DEUTSCHLAND❙ Horst Bayrhuber / Eckhard R. Lucius / Ute Harms / AngelaKroß, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften ander Universität Kiel, Olshausenstraße 62, D-24098 KIEL.❙ Michael Schallies, Paedagogische Hochschule Heidleberg,Im Neuenheimer Feld 561, D-69120 HEIDELBERG.❙ Ognian Serafimov, UNESCO-INCS, c/o Jörg-Zürn-Gewerbeschule, Rauensteinstraße 17, D-88662ÜBERLINGEN.❙ Eberhard Todt, Fachbereich Psychologie, Universität Gießen,Otto-Behaghel-Straße 10, D-35394 GIEßEN.

EIRE❙ Catherine Adley / Cecily Leonard, University of Limerick,LIMERICK.

ESPAÑA❙ María Sáez Brezmes / Angela Gómez-Niño / Rosa M.Villamañán, Facultad de Educación, Universidad de Valladolid,Geologo Hernández Pacheco 1, ES-47014 VALLADOLID.

ESTONIA❙ Tago Sarapuu, Science Didactics Dept., Institute ofMolecular and Cell Biology, University of Tartu, Lai Str. 40,EE-2400 TARTU

FRANCE❙ Gérard Coutouly, LEGTP Jean Rostand, 18 Boulevard de laVictoire, F-67084 STRASBOURG Cedex.❙ Laurence Simonneaux / Jean-Baptiste Puel, Ecole Nationalede Formation Agronomique, Toulouse-Auzeville, BoîtePostale 87, F-31326 CASTANET TOLOSAN Cedex.

La Iniciativa Europea para la Enseñanza de la Biotecnología (EIBE)pretende promover experiencias, aumentar la comprensión y facilitarel debate público informado mediante la mejora de la enseñanza de labiotecnología en escuelas e institutos de toda la Unión Europea (UE).

GREECE❙ Vasilis Koulaidis / Vasiliko Zogza-Dimitriadi, Dept. ofEducation, Unit of Science, University of Patras, Rion,GR-26500 PATRAS

ITALIA❙ Antonio Bargellesi-Severi /Alessandra Corda Mannino/Stefania Uccelli , Centro di Biotecnologie Avanzate, LargoRosanna Benzi 10 , I-16132 GENOVA.

LUXEMBOURG❙ John Watson / Laurent Kieffer, Ecole Européenne deLuxembourg, Département de Biologie, 23 Boulevard KonradAdenauer, L-1115 LUXEMBOURG.

NEDERLAND❙ David Bennett / Ana-Maria Bravo-Angel, CambridgeBiomedical Consultants, Schuytstraat 12, NL-2517 XE DENHAAG.❙ Fred Brinkman, Hogeschool Holland, Academy for Com-munication, Postbus 261, NL-1110 AG DIEMEN.❙ Liesbeth van de Grint / Jan Frings, Hogeschool van Utrecht,Educatie Centrum voor Biotechnologie, FEO, AfdelingExacte Vakken, Biologie, Postbus 14007, NL-3508 SBUTRECHT.

POLAND❙ Anna Sternicka, Department of Biology, University ofGdansk, Bazynskiego 1, GDANSK

SVERIDGE❙ Margareta Johansson, Föreningen Gensyn, PO Box 37, S-26881 SVALÖV.❙ Elisabeth Strömberg, Östrabo Gymnasiet, S-45181UDDEVALLA.

SWITZERLAND❙ Kirsten Schlueter, Instutut fuer Verhaltenswissenschaft,Eidgenoessische Technische Hochschule IfV/ETH, ETHZentrum TUR, Turnerstr. 1, CH-8092 ZUERICH

THE UNITED KINGDOM❙ Wilbert Garvin, Northern Ireland Centre for SchoolBiosciences, NIESU, School of Education, The Queen’sUniversity of Belfast, BELFAST, BT7 1NN.❙ John Grainger / John Schollar / Caroline Shearer, NationalCentre for Biotechnology Education, The University of Read-ing, PO Box 228, Whiteknights, READING, RG6 6AJ.❙ Jenny Lewis, Centre for Studies in Science and MathematicsEducation, University of Leeds, LEEDS LS2 9JT❙ Jill Turner, School of Nursing and Midwifery, 1-3 CollegePark East, The Queen’s University of Belfast, Belfast, BT71LQ.❙ Paul Wymer, Society for General Microbiology, MarlboroughHouse, Basingstoke Road, READING RG7 1AE.

Centros de contacto de la EIBE

3EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998 UNIDAD 1: MICROBIOS Y MOLÉCULAS

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Microbios ymoléculas

Con

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do


1UNIDAD

Índice★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

lllll Seguridad, copyright yagradecimientos 4

lllll A propósito de esta unidadIntroducción 5

lllll Confección de modelosModelo recortable de ADN 6Modelo recortable de un virusbacteriófago 8

lllll Extracción de ADNExtracción de ADN de una bacteria10Extracción de ADN de una cebolla 12

lllll Microbios productivosProducción de amilasa 14Producción de celulasa 16Producción de antibióticos 18

lllll Seguimiento de la actividadmicrobiana

Masa de pan 20Células de levadura inmovilizadas 22La pila microbiana 25

lllll Transferencia de genesConjugación bacteriana 27Transferencia de genes deAgrobacterium tumefaciens 31

lllll Apéndice 1Recetas de caldos de cultivomicrobiano 34

lllll Apéndice 2Técnicas microbiológicas básicas 35

lllll Apéndice 3Apertura de una ampolla 40

World Wide Web★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Pocas áreas conocen actualmente un desarrollotan rápido como la biotecnología. Las unidadesEIBE se publican en formato electrónico, con elobjeto de poder ser revisadas, actualizadas ydistribuidas a un coste lo más bajo posible.Estas páginas (así como las restantes UnidadesEIBE) resultan accesibles en Europa y en el restodel mundo a través de World Wide Web. Puedenencontrarse en la dirección:

http://www.rdg.ac.uk/EIBE

Todas las unidades EIBE accesibles desde WorldWide Web son archivos con formato PDF(Portable Document Format). Esto significa quela elevada calidad de las imágenes, así como loscolores, tipos de caracteres y distribución de losdocumentos se conservan, independientementedel tipo de ordenador empleado (plataformasWindows, DOS, UNIX o Macintosh, incluyendoPower PC).

Además, los archivos PDF tienen tamaños másreducidos que los archivos originales de los queproceden, de manera que su volcado al ordenadorresulta más rápido. Sin embargo, para visualizarlas Unidades EIBE es preciso disponer de unacopia del programa de lectura Adobe Acrobat®.

El programa Acrobat® se encuentra disponible, sincoste, en varios idiomas (neerlandés, inglés,francés, alemán e italiano), y puede volcarse desdeladirección web de EIBE anterior, o desde la deAdobe:

http://www.adobe.com

Con este software, resulta posible ver e imprimirlas Unidades EIBE. También podrá navegar yencontrar documentación con facilidad.

NOTA: Adobe y Acrobat son marcas registradas de AdobeSystems Incorporated, y en determinadas jurisdicciones,pueden encontrarse registradas. Macintosh es una marcaregistrada de Apple Computer Incorporated.

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4 UNIDAD 1: MICROBIOS Y MOLÉCULAS EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998

SeguridadEn todas las unidades EIBE se ha procuradoidentificar y señalizar cualquier posible peligro.Asimismo, en cada caso se sugieren las medidas deprecaución adecuadas.

Siempre que ha sido posible, los procedimientospropuestos no revisten riesgos mayores que losevaluados y aceptados corrientemente. Cuando resultenecesario efectuar una evaluación especial de riesgos,aparecerá una indicación al respecto en el texto. ElApéndice 2 de esta Unidad proporciona algunasindicaciones adicionales en materia de seguridad.

Los usuarios, no obstante, deben tener en cuenta quepueden producirse errores u omisiones, y que losdistintos centros y autoridades educativas pueden estarsujetos a normativas diferentes. Por tanto, antes deiniciar cualquier actividad, los usuarios deberán siemprellevar a cabo su propia evaluación de riesgos.Cualquier tipo de norma local emitida por un centro ouna autoridad educativa DEBE ser respetada,independientemente de las sugerencias en esta UnidadEIBE.

Salvo indicación en contra en el contexto, se asume que:

● las prácticas se llevan a cabo en un laboratorio deciencias, adecuadamente equipado y mantenido;

● todos los equipos eléctricos que se conecten a una redde suministro han superado sus correspondientesinspecciones de mantenimiento;

● las operaciones normales del laboratorio, como porejemplo, calentar substancias, se realizan con elcuidado necesario;

● las prácticas son correctas en lo que se refiere amanipulación de productos químicos y organismosvivos;

● siempre que se identifica un riesgo potencial paralos ojos se utiliza protección ocular;

● los alumnos o estudiantes conocen técnicas seguraspara realizar actividades tales como manipularproductos químicos o microorganismos.

© CopyrightEsta Unidad EIBE está protegida por copyright. Losautores de esta Unidad son propietarios de los derechosintelectuales de copyright, según consta la Sección 77 delDesigns, Patents ADNCopyright Act del Reino Unido (1988).

Uso educativo. Está permitido realizar copiaselectrónicas o en papel de esta Unidad EIBE, asícomo copias individuales para utilizar en clase,siempre y cuando dichas copias se distribuyan sincoste o exclusivamente al coste dela reproducción, ylos autores de la unidad aparezcan citadoseidentificados como propietarios del copyright.

Otros usos. Esta Unidad puede distribuirse departicular a particular con fines no lucrativos, pero noa través de listas de distribución electrónica, listas decorreo (listserv), foros electrónicos, BBS, direccionesno autorizadas de World Wide Web, o cualquier otromedio de tipo masivo, ni a través de mecanismos deacceso o distribución que sustituyan la suscripción oel acceso individual autorizado, ni mediantecualquier otro procedimiento cuya finalidad no seala de cumplir de buena fe estas restricciones.

Uso comercial. Se prohibe terminantementeutilizar material perteneciente a esta Unidad confines lucrativos, sin el consentimiento previo de lospropietarios del copyright. Los interesados enemplear este material, en todo o en parte, con finescomerciales, o reimprimirlo mediante cualquiersistema, deberán contactar con:

Secretaría de EIBE (Ute Harms)c/o Institut für die Pädagogik derNaturwissenschaftenUniversidad de KielOlshausenstrasse 62D-24098 KIEL 1AlemaniaTeléfono:+ 49 (0) 431 880 3137Fax: + 49 (0) 431 880 3132Correo electrónico: [email protected]

Equipo de desarrollo● Catherine Adley, Universidad de Limerick. Eire.● Jan Frings, Hogeschool van Gelderland, Holanda.● Cecily Leonard, Universidad de Limerick. Eire● Eckhardt R. Lucius (Coordinador de la Unidad),

IPN, Kiel, Alemania.● Marleen van Strydonk, Universidad de Amberes,

Bélgica.● Paul E. O. Wymer, The Wellcome Trust for

Medical Science, Londres. Reino Unido

Diseño, ilustración, composición, edición y textoadicional: Dean Madden, NCBE, Universidad de Reading,Reino Unido. Copyright de las ilustraciones y la tipografía: ©Dean Madden, 1997

AgradecimientosEIBE desea agradecer de una forma especial su colaboración en la preparación de este material a las siguientes personas: Liesbethvan deGrint (Hogeschool van Utrecht, Holanda) y John Schollar (National Centre for Biotechnology Education, Universidad deReading, Reino Unido), que organizaron y llevaron a cabo un taller supranacional en el que pusieron a prueba el material de estaUnidad. Los siguientes profesores tomaron parte en el mismo, y aportaron valiosos comentarios sobre el borrador del material:E. Vergauts, L. Daniels, L.Neels (Bélgica); Dorte Hammelv (Dinamarca); LuciènneDiemer, Gérard Coutouly (Francia); ThomasJess, Dr. U. Schneck, Dr. E. Lipkow (Alemania); A. De Graaf, Guus Smid, J. Gradener (Holanda); Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackie, Sarah Whitethread, Maggie Parson (ReinoUnido).


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Intr

oduc

ción

A propósito deesta unidad★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Esta Unidad se compone de un conjunto deactividades diseñadas para ser utilizadas bien deforma independiente, bien en serie como partede un programa de enseñanza. Han sidodesarrolladas por profesores y educadores enactivo, pertenecientes a distintos paíseseuropeos, apoyados y animados por el DGXIIde la Comisión Europea, y bajo los auspicios deEIBE (European Initiative for Biotechnology Educa-tion)

Todas las actividades propuestas han sidopuestas a prueba extensamente en talleresprácticos con intervención de profesores detoda Europa.

Las actividades incluidas en esta Unidad son lassiguientes:

1. Modelos baratos de una molécula de ADNy de varios microorganismos. El objetivoconsiste en mostrar las característicasbásicas de estos sistemas y dar a losalumnos ocasión de considerar el tamañorelativo de los microbios.

2. Métodos simples, seguros y económicos deextracción de ADN, proporcionando a losalumnos una experiencia sobre las técnicasbásicas involucradas y dándoles unaoportunidad de ver material genético.

3. Una serie de experiencias que inciden en:a) la presencia de microorganismos en elambiente, y la selección de variedadesútiles; b) algunos de los productos que seobtienen a partir de los microbios(enzimasy antibióticos). Dos de estas experienciasson cualitativas; otra propone un ensayocuantitativo de producción de enzimas.

