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MEMORIA JUSTIFICATIVA DEL PROYECTO URA12/03:
BIOMONITOREO MEDIANTE BIOMARCADORES SENCILLOS DE EFECTOS
DE DISRUPCIÓN ENDOCRINA EN POBLACIONES DE MUBLES (Chelon
labrosus) DE LA COSTA VASCA Y CARACTERIZACIÓN MEDIANTE
BIOENSAYOS Y BIOSENSORES DE CONTAMINANTES DISRUPTORES
ENDOCRINOS EN AGUAS DE DEPURADORAS DE LA CAV.
Investigadores: Maren Ortiz-Zarragoitia (IP), Miren P. Cajaraville, Maria Carmen
Barbero, Teresa Serrano, Urtzi Izagirre, Cristina Bizarro y Beñat Zaldibar (Grupo de
Investigación consolidado de Biología Celular en Toxicología Ambiental). Nestor
Etxebarria, Olatz Zuloaga, Aresatz Usobiaga, Maitane Olivares, Asier Vallejo (Grupo de
Investigación consolidado de Ikerkuntza eta Berrikuntza Analitikoa).
En Leioa a 21 de Marzo de 2013.
Contacto:
Dr. Maren Ortiz-Zarragoitia
Centro de Investigación de Biología y Biotecnología Marinas Experimentales
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
Areatza Pasealekua, s/n, 48620 Plentzia
Telf: 946013548, Fax: 946013500
e-mail: [email protected]
http://www.ehu.es/GrupoBCTA
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Biomonitoreo mediante biomarcadores sencillos de efectos de disrupción endocrina
en poblaciones de mubles (Chelon labrosus) de la costa vasca y caracterización
mediante bioensayos y biosensores de contaminantes disruptores endocrinos en
aguas de depuradoras de la CAV.
RESUMEN: Los disruptores endocrinos son contaminantes ambientales que pueden
alterar el normal funcionamiento del sistema endocrino de un organismo, afectando
severamente su desarrollo y reproducción. En casos extremos, estas alteraciones
pueden condicionar la supervivencia del organismo y comprometer la viabilidad de la
población afectada. En estudios previos realizados en la costa vasca se ha detectado
efectos de disrupción endocrina en varias poblaciones de mubles.
El objetivo del presente proyecto ha sido la identificación de efectos de disrupción
endocrina poblaciones de mubles que habitan zonas posiblemente impactadas por
compuestos disruptores endocrinos y caracterizar la carga estrogénica en efluentes de
depuradoras vascas. Así, tras capturar mubles en 5 poblaciones (Santurtzi, Gernika,
Ondarroa, Deba y Pasaia) se ha detectado la presencia de peces intersex en Gernika y
Deba. Los niveles de vitelogenina en machos (marcador de estrogenicidad en peces)
demostraron la exposición en todas las poblaciones estudiadas a compuestos
estrogénicos. De todas formas el patrón de contaminantes presentes en cada estuario
estudiado ha sido diferente. La caracterización del potencial xenoestrogénico de los
efluentes de la EDAR de Galindo y la EDAR de Gernika, se ha realizado con alevines de
mubles expuestos durante un periodo total de 10 días. Ambos efluentes han
demostrado potencial para inducir la expresión de los genes vitelogenina y aromatasa
cyp19a2, marcadores de xenoestrogenicidad. De esto se concluye que ambos efluentes
finales tienen capacidad estrogénica para los peces. Finalmente, se han desarrollado
herramientas para ensayos de evaluación de la toxicidad de sedimentos utilizando el
gusano poliqueto Nereis, que puedan utilizarse en un futuro. En conclusión, se hace
necesaria la implementación de un programa de seguimiento de la disrupción
endocrina en la costa vasca y evaluar el potencial estrogénico y su impacto en el medio
de los efluentes de depuradoras de aguas residuales en nuestra Comunidad
Autónoma.
