Metabolismo: la metilacin de ADN es alterada en linfocitos B y NK en humanos obesos y diabticos tipo 2Objetivo. La obesidad est asociada con inflamacin de bajo grado y la filtracin de dculas inmunes en tejidos insulino-sensitivos, llevando a una discapacidad metablica. Los mecanismos epigenticos controlan la determinacin del linaje de clulas inmunes, su funcin y migracin, y estn implicados en la obesidad y diabetes tipo 2 (T2D). El enfoque de este estudio fue determinar el perfil de metilacin global de ADN de clulas inmunes en individuos obesos y T2D de manera especfica para clulas.Materiales y mtodos. Fueron reclutados 14 sujetos obesos y 11 sujetos delgados de misma edad, as como 12 obesos T2D y 7 sujetos delgados de la misma edad. Los niveles globales de metilacin de ADN fueron medidos de manera especfica para clulas por citometra de flujo. Validamos el ensayo contra medidas de espectrometra de masa del contenido total de 5-metilcitosina (5meC) en clulas cultivadas tratadas con el agente de hipometilacin decitabina (r = 0.97, p < 0.001).Resultados. La metilacin global de ADN en clulas mono-nucleares de sangre perifrica (PBMC), monocitos, linfocitos o clulas T no estuvo alterada en obesos o sujetos T2D. Sin embargo, los anlisis de fracciones de la sangre de sujetos delgados, obesos y T2D mostraron altos niveles de metilacin en clulas B provenientes de sujetos obesos y T2D; y en clulas asesinas naturales (NK) de pacientes T2D. En estos tipos de clulas, los niveles de metilacin de ADN fueron correlacionados positivamente con resistencia a la insulina, sugiriendo una asociacin entre cambios de metilacin de ADN, funcin inmune y disfuncin metablica.Conclusiones. Tanto obesidad como T2D fueron asociados con alteradas firmas epigenticas del sistema inmune de manera especfica para clulas. Estos cambios podran contribuir a las funciones inmunes alteradas asociadas con obesidad e insulino-resistencia.

Introduccin

El sistema inmune est compuesto por una amplia variedad de clulas, cada una con una firma especfica de expresin de genes determinada por procesos epigenticos como la metilacin de ADN y modificacin de histonas. A lo largo del control de la estructura de cromatina, los procesos epigenticos modulan el acceso a los factores de transcripcin de unin al ADN, de este modo seleccionando para activacin o represin transcripcional, por ejemplo, genes especficos del linaje. Los estudios que investigaron la metiloma de ADN de PBMCs han mostrado patrones de metilacin especficos a genes importantes para la funcin inmune y adems han sugerido que la alteracin en la metilacin de ADN probablemente sea un importante mecanismo que contribuye a la variacin inter-individual en la funcin de clulas inmunes.

La obesidad, caracterizada por una elevada adiposidad sobre masa magra, est asociada con variabilidad epigentica en la sangre. Hoy est claro de que las clulas inmunes participan en la inflamacin sistmica de bajo grado crnica que se observa en la obesidad, con filtracin de macrfagos en el tejido adiposo promoviendo la inflamacin. Los macrfagos del tejido adiposo contribuyen a la etiologa de la resistencia a la insulina a travs de la secrecin de citocinas pro-inflamatorias como el factor- de necrosis tumoral o la interleucina-6, conocidos reguladores hacia abajo de sealizacin de insulina. El rol de las clulas inmunes en el desarrollo de la insulino-resistencia no se limita a los macrfagos. Tanto linfocitos B como T han mostrado ser importantes contribuidores del proceso inflamatorio y la resultante insulino-resistencia en tejidos metablicamente activos, y en particular en el tejido adiposo.

En estudios investigando la metilacin de ADN en la sangre de sujetos con disfuncin metablica, la metilacin de ADN fue exclusivamente analizada en fracciones enteras de PBMC, las cuales se componen de numerosos tipos de clulas. Sin embargo, las medidas globales de metilacin de ADN hechas de fracciones enteras de PBMC pueden ser oscurecidas por potenciales cambios en los recuentos de tipos de clulas en la sangre. Dado que la obesidad y la diabetes tipo 2 fueron asociadas con una remodelacin de los recuentos de las clulas en la sangre y que las sub-poblaciones de leucocitos exhiben una especfica firma de metilacin global de ADN, la alterada metilacin de ADN en las fracciones enteras de PBMC podran simplemente reflejar un cambio en la frecuencia de determinadas sub-poblaciones de leucocitos.