4. Varias experiencias sobre los efectos delcrecimiento microbiano, que van desdeoperaciones sencillas con masa de panhasta trabajos sobre fermentación, paraterminar con la medición directa de laactividad metabólica de la levadura. Cadauna de estas experiencias deja amplias

posibilidades de profundizar más en lamateria. Con objeto de motivar a losalumnos, las actividades seleccionadas nose centran tan sólo en lo principiosteóricos, sino que reflejan aplicacionesbiotecnológicas.

5. Dos actividades de demostración, en lasque se describen los procedimientosnaturales de transferencia de genes, comouna introducción práctica a los principiosde la modificación genética.

Dos de las actividades prácticas implican laproducción y acción de antibióticos, así como latransferencia de resistencia antibiótica. Por estarazón, se incluye información complementariasobre la materia.

Los autores han procurado combinaractividades simples con otras más avanzadas,con el deseo de que cualquier profesor debiología pueda encontrar algún material de suinterés. Se incluyen asimismo dos apéndicescon información básica sobre el uso de técnicasmicrobiológicas en laboratorios docentes.

En un futuro cercano, se podrá disponer deguías suplementarias con información sobredistintas formas de preparar un curriculum,normativas de seguridad, disponibilidad demateriales y otros datos de importancia,extendidos a distintas partes de la UniónEuropea.

Cualquier comentario relativo a este materialserá bienvenido, especialmente si procede deprofesores, que son los destinatarios principalesdel mismo. Cualquier comentario o cuestiónreferente a esta Unidad puede enviarse a

Eckhard R. LuciusInstitut für die Pädagogik derNaturwissenschaftenUniversidad de KielOlshausenstrasse 62D-24098 KIEL 1Alemania

Teléfono: + 49 (0) 431 880 3137Fax: + 49 (0) 431 880 3132Correo electrónico: [email protected]

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El código genéticoCada una de las secuencias de tres basesnitrogenadas presentes en la doble hélice del ADNcodifica uno de los veinte aminoácidosrepresentados en el centro de la tabla medianteun código de tres letras.

N°1 N°2 N°3

Modelo recortablede ADN★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

ObjetivoPoner de relieve las características esenciales de laestructura del ADN (ácido desoxirribonucleico).

OrganizaciónConfeccionar el modelo lleva unos 30 minutos. Si,además, se quieren colorear las piezas recortables(en la página siguiente), se necesitará algo más detiempo.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de alumnos● Tijeras.● Pegamento para papel, cinta adhesiva o una

grapadora pequeña. Nota: también puede emplearsecinta biadhesiva, aunque tiene tendencia a despegarse alcabo de un tiempo.

● Hilo (para ponerle al modelo una etiqueta, ypara colgarlo una vez esté terminado).

Nota: si se desea confeccionar un modelo mas resistente, sepueden utilizar dos pares de cadenas de azúcares fosfatados,en lugar deuno, y pegarlas formando dos cadenas dobles.

Detalles de montaje1. Recortar las cadenas A y B de azúcares /

fosfatos.2. Recortar los �travesaños� intermedios

(pares de bases nitrogenadas).3. Doblar las pestañas de los travesaños tal y

como se indica en la página siguiente.4. Pegar una de las pestañas situadas en los

extremos de cada travesaño en loscuadrados numerados de la columna A.Los travesaños pueden pegarse encualquier orden, sin que importe haciadonde apuntan.

5. Pegar la otra pestaña de cada travesaño enlos cuadrados numerados correspondientesde la columna B.

6. Se conseguirá un modelo de la doble hélicedel ADN. Poner la etiqueta, utilizando hilo.Si se desea, el modelo también puedeetiquetarse empleando los diagramassituados bajo estas líneas.

AgradecimientosEste modelo es una adaptación del desarrolladopor la organización de investigación CSIRO, delgobierno australiano, para el �Double Helix� ScienceClub. EIBE quiere agradecer a CSIRO su ideaoriginal y su permiso para adaptar el modelo.

La estructura del ADNLas cadenas de moléculas de azúcar y de fosfatosforman las dos �columnas vertebrales� del ADN. Entreellas, cuatro bases nitrogenadas, llamadas timina (T),citosina (C), adenina (A) y guanina (G) se unen mediantepuentes de hidrógeno.


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Timina

CitosinaGuanina

Adenina

(S) Azúcar

(P) Fosfato

European Initiative forBiotechnology

Education

MODELOdel ADN

Col

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B �travesaños� formados por pares de bases

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Con

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odel

osModelos demicrobios★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Con frecuencia, a los alumnos les resultadifícil apreciar la escala de dimensiones delos microorganismos. Por otro lado, lesresulta complicado entender su estructuratridimensional a partir de la visión bidi-mensional que proporciona el microscopio.

Mediante la confección de modelos, estaactividad pretende ayudar alos alumnos acomprender tanto las característicasfundamentales de los microbios, como sustamaños relativos.

Esta actividad tiene tanto más éxito cuantamayor libertad se concede a los alumnospara desarrollar sus propios modelos, enlugar de seguir un plan específico. Por estarazón, la tarea puede terminarse en casa(donde existen más materiales deconfección y se dispone de más tiempo).

Nota: A aquellos individuos cuya dignidad se sientaofendida por la confección de modelos recortables,conviene recordarles la larga y distinguida tradición deconfección de modelos de la biología molecular, a pesarde que, en la actualidad, los modelos físicos han sidoventajosamente sustituidos por modelos numéricosasistidos por ordenador.

Objetivo● Mostrar las características esenciales de la

estructura de un virus bacteriófago λ y deuna serie de bacterias.

● Ayudar a los alumnos a apreciar lostamaños relativos de los virus y lasbacterias.

OrganizaciónSe necesita unos 30 minutos para armar elmodelo del bacteriófago. Si se desea que losalumnos coloreen la estructura de la páginasiguiente, se precisará algo más de tiempo. Losmodelos de bacterias, por su parte, requierenuna hora o más, dependiendo del cuidado conque se hagan. Nota: puede ser interesante utilizaresta actividad como tarea para casa.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de alumnos● Libros de texto, en los que se indiquen las

estructuras de los virus y las bacterias.● Materiales para confección de modelos

recortables, tales como cartulina, cartón deembalar, bolas de ping-pong, cuentas decollares, etc.

● Tijeras.● Pegamento, cinta adhesiva o una grapadora

pequeña.● Pinturas.

Instrucciones para losalumnosVirusConstruir un modelo de bacteriófago λempleando la estructura recortable dada.

BacteriasUtilizar distintos materiales para construirmodelos de bacterias (cocos y bastones)

En cada uno de los modelos:1. Identificar las características básicas que

refleja el modelo, por ejemplo, membranascelulares, material genético.

2. Informarse del tamaño real del organismorepresentado por el modelo.

3. Pensar en una manera sencilla de explicarlos tamaños relativos de los modelos aalumnos más pequeños. Por ejemplo: �silas bacterias de verdad tuvieran estetamaño, tú, en comparación, serías tangrande como una casa�.

AmpliaciónTambién se puede proponer a los alumnos querealicen modelos de células animales y vegetales,que se utilizarán para recalcar las diferenciasentre eucariontes y procariontes, y para insistiren la hipótesis de la endosimbiosis en serie (alexplicar el origen evolutivo que se supone paralos eucariontes).

Información suplementariaLas actividades relacionadas con la confecciónde modelos se describen ampliamente en lasiguiente publicación:

Nicholl, L. y Nicholl, D. (1987),Modelling the eukaryotic chromosome: astepped approach. Journal of Biological Education 21 (2) 99-104.

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.......Estructura para la cabeza de unbacteriófago λ λ λ λ λ

Fotocopiar esta estructura sobre un cartón o lámina de acetato(lámina OHP).

Recortar por el borde exterior de la estructura, marcar y doblarpor todas las líneas y, a continuación, poner en las pestañas unpegamento fuerte para papel, de secado rápido.

La hebra de ADN puede representarsemediante un hilo grueso o un cable.

La cola puede hacerse con una pajita(el modelo resulta más realista si seemplean pajitas flexibles, estiradas).

Cabeza,con ADNen elinterior

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cytoplasm

membranacelular

paredcelular

ribosomas,puntos desíntesis deproteínas

plásmidos,pequeños anillosde ADN

cromosoma

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de A

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Aislamiento deADN bacteriano★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

En esta actividad, se emplea lisozima(un enzima), para degradar la paredcelular de las bacterias, y detergentedoméstico, para romper las membranascelulares internas, liberando los ácidosnucleicos (ADN y ARN).

ObjetivoAislar los ácidos nucleicos de la bacteriaEscherichia coli K-12.

Preparación previaDeberán prepararse cultivos de bacterias en uncaldo nutriente con una antelación mínima decuatro días (sólo los cultivos maduros propor-cionan cantidades significativas de ácidosnucleicos).

OrganizaciónEsta actividad se completa en unos 50 minutos,en los que se incluye un período de 30 minutosde incubación de las bacterias en presencia delenzima.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo dealumnos● Cultivo maduro de Escherichia coli K-12 (véase

Preparación previa, más arriba).● Lisozima en polvo. Sólo se precisa una

cantidad mínima, tomada con la punta deuna espátula.

● 6 ml de etanol frío (el IMS da buenosresultados).

● 0,5 ml de detergente doméstico, por ejemploPril (Henkel), Woolite (Reckitt & Colman).

● Sistema de inoculación.● 3 ml de agua destilada.● 2 Tubos de ensayo.● Pipeta o jeringuilla de plástico de 1 ml, para

eliminar el agua y la solución de lisozima.● Baño termostático a 60 ºC.● Incubadora, a 37 ºC.

Procedimiento1. Preparar un cultivo de Escherichia coli K-12, al

menos cuatro días antes de la fecha enque sedesee aislar el ADN, en un tubo de ensayo.

2. Añadir una pequeña cantidad de lisozima a 5ml de suspensión bacteriana, y mezclar bien.

3. Incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 ºC.4. Añadir a la suspensión bacteriana 0,5 ml de

detergente doméstico.5. Incubar la mezcla durante 2 minutos en un

vaso de precipitado a 60 ºC.6. Dejar que la mezcla se enfríe, introduciendo el

tubo de ensayo en agua fría durante unosminutos.

7. Lentamente, y con mucho cuidado, verter unapequeña cantidad de etanol frío sobre lasuperficie de la mezcla, de manera que formeuna capa.

8. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN)precipitarán en la capa superior de etanol, dela cual se extraerán utilizando una pipeta.

Ampliación1. Teñir el ADN empleando una solución de

acetoorceína o de azul de metileno.

Precauciones de seguridadAl manejar cultivos, deberán seguirse losprocedimientos estándar de seguridadmicrobiológica. También debe tenerse cuidadoal utilizar agua caliente (paso 5).

AgradecimientosEste procedimiento se basa en el desarrollado por Hertel etal. y Süssmuth et al. (1987), que aislaron el ADN del Bacillussubtilis. También queremos dar las gracias al profesorJoseph Lengeler, de Osnabrück, por su sugerencia deemplear detergente doméstico.

Célula bacteriana típica, con indicación de lasituación de los ácidos nucleicos, y de lospuntos de actuación de la lisozima y del deter-gente (sobre la pared y la membrana celular)


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Etanol frío

Lisozima

Suspensiónbacteriana, 5 ml

Detergentedoméstico

Agua fría

ADNyARN

60 °C

1 2

3 4

5 6

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1. Preparar un cultivode E. coli K-12 en uncaldo nutriente.

2. Añadir una pequeñacantidad delisozima a 5 ml desuspensión bacte-riana, y mezclarbien.

3. Incubar la mezcladurante 30 minutosa 37 ºC.

4. Añadir a la suspen-sión bacteriana 0,5ml de detergentedoméstico.

5. Incubar la mezcladurante 2 minutosen un vaso deprecipitado a 60ºC.

6. Dejar que la mezclase enfríe en aguafría durante unosminutos.

7. Lentamente, y conmucho cuidado,verter una pequeñacantidad de etanolfrío sobre la super-ficie de la mezcla,de manera queforme una capa.

8. Los ácidosnucleicos (hebrasfinas de color blan-co) se extraerán enla capa de etanol.

Golpear el tuboligeramente paramezclar el contenido

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Aislamiento delADN de una cebolla★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

A continuación se describe un métodosimple para aislar el ADN y el ARN deun tejido vegetal. En primer lugar, eltejido se rompe mediante un procedi-miento mecánico. A continuación, lasmembranas celulares y las que rodean elnúcleo se degradan empleando deter-gente doméstico. Los fragmentos de lacélula se separan por filtración. Losácidos nucleicos y las proteínas solublespermanecen en la solución. Las proteí-nas se degradan mediante un enzima, ylos ácidos nucleicos se extraen en etanolfrío.

ObjetivoAislar ácidos nucleicos a partir de tejidos deuna cebolla.Nota: los ácidos nucleicos preparados por este sistema no sonmuy puros. El objetivo fundamental de la técnica descritaconsiste en poner de manifiesto los principios básicos deextracción de ADN de un tejido.

Preparación previaEl etanol utilizado debe estar muy frío. Colóquelo enun congelador, en una botella de plástico, al menos 24horas antes de iniciar esta actividad.

OrganizaciónEsta actividad se lleva a cabo en unos 35 minutos,incluyendo un período de incubación de 15 minutos.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de alumnos

● Una licuadora doméstica.● Un cuchillo de cocina afilado, y una tabla de

cocina.● Un embudo grande de plástico.● Baño termostático a 60 ºC.● Un recipiente con hielo.● 2 vasos de precipitado de 250 ml.● Papel de filtro de café (no utilizar papel de filtro

de laboratorio).● Una cebolla mediana.● 10 ml de líquido de limpieza (no utilizar uno de

tipo concentrado, más espeso).● 3 g de sal de mesa.● 100 ml de agua destilada.● 1 tubo de hervido.● 1 varilla agitadora de vidrio.