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INDICE
FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA SOLICITUD ………........4
TAREAS DESARROLLADAS …………………………………………………………………………………...10
RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS …………………………........................................19
CONCLUSIONES...………………………………………………………………………………………………….27
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO…………………………………………………………………………....................................28
PLAN DE FORMACION, DIFUSIÓN Y TRANSFERENCIA…………………………………………..…31
TABLAS………………………………………………………………………………………………………………….34
ANEXO IMÁGENES…………………………………………………………………………………………………35
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FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA
SOLICITUD
La Directiva Marco del Agua Europea (DMA, 2000/60/EC) exige a los Estados Miembros
proteger, mejorar y restaurar todas las masas de agua superficiales con el fin de
alcanzar al menos el “Buen estado” para el año 2015, concepto que integra una
valoración conjunta tanto desde el punto de vista de su “estado químico” como de su
“estado ecológico”. Asímismo, la Directiva Marco Europea sobre Estrategia Marina
(EM) (2008/56/CE), en concreto, trata de garantizar que todas las aguas marinas (con
toda su diversidad ecológica) permanezcan dinámicas, limpias, sanas y productivas,
extendiendo las implicaciones de la DMA (ríos, lagos, aguas subterráneas, aguas de
transición y aguas costeras) a todas las masas de agua en Europa. La EM se fija el año
2020 como fecha para el cumplimiento de estos objetivos. Para ello es necesario
implementar redes de seguimiento de la calidad del medio, y estrategias/metodologías
que permitan una correcta evaluación de su estado. Entre las medidas que deben
incluirse en estas redes/programas de seguimiento se deben incluir, al menos, el
seguimiento de las sustancias prioritarias (estado químico) y de aquellos
contaminantes vertidos en mayor cantidad y la evaluación de los elementos biológicos
que puedan ser más sensibles a la presión evaluada (estado ecológico). En ese
contexto, los biomarcadores constituyen una herramienta muy útil para evaluar e
identificar las causas de los impactos sufridos por los organismos en los ecosistemas.
Los biomarcadores son medidas a nivel celular, bioquímico y/o molecular que indican
si un organismo ha estado expuesto a contaminantes y la respuesta del organismo al
contaminante.
Actualmente, la Red de Seguimiento de la Calidad de las masas de agua en la
Comunidad Autónoma Vasca incluye medidas químicas y algunas pocas medidas
biológicas. En estas actuaciones no se consideran compuestos nuevos que están
apareciendo en el ambiente y cuyas concentraciones están creciendo en todas las
masas de agua europeas y han sido denominados globalmente como contaminantes
emergentes. El estudio de estos compuestos se encuentra entre las líneas de
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investigación prioritarias de los principales organismos dedicados a la protección de la
salud pública y medioambiental, tales como la Organización Mundial de la Salud
(OMS), la Agencia para la Protección del Medio Ambiente (EPA), o la Comisión
Europea. Los contaminantes emergentes son compuestos de los cuales se sabe
relativamente poco o nada acerca de su presencia e impacto en los distintos
compartimentos ambientales, razón por la cual y a su vez consecuencia de que no
hayan sido regulados, y de que la disponibilidad de métodos para su análisis sea nula o
limitada. Otra particularidad de estos compuestos, es que debido a su elevada
producción y consumo, y a la como consecuente continua introducción de los mismos
en el medio ambiente, no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.
Dentro de esta familia compleja de compuestos contaminantes se encuentran los
retardantes de llama bromados, los cloroalcanos, los pesticidas polares, los
compuestos perfluorados, los fármacos, las drogas de abuso, y los metabolitos y/o
productos de degradación de las clases de sustancias anteriores. Estos compuestos
han sido catalogados también como disruptores endocrinos.