En este estudio, apuntamos a usar un ensayo especfico de clulas para determinar el perfil de metilacin global de ADN de los diferentes sub-tipos de PBMC en individuos obesos y T2D. Usando un anticuerpo monoclonal a 5meC y citometra de flujo, proporcionamos la primera medida de niveles relativos de metilacin global de ADN en tipos de clulas individuales dentro de las PBMC de sujetos delgados, obesos y T2D.

Materiales y mtodos

Estudio de la poblacinEste proyecto fue aprobado por el Comit de ticas de la Regin Capital de Dinamarca. 44 sujetos hombres de 18 a 60 aos fueron reclutados por anuncios locales en campus de universidades u hospitales locales y se obtuvo el consentimiento informado de los participantes. Los participantes estaban libres de enfermedades recientes o males infecciosos o inflamatorios, fuera de desrdenes metablicos, que podran afectar su sistema inmune. El ndice de masa corporal (BMI) y el diagnstico de T2D fueron usados para generar 4 grupos: 14 hombres obesos (Obeso, edad = 35.1 6.7 aos, BMI = 36.3 6.3 kg/m2, no diabtico/saludable) y 11 delgados de la misma edad (Delgado, edad = 34.8 3 aos, BMI = 23 1.4 kg/m2, no diabtico/saludable), as como 12 pacientes con diabetes tipo 2 (T2D, edad = 44.1 6.5 aos, MBI = 34.9 4.8 kg/m2) y 7 delgados de la misma edad (delgado, edad = 44.1 6 aos, BMI = 23.7 2.2 kg/m2, no diabtico/saludable).

Recoleccin de muestraLas muestras de sangre se obtuvieron por venopuncin de una vena antecubital y recolectados en tubos tratados con cido etilendiamina tetracetico o tratados con cido citrato dextrosa, seguido por aislamiento de PBMCs por gradiente de centrifugacin Ficoll como previamente dicho.Recuento completo de clulas de sangre e ndice de insulino-resistenciaEn pequeos subgrupos, el recuento diferencial de clulas fue realizado usando un analizador de hematologa automatizado Sysmex XE-2100 para la determinacin de la frecuencia de neutrfilos, monocitos, linfocitos y T cooperadores (CD3/CD4 doble positivo), clulas citotxicas T (CD3/CD8 doble positivo), clulas B (CD45/CD19/CD20 triple positivo) y clulas NK (CD3 negativo, CD45/16/56 triple positivo). Los niveles de glucosa e insulina en ayuno fueron medidos usando analizadores automatizados y el nivel de insulino-resistencia fue calculado usando el Modelo de Evaluacin de la Homeostasis (HOMA-IR).

Cultivo de clulasLa lnea celular de cncer colorrectal RKO fue mantenido en el medio Eagle modificado de Dulbecco, complementado con 25 mM de glucosa, 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml penicilina, 100 ug/mL estreptomicina y 2 mM de glutamato y se dej crecer a 37C en 5% CO2. Las clulas fueron tratadas cada 24h por un perodo de 72h reemplazando el medio complementado con 2.5 uM de decitabina fresca preparada en un filtro de 50% de cido actico esterilizado. Las clulas fueron cosechadas en puntos diarios antes y durante el tratamiento, y a los 3 das tras la retirada de las drogas.

La lnea celular del linfocito T Jurkat en humanos fue mantenida en RPMI 1640 complementada con 100 U/mL de penicilina, 100 ug/mL estreptomicina , 100 U/mL L-glutamina y 10% FBS. El medio de cultivo fue refrescado cada tercer da y la densidad celular fue mantenida 1 milln de clulas/mL. 24h despus del ltimo pasaje, las clulas fueron tratadas con 2.5 uM de decitabina como se dijo antes y cosechadas a diferentes puntos temporales hasta 52h.Cuantificacin de la metilacin global por citometra de flujoLa metilacin global en PBMCs, RKO y clulas Jurkat fue cuantificada como antes se dijo con leves modificaciones. Las PBMCs cro-preservadas fueron rpidamente descongeladas a 37C, transferidas en el medio de cultivo y lavadas 2 veces en RPMI 10% del FBS. Para las clulas RKO, las clulas fueron separadas del recipiente de cultivo cultivndose con tripsina a 37C por 5min. Las clulas luego fueron lavadas 2 veces en la solucin salina de Dubecco tamponada con fosfato (D-PBS), con 1% de albmina de suero bovino (BSA). Para las clulas Jurkat, las clulas fueron transferidas a un nuevo tubo estril y lavadas 2 veces en D-PBS con 1% de BSA.