● Enzima proteasa, por ejemplo, Neutrase (NovoNordisk), 2-3 gotas.

● 6 ml de etanol a 0 ºC (puede utilizarse IMS).

Procedimiento1. Añadir la sal de mesa al líquido de limpieza,

añadiendo a continuación agua destilada hasta100 ml.

2. Cortar la cebolla en trozos pequeños, pero detamaño no inferior a 10 mm x 10 mm.

3. Echar los trozos de cebolla en un vaso deprecipitado, junto con la solución de sal y líquidode limpieza.

4. Colocar el vaso de precipitado en un bañotermostático durante exactamente 15 minutos.

5. Enfriar la mezcla introduciendo el vaso deprecipitado en un baño de hielo y agua durante 5minutos, agitando con frecuencia.

6. Verter la mezcla en una licuadora, y licuarladurante no más de 5 segundos.

7. Filtrar la mezcla a un segundo vaso deprecipitado, asegurándose de que la espumaformada sobre la superficie del líquido nocontamina el filtrado.

8. Añadir a un tubo de ensayo hervido 6 ml deextracto de cebolla y 2-3 gotas de proteasa, ymezclar bien.

9. Verter etanol a 0 ºC cuidadosamente y por lasparedes del tubo, formando una capa por encimadel extracto de cebolla. Dejar reposar el tubodurante unos minutos, sin moverlo.

10. Los ácidos nucleicos precipitarán en la capasuperior.

Ampliación1. Teñir el ADN empleando una solución de

acetoorceína o de azul de metileno.2. También puede extraerse ADN de ciertos tejidos

animales, tales como huevas de bacalao, hígado omollejas. En este caso, es preferible romper eltejido empleando un mortero en lugar de lalicuadora, porque de lo contrario las hebras deADN podrían resultar seccionadas.

Precauciones de seguridadEsta actividad no plantea ningún peligro especial, sibien es preciso tener cuidado al cortar la cebolla omanejar la licuadora.

AgradecimientosEste método ha sido adaptado del texto A Sourcebookof Biotechnology Activities, de Alison Rasmussen yRobert Matheson(1990) National Association ofBiology Teachers. North CarolinaBiotechnologyCenter. ISBN: 0 941212092.

Dicha publicación puede solicitarse a NABT, 11250Roger Bacon Drive #19.Reston. Virginia 22090, Estados Unidos.


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Líquidode

limpieza

1 2 3 4

765 8

9

Aislamentodel ADN deuna cebolla

ADNy

ARN

10 ml de líquido delimpieza3 g de sal de mesa100 ml de agua1 cebolla mediana

Mezclar la sal de mesa con ellíquido de limpieza, y añadiragua hasta un volumen de100 ml. Agitar bien paradisolver la sal.

Añadir la cebollatroceada a ladisolución deagua y líquido delimpieza.

El líquido de lim-pieza rompe lasmembranas de lascélulas, liberando elADN que se encuen-tra en el núcleo decada una de ellas.

Introducir el vaso deprecipitado en unbaño termostático a60 ºC durante 15minutos.

El proceso se acelera conun ligero calentamiento...

...además de que el calordesnaturaliza lasADNasas que podríandegradar el ADN.

Enfriar la mezclaintroduciendo el vasode precipitado en unrecipiente con hielodurante unos minutos.

...pero si se calientadurante demasiadotiempo, también el ADNse rompe, por lo que esnecesario parar la reac-ción con un baño de hielo.

Licuar durante no másde 5 segundos.

La licuadora ayuda a abrirlas células de la cebolla.De todos modos, noconviene licuar mucho lasolución, o podríanseccionarse las cadenasde ADN.

Filtrar la mezclalicuada.

De este modo sesepara el material dela pared celular(retenido porel filtro)del ADN y las pro-teínas, que quedanen la disolución.

Añadir 2-3 gotasde enzimaproteasa a unos10 ml del extractode cebolla.

Sólo se necesita unapunta de espátulade proteasa pararomper todas lasproteínas de ladisolución.

Con mucho cuidado,verter un volumen deetanol muy frío sobre lasuperficie del extractode cebolla.

El etanol* DEBE encontrar-se muy frío. Póngalo en elcongelador 24 h. antes deutilizarlo.

* también puedeemplearse IMS (industrialmethylated spirits).

El ADN se extrae en lacapa superior (etanol)

El ADN no se disuelve enetanol, por lo que escapadel extracto y quedasuspendido en la capasuperior.

Proteasa

Filtrode café

Etanol muyfrío

SALDE

MESAHIELO

Mezclaragitando

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a-1,6gluco-sidasa

α-amilasa

β-amilasaamiloglucosidasa

uniónuniónuniónuniónuniónααααα-----1,4

uniónuniónuniónuniónuniónααααα-----1,6

Lugares deacción enzimáticasobre la amilopectina

En la amilosa y la amilopectina, las unidades deglucosa se encuentran unidas por enlaces α−(α−(α−(α−(α−(1,4);;;;;en la amilopectina, las cadenas laterales se unena la cadena principal mediante enlaces α−α−α−α−α−(1,6). Lasprincipales amilasas producidas industrialmenteson:ααααα-amilasa-amilasa-amilasa-amilasa-amilasa: hidroliza los enlaces ααααα−(1,4) de lospolímeros de glucosa, pero sólo en el interior delas cadenas, proporcionando cadenas más cortas(dextrinas). Se obtiene comercialmente a partir debacterias (por ejemplo, Bacillus spp.).βββββ-amilasa-amilasa-amilasa-amilasa-amilasa: hidroliza los enlaces ααααα−(1,4) de lospolÌmeros de glucosa, extrayendo de formasucesiva unidades de maltosa de los extremos delas cadenas. No puede superar los enlaces de tipoααααα−(1,6). Se obtiene comercialmente a partir de lamalta y la cebada.amiloglucosidasaamiloglucosidasaamiloglucosidasaamiloglucosidasaamiloglucosidasa: Rompe los enlaces α−α−α−α−α−(1,4),,,,,extrayendo progresesivamente unidades deglucosa de los extremos de las cadenas. Tambiénpuede hidrolizar los enlaces α−(1,6)α−(1,6)α−(1,6)α−(1,6)α−(1,6), si bien lo hacemuy lentamente. Se obtiene comercialmente apartir de los hongos Aspergillus spp. y Rhizopusoryzae.pullulanasa: pullulanasa: pullulanasa: pullulanasa: pullulanasa: hidroliza los enlaces ααααα-(1,6). Seobtiene comercialmente a partir de las bacteriasBacillus acidopullulyticus y Klebsiella pneumoniae.

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osProducción de amilasapor los microbios del suelo★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

El almidón está compuesto por unidades deglucosa unidas entresí formando bien unpolímero lineal, llamado amilosa, bien unpolímero ramificado, llamado amilopectina.Estos polímeros se degradan por la acción deamilasas extracelulares, producidas por unagran variedad de organismos, entre los que seencuentran bacterias y hongos. Muchosmicrobios se examinan con el objeto deencontrar los más adecuados para la pro-ducción industrial de enzimas. En estainvestigación, se estudian los microbios delsuelo, en busca de productores de enzimasextracelulares.

Objetivo● Examinar los microorganismos que se

encuentran en la tierra de forma natural, en buscade productores de amilasa.

Conocimientos previosnecesariosLos alumnos deben estar familiarizados con losprocedimientos microbiológicos estándar, incluyen-do técnicas asépticas.También resultaría útil queconocieran la reacción del almidón con el yodo.

Preparación previaSolución de yodo. Debe prepararse con al menosun día de antelación. Los cristales de yodo tardan untiempo en disolverse por completo.Antes de la actividad, deberá prepararse un agar dealmidón / nutriente y varias botellas de aguaesterilizada.Lo ideal sería que las muestras de suelo empleadasse secaran al aire antes de su uso.Bastoncillos esterilizados de algodón. Losbastoncillos esterilizados de algodón que seencuentran en las tiendas tienen un palo de plásticoque se funde al esterilizar en autoclave. Algunos,incluso están tratados con un agente antimicrobiano.Por esta razón, para esta práctica es preciso prepararbastoncillos caseros, liando una pequeña cantidad dealgodón en rama alrededor de un palillo.Introdúzcalos en un autoclave a 121 ºC durante 15minutos, dentro de una botella de McCartney oenvueltos en papel de aluminio.

OrganizaciónPreparación e inoculación sobre placas de Petri:45 minutosObservación de los resultados 2-3 días más tarde:15 minutos

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo dealumnos (se asume que se dispone deequipo normal de laboratorio)● Placa de Petri estéril con 15-20 ml de almidón

estéril/ nutriente de agar, preparado añadiendo aun agar nutriente comercial un 0,2% de almidónsoluble.

● 1 g de tierra seca, recogido 10 cm por debajo dela superficie.

● Una solución de yodo, preparada por disoluciónde 1 g de cristales de yodo y 2 g de yoduro depotasio en 300 ml de agua destilada.

● 15 ml de agua destilada esterilizada en una botellade McCartney.

● Un bastoncillo de algodón estéril, de fabricacióncasera (véase Preparación previa más arriba).

● Rotulador (para marcar la placa de Petri).

unidad de glucosa


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Amidónnutrientede agar

Aguaesterilizada

Procedimiento1 Mezclar 1 g de tierra seca con 15 ml de agua

destilada esterilizada. Agitar bien para dispersarla tierra.

2 Inocular sobre una placa con agar de almidón /nutriente, empleando un bastoncillo esterilizadode algodón para extender la suspensión de tierrasobre la superficie del agar.

3 Marcar la placa de Petri con las iniciales de suresponsable, la fecha y la fuente del inóculo.

4 Incubar la placa inoculada, en posición invertida,durante 2-3 días a 30 ºC.

5 Verter, con mucho cuidado, disolución de yodosobre las placas inoculadas, hasta cubrir porcompleto la superficie del agar, con una capa deyodo de aprox. 1 mm. Las zonas en las quetodavía quede almidón se teñirán de un colorentre azul y negro (las moléculas de yodopenetran en el espacio central de las cadenashelicoidales del almidón, formadas por glucosa).Si los microorganismos han degradado almidón,

aparecerán zonas de color marrón claro (el colorde la solución de yodo) en los bordes de lascolonias.

Precauciones de seguridadIMPORTANTE: Esta actividad puede estarprohibida en algunos países, puesto que, tras laincubación, las placas, inoculadas con organismosindeterminados, se abren al aire. Si resulta necesario,en lugar de organismos del suelo, puede utilizarse uncultivo de Bacillus subtilis. Al realizar esta actividad yal deshacerse de los cultivos, deberán seguirse losprocedimientos estándar de seguridad micro-biológica, si bien en este caso no es estrictamentenecesario emplear técnicas asépticas hasta elmomento de la inoculación de las placas. No esrecomendable acometer subcultivos de organismossin identificar procedentes de las placas inoculadas.El yodo es tóxico, y debe manipularse con cuidado.

Producción de amilasa porlos microbios del suelo

Preparar una placa de Petri con unagar de almidón / nutriente estéril.

Preparar unasuspensión de1 g de tierra en15 ml de aguaesterilizada.

Tierra seca

Inocular la suspensión en elagar, utilizando un baston-cillo de algodón estéril.

Incubar la placa a 30°Cdurante 2-3 días.

Teñir la placa con una solución deTeñir la placa con una solución deTeñir la placa con una solución deTeñir la placa con una solución deTeñir la placa con una solución deyodo, para poder ver los lugares enyodo, para poder ver los lugares enyodo, para poder ver los lugares enyodo, para poder ver los lugares enyodo, para poder ver los lugares enque el almidón ha sido degradado.que el almidón ha sido degradado.que el almidón ha sido degradado.que el almidón ha sido degradado.que el almidón ha sido degradado.

Incubar la placa enposición invertida

El almidón se ha degradadoen las zonas claras

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osProducción decelulasa★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Existe un gran interés por utilizar los deshe-chos de celulosa como substancias nutrientesen procesos de fermentación, lo que permitiríaconvertir unas materias primas de coste muyreducido en productos de gran valor. La mayorparte de las celulasas industriales se obtienenpor fermentación sumergida del hongo Tricho-derma reesei. Sin embargo, la bacteria Cellulomonascrece más rápidamente en una placa de Petri, ysu producción de celulasas extracelulares resultafácil de medir.

ObjetivoLlevar a cabo un ensayo cuantitativo de laproducción de celulasa por parte de Cellulomonas.

Preparación previaSe prepararán cultivos de Cellulomonas, enun caldo nutriente (por ejemplo, en botellas deMcCartney), para su utilización durante la clase.El cultivo debe prepararse dos o tres días antesde la realización de la práctica. Los cultivosdeben incubarse a una temperatura de 25-30 ºC.

Medio de cultivo, que contiene los siguienteselementos: 0,5 g de carboximetilcelulosa (unaforma soluble de la celulosa); 0,1 g de NaNO3;0,1 g de K

2HPO

4; 0,1 g de KCl; 0,005 g de

MgSO4; 0,005 g de extracto de levadura; y 0,1 gde glucosa. Todas estas substancias se añaden a100 ml de agua. El medio se solidificaañadiendo agar al 1,7% en peso o en volumen.