La disrupción endocrina ha sido definida por la Organización Mundial de la Salud como
cualquier alteración en el sistema endocrino que afecta, entre otros, la reproducción y
el desarrollo de los organismos y en caso extremo puede producir una disminución
dramática de la población afectada. Los compuestos disruptores endocrinos tienen un
origen antropogénico y en gran medida su último reservorio son las masas de agua,
especialmente ríos y estuarios. Los efluentes de depuradoras de aguas residuales
urbanas como industriales son una de las principales fuentes de compuestos
disruptores endocrinos en el medio ambiente y las poblaciones que habitan en las
zonas de estos efluentes suelen verse severamente afectadas, causando en algunos
casos reducciones dramáticas en el tamaño de la población. Entre los agentes
causantes de disrupción endocrina se encuentran diversos contaminantes ambientales
como los ya mencionados alquilfenoles, hormonas sintéticas, PAHs, ftalatos,
tributilestaño, etc., todos incluidos el Anexo VII de la DMA como contaminantes
prioritarios. Es más, la DMA propone que cualquier sustancia y preparado, o productos
derivados de ellos, con propiedades esteroidogénicas, cancerígenas, mutágenas o que
puedan afectar a la tiroides, a la reproducción o a otras funciones endocrinas en el
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medio acuático o a través del medio acuático deben ser analizadas en los programas
de seguimiento.
Los trabajos sobre efectos biológicos de los contaminantes disruptores endocrinos en
la costa vasca no son muy numerosos. En los últimos años nuestro grupo de
investigación ha descrito efectos de disrupción endocrina en peces Chelon labrosus
(mubles) que habitan zonas de estuarios de la costa vasca como, la Reserva de la
Biosfera de Urdaibai, el puerto de Arriluze en el Abra, la ría de Plentzia y el Puerto de
Pasaia. Estos peces mostraban gónadas intersex (feminización del tejido gonadal con
presencia de gametos femeninos dentro del tejido testicular) y niveles elevados de
vitelogenina en plasma. Los niveles de vitelogenina, proteína regulada por la hormona
estradiol y sintetizada exclusivamente por las hembras de organismos ovíparos
durante el desarrollo gametogénico, han sido ampliamente utilizados como
biomarcador de exposición a compuestos feminizantes (xenoestrogénicos) en peces
machos o inmaduros. Este biomarcador está siendo recomendado por organizaciones
que se preocupan por el estudio de los efectos de los contaminantes sobre los
organismos acuáticos, como la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo
Económico) e ICES (International Council for the Exploration of the Sea). Las
poblaciones de mubles mencionadas mostraban en la bilis niveles elevados de
compuestos disruptores endocrinos como alquilfenoles, bisfenol A, hormonas
sintéticas y ftalatos.
De modo paralelo, se han desarrollado diversas metodologías analíticas para el análisis
de algunos contaminantes con actividad disruptiva como alquilfenoles, estrógenos,
PAHs, etc. y se han realizado estudios sobre la distribución de algunos de estos
contaminantes en los estuarios de Bilbao y Urdaibai. Actualmente se están estudiando
algunos sistemas de muestreo pasivo para la monitorización de estos contaminantes
en EDAR de Bizkaia. Además, se pretende estudiar la viabilidad de los sistemas
denominados CFIS (Continuous Flow Integrative System) diseñados por LABAQUA
(Murcia) y que están en fase avanzada de ensayo.
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Atendiendo a la preocupación expresada por la Comisión Europea en su comunicación
COM(1999)706 al Parlamento Europeo y sucesivas actualizaciones, sobre la presencia y
efectos de los compuestos disruptores endocrinos en el medio ambiente y siguiendo
las recomendaciones sobre desarrollo de redes de biomonitoreo biológico recogidas
en la Estrategia Marina Europea, el presente proyecto se propone los siguientes
objetivos y actuaciones:
1º) Caracterización de efectos de disrupción endocrina en estuarios de la costa vasca,
sensibles de estar afectados por contaminantes disruptores endocrinos mediante
biomonitoreo de poblaciones residentes de mubles (Chelon labrosus). El muble ha
sido seleccionado como especie centinela para el estudio de la disrupción endocrina en
la costa vasca, debido a que es una especie distribuida a lo largo de toda nuestra costa
y su captura es relativamente fácil. El muble es un organismo detritívoro que se
alimenta de partículas en suspensión y de materia orgánica acumulada en el fondo,
con lo que la exposición a contaminantes ambientales es constante, y por lo tanto,
ofrece una imagen apropiada del estado ambiental de la zona de estudio. Además, es
una especie bastante resistente a la contaminación, pero que muestra respuestas
cuantificables, lo que hace del muble una especie muy apropiada para su uso como
organismo centinela. Trabajos recientes desarrollados en estuarios vascos, han
demostrado que los mubles pueden mostrar signos de disrupción endocrina como
gónadas intersex y alteraciones en los niveles de expresión de genes asociados con la
reproducción. Estudios analíticos de la bilis de los mubles con efectos de disrupción
endocrina, han demostrado la acumulación de compuestos disruptores endocrinos
como los alquilfenoles, ftalatos, bisfenol A, hormonas sintéticas, etc. Por lo tanto,
aplicando un sistema de biomonitoreo, propuesto en los proyectos URA10/02 y
URA11/03, se ha determinado la extensión de la disrupción endocrina en estuarios
vascos mediante dos actuaciones: Por una parte, se ha analizado la presencia de
contaminantes químicos con efectos disruptivos tanto en el agua como en los
sedimentos superficiales. Por otra parte, se han analizado mubles mediante
biomarcadores rápidos y sencillos de aplicar, como son los niveles de vitelogenina en
plasma (biomarcador específico de efectos feminizantes en peces), estudio
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histopatológico de la gónada para la detección de organismos intersex y cuantificación
de metabolitos de compuestos disruptores endocrinos en la bilis.