La viabilidad celular fue evaluada por inspeccin visual usando tincin con azul tripn y la densidad fue normalizada a un mximo de de 5 millones de clulas/mL. Luego de 30min a 37C en 5% CO2, las clulas fueron fijadas en 2% de paraformaldehido (PFA) en D-PBS por 10min a 37C. Luego de 2 lavados usando D-PBS con 1% de BSA y 0.1% de polisorbato-20, las clulas fueron permeabilizadas en 100% de metanol a -20QC por 30min. Luego de 3 lavados adicionales, las clulas fueron incubadas a 37C en una solucin de cido clorhdrico 2veces de lo normal (2 N HCl, por si acaso) por 30min y luego transferido a 0.1 M de tampn de borato por 5min. Luego de 3 lavados adicionales las PBMCs fueron manchadas con una combinacin de anti CD3-ficoeritrina conjugada, CD8- y CD14-peridinina clorofila conjugada, CD4- y CD19-aloficocianina conjugada. Las PBMCs manchadas y las clulas RKO y Jurkat fueron manchadas an ms con anti 5meC conjugada o su correspondiente control de isotipo. Ambos anticuerpos conjugados fueron etiquetados usando un kit de etiquetado segn instrucciones del fabricante. Las clulas fueron incubadas con los diferentes anticuerpos o sus correspondientes controles de isotipo por 20min a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego de 2 lavados ms, fueron resuspendidas en 400 uL de 1% de PFA en D-PBS y adquiridas inmediatamente en un citmetro de flujo.

Todos los datos fueron analzados usando FlowJo v.10 y Cytobank. Los linfocitos y monocitos fueron cerrados basndose en su tamao y granularidad. Los monocitos fueron ms encerrados an basndose en la positividad de CD14. Los linfocitos CD3+CD4+ fueron considerados como clulas cooperadoras T; CD3+CD8+ como clulas citotxicas T; CD3-CD19+ como clulas B y CD3-CD8+ como clulas asesinas naturales (NK). Para las clulas RKO o Jurkat, la poblacin fue cerrada basndose en tamao y granularidad. En cada poblacin la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) fue medida y normalizada por la MFI del control de isotipo.