OrganizaciónPreparación e inoculación de las placas de Petri:45 minutosObservación de los resultados, 2-3 días mástarde: 15 minutos

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de

alumnos (se asume que se dispone dematerial normal de laboratorio)

● Cultivo maduro de Cellulomonas sp.● Placa de Petri esterilizada, con 15 ml de

medio de cultivo estéril (véase Preparaciónprevia más arriba).

● Agua esterilizada (en una botella deMcCartney).

● 2 jeringas estériles de 1 ml (sin agujas), o 2

pipetas estériles, provistas de tapón, y uncargador de pipeta.

● Vaso de precipitado con una solución declorato I al 5%, por ejemplo, Domestos(Lever).

● Solución de rojo Congo (1 mg por ml deagua).

● Solución de cloruro sódico 1M.● Etanol (para esterilizar el taladro para

corcho).● Taladro para corcho, de 5 mm de diámetro.● Incubador, a 25-30 ºC.● Rotulador para marcar las placas de Petri.

Procedimiento1 Mojar en alcohol un taladro para corcho de

5 mm de diámetro. Prenderlo hasta que elalcohol se consuma.PRECAUCIÓN. Mientras se realiza estaoperación, el taladro debe sostenerse enposición horizontal, para evitar que la llamaatraviese el orificio central del taladro yproduzca quemaduras en la mano.

2 Sujetando la placa con el medio de cultivo,cortar con el taladro un círculo del mismo,con forma de un tapón circular. Separardicho tapón de agar del taladro, utilizandouna aguja si resulta necesario.

3 Repetir los pasos 1. y 2., con lo que seabrirán dos agujeros en el agar.

4 Etiquetar cada uno de los agujeros sobre labase de la placa de Petri. Un código adecuadopodría ser C para Cellulomonas y A para el aguaesterilizada, utilizada como blanco.

5 Colocar 0,2 ml de cultivo microbiano en elorificio marcado como C, y 0,2 ml de aguaesterilizada en el marcado como A, utilizandoen cada caso pipetas o jeringas separadas.Introducir las jeringas usadas en un vaso deprecipitado con desinfectante.

6 Incubar las placas durante 1 semana a 25-30 ºC. Después de 48 horas a 30 ºC,Cellulomonas produce zonas de color claro dehasta 16 mm de diámetro.

Tras la incubación...7 Lavar las placas con disolución de rojo Congo

durante 15 minutos. A continuación, eliminar eltinte con una disolución de sal durante 10-15minutos. Las zonas que no se hayan teñido indi-can que el medio de cultivo se ha roto en β-(1 - 4)glicanos con siete o menos unidades de glucosapor cadena. El diámetro de la zona despejadapuede medirse para obtener una comparacióncuantitativa de la actividad lítica sobre la celulosa.


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Producción decelulasa

AlcoolAlcoolAlcoolAlcoolAlcooletilicoetilicoetilicoetilicoetilico

Tapón dealgodón enrama

1. Esterilizar eltaladro paracorcho mojándoloen etanol yquemándolo

2. Cortar y retirar dos taponesde agar de la placa, formadodos «pocillos»

3. Inocular uno de los pocillos concultivo de Cellulomonas

Llenar el segundo pocillo conagua esterilizada

4. Incubar la placaa 30 °C durante48 horas

5. Teñir la placa

Medir el diámetro del área dedegradación de la celulosa

PRECAUCIÓN:el etanol es inflamable

Sellar la placacon un poco decinta adhesiva

Precauciones de seguridadDurante la realización de esta actividad, deberánobservarse las normas estándar de seguridadmicrobiológica, así como utilizarse técnicas asépticas.

IMPORTANTE: Si se utilizan muestras desuelo para estudiar la producción de celulasas(Ampliación. Actividad 1), es posible que lasregulaciones locales prohiban reabrir las placas,una vez inoculadas.

Ampliación1 También pueden pipetearse suspensiones de

tierra sobre orificios en el medio de cultivo, paraexaminar la actividad de las celulasas de la floramicrobiana del suelo.

2 La misma técnica puede emplearse para com-probar la actividad de preparados comercialesde celulasa.

3 El curso de la actividad de la celulasa puedeobservarse a lo largo de varios días, empleandoplacas duplicadas.

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Cultivo de tres días de antigüedad deStreptomyces griseus (izquierda). Losorganismos de ensayo son, de arriba aabajo:Candida utilis, Micrococcus luteus,Pseudomonas fluorescens, Bacillusmycoides, Escherichia coli K-12.

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osProducción deantibióticos★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Numerosos microorganismos producenantibióticos, substancias capaces de inhibir elcrecimiento de competidores bacterianos, o deeliminarlos directamente. Desde el desarrollode la penicilina en la década de los 40(producida por el hongo Penicillium), estassubstancias han cosechado éxitos formidablesen la lucha contra las enfermedades. En laactualidad, los antibióticos más importantes seproducen a partir de la bacteria Streptomyces.Este documento contiene informaciónsuplementaria sobre la acción de los antibió-ticos, así como acerca del fenómeno de laresistencia microbiana.

ObjetivoMostrar la producción del antibiótico estreptomicinapor Streptomyces griseus, así como su efecto sobre elcrecimiento de distintos organismos.

Conocimientos previosnecesariosOrigen y efectos de los antibióticos. Desarrollo ypropagación de la resistencia a los antibióticos(véase texto adjunto).

Preparación previa

Se necesitan cultivos activos de Streptomyces griseus,que deben dejarse crecer durante 2-3 días en placascon 15-20 ml de medio basal de agar.

Previamente, es preciso preparar un cultivo con elcual inocular las placas. Para ello, suspender unapequeña cantidad de Streptomyces, tomado de uncultivo maduro con un asa de siembra, en 1 ml decaldo basal estéril. A continuación, pipetearlo en untubo de ensayo con otros 5 ml de caldo basal estéril.Incubar el cultivo durante 24 horas a 30 ºC.

Pasado este tiempo, inocular las placas de Petri conel cultivo de Streptomyces griseus. Extender el cultivoformando una línea recta vertical hacia la izquierdade la placa, de manera que la parte derecha delcultivo permanezca estéril.

Incubar las placas durante 3-4 días a 30 ºC.

Adicionalmente, y con una antelación de 24 horas,preparar cultivos de organismos de prueba (talescomo Bacillus mycoides, Candida utilis, Escherichia coliK-12, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens).

OrganizaciónPreparación de los medios y los inóculos: 60minutosIncubación inicial del cultivo de Streptomyces: 24horas, más una incubación adicional de 72-96 horasInoculación de las placas: 20 minutosIncubación: 24-72 horas

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo dealumnos (se asume que se dispone dematerial ordinario de laboratorio)● Acceso a un incubador, ajustada a 30 ºC.● Asa de siembra.● Placa de Petri estéril, con 15-20 ml de medio

basal de agar, en el que se siembra Streptomycesgriseus, dejándolo crecer durante 48-72 horas(véase Preparación previa, más arriba).

● Cultivos en agar de algunos de los siguientesorganismos, para la realización de pruebas*:- Candida utilis (levadura),- Micrococcus luteus (bacteria)- Pseudomonas fluorescens (bacteria)- Bacillus mycoides (bacteria)- Escherichia coli K-12 (bacteria)

* Es conveniente informarse sobre las regulaciones locales enmateria de utilización de microorganismos en centros docentes(el empleo de algunos de ellos puede estar prohibido en algunospaíses).


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Producción de antibióticos

Procedimiento1. Inocular cada una de las placas de preparado

de Streptomyces con los organismos de ensayo,de la siguiente manera:a) Esterilizar un asa de siembra pasándola

por un mechero Bunsen y dejándolaenfriar brevemente.

b) Cargar el asa de siembra con cultivo de losorganismos de ensayo, y extender cadauno de ellos en una sola franja horizontal,sobre la parte del medio no ocupada porStreptomyces (a la derecha del mismo). Lasfranjas de organismos de ensayo debencomenzar cerca del borde del cultivo deStreptomyces, formando con él ángulosrectos. IMPORTANTE. No tocar el cultivo deStreptomyces con el asa de siembra.

c) Volver a esterilizar el asa de siembrapasándolo de nuevo por la llama. Repetirlos pasos (a)-(c) para cada uno de loscultivos de ensayo.

2. Incubar las placas durante 2 días a 30 ºC.3. Examinar las placas.

Precauciones de seguridadEsta actividad debe llevarse a cabo en un labora-torio. Durante la realización de la misma, y aldeshacerse de los cultivos, se observarán losprocedimientos estándar de seguridadmicrobiológica. Las cantidades de antibióticoproducidos en el curso de la práctica no constituyenningún peligro.

NotaStreptomyces griseus produce el antibióticoestreptomicina, que se difunde por el medio decultivo. La estreptomicina y otros antibióticosrelacionados interfieren con la síntesis de proteínasal unirse al componente 30S, presente en losribosomas bacterianos. Algunos organismos, comoBacillus mycoides, Escherichia coli o Micrococcus luteus sonsensibles. Otros, como Pseudomonas fluorescens, sonresistentes. La estreptomicina no afecta a las leva-duras (Candida utilis), cuyas células son eucariontes yposeen una estructura ribosómica distinta. Para másinformación, véase el texto adjunto, en el que sedescribe en detalle la producción y la forma deactuación de los antibióticos.Preparar un cultivo de Streptomyces

griseus en una placa dePetri con 3-4 días deantelación.Esterilizar un asa de

siembraExtender unode los

cultivos de ensayo enla placa deStreptomyces griseusRepetir el proceso

para cada uno de los cultivos deensayo. El asa de siembra debeesterilizarse después de cadaaplicación

Incubar la placa, en posiciónIncubar la placa, en posiciónIncubar la placa, en posiciónIncubar la placa, en posiciónIncubar la placa, en posicióninininininvvvvvererererertida,tida,tida,tida,tida, dur dur dur dur durante 2-3 días a 30 ante 2-3 días a 30 ante 2-3 días a 30 ante 2-3 días a 30 ante 2-3 días a 30 ºC

Una sola franja a laizquierda de la placa

Cultivos deensayo

No tocar elcultivo deStreptomyces

Sellar las placascon cinta adhesiva

Etiquetar labase de laplaca

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aPreparación demasa de pan★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

La fabricación del pan es una de las aplica-ciones más antiguas de la biotecnología. Lasevidencias se remontan al antiguo Egipto,en donde ya se utilizaba levadura en lafabricación del pan hacia el año 4.000 A.C.En el Reino Unido, el pan se producetradicionalmente a partir de una masacompuesta por harina de trigo, agua, sal y,en algunos casos, grasas, según la receta.Esta masa forma una matriz en la que lalevadura queda atrapada. Las amilasas de laharina humedecida convierten el almidónen glucosa, que sirve de alimento a lascélulas inmovilizadas de levadura.

La levadura también necesita una fuente denitrógeno, que obtiene en forma depeptonas y aminoácidos procedentes de lahidrólisis parcial de las proteínas de laharina (denominadas gluten de formacolectiva). La respiración anaerobia de lalevadura genera dióxido de carbono yalcohol.

El gluten aporta elasticidad y plasticidad ala masa, lo que asegura que el dióxido decarbono quede atrapado en su interior,formando burbujas que originan ellevantamiento de la masa.

ObjetivoEste procedimiento puede emplearse parainvestigar los efectos de distintos compo-nentes, que producen modificaciones en lasproteínas de la harina o en la actividadenzimática.

OrganizaciónEsta actividad se completa en unos 50 minu-tos, según las condiciones (temperatura, etc).

Equipo y materialesPara cada lote de masa● 1 g de levadura seca.● 75 g de harina fuerte de panadero.● 50 ml de agua.● Otros ingredientes adicionales, si se

desea, tales como ácido ascórbico,α-amilasa, bromato potásico (véaseAmpliación, más adelante).

● Vasos de precipitado pequeños, paramezclar la masa.

● Varillas de vidrio resistentes, paramezclar la masa.

● 2 probetas de 100 ml.● Un cronómetro.

Procedimiento1 Reactivar en agua la levadura seca.

Añadir la harina fuerte y mezclar bien.2 Enrollar la masa formando una especie

de salchicha, y colocarla en una de lasprobetas de medida.

3 Medir la altura de la masa en lasprobetas cada 10 minutos, durante unperíodo de 1 hora.

Ampliación1 ¿Qué efecto tiene sobre la velocidad

de crecimiento de la masa el empleo dedistintos tipos de levadura seca depanadero? (Por ejemplo, la levaduraseca normal es una forma de levadura,relativamente nueva, preparada para sermezclada con agua).

2 ¿Qué diferencias existen entre lasvelocidades de crecimiento de masashechas con distintos tipos de harina?(Por ejemplo, harinas de panadero,refinada e integral. Las harinas depanadero son ricas en gluten, pero muypobres en α-amilasa. Las harinasintegrales son ricas en α-amilasa).

3 ¿Qué efecto tiene sobre la velocidad decrecimiento de la masa el ácidoascórbico (vitamina C)? El ácidoascórbico interacciona con los enzimasde la masa, limitando la formación deenlaces de azufre entre las proteínas delgluten. (Añádase 1 g a la receta dadaanteriormente para la masa de pan).


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LEVADURALEVADURALEVADURALEVADURALEVADURASECASECASECASECASECA

4 ¿Qué efecto tiene sobre la velocidad decrecimiento de la masa la adición de α-amilasa? ¿Cómo se explican lasdiferencias observadas?