2º) Desarrollar metodologías apropiadas para la detección de contaminantes
emergentes en efluentes de depuradoras y evaluar la capacidad de producir
disrupción endocrina de estos efluentes en peces. Ante la reciente preocupación
mostrada por la Comisión Europea sobre la presencia de contaminantes emergentes
con potencial actividad de disrupción endocrina, se hace necesario el desarrollo de
técnicas capaces de cuantificar y detectar estos compuestos en las masas de agua. En
este sentido, se propone realizar el seguimiento de los niveles de diferentes
disruptores endocrinos en los efluentes de depuradora mediante sistemas de
muestreo pasivo (SMP). Este tipo se sistemas permiten realizar una evaluación
integrada de la presencia de contaminantes, que se encuentran en concentraciones
muy bajas y con unas variaciones regulares, debido al aporte continuo en los
influentes. Debido al desconocimiento existente en cuanto al potencial real de estos
contaminantes emergentes como disruptores endocrinos, se han expuesto alevines de
muble a dos efluentes de depuradoras y se han estudiado biomarcadores de
disrupción endocrina, como los mencionados en el objetivo 1. Además, junto con los
ensayos in vivo con peces también se ha estudiado el potencial estrogénico de los
efluentes mediante bioensayos in vitro. Estos bioensayos constan de células
transfectadas capaces de responder cuantitativamente ante la presencia de
compuestos hormonales estrogénicos.
3º) Aplicación y desarrollo de bioensayos con lombrices Nereis sp, en sedimentos
recogidos en zonas sensibles a contaminantes emergentes. Los bioensayos basados
en organismos invertebrados como los gusanos, ofrecen una posibilidad sencilla,
rápida y aplicable para la caracterización biológica de matrices tipo sedimentos en
ecosistemas acuáticos. Se han expuesto gusanos adultos del género Nereis sp. a
sedimentos susceptibles de contener contaminantes emergentes y se ha caracterizado
la respuesta a nivel celular y tisular con especial énfasis en el sistema digestivo y
reproductor. La Directiva Marco Europea sobre Estrategia Marina ya establece la
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necesidad de estudiar el impacto no solo en organismos vertebrados, sino también en
organismos invertebrados.
4º) Preparación de un informe científico-técnico describiendo en detalle los
protocolos aplicados y desarrollo de una serie de recomendaciones que puedan
aplicarse en las Redes de Seguimiento de la Calidad de las Aguas. Todo esto
redundará en un mejor conocimiento del estado de los ecosistemas acuáticos y
facilitará la toma de medidas correctoras y desarrollo de futuros programas de
seguimiento y vigilancia.
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TAREAS DESARROLLADAS
TAREA 1: Estudio de efectos de disrupción endocrina en poblaciones de mubles
seleccionadas en la costa vasca mediante biomarcadores específicos.