Cuantificacin de la metilacin global por LC-MS/MSLa metilacin global en clulas RKO fue cuantificada como se dijo antes usando un tndem de cromatografa lquida de espectrometra de masas (LC-MS/MS). La cantidad absoluta de 5-metil2'-deoxicitidina (5mdC) fue determinada como un porcentaje de 2'-deoxicitidina mas 5mdC en el ADN genmico extrado de clulas RKO mediante extraccin de fenol-cloroformo usando LC-MS/MS como previamente publicado. Esto involucr la biosntesis en-casa (interna) de los estndares internos de [15N3]-dC y [15N3]-5mdC y una digestin de 1 paso de ADN genmico de 1ug clavado con estndares internos de [U-15N] en desoxirribonuclesidos. Los anlisis fueron realizados usando un inyector automtico de Bomba de Cromatografa Lquida Accela de Ultra Alto Rendimiento, acoplado directamente a un espectrmetro de masas triple cuadrupolo de Acceso Cuntico TSQ en el modo de in positivo va una interfaz de electrospray. Los datos fueron procesados usando la funcin Quanbrowser del paquete de software Xcalibur v2.0.7.Secuenciacin de bisulfito de ADN desde clulas B aisladasLas PBMCs fueron resuspendidas en PBS (solucin salina tamponada en fosfato) con 1% BSA y manchadas con APC anti-CD19. Las clulas manchadas fueron lavadas 2 veces en PBS con 1% BSA y resuspendidas en 400 uL de PBS con 1% BSA antes de la clasificacin en una FACS-Aria (clasificador). El ADN genmico fue purificado de clulas B usando el Kit de Sangre y Tejidos DNeasy. La conversin de bisulfito fue realizada usando el kit de iluminacin de metilacin de ADN EZ, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las regiones correspondientes a TFAM (factor de transcripcin A, mitocondria), GAPDH (gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa), UBASH3a (asociado a la ubiquitina y dominio SH3 que contiene protena A) y TRIM3 (motif-3 que contiene tripartito) fueron amplificadas usando los cebadores respectivos: adelante GGGGATAGAGGTGGTTTAATAG y reversa AAACACTATAAAAAATCTACTAACATC, adelante GGGAGAAAGTAGGGTTGGTTATTAG y reversa TCCCTAACCTCCCGAATTTCTCTC, adepante ATAGATAAGGAGATTGGGATTTAGG y reversa CAATTTTCAAAATTCTATTTACAAAATACT, adelante GTTTTGGGTATTGTTTTTTTGT y reversa ATCTCAAAAATTAAAATAAAACTCC. Los productos purificados de PCR fueron preparados para secuenciacin usando el protocolo de preparacin de ADN TruSeq adaptado para concentraciones de bajos insumos. Las muestras fueron secuenciadas usando un secuenciador MiSeq. Los archivos Fastq fueron analizados por FastQC v0.9, y los adaptadores/cebadores indentificados fueron removidos por Trimmomatic 0.30. Los extremos de la lectura se cortaron para remover nucletidos con un puntaje por debajo de 3, y un puntaje promedio sobre 15 a travs de las 4 bases. Las lecturas de QCed fueron mapeadas por Bismark v10.0 usando bowtie2 v2.2.2, permitiendo 1 desajuste en la semilla, y una longitud de semilla de 10 bases. El alineador fue puesto en modo my sensitivo usando -D 50 y -R 10. Bismark tambin fue usado para procesar los archivos resultantes del alineamiento, generando un reporte en todas las citosinas metiladas en las 4 secuencias. Los anlisis subsecuentes fueron hechos en R v3.1.0. Para cada muestra, las posiciones cubiertas por menos de 1000 lecturas fueron excluidas. Para el trazado, la media y el intervalo de confianza del 95% fueron calculados usando el mtodo ajustado de percentil bootstrap. Los trazados fueron generados usando el paquete ggplot2.Anlisis estadsticoLos resultados se presentan como desviaciones estndar de la media . Todos los anlisis estadsticos fueron hechos en el Paquete de Estadsticas SPSS v21 y la significacin estadstica fue puesta en p < 0.05. La normalidad de la distribucin fue probada usando los tests de Curtosis y Oblicuidad. Cuando la suposicin de normalidad fue violada, se realiz transformacin logartmica para alcanzar la distribucin normal. La diferencia entre grupos (Delgado vs Obeso y Delgado vs T2D) para los valores antropomtricos y hematolgicos o los niveles de metilacin global fue probada usando un test Student t. Los niveles de correlacin fueron evaluados usando el coeficiente de correlacin de Pearson. Los resultados de la secuenciacin de bisulfito fueron analizados para cada posicin de citosina, donde las diferencias entre delgado y obeso o T2D fueron probadas usando el test no-paramtrico de Kolmogorov-Smirnov.

Fig.1 Validacin del ensayo de cuantificacin de 5-metilcitosina usando citometra de flujo. A Cuantificacin representativa de los niveles de 5-metilcitosina medidos por citometra de flujo en clulas RKO tratadas con decitabina por 72h y luego dejadas por 3 das despus de la retirada de las drogas. B Correlacin entre % de 5-metilcitosina cuantificada por LC-MS/MS y MFI de 5-meC medida por citometra de flujo. C Niveles de MFI de 5-meC medidos en clulas Jurkat luego de exponerse a decitabina.