5 El bromato potásico facilita laformación de enlaces de azufre entremoléculas adyacentes de gluten, con loque la masa gana en elasticidad yposibilidad de expansión. Por supuesto,una expansión excesiva haría perderestabilidad a la masa. Comparar lasmasas preparadas con y sin este aditivo.

6 La sal inhibe la actividad de lasproteasas, evitando que el gluten sedebilite y convierta en una masapegajosa, incapaz de retener lasmoléculas de dióxido de carbono. Un

exceso de sal forma enlaces iónicosmuy fuertes entre las cadenas lateralesde las moléculas de proteína, con loque pierden elasticidad y el pan salecorreoso. Tratar de determinar elcontenido óptimo en sal de la masa.

Información adicionalOn food and cooking. The science and lore of thekitchen. Harold McGee (1991). Harper CollinsPublishers. ISBN: 0 00 4126572

Pritchard, P. E. (1992) �Studies on the bread-improving mechanism of fungal alpha-amy-lase� Journal of Biological Education 26, (1) 12-18

MASA DE PAN. RECETA BÁSICA

1. Echar 1 g de levadura seca en 50ml de agua.

2. Dejar que la levadura se hidrate y,a continuación, añadir 75 g deharina.

3. Mezclar bien.

1. Colocar la masa en una probetagraduada.

2. Anotar el volumen de la masa enintervalos de 10 minutos.

Cuestiones¿En qué medida el volumen de lamasa refleja la tasa de crecimientode la levadura? ¿Cómo podríacomprobarse la respuesta?

¿Qué otros factores (además de laactividad de la levadura) podrÌanafectar al volumen de la masa?

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Photograph courtesy D

r Duncan C

asson

Células de levadura immovilizadasen una matriz de alginato cálcico

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aCélulas de levadurainmovilizadas★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

La levadura de panadero ordinaria, Saccaromycescerevisiae es incapaz de fermentar el azúcarlactosa. El enzima β-galactosidasa degrada lalactosa a glucosa y galactosa. La levadura inmo-vilizada junto con este enzima puede crecer enun medio que contiene lactosa. De los dosazúcares producidos por la acción enzimática,la levadura utiliza preferentemente la glucosa.Cuando se agotan las existencias de este azúcar,la levadura ajusta su metabolismo al otro pro-ducto de degradación de la lactosa, pasando anutrirse de galactosa. La actividad de la levadurase controla midiendo el volumen de gas(dióxido de carbono) producido durante lafermentación.

ObjetivoProporcionar una introducción al estudiocuantitativo de la fermentación.

Preparación previaEl alginato de sodio no se disuelve muy bien enagua. Para disolverlo, es necesario emplear aguacaliente y agitar durante un tiempo. Por ello, lasolución de alginato de sodio deberá prepararse conantelación. Si se tiene intención de guardarla duranteun período prolongado, es recomendableesterilizarla antes en autoclave. Importante: en todas lassoluciones deberá emplearse agua destilada o desionizada,puesto que los iones calcio del agua del grifo provocan ladeposición del alginato.

OrganizaciónLas células inmovilizadas de levadura puedenprepararse en 10-15 minutos. La fermentaciónpuede llevar una semana.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de alumnos● 10-15 ml de solución de alginato de sodio al 4%.● 100 ml de disolución de cloruro cálcico al 1,5%.● Jeringuilla de 10 ml, sin aguja.● Colador de té.● 2 vasos de precipitado de 200 ml.● 2 matraces Erlenmeyer, de 250 ml.● 2 Tapones adaptados al tamaño de los matraces de

fermentación, con agujero y provistos de un tubo.● 2 vasos de precipitado grandes (por ejemplo,

de 500 ml).● 2 probetas graduadas de 100 ml.

● Solución de un producto químico deesterilización, por ejemplo una solución demetabisulfito de sodio o de un productocomercial, como puede ser Milton (solución dehipoclorito sódico, Procter & Gamble).

● Solución de cloruro sódico al 13%,aproximadamente 1 l (puede utilizarse sal demesa ordinaria).

● 100 ml de medio, con 2 g de glucosa, 1 g deextracto de levadura y 1 g de peptona.

● 100 ml de medio, con 2 g de lactosa, 1 g deextracto de levadura y 1 g de peptona.

● 2 ml de enzima β-galactosidasa, por ejemploLactozym (Novo Nordisk).

● Levadura de panadero, fresca o seca.

ProcedimientoPreparar gránulos de levadura y enzimainmovilizados de la siguiente manera:1 Mezclar la levadura seca con 25 ml de agua

destilada en un vaso de precipitado pequeño.Taparlo y dejar que la levadura se hidratedurante 10 minutos a temperatura ambiente.

2 Mezclar en el otro vaso de precipitado pequeñola solución de alginato sódico con β-galactosi-dasa. Añadir 10 ml de la suspensión delevadura, y remover.


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Ca2+

3 Cargar una jeringa con mezcla de levadura,alginato y enzima. Descargarla, gota a gota,sobre un vaso de precipitado grande, quedeberá contener solución de cloruro sódico.

4 Dejar que los gránulos de células inmovilizadasde enzima y levadura se endurezcan en lasolución de cloruro sódico durante 10 minutos.

5 Separar los gránulos de la solución utilizando elcolador. Lavar los gránulos con agua del grifoen abundancia.

Los gránulos en agua esterilizada pueden almacenarse enrefrigerador hasta tres días, antes de ser utilizados.

Preparar los recipientes de fermentación de lasiguiente manera:1 Esterilizar los frascos empleando una solución

de metabisulfato sódico o de un productosimilar. Una vez completada la esterilización,lavar los frascos con agua abundante.

2 Llenar los frascos con medios de cultivoesterilizados. Utilizar, para el primer frasco, unmedio de glucosa (como control) y, para elsegundo, un medio de lactosa.

3 Añadir en cada frasco cantidades iguales degránulos de levadura inmovilizada (igual peso oigual número de gránulos).

4 Tapar los frascos con tapones provistos detubos de descarga.

5 Mantener los frascos a una temperatura de 21-25 ºC. Recoger los gases que se desprendan

sobre una solución de cloruro sódico al 13%(esta disolución no absorbe el dióxido decarbono). Anotar, a intervalos adecuados, elvolumen de gas recogido.

6 Representar gráficamente los resultados(volumen de gas en función del tiempo).

Ampliación1 Pueden emplearse distintos tipos de levaduras,

por ejemplo de los tipos empleados en lafabricación de pan y de vino.

2 También pueden variarse parámetros talescomo la concentración de β-galactosidasa, latemperatura de incubación, y otros.

Precauciones de seguridadEl aumento de la presión en el interior de losrecipientes de vidrio debida al desprendimiento degases puede resultar peligrosa. Por ello, esconveniente asegurarse de que los recipientes defermentación estén correctamente ventilados.También debe tenerse cuidado al emplear agentesquímicos esterilizadores, debiéndose observar lasinstrucciones dadas en cada caso por el fabricante.

La técnica más extendida para inmovilizar células consiste enatraparlas con alginato cálcico. Esta técnica resultaespecialmente adecuada para células vivas, al requerircondiciones de reacción muy suaves. Entre las aplicacionesde este versátil método destaca su empleo en biorreactores,tanto con células vivas como con células muertas, enatrapamiento de protoplastos vegetales y embriones de plantas(�semillas artificiales�) para micropropagación, eninmovilización de hibridomas celulares para producción deanticuerpos monoclonales, y en atrapamiento de enzimas yfármacos (véase la tabla de la página siguiente).

Las células o enzimas que van a ser atrapados se mezclanprimeramente con una solución de alginato sódico. Lamezcla se añade a otra disolución, que contiene cationesmultivalentes (normalmente Ca2+). En cuanto las gotas dealginato/enzima entran en contacto con la solucióncatiónica, se forman esferas que quedan depositadas en elfondo, atrapando las células en una red tridimensional decadenas de alginato unidas lateralmente (véase el diagramasobre estas líneas).

Para más información, véase Smidsrød, O. y Skjåk-Bræk, G.(1990), Alginate as an immobilization matrix for cells. Trendsin Biotechnology 8(3), 71-78.

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®

The University of Reading, United Kingdom

NATIONAL CENTRE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATIO

N

Enzymes for Schools and Colleges

Novo Nordisk Lactozymβ-galactosidase from Kluyveromyces lactis

100 ml

Store at 4°C. Do not freeze.

Saccharomyces cerevisiaeFermentation results

Levadura, enzima lactasa ysolucíon de alginato sódico

Añadir gota a gota

Aclararcon agua

El enzima del interior de losgránulos rompe la lactosa ensus constituyentes, glucosay galactosa

Solucíon decloruro cálcico

Las células de levadura se nutrende los azúcares formados por elenzima, produciendo alcohol ydióxido de carbono

Solución de lactosa,reforzada conpeptona y extractode levadura

Soluciónde clorurosódico al

13%

Representar lavariación delvolumen de gas enfuncíon del tiempo

CO2

Ejemplos del empleo de células immovilizadas con alginato (Smidsrød y Skjåk-Bræk, 1990)

Células Producto/empleo

BacteriasErwinia rhapontici IsomaltulosaPseudomonas denitrificansTratamiento de agua potableZymomonas mobilis Etanol

CianobacteriasAnabena sp. Ammoniaco

HongosKluyveromyces bulgaricus Hidrólisis de la lactosaSaccharomyces cerevisiae EtanolSaccharomyce bajanus Producción de champán

AlgasBotryococcus braunii Hidrocarburos

Células Producto/empleo

Células VegetalesChatharanthus roseus Alcaloides para tratamiento

del cáncerVarias plantas Semillas artificialesProtoplastos vegetales Manipulación de células,

microscopíaCélulas de mamíferos

Hibridomas Anticuerpos monoclonalesIslotes de Langerhans Insulina/ImplantaciónFibroblastos o células Interferoni ( α o β ) de linfoma

LEVADURALEVADURALEVADURALEVADURALEVADURASECASECASECASECASECA


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Montaje de una célulamicrobiana (las dimensionesexactas no son importantes. Ladel dibujo mide aproximadamente

55 mm x 55 mm)

Orificio a travésdel que se llenala cámara

junta deneopreno

terminal del electrodode fibra de carbono

La pieza deJ-Cloth evitaque elelectrodotoque lamembrana

membrana deintercambio decationes

La cámara vapegada a la placaterminal con unpegamentoimpermeable

Segu

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a

La pila microbiana★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Durante décadas, los microbios capaces deproducir electricidad fueron objeto decuriosidad biológica. En la actualidad, losinvestigadores auguran su aplicación encámaras y relojes de pulsera, como fuentesde energía para los países del TercerMundo, y en biorreactores destinados atransformar los deshechos industriales enelectricidad. La pila microbiana descrita acontinuación genera una pequeña corrienteeléctrica al retirar electrones de la cadena detransporte de la levadura. Puede emplearsepara estudiar la respiración de una maneranueva y estimulante. La información deestas páginas se amplía en BIO/technologyEducation, Volumen 1, No 4, páginas 163-168.

Objetivos● Proporcionar una introducción motivadora

al estudio de la respiración.● Permitir el estudio de algunos de los factores

que influyen en la respiración microbiana.● Mostrar que la materia orgánica de desecho

puede emplearse para generar electricidad.

Preparación previaLas soluciones de reactivos deberán prepararsecon antelación. Poner en remojo en agua des-tilada la membrana de intercambio de cationes24 horas antes de utilizarla. La levadura seca sereactiva en el momento de montar la pila.

OrganizaciónEl montaje de la pila, hasta que ésta empieza agenerar electricidad, lleva unos 30 minutos.

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo de alumnos● Una pila Perspex (ICI), fabricada en chapa

de 4 mm.● 2 juntas de neopreno.● Una membrana de intercambio de cationes,

cortada para encajar entre las cámaras de lapila. La membrana puede reutilizarse indefinida-mente, pero se funde si se esteriliza en autoclave.

● 2 Electrodos de tejido de fibra de carbono,cortados a medida.

● 2 piezas de J-Cloth (Johnson & Johnson),cortados para encajar dentro de la célula.

● 2 jeringuillas de plástico de 10 ml, paraadministrar líquidos.

● La base o la tapa de una placa de Petri, paracolocar la pila.

● 2 cables eléctricos, con conector de pinza.● Voltímetro o multímetro para medida entre

0-5 V, y / o un motor de baja corriente.● Tijeras

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V

4 H+

4 4

Fe(CN)64-

3-Fe(CN)6

Funcionamientode la pila

Ánodo Cátodo

indica electrones

Glucosa azul demetileno

(reducido)

Hexaciano-ferrato

potásico

Dióxido decarbono

membrana de intercambio de cationes

azul demetileno(oxidado)

Pila montada

Célu

las d

e le

vadura

scade

na de transpo

rte de

ele

ctrone

s

Todas las disoluciones mencionadas a con-tinuación deberán prepararse empleandocomo disolvente un medio tampón defosfato 0,1 M, a pH 7,0, en lugar de agua.● Levadura seca de panadero, mezclada con

solución de fosfato 0,1 M hasta formar uncaldo espeso (no añadir solución de glucosa sinantes reactivar la levadura en el medio tampón).

● 5 ml de solución de azul de metileno 10 mM.● 5 ml de solución de glucosa 1 M.● 10 ml de solución de hexacianoferrato (III) de

potasio 0,02 M (también llamado ferricianuropotásico).

Para preparar medio tampón de fosfato 0,1 M,a pH 7,0, disolver 4,08 g de Na2HPO4 y 3,29 gde NaH2PO4 en 500 ml de agua destilada.