Durante los meses de Mayo y Junio se ha procedido a la captura, mediante pesca con
caña, de mubles (Chelon labrosus) en cinco estuarios de la costa vasca. Los puntos
seleccionados fueron el puerto de Santurtzi (en sustitución de Zierbana, ya que la
recogida de muestras fue más fácil), Gernika, Ondarroa, Deba y Pasaia. Finalmente se
decidió no recoger mubles en Hondarribia debido a los problemas para capturar
mubles en esta zona. Se capturaron entre 20-30 mubles en cada zona de estudio y se
procedió a su procesamiento in situ, recogiendo muestras de hígado, gónada, cerebro
y sangre. En todo momento y a lo largo de todo el estudio, los procedimientos
seguidos se ajustaron a las normativas estatales y europeas en vigor (Ley 32/2007 del 7
de Noviembre; Directiva 2010/63/UE) con el fin de reducir el daño causado a los
organismos capturados. Además, han contado con la evaluación favorable del Comité
de Ética para el Bienestar Animal (CEBA) de la UPV/EHU.
Los mubles capturados fueron anestesiados sumergiéndolos en una solución saturada
de benzocaína, tras lo cual se registró su talla y peso. El tamaño del pez se midió desde
su parte frontal hasta la parte final sin incluir la aleta caudal. Inmediatamente después
se procedió a la extracción de sangre. Para ello se utilizaron jeringuillas heparinizadas,
extrayendo la sangre (unos 1,5 mL por pez) de la vena caudal. La sangre se transfirió a
microtubos eppendorf de 2 mL y se centrifugó a 1000 rpm durante 5-7 min para
obtener el plasma. Tras recoger el plasma del sobrenadante del tubo, se transfirió a un
criotubo de 2 mL que contenía una gota de aprotinina (para la inhibición de la
degradación de proteínas) y se congeló en nitrógeno líquido. El plasma se transportó
hasta el laboratorio congelado en nitrógeno líquido, donde finalmente fue almacenado
a -80ºC y forma parte del Banco de Bioespecimenes Ambientales de la Bahía de Bizkaia
(BBABB) de la UPV/EHU, que servirán para futuros estudios.
Para proceder a la disección de los peces, se sacrificaron previamente mediante
decapitación. Se extrajeron muestras de cerebro, gónada e hígado. La gónada y el
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hígado se extrajeron enteros y se pesaron por separado. El cerebro se introdujo en un
vial estéril (2 mL) que contenía RNAlater (Invitrogen) para conservar el RNA presente
en el tejido, y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. En el laboratorio, estas
muestras fueron almacenadas en congeladores a -80ºC hasta su análisis. Con una
porción de las muestras de hígado y gónada, se procedió del mismo modo que con las
muestras de cerebro y se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su transporte al
laboratorio. Se procedió al estudio de los niveles de transcripción del gen vitelogenina
como marcador de estrogenicidad. Las muestras fueron descongeladas, se retiró el
exceso de RNAlater con un papel secante y se introdujo cada muestra en un vial de 2
mL que contenía 1 mL de Trizol (Invitrogen) y microbolas de teflón. Se homogenizaron
las muestras en un disruptor de tejidos (Hybaid). Posteriormente se recogió el
homogenizado y se transfirió a un microtubo eppendorf estéril de 2 mL. Se añadieron
200 µL de cloroformo y se centrifugaron las muestras a 12000 rpm a 4ºC en una
centrífuga eppendorf para la separación de proteínas, DNA y RNA. Tras este primer
centrifugado se recogió el sobrenadante que contenía el RNA y se transfirió a una
columna de extracción de RNA (RNeasy kit, Ambión). Siguiendo el protocolo del kit
comercial de extracción se consiguió el RNA total de cada muestra. Posteriormente
una alícuota de muestra conteniendo 1 µg/µL de RNA se transfirió a un nuevo
microtubo eppendorf estéril y se procedió a la síntesis de cDNA utilizando otro kit
comercial (SuperScript First Strand Synthesis, Invitrogen). El excedente de RNA de cada
muestra se almacenó a -80ºC y las muestras de cDNA se almacenaron a -40ºC. El
análisis de la expresión de los genes de interés se realizó mediante PCR cuantitativa a
tiempo real (qPCR). Para ello se utilizaron cebadores y sondas de oligonucleótidos
específicos para el gen de la vitelogenina en mubles, desarrollados por nuestro grupo
de investigación y sintetizados por encargo por la compañía AppliedBiosystems. El
proceso consistió en, tras descongelar el cDNA, coger una alícuota de 1 µg de cDNA y
proceder a su análisis con los cebadores y las sondas específicas para cada gen
incluidas en el kit comercial de PCR a tiempo real de AppliedBiosystems. La lectura de
los niveles de expresión se realizó con el termociclador 7100 de AppliedBiosystems.