ResultadosPara determinar el perfil de metilacin global de ADN de tipos de clulas individuales dentro de las PBMCs, usamos un mtodo previamente desarrollado en lneas celulares. Probamos este mtodo, que se basa en la evaluacin de metilacin de ADN usando un anticuerpo monoclonal para la 5-meC detectada por citometra de flujo, contra un espectrmetro de masa de alta definicin, el cual representa para nuestro conocimiento el ensayo teniendo la sensibilidad y precisin ms altas para la cuantificacin de 5-meC. El anlisis de metilacin de ADN fue realizado en clulas RKO no tratadas, as como clulas expuestas al agente decitabina de hipometilacin del ADN por 24, 48, 72h y 3 das despus de la retirada de las drogas. El anlisis de correlacin de Pearson del total de los niveles de metilacin de citosina medidos usando ambas tcnicas revelaron una estrecha asociacin (r = 0.97, p = 0.001, Fig. 1 A y B). Esto fue confirmado en clulas Jurkat donde el efecto de la decitabina fue exitosamente detectado por citometra de flujo (Fig. 1 C), adems validando el uso de citoetra de flujo para monitorear la metilacin global de ADN.

Despus usamos este ensayo para determinar los niveles de metilacin global de ADN en las PBMCs de obesos e individuos T2D. Importante, ya que la metilacin global sangunea de ADN ha mostrado variar con la edad, hemos emparejado por edad a los participantes obesos y T2D a 2 cohortes de control separados de sujetos delgados y tolerantes normales a la glucosa. En adicin, se ha planteado la hiptesis de que una variacin en el recuento de clulas sanguneas podra potencialmente enmascarar una alteracin en la metilacin global de manera especfica para tipos de clulas. As hemos investigado frecuentemente los subtipos de leucocitos. Sin embargo, en nuestra poblacin, los recuentos de clulas sanguneas mostraron un perfil similar a travs de los grupos (Tabla 1, p > 0.05).Tabla 1 - Recuentos de clulas sanguneas.

Delgado(n = 4)Obeso(n = 12)T2D(n = 12)

Neutrfilos

(% total de leucocitos)51.8 4.552.7 8.258.7 10.6

Monocitos

(% total de leucocitos)8.9 2.17.7 1.76.6 1.3

Linfocitos(% total de leucocitos)35.5 4.735.6 6.531.2 10.5

Clulas cooperadoras T(% total de leucocitos)16.6 3.616.2 3.815.8 8.4

Clulas citotxicas T(% total de leucocitos)6.4 1.810.1 4.18.1 3.0

Clulas B(% total de leucocitos)4.6 1.45.4 2.14.0 2.9

Clulas NK(% total de leucocitos)5.9 2.54.7 2.83.8 1.7

T2D: grupo de diabetes tipo 2, NK: asesina natural. Ninguna diferencia significativa se observ entre los diferentes grupos para alguna de las sub-poblaciones mostradas aqu.

Luego comparamos a los sujetos obesos y T2D con sus respectivos grupos de control y no encontramos diferencia en los niveles de metilacin global de ADN en la fraccin de PBMCs (que comprenden tanto linfocitos como monocitos) o en las poblaciones de linfocitos o monocitos evaluadas separadamente (Fig.2 A y B para delgado vs obeso, n = 11 y n = 14 respectivamente, Fig.2 C y D para delgado vs T2D, n = 7 y n = 12 respectivamente, p > 0.05).

Fig.2 Anlisis de niveles de 5-meC en clulas mono-nucleares de la sangre perifrica (PBMCs), linfocitos y monocitos entre sujetos delgados y obesos o diabticos tipo 2. A Cuantificacin representativa de niveles de 5-meC en PBMCs, linfocits y monocitos (grupo obeso en oscuro y delgados en gris). B Comparacin de la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) de 5-meC entre el grupo delgado (gris) y el obeso (negro). C Cuantificacin representativa de los niveles de 5-meC en PBMCs, linfocitos y monocitos (grupo delgado en gris y T2D en negro). D Comparacin de la MFI de 5-meC entre el grupo delgado (gris) y T2D (negro).

Fig.3 Comparacin de la metilacin global en sub-poblaciones de linfocitos entre pacientes delgados y obesos o diabticos tipo 2. A Niveles representativos de 5-meC en clulas cooperadoras T, citotxicas T, B y NK (grupo delgado en gris y obeso en negro). B Comparacin de la MFI de 5-meC entre el grupo delgado (gris) y el obeso (negro), *Significativamente diferente del grupo obeso (p < 0.05). C Niveles representativos 5-meC en clulas cooperadoras T, citotxicas T, B y NK (grupo delgado en gris y T2D en negro). D Comparacin de la MFI en 5-meC entre el grupo delgado (gris) y T2D (negro), *Significativamente diferente del grupo T2D (p < 0.05).