Procedimiento1 Cortar dos electrodos de fibra de carbono tal y

como se indica en la página anterior.2 Cortar dos piezas de J-Cloth que encajen en el

interior de la pila.3 Montar una pila según el esquema de la página

anterior.4 Colocar el montaje sobre la base o la tapa de

una placa de Petri que recoja cualquier fuga delíquido.

5 Mezclar las disoluciones de levadura, glucosa yazul de metileno. Inyectar la solución en una delas cámaras de la pila utilizando una jeringuilla.

6 Inyectar solución de hexacianoferrato (III) depotasio en el otro lado de la pila.

7 Conectar un voltímetro o multímetro a loselectrodos terminales, utilizando pinzasconectoras. Este tipo de pilas produce unacorriente típica de 0,4-0,6 V. La corrientecomienza a producirse inmediatamente. Si el

aparato de medida marca cero, revisar las conexiones yverificar que los electrodos de fibra de carbono no esténtocando la membrana de intercambio de cationes.

Ampliación1 Para conseguir una tensión eléctrica mayor,

pueden conectarse entre sí varias pilas. Elaumento del tamaño de la célula (o de lasuperficie de los electrodos) aumentará laintensidad de corriente, pero no la tensiónsuministrada por la pila.

2 Pueden emplearse distintos intermediariosy/o tipos de levadura, por ejemplo, de lasclases empleadas en la fabricación de pan ovino. Nota: por razones de seguridad, no serecomienda la utilización de otros microorganismosen la confección de la pila.

3 Investigar el efecto de la temperatura sobre laacción de la pila (deberá considerarse qué�controles� es preciso establecer a la hora deefectuar comparaciones de este tipo).

Precauciones de seguridadEl hexacianoferrato (III) depotasio es venenoso. Cuando semanipule esta substancia, deberáutilizarse protección ocular. Sidicha disolución entrara en

contacto con los ojos, estos deberán lavarse conagua abundantemente y, a continuación, serinspeccionados por un médico. En caso deingestión, hacer beber al intoxicado aguaabundante y trasladarle a un centro médico. A lahora de desechar la solución usada, deberárespetarse la normativa local aplicable.

AgradecimientosLa pila microbiana fue desarrollada por el Dr.Peter Nennetto, del King�s College de Londres.


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Tra

nsfe

renc

ia d

e ge

nes

Plásmido F

Figura 1. Conjugación y transferencia de plasmidos F entre células bacterianas

1. Los plásmidos F sedesenrollan y replican

el plásmidoincluye genesque codificanproteínas parel pilus sexual

2. A través del pilus, pasanhebras individuales deADN a la célula recpetora

pilus sexualcromosomabacteriano

3. Se sintetiza ADNcomplementario,formando un nuevoplásmido F.

Receptor

Transferencianatural de genespor conjugaciónbacteriana★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Existen varios métodos naturales de trans-ferencia de genes entre bacterias. Dichosmecanismos han seguido una evoluciónorientada probablemente a favorecer la adap-tación a condiciones ambientales en rápidavariación. Como norma general, los genes conmayor movilidad se encuentran situados enlos plásmidos.

Los plásmidos son anillos de ADN que sereplican independientemente del cromosomabacteriano, y en los que se localiza un pequeño

número de genes que proporciona a su porta-dor la capacidad de degradar substanciaspeligrosas presentes en el ambiente, tales comometales pesados o antibióticos.

Se conocen tres tipos de transferencia naturalde material genético:

Transformación, consistente en la captaciónde ADN libre en los alrededores de la célula.

Transducción, que es el movimiento de ADNde una célula a otra a través de la intervenciónde un bacteriófago.

Conjugación, que es la transferencia de�plásmidos F�, especializados, a través de unestrecho tubo (pilus sexual o fimbria) queconecta dos células bacterianas (véase figura 1).

Los ingenieros genéticos emplean todos estosmétodos, sobre todo la transformación, paraintroducir en las bacterias genes seleccionados.

Donante

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Figura 2. Apariencia de las cepasdonante y receptora en un agar deMacConkey

ReceptorEscherichia coli(cepa Lac-)

DonanteEscherichia coli(cepa Lac+)

Figura 3:Diferenciación delas cepas donante,receptora y trans-conjugada en unagar de MacConkeyordinario.

Receptor Escherichia coli

K-12 L17

Pequeñascolonias decolor blanco

DonanteEscherichia coli

K-12 CSH36

Ausenciade colonias

Gen de resistencia a laestreptomicina en el

cromosoma

Gen de resistencia a laestreptomicina en el

cromosoma

Coloniasde color

rojoGen Lac+ en el

plásmido

Gen Lac+

en elplásmido

Colonias decolor rojo

Transconjugada

Pequeñascolonias decolor blanco

En esta práctica se estudia la conjugación entredos cepas de bacterias presentes en lanaturaleza.Nota: esta práctica emplea bacterias,plásmidos y procesos naturales, y noconstituye, por lo tanto, un experi-mento de �ingenierÌa genética�.

Plásmidos FLos llamados plásmidos F (la �F� significa�fertilidad�) contienen genes que permiten latransferencia de una copia del plásmido de unacélula donante a otra receptora o, en otraspalabras, la conjugación bacteriana.

Los plásmidos F pueden igualmente incorporarotros genes. Por ejemplo, en esta práctica, lacepa donante posee un plásmido llamado F Lac.Dicho plásmido se llama así porque incluyegenes que permiten a la bacteria portadora lametabolización de la lactosa (la bacteria sedenomina, en tal caso, una cepa Lac+). Encontraste, la célula receptora, que no disponedel plásmido, es incapaz de metabolizar lalactosa (es una cepa Lac-).

Los cultivos de estas dos cepas sobre agar deMcConkey se distinguen fácilmente por suapariencia: las colonias de donante forman

colonias de color rojo, mientras que las coloniasde receptor son de color blanco (véase Figura 2).

Cuando se mezclan las cepas donante y receptora,se produce una transferencia de plásmidos F Lacdel donante al receptor, con lo que este últimoadquiere la facultad de metabolizar lactosa.

Las cepas donante, receptora y transconjugadapueden distinguirse mediante un �truco�


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DonanteDonanteDonanteDonanteDonante

ReceptorReceptorReceptorReceptorReceptor

genético. Se selecciona una cepa receptora conun gen cromosómico que la haga insensible a laacción del antibiótico estreptomicina. La cepadonante no dispone de dicho gen, y su creci-miento es inhibido por la estreptomicina. Deeste modo, las cepas receptora y transconjugadapueden identificarse por su capacidad para creceren presencia de estreptomicina (Figura 3).

Objetivos● Proporcionar una introducción motivadora

a la genética bacteriana.● Dar a los alumnos la oportunidad de

discutir materias relacionadas con latransferencia natural de genes, por ejem-plo, la propagación de la resistencia a losantibióticos, o la evaluación de riesgos eningeniería genética.

Preparación previaLos siguientes medios deberán prepararse yesterilizarse:● 3 matraces Erlenmeyer de pequeño tamaño

(por ejemplo, 100 ml), cada uno de ellos con10 ml de caldo nutriente esterilizado.

● Agar de McConkey esterilizado, al que seañadirán 200 mg de sulfato de estreptomi-cina por cada ml de disolución. Cuando elagar se haya enfriado a 50 ºC (se notarácaliente al tocarlo con la mano), deberádividirse entre las placas de Petriesterilizadas (unos 15-20 ml por placa).

● Los cultivos utilizados son:Cepa donante:

Escherichia coli K-12 CSH36(Nº DSM 6253)

Cepa receptora:Escherichia coli K-12 L17(Nº DSM 6254)

Estos organismos naturales proceden de laColección Alemana de Microorganismos yCultivos Celulares (DSM). Ambos cultivos sesuministran liofilizados, en forma de ampollasde vidrio. Las ampollas deben abrirse correcta-

mente, con el objeto de evitar tanto la conta-minación de su contenido como que el usuariose exponga a peligros innecesarios (véanse lasinstrucciones adjuntas). La cepa donante no semantiene en estado activo con facilidad, por loque es necesario utilizar un cultivo reciénreactivado.

Los cultivos de las cepas donante y receptora sepreparan con un día de antelación, de lasiguiente manera:

1 Inocular uno de los Erlenmeyer de nutrienteestéril con la cepa donante (y etiquetarlocon la palabra �Donante�), y otro con lareceptora (y etiquetarlo como �Receptor�).

2 Incubar ambos matraces durante la noche a37 ºC, si es posible en un baño termostáticoprovisto de agitador.

El contacto entre los cultivos se lleva a cabo dela siguiente manera:

1 Con una pipeta esterilizada, añadir 0,8 ml(de forma aséptica) de la cepa donante altercer matraz, que deber· contener 10 ml decaldo nutriente estéril.

2 Con una pipeta esterilizada, añadirasépticamente 0,2 ml de cepa receptora almismo matraz.

3 Etiquetar el matraz adecuadamente eincubarlo a 30 ºC durante 16-24 h.Nota: durante la incubación, el matraz deber·agitarse CON SUMO CUIDADO. Laagitación vigorosa puede romper los pili deunión entre las células en conjugación.

Para preparar bastoncillos esterilizados dealgodón, liar una pequeña cantidad de algodónen rama alrededor de la punta de un palillo.Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15minutos dentro de una botella de McCartney oenvueltos en papel de aluminio.

OrganizaciónPreparación del medio: 60 minutosIncubación inicial: 48 horasInoculación de las placas: 15 minutosIncubación: 24 horasObservación de resultados: 20 minutos

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D

R

M

MezclaMezclaMezclaMezclaMezcla

Desinfectante

Equipos y materialNecesario para cada alumno o grupo dealumnos (se asume que se dispone dematerial normal de laboratorio)● Acceso a un incubador, ajustado a 30 ºC.● Placa de Petri esterilizada, con 15-20 ml de

agar de McConkey, al que se añadiráestreptomicina.

● Los siguientes cultivos, previamentemadurados en agar nutriente:

- Cepa donante- Cepa receptora- Mezcla de cepas donante y receptora

● 3 bastoncillos esterilizados de algodón, defabricación casera.

● 1 vaso de precipitado pequeño, con unasolución desinfectante de Domestos (Lever)al 3%, en el que se introducirán losbastoncillos usados.

● Rotulador (para marcar las placas de Petri).

Procedimiento1 Trazar tres líneas en la base de una de las placas

con estreptomicina y agar de McConkey,dividiéndola en tres porciones iguales.

2 En el centro de cada una de las porciones,dibujar un círculo de unos 10 mm dediámetro. En el interior del primero,escribir una �D� (cepa donante), en elsegundo una �R� (cepa receptora), y en eltercero una �M� (mezcla de las dos cepas,que da lugar a transconjugados).

3 Inocular cada una de las porciones marcadascon las cepas bacterianas correspondientes,utilizando bastoncillos esterilizados dealgodón. Utilizar un bastoncillo nuevo paracada cultivo. Introducir los bastoncillosusados en un vaso con desinfectante.

4 Dejar que las placas reposen durante unosminutos, hasta que no se vea líquido sobre lasuperficie del agar. Incubar las placas, enposición invertida, durante uno o dos días a30 ºC.

AmpliaciónEs posible realizar algunas versiones de caráctercuantitativo sobre la práctica:1 Diluyendo los cultivos de donante y receptor

en una solución de Ringer esterilizada o enuna solución 10-3 M de MgSO4, se puededeterminar la relación óptima entre donantey receptor.

2 También es posible determinar el tiempo decontacto óptimo para la conjugación.

Precauciones de seguridadEsta práctica debe llevarse a cabo en unlaboratorio. Durante la realización de la misma, yal deshacerse de los cultivos, se observarán losprocedimientos estándar de seguridadmicrobiológica, incluyendo técnicas asépticas.

AgradecimientosEsta práctica es una versión simplificada de ladesarrollada por la Profesora Patricia Nevers, de laUniversidad de Hamburgo. A su vez, el protocolo de laProf. Nevers está basado en el de E. Härle yR. Hausmann, de la Universidad de Friburgo.


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Transferencianatural de genes deAgrobacteriumtumefaciens★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Los tumores vegetales constituyen un serioproblema en la práctica de la agricultura, lahorticultura y la viticultura. Con frecuencia sedesarrollan aprovechando pequeños desperfectos enlas plantas producidos durante el cultivo del suelo, ocomo consecuencia de los daños causados porheladas o injertos.

A principios de nuestro siglo se descubrió queciertos tumores siempre se encontraban asociados ainfecciones bacterianas. Las bacterias involucradas sedenominaron Agrobacterium tumefaciens (del griego:agros = campo; del latín: tumor = hinchazón,dilatación; facere = hacer), aunque no se hizo la luzsobre las complejas interrelaciones entre las plantasy Agrobacterium hasta finales de los años 70.

Las bacterias infecciosas introducen una pequeñaparte de su información genética (un plásmido) en elgenoma de las células vegetales, obligando a lascélulas infectadas a adoptar un programa favorable alas bacterias. Cada una de las células afectadas de laplanta se ve obligada a dividirse, desarrollándose untumor que sirve de hábitat a las bacterias intrusas, altiempo que les proporciona una serie de derivadosde aminoácidos poco frecuentes que necesitan parasubsistir.

Los métodos de transferencia genética utilizados porAgrobacterium fueron adaptados y hoy los empleanlos cultivadores de plantas para transferir genes deinterés sin los largos períodos de espera de loscruces de cultivos. Como resultado, diversas formasmodificadas de Agrobacterium se han convertido enuna importante herramienta de la tecnologíagenética.