Otra porción de la gónada y el hígado se recogió en cassetes de histología y se
sumergieron en fijador 10% de formalina tamponada con 2.5% de glutaraldehído. Se
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mantuvieron a 4ºC durante 24 horas hasta su posterior procesamiento.
Posteriormente, se transfirieron a alcohol de 70º y se deshidrataron químicamente en
un proceso de alcoholes seriados con ayuda del procesador de tejidos automático
Leica ASP300. Se incluyeron en resina de metacrilato (Tecnovit 7100) y se realizaron
secciones de 5 µm de grosor y se tiñeron con un protocolo convencional de
hematoxilina/eosina. Finalmente el estudio histológico/histopatológico se realizó en
un microscopio Olympus BX60 acoplado a un sistema de ordenador de captura de
imágenes. Se prestó especial atención a las fases gametogénicas, procesos de
intersexualidad y agregados de melanomacrófagos (células de respuesta inmune en
peces).
El resto de la gónada y del hígado se etiquetó debidamente envueltos en papel de
aluminio y se congelaron en nitrógeno líquido. Estas muestras se almacenaron a -40ºC
a su llegada al laboratorio y son susceptibles de ser incorporadas al BBABB de la
UPV/EHU.
Por último, se recogieron muestras de bilis de cada individuo utilizando una jeringuilla
estéril de 1 mL. La bilis se extrajo directamente del saco biliar adyacente al hígado. La
muestra de bilis se transfirió a viales de plástico inerte de 2 mL (Corning) y se congeló
rápidamente en nitrógeno líquido. También se recogieron otolitos de la parte frontal
de los peces. Tras su extracción y limpiado se almacenaron en viales de 2 mL en etanol
absoluto a 4ºC. Las muestras de bilis y los otolitos de los peces se encuentran
almacenados en el BBABB de la UPV/EHU, para futuros análisis.
TAREA 2: Desarrollo de protocolos específicos para la cuantificación de actividades
esteroidogénicas en gónada de mubles.
Durante el desarrollo de esta Tarea 2 se analizaron muestras de mubles recogidas en
anteriores proyectos URA entre los años 2011 y 2012 en el puerto de Pasaia y
almacenadas en el BBABB de la UPV/EHU. Se ha estudiado la expresión de genes
asociados al proceso de esteroidogénesis en peces como StAR (steroid acute
regulatory protein), cyp11b (responsable de la síntesis de andrógenos) y cyp19a1
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(responsable de la síntesis de estrógenos) y genes relacionados con el catabolismo
hormonal como sulfotransferasa y glucotransferasa. El protocolo seguido para la
cuantificación de los niveles de estos genes tanto en hígado como en gónada ha sido el
mismo descrito en la Tarea 1. Junto con los niveles de transcripción de los genes
indicados, también se han cuantificado los niveles de estrógenos (estradiol) y
andrógenos (11-Ketotestosterona) en el plasma de los mismos organismos. Para este
fin, el plasma se descongeló cuidadosamente a 4ºC y se mezcló con una solución de
dietileter en una proporción 1:5. La fase orgánica extrajo las hormonas presentes en el
plasma y esta fase orgánica fue transferida a un nuevo tubo donde se evaporó el
dietileter bajo atmosfera de nitrógeno. Las hormonas fueron resuspendidas en etanol
y se cuantificaron con kits comerciales específicos de la empresa Cayman Chemical.
Además de los niveles hormonales en plasma y la cuantificación de los transcriptos de
los genes esterodogénicos en la gónada, se midió la actividad de la enzima