Analizamos an ms la metilacin global de ADN en subtipos individuales de clulas (cooperador T, citotxico T, B y NK). Encontramos que las clulas de los sujetos obesos mostraban un marcado aumento en los niveles de metilacin comparados con sus controles delgados (Fig.3 A y B, n = 14 para obesos y n = 11 para delgados, p = 0.012), pero no clulas cooperadoras T, citotxicas T, B o NK (Fig.3 A y B, p > 0.05). En pacientes T2D detectamos elevados niveles de metilacin en clulas B y NK (Fig.3 C y D, n = 12 para T2D y n = 7 para delgados, p = 0.022 y p = 0.004 para clulas B y NK, respectivamente) pero no una diferencia significativa de metilacin en clulas cooperadoras T y citotxicas T (Fig.3 C y D, p > 0.05). Por otro lado, encontramos que la metilacin global de ADN en clulas B fue correlacionada con la insulina en ayunas (Fig.4 B, r = 0.64, p = 0.008, n = 16) y la resistencia a la insulina (Fig.4 C, HOMA-IR, r = 0.63, p = 0.009, n = 16) pero no con la glucosa en ayunas (Fig4. A), adems favoreciendo un enlace entre clulas B y el desarrollo de insulino-resistencia. Una tendencia similar fue observada en clulas asesinas naturales (NK), pero slo alcanzando significancia cercana para la insulino-resistencia (Fig4. F, r = 0.49, p = 0.057, n = 16), mientras que no se observ una asociacin con la glucosa o insulina en ayunas (Fig.4 D y E).

Fig.4 Asociacin entre la metilacin global de ADN en linfocitos B y NK e ndices metablicos. Correlacin entre los niveles de 5-meC (MFI) en linfocitos B y glucosa A, Insulina B y HOMA-IR C. Correlacin entre niveles de 5-meC (MFI) en linfocitos NK y glucosa D, Insulina E y HOMA-IR F.

Para determinar si los cambios globales de la metilacin de ADN afectan cada citosina en el genoma o son especficos en cada gen, hemos analizado la metilacin de un gen constitutivo (house-keeping) y los genes mostraron en otros estudios ser diferencialmente metilados en las PBMCs de obesos (TRIM3, UBASH3a) o sujetos insulino-resistentes (TFAM). En las regiones probadas, slo unos pocos residuos de citosinas fueron encontrados diferentemente metilados, notablemente la citosina -235 relativa al sitio de inicio de la transcripcin (TSS) del gen UBASH3a, el cual fue hipermetilado en T2D (Fig.5). Estos datos sugieren que la alteracin global en la metiloma de linfocitos B es especfica de genes.

Fig.5 Anlisis de metilacin de ADN especfica de genes en clulas B de delgados, obesos y diabticos tipo 2. El porcentaje de metilacin de citosinas dentro de los genes GAPDH, TFAM, UBASH3a y TRIM3 en clulas B de los delgados (rojo), obesos (verde) o T2D (azul), relativa al sitio de inicio de la transcripcin (TSS). Los datos se muestran como media con un intervalo de confianza del 95%. Smbolos llenados CpG, smbolo Vaco no-CpG, Cuadrados significativamente diferente del grupo de delgados (p < 0.05).

Discusin

Numerosos estudios han reportado que los perfiles de metilacin global y especfica de genes del ADN son alterados en la sangre de individuos obesos, sin enfocarse en sub-poblaciones de clulas sanguneas especficas. Aqu, hemos usado un ensayo basado en citometra de flujo para determinar ms, de manera especfica para tipos de clulas, el perfil de metilacin global de ADN de la sangre obtenida de sujetos obesos y T2D. Proveemos evidencia de que la obesidad y la T2D estn asociadas con un dramtico remodelamiento del epigenoma de especficos tipos de clulas inmune.