Agrobacterium tiene forma de barra y aproximada-mente el mismo tamaño que E. coli, es decir, unalongitud entre 1 y 3 µm. Mientras vive en losestratos superiores del suelo, Agrobacterium tumefaciensconserva su virulencia. Es un organismo saprofitocapaz, sin embargo, de utilizar nitrógeno inorgánico.Agrobacterium invade exclusivamente plantasdicotiledóneas, en las que sólo puede penetrar através de cortes. Las bacterias no son capaces depenetrar a través de paredes de células vegetalesintactas.Las células dañadas funcionan como «cebo» de las

bacterias, activando la transferencia de genes. Lasbacterias se multiplican en el área que rodea la«herida» y penetran en el espacio intercelular,adhiriéndose a las paredes de las células vegetales. Elplásmido de Agrobacterium es transferido al interiorde las mismas, terminando por integrarse en elpropio cromosoma de la célula. Desde allí, induce laproducción de opinas, que Agrobacterium empleacomo fuente de carbono y nitrógeno.

ObjetivosEn esta actividad se infectan células deBryophyllum = Kalanchoe sp. con formas natu-rales de Agrobacterium, en diversas condiciones.Bryophyllum es fácil de cultivar, y sufre elfenómeno de propagación con rapidez. Elcrecimiento del tumor se observa durante 4semanas. Existe la opción de estudiar lassiguientes variantes del protocolo:

A. Modo de infección:- Practicar un corte e infectarlo

inmediatamente con Agrobacterium.- Practicar un corte e infectarlo con

Agrobacterium al día siguiente.- Practicar un corte e infectarlo

inmediatamente con Agrobacterium.Cubrir con un pedazo de pañuelo depapel húmedo.

- Practicar un corte, pero sin infectarlocon bacterias.

- Aplicar Agrobacterium sobre zonas deplantas no dañadas.

B. Punto de infección- tallo;- superficie de las hojas;- yemas.

Preparación previa1 Propagación de las plantas portadoras (si

se considera apropiado, los alumnospueden realizar esta parte en casa).

2 Preparación de medio nutriente y decultivos de Agrobacterium tumefaciens almenos dos semanas antes de ser utilizados.

OrganizaciónCrecimiento de las plantas portadoras (si esnecesario): 4 mesesPreparación del cultivo de Agrobacterium:

2 semanasInfección de las plantas con Agrobacterium:

20 minutosObservación del crecimiento del tumor:

de 3 a 4 semanas

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Esterilizaruna agujaprovista demango

PRECAUCIÓN:EL ETANOLES INFLAMABLE

Arañar laplanta con laagujaesterilizada

Pasar el asa desiembra por lallama antes ydepués de cadauso

Cultiva deAgrobacteriumtumefaciens

Aplicarbacterias en elcorte

Etanol

Equipo y materialesNecesarios para cada alumno o grupo dealumnos (se asume que se dispone del equiponormal de laboratorio)● Agua esterilizada (dispensada en una

botella de McCartney).● Aguja de inoculación.● Asa de siembra.● Microscopio binocular.● Tijeras.● Etiquetas y rotulador.● Toallitas de papel.● Cinta adhesiva.● Etanol, para esterilizar los instrumentos a

la llama.● Cultivo de Agrobacterium tumefaciens (en

agar nutriente).● Plantas de Kalanchoe (Bryophyllum), de unos

3 ó 4 meses de edad.

ProcedimientoLas plantas empleadas en el experimento setratan de distintas maneras (véanse las notasintroductorias anteriores, y las instrucciones acontinuación).

1 Etiquetar cada planta con la fecha y el tipode tratamiento recibido. Si se consideranecesario, identificar las partes infectadasde las plantas (por ejemplo, con etiquetascolgantes).

2 Después del tratamiento, colocar las plantasen un lugar bien iluminado,manteniéndolas húmedas, pero sin regarlasen exceso.

3 Observar y anotar el desarrollo de lostumores durante las siguientes 4-6 semanas.Examinar una muestra de tejido del tumoral microscopio binocular, y compararla conuna muestra de tejido de una hoja sana.

Infección de las plantas con Agrobacterium

Método 1 (los cortes se infectan inmediatamente)1 Sumergir en alcohol una aguja de

inoculación. Extraerla, y prender el alcoholcon un mechero hasta consumirlo porcompleto. Arañar la superficie de la plantauna o más veces.

2 Infectar los cortes con Agrobacteriumextraído del cultivo. Para ello, pasar un asade siembra por la llama y dejar que seenfríe brevemente. Tomar con el asa unapequeña cantidad de cultivo bacteriano (decolor blanco), y extenderlo sobre el corte.Esterilizar de nuevo el asa de siembra.

Método 2 (infección de las plantas 24 horas despuésde practicar los cortes)1 Practicar cortes en las plantas (siguiendo el

Método 1).2 Extender Agrobacterium en el área de los

cortes al día siguiente.

Método 3 (los cortes se infectan inmediatamente, y secubren con pañuelos húmedos de papel)

1 Practicar cortes en la planta, e infectarlasegún el procedimiento del Método 1.

2 Cortar piezas de las toallitas o pañuelos depapel, y humedecerlas en agua del grifoesterilizada. Colocar los pedacitos sobre loscortes y asegurarlos con cinta adhesiva.Mantener los papeles húmedos durante dosdías.


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Los genes útiles sonaislados del

organismo donante

Enzimarestrictivo

El enzimarestrictivocorta el ADN enlugaresespecíficos

La ADN ligasa une losfragmentos de ADN

Los genes nodeseados soneliminados del

plásmido

Nuevo plásmidointroducido enAgrobacteriumtumefaciens

PlásmidoCromosoma bacteriano

Trozos de hoja, cortados enforma de disco, flotando en

una suspensión de células deAgrobacterium

El nuevo plásmidopenetra en lacélula a traversdel corte

Los discos se cultivan en unmedio nutriente selectivo, quesólo permite el crecimiento de

las células transformadas

A continuación puedenregenarse plantas

enteras, que yacontienen el gen

introducido

Utilización de formas modificadas de Agrobacterium tumefaciens en tecnología genética

Método 4 (los cortes no se infectan)1 Practicar cortes en los mismos puntos

descritos en el Método 1, y en otrospuntos distintos. Cubrir estos últimoscortes con papel húmedo, sin tratarlos conAgrobacterium.

Método 5 (infección sin cortes previos)1 No practicar ningún corte a la planta.2 Valiéndose de un asa de siembra, aplicar

Agrobacterium en uno o más puntos de lasuperficie sana.

Precauciones de seguridadEsta actividad deberá llevarse a cabo en unlaboratorio. Durante la manipulación de cultivos

microbianos, deberán observarse los procedi-mientos estándar de seguridad microbiológica,incluyendo las técnicas asépticas.IMPORTANTE: A. tumefaciens es un agentepatógeno de las plantas de cierta consideración.Su uso en estudios experimentales se encuentraestrictamente controlado en algunos países yregiones. Quienes deseen llevar a cabo este tipode prácticas deberán asegurarse de respetar lasregulaciones locales en vigor.

AgradecimientosEsta práctica fue desarrollada por Uta Nellen,del Centro de Biología Escolar y EducaciónMedioambiental de Hamburgo. EIBE deseaagradecerle su permiso para emplear estematerial.

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Apéndice 1Recetas de caldos de cultivo microbiano


1UNIDAD

Los medios de agar nutriente y los caldos nutrientes se preparan a través de productoscomerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de ser utilizados, debenesterilizarse en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. En general, los medios ya preparadosse pueden almacenar durante meses a temperaturas de 4 ºC (aproximadamente)

Medio de agar y almidónAgar nutriente 20,7 gAlmidón, soluble 2,0 g

Enrasar a un litro con agua destilada y esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

Agar de McConkey con estreptomicinaAgar de McConkey 50,0 gAgua destilada 990 ml

Tras esterilización en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, dejar que la disolución se enfríehasta 50 ºC. A continuación, añadir:

Solución de sulfato de estreptomicina 200 mg / 10 ml

Las placas de este tipo deben ser recientes. Pueden almacenarse en un refrigerador a 4 ºC(aproximadamente), pero sólo durante unos pocos días.


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Apéndice 2Técnicas microbiológicas


1UNIDAD

AerosolesLos aerosoles son gotas de pequeño tamaño,cargadas de microbios, que se liberan poraccidente y pueden permanecer suspendidas en elaire durante media hora o más, con riesgo deresultar inhaladas. Constituyen la principal fuentepotencial de infección en los laboratorios. Losaerosoles formados como consecuencia delderrame de cultivos puede ocasionar infeccionesen la piel o en los ojos. Las probabilidades deingerir microbios aumentan si los cultivos sepipetean con la boca.

Comportamiento general en ellaboratorioDeberán observarse las siguientes precauciones:

No se deberán producir operaciones de trans-ferencia de substancias entre las manos y la boca(por ejemplo, chupar o morder lapiceros,humedecer etiquetas con la boca, pipetear con laboca). En el laboratorio no se deberá comer,beber ni fumar.

Se recomienda encarecidamente que losalumnos utilicen batas de laboratorio. Laspersonas expuestas a cortes y abrasionesdeberán protegerse con prendas impermeablesantes de iniciar el trabajo práctico.

Los puestos de trabajo deberán limpiarse con unproducto desinfectante de laboratorio antes ydespués de cada sesión práctica. Los proveedoresde productos químicos para escuelas de cienciasdisponen de desinfectantes apropiados.

Los profesores, ayudantes y alumnos deberánlavarse las manos al terminar la sesión práctica.

Derrames y ry ry ry ry roturoturoturoturoturasasasasasCuando, en un accidente, se encuentreinvolucrado un cultivo microbiano, deberánobservarse las siguientes normas.Utilizar guantes desechables. El recipiente roto yel cultivo derramado deberán cubrirse con unpaño humedecido en desinfectante. Cuandohayan transcurrido no menos de 10 minutos, losrestos se recogerán empleando paños de papel yun cogedor. El material contaminado se colocaráen un contenedor de deshechos infectados, o enuna bolsa de deshechos. Antes de deshacerse delos residuos, estos deberán ser esterilizados enautoclave. El cogedor también deberá esterilizarseen autoclave o mantenerse en desinfectantedurante 24 horas.

Contaminación accidental dela piel o la ropaLas personas salpicadas deberán lavarse tanpronto como resulte posible. Las prendas de ropaque se encuentren muy contaminadas deberánremojarse en desinfectante antes de lavarse.Los paños de limpieza contaminados deberánesterilizarse en autoclave o introducirse endesinfectante.

Fuentes de microbiosTodos los microorganismos pueden considerarsepotencialmente peligrosos. Los organis-mos utilizados en las experien-cias de esta unidad presentanriesgos mínimos, siempre ycuando las prácticas seancorrectas. Los organismosdeberán ser suministrados porproveedores reconocidos.

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sujetar el tapóncon el meñique

Técnicas asépticas★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Los objetivos de las técnicas asépticas son lossiguientes:

a.- Obtener y conservar cultivos puros demicroorganismos.

b.- Aumentar la seguridad en lasmanipulaciones con microorganismos.

Un cultivo �puro� contiene una única especiede microorganismos, mientras que un cultivo�mixto� contiene dos o más especies.

La contaminación de los cultivos constituyeuna amenaza constante, ya que los microbios seencuentran en todas partes: en la piel, en el aire,y en cualquier objeto inanimado. En líneasgenerales, para obtener un cultivo puro sedeben utilizar materiales y un medio de creci-miento estériles, y excluirse los contaminantes.

Será muy poco realista esperar que losestudiantes jóvenes fueran auténticos expertosen el empleo de las técnicas asépticas. Sinembargo, en algunas de las actividades de estaUnidad, resulta necesario que los alumnostransfieran cultivos asépticamente. En estoscasos se sugiere tomar las siguientes medidas:

El medio de crecimiento debe esterilizarseantes de su uso mediante un autoclave. Debenutilizarse recipientes estériles (frascos, placas dePetri, etc). Las tapas deben guardarse enrecipientes para evitar su contaminación.

Se debe trabajar cerca de un mechero Bunsen,con el fin de que las corrientes de aire provo-cadas por la llama alejen los microbios quepodrían contaminar el medio de crecimiento ylos cultivos puros.

Cuando se traspasa un cultivo, y para evitar lacontaminación del mismo, los envases que seutilicen no deben permanecer destapados mástiempo del que sea estrictamente necesario.Cuando se le quite el tapón a una botella, dichotapón se guardará en la mano hasta que secoloque de nuevo en la botella, con lo que sereducen las posibilidades de contaminar elcultivo o el puesto de trabajo. Al destapar unfrasco que contenga un cultivo, el cuello delmismo deberá pasarse por la llama durante unoo dos segundos. Con esta operación, se matan

los microbios presentes en el cuello delrecipiente, y se generan corrientes de convecciónque contribuyen a prevenir la contaminaciónaccidental del cultivo por microbios presentesen la atmósfera.

Cuando se tiene práctica, la forma másadecuada para trabajar consiste en sostener elasa de siembra con una mano y el frasco en laotra, de manera que el dedo meñique de lamano que sostiene el asa quede libre parasujetar contra la palma el tapón del frasco. (Esimportante aflojar el cierre del tapón antes detomar en la mano el asa de siembra). Si esnecesario, esta operación puede ser realizada enequipo por dos alumnos.

Antes y después de la transferencia de uncultivo, el alambre del asa de siembra se debecalentar en el mechero, manteniéndolo en lallama hasta que se ponga al rojo. Es importanteintroducir el asa en la llama lentamente con elfin de evitar la formación de chispas yaerosoles.

Cuando el mechero Bunsen no se estéutilizando, deberá mantenerse encendido conuna llama de color amarillo. En cambio, cuandoel mechero vaya a utilizarse para esterilizar elasa de siembra o para pasar por la llama elcuello de una botella de cultivo, deberáutilizarse una llama azul de 5 cm de alto.

Es muy importante evitar la contaminación enel área de trabajo, esterilizar los instrumentos, eintroducir en una solución desinfectante todaslas pipetas inmediatamente después de haberlasutilizado.


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Sellarligeramentela placa concintaadhesiva

Etiquetarla base dela placa

Antes de llevar a cabo la inoculación, deberá etique-tarse la base de la placa de Petri en que se vaya a hacerel cultivo, indicando el nombre del responsable delexperimento, la fecha, y el nombre del microorganis-mo que se cultiva en la placa. De esta manera, tanto laplaca como su contenido quedan claramente identificados.

Una vez realizada la inoculación, se debe sellar la placade Petri utilizando cinta adhesiva, tal como se muestraen la figura. Deberán colocarse cuatro trozos de cintaadhesiva desde la base de la placa hasta la tapa, para

Incubación de los cultivos★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

asegurar que no se produzca la apertura accidental dela misma. Sin embargo, no se deben sellar comple-tamente los bordes de la placa porque podría crearseun medio de crecimiento anaerobio dentro de la placa.

BacteriasCuando se incuban cultivos de bacterias, las placas dePetri que los contienen deben colocarse de forma quela base quede orientada hacia arriba, de modo que sidurante el proceso de incubación se producen con-densados, éstos caigan sobre la tapa y no sobre elcultivo. Si antes de llevar a cabo la inoculación seobserva la existencia de condensación sobre la placa dePetri, ésta debe secarse antes de emplearla para el cultivo.

Las colonias de bacterias deben resultar visibles a los2-3 días de incubación a 25-30 ºC.

HongosLas placas de Petri que contienen cultivos de hongosno necesitan colocarse en posición invertida durante laincubación. Los cultivos de hongos requieren 7 días deincubación. Aunque, con frecuencia, la temperaturaambiente (~21 ºC) es suficiente para hacer posible elcrecimiento de los hongos, se consigue un mejorcontrol si se utiliza una incubadora.

Tratamiento y esterilización del material utilizado★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Es muy importante deshacerse correctamente detodo el material utilizado en las clases prácticaspara evitar la contaminación del laboratorio y delas personas que se encuentran en él. Todos losrecipientes utilizados para el almacenamiento y elcrecimiento de los cultivos deben ser esterilizadosen autoclave, lavados con desinfectante yaclarados antes de reutilizarse.

En el laboratorio se debe disponer de dos bolsasde autoclave: una para el material de vidrioreutilizable y otra para los materiales desechables.Cerca de cada una de las áreas de trabajo debehaber un recipiente alargado desechos para laspipetas, y otro pequeño para los portaobjetos queya que hayan sido utilizados. También debe haberun cubo de metal para ir colocando en él elmaterial de vidrio que se rompa.

Tanto las pipetas desechables de plástico, comolos portaobjetos y cualquier líquido procedente delos cultivos deberá introducirse en pequeñosrecipientes con desinfectante. Después, las pipetasde plástico deben esterilizarse en autoclave ydesecharse, mientras que los portaobjetos se

deben mantener en desinfectante durante 24horas. A continuación se lavan con agua, seaclaran bien y ya pueden volver a utilizarse.

Las pipetas de vidrio deben colocarse en unrecipiente alargado con desinfectante, pero paraevitar la formación de aerosoles, no debesepararse el cargador de la pipeta hasta que éstatenga la punta introducida en el desinfectante. Laspipetas sucias deben esterilizarse en autoclave,lavarse y aclararse antes de reutilizarlas.

La ropa, las placas de Petri de plástico, y las toallitasde papel contaminadas se colocarán en la bolsa deautoclave destinada a material desechable.

El material de vidrio contaminado de todo tipodeberá colocarse en la bolsa de autoclave paramaterial de vidrio.

El material de vidrio que no se haya contaminadose puede lavar normalmente. El material de vidrioroto se colocará en una caja destinada a tal fin. Sieste material está contaminado debe esterilizarseen autoclave antes de desecharlo, si no está con-taminado se puede desechar de forma inmediata.

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Temperatura Tiempo de estanciaen autoclave

100 °C 20 horas110 °C 2,5 horas115 °C 50 minutos121 °C 15 minutos125 °C 6,5 minutos130 °C 2,5 minutos

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Esterilización en autoclave★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

La esterilización conlleva la completadestrucción de todos los microorganismos,incluidas sus esporas.

Antes de comenzar el trabajo práctico, todoel material que vaya a ser utilizado debeesterilizarse para garantizar la ausencia decontaminantes. Asimismo, al terminar eltrabajo, los cultivos y el material contami-nado deben volver a esterilizarse antes dedesecharse.

El método preferido para la esterilizaciónde medios de cultivo, soluciones acuosas ycultivos desechados es la esterilización. Laesterilización es un procedimiento queutiliza vapor a alta presión, generalmente auna temperatura de 121 ºC. Dado que elvapor desnaturaliza las proteínas de losmicrobios, éstos mueren más eficazmentecon calor húmedo que con calor seco. Elproceso de esterilización puede realizarsebien mediante una olla a presión doméstica,o bien con un autoclave fabricado como tal.Las ollas a presión domésticas se puedenutilizar en los laboratorios de los colegios,pero su baja capacidad puede resultar uninconveniente cuando se necesita esterilizartodo el material que genera una clase.

Principios de la esterilizaciónen autoclavePara que el proceso sea efectivo, hay quecontrolar dos factores fundamentales. Enprimer lugar, no debe quedar aire dentro delautoclave. De esta manera se asegura que elvapor a alta temperatura entre en contacto conla superficie que se quiere esterilizar. Si quedaseaire en el autoclave, la temperatura a la mismapresión de vapor sería más baja. Además, losmateriales a esterilizar no deben colocarse muyjuntos con el fin de que pueda circular bien elaire entre ellos. Las botellas y los recipientes nodeben introducirse con las tapas puestas, con elfin de que el aire interior pueda escapar y no seproduzca una elevada presión dentro de ellosdurante el proceso.

En segundo lugar, hay que mantener el procesodurante el tiempo suficiente como para que elcalor penetre (por conducción), hasta el centrodel medio de cultivo que se tenga en la placa dePetri o en otros recipientes. El tiempo deduración del proceso depende de la tempera-tura alcanzada, y se indica a continuación.

Observando el gráfico anterior se puedeconcluir que pequeñas diferencias en latemperatura pueden determinar grandesdiferencias en el tiempo necesario para llevar acabo una correcta esterilización. También esimportante que en el tiempo durante el cual serealiza la esterilización lleguen a alcanzar latemperatura necesaria todos los materiales queestán siendo esterilizados (por ejemplo la partemás interna de un caldo de cultivo contenidoen un vaso de fermentación).

A continuación se mencionan tres factoresdeterminantes para la duración del proceso deesterilización en autoclave.

● Tiempo de penetraciónEs el tiempo necesario para que la par-te más interna del contenido del auto-clave alcance la temperatura requerida.

● Tiempo de mantenimientoEs el tiempo mínimo necesario paraque, a una temperatura dada, muerantodos los organismos vivos del materialque se está esterilizando.

● Tiempo de seguridadEs un margen de seguridad.Normalmente viene dado por la mitaddel tiempo de mantenimiento.


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Una olla a presión doméstica trabaja a 121 ºC,por lo tanto el tiempo total invertido en laesterilización sería:- Tiempo de penetración 5 minutos- Tiempo de mantenimiento 15 minutos.- Tiempo de seguridad 5 o más minutos.En total la esterilización duraría 25 minutos.

Recipiente Volumen Tiempo de

mantenimiento

Tubos de ensayo 20 ml 12-14 minutos

Frasco / matraz 50 ml 12-14 minutos

Frasco / matraz 200 ml 12-15 minutos

Fermentador 1 l 20-25 minutos

CaramelizaciónLos autoclaves a veces operan por encima de121 ºC. En estos casos el ahorro de tiempo queconlleva trabajar a temperaturas superiores a121 ºC puede parecer un beneficio, pero no hayque olvidar que temperaturas tan altas puedenser perjudiciales para determinados medios. Porejemplo, las soluciones de glucosa experimen-tan a altas temperaturas el llamado proceso decaramelización, dando lugar a la formación decompuestos que pueden resultar tóxicos paralos microbios que se cultiven en esa solución.En el caso de la glucosa, esta reacción se puedeevitar ajustando el pH del medio a un valor de4. Tras la esterilización sería necesario volver areajustar el pH al valor que sea convenientepara el trabajo que se vaya a realizar.

Reacciones de MaillardEsta es una reacción que puede producirse atemperaturas altas por la interacción entre loscompuestos nitrogenados y los hidratos decarbono existentes en el medio, dando lugar a laformación de compuestos que tiñen el mediode un tono marrón, además de ser tóxicos paraalgunos microbios. Debido a esta reacción, enalgunos casos se hace necesario esterilizar porseparado los hidratos de carbono del resto delmedio, como ocurre en la preparación del agarde leche.

Utilización y cuidado rutinariode los autoclavesCuando se emplea una olla a presión o unautoclave, deben seguirse las instrucciones delfabricante. Hay que tener especial cuidado entener siempre suficiente agua en el autoclave

para que durante el proceso no hierva en seco.Una olla a presión doméstica requiere al menos250 ml de agua; autoclaves más grandesnecesitarán mayores volúmenes de agua. Lautilización de agua destilada o desionizada en elautoclave evitará la oxidación del mismo. Losautoclaves deben secarse cuidadosamente antesde guardarse. De lo contrario apareceránpequeñas depresiones en la base, que provoca-rán el adelgazamiento progresivo del recipiente,que podría terminar por abombarse haciaafuera al ser sometido a presión.

Cuando se emplea el autoclave, antes de cerrarla válvula de salida, se debe permitir que elvapor escape libremente durante alrededor deun minuto, de manera que se expulse todo elaire existente en el interior. Una vez que se hacompletado el ciclo del autoclave, antes deabrirlo hay que esperar el tiempo necesario paraque el contenido se enfríe y vuelva a la presiónnormal. Una apertura prematura del autoclave(con la consiguiente reducción en la presión),podría provocar fenómenos de condensacióndentro del mismo, además de proyectar hacia elexterior el contenido, lo cual resultaríapeligroso debido a su elevada temperatura.

Esterilización químicaPara la esterilización se emplean diversoscompuestos químicos. Los más utilizados sonhipocloritos y compuestos fenólicos.

Los fenoles eliminan eficazmente bacterias yhongos, pero no atacan ni a sus esporas ni aalgunos tipos de virus. Además, pierden granparte de su actividad al contacto con caucho,madera y plástico. En laboratorio se empleanpara desinfectar envases de deshecho ysuperficies.

Los hipocloritos (como las lejías), no son losproductos más apropiados para esterilizarplacas de Petri usadas y otros materiales, ya quese pierde actividad en presencia de proteínas ymateriales plásticos. Sin embargo una soluciónal 5 % de Domestos (Lever) o una solución deClorato I es adecuada para la esterilización deenvases desechables usados.

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Openingan ampoule

Apéndice 3Apertura de una ampolla


1UNIDAD

Apertura deuna ampolla

PRECAUCIÓNAl abrir una ampolla,puede producirse pro-yección de esquirlasde vidrio, por lo que esnecesario llevar gafasde seguridad.

1 Calentar la cabeza de la ampolla a lallama de un mechero Bunsen. Girar laampolla durante el calentamiento (verdiagrama).

2 Con una pipeta, verter dos o tres gotasde agua fría, no más, sobre la cabezacaliente de la ampolla. El vidrio seresquebrajará.

3 Golpear la cabeza resquebrajada conunas pinzas, firme perocuidadosamente, hasta que sedesprenda. Recoger todos los trozos devidrio sobre la base de una placa dePetri, y asegurarse de que el vidrio rotose deshecha correctamente.

4 Ayudándose de unas pinzas, extraer eltapón de algodón que retiene el tubointerno de la ampolla.

5 Con mucho cuidado, sacar dicho tubointerno, depositándolo sobre una placade Petri esterilizada. A continuación,tapar la placa.


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Reactivación de un cultivoliofilizado

1 Retirar con unas pinzas el tapón dealgodón. Pasar brevemente por la llamala boca del tubo interior de vidrio.

2 Añadir asépticamente alrededor de1 ml de caldo de cultivo estéril alcontenido del tubo interior.

3 Volver a pasar por la llama la boca deltubo, y colocar de nuevo en su sitio eltapón de algodón. Dejar reposar eltubo durante 20 minutos, mientras elcultivo seco se reactiva.

4 Utilizando un asa de siembra esterili-zada, mezclar bien el contenido deltubo y verterlo en un tubo de ensayoesterilizado que contenga unos 5 ml demedio de cultivo.

5 Incubar el cultivo durante la noche a30 ºC.

Al día siguiente...

6 Utilizando un asa de siembrapreviamente pasada por la llama,coloque una gota de la suspensiónformando un surco sobre la superficiede una placa de agar nutriente. Estaoperación tiene por objeto verificar que elcultivo no está contaminado. En la placa, sólodebe crecer un tipo de colonia.

microbios y molØculas - uni kiel

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