Anteriormente, Zhao et al. report que la metilacin global de ADN en los leucocitos de la sangre perifrica, como se evalu por pirosecuenciacin de bisulfito en la secuencia Alu, fue asociada con la resistencia a la insulina. En nuestro estudio no encontramos diferencia alguna en la metilacin global de ADN para PBMCs, linfocitos o monocitos entre delgados, obesos o individuos T2D. En vista de los resultados, slo podemos especular que la naturaleza de nuestro ensayo (interrogando todas las citosinas versus citosinas dentro de las repeticiones Alu), las caractersticas de los participantes, una remodelacin del recuento de clulas sanguneas o la contribucin de granulocitos frente a los niveles de metilacin global de ADN (ya que slo incluimos PBMCs) puede ser responsable para la diferencia entre nuestros resultados y los de Zhao et al. Dado que cada tipo de clula sangunea muestra una firma especfica de metilacin global de ADN, una variacin en la frecuencia de los tipos de clulas sanguneas podra potencialmente enmascarar una alteracin en la metilacin global de manera especfica para tipos de clulas como previamente se haba planteado hiptesis. En nuestra poblacin, no observamos diferencia alguna en los recuentos de clulas sanguneas a travs de los grupos, descartando un potencial efecto de enmascaramiento de los recuentos de clulas sanguneas en la metilacin global de ADN de toda la poblacin de PBMC.

Nuestro anlisis de metilacin de ADN especfico para genes en linfocitos B revel que la hipermetilacin global no es causada por hipermetilacin de cada residuo de citosinas, sino que es especfica de ciertos genes y citosinas (es lo que entend al traducir). Hemos reportado anteriormente un perfil similar en el msculo esqueltico luego de una sola sesin de ejercicio, donde la metilacin global fue alterada pero no todos los genes fueron afectados. De manera similar, las clulas cancergenas muestran una firma de metilacin global, con patrones de metilacin especficos de genes. En nuestra cohorte, slo pudimos replicar parcialmente descubrimientos anteriores mostrando que la metilacin de los promotores TRIM3 y UBASH3a es alterada en sujetos con T2D. En nuestro estudio, la metilacin del promotor TRIM3 no fue alterada y UBASH3a fue moderadamente afectada en la citosina -235 relativa con el sitio de inicio de transcripcin (TSS) en T2D. Dado que nuestro anlisis se condujo en fracciones puras de clulas B, la discrepancia podra deberse a las sub-poblaciones de monocitos y linfocitos haciendo cuenta para los cambios detectados en las fracciones totales de PBMCs.

En este estudio, encontramos que tanto obesos como individuos T2D fueron caracterizados por una elevada metilacin global de ADN en las clulas B. Anteriormente, las clulas B han mostrado jugar un rol central en el desarrollo de la resistencia a la insulina, mediante la produccin de anticuerpos IgG y la activacin de clulas T y macrfagos. Est documentado que severas funciones de las clulas B son reguladas epigenticamente y que la desregulacin epigentica en las clulas inmunes ha sido asociada a una funcin inmune alterada en la enfermedad. De manera similar, encontramos que las clulas NK, aunque slo en la diabetes tipo 2, mostraron una elevada metilacin global. Las funciones de las clulas NK tambin pueden ser reguladas epigenticamente y estas clulas se han asociado con la obesidad e inflamacin inducidas por dieta, llevando adems a la insulino-resistencia. Nuestros resultados que muestran que la metilacin global de ADN es elevada en clulas B y NK sufiere que los cambios epigenticos estn involucrados en la alterada funcin inmune descrita en la obesidad y T2D. Esto es adems apoyado por la correlacin positiva que observamos entre el nivel de insulino-resistencia y la metilacin global de ADN en clulas B y en cierta medida en clulas NK.

Colectivamente, nuestros resultados muestran que la insulino-resistencia est asociada con dramticos cambios epigenticos en especficas sub-poblaciones de linfocitos, contribuyendo potencialmente a la alterada funcin inmune reportada en desrdenes metablicos. Interesantemente, diferencias en la metilacin global de ADN no fueron encontradas en todo el nivel de PBMCs salvo en tipos especficos de clulas. Esto estresa la relevancia de usar ensayos de tipos especficos de clulas al investigar firmas epigenticas en muestras clnicas de tejidos caracterizadas por una alta heterogeneidad en la frecuencia de los tipos de clulas y el fenotipo, como la sangre.

Referencias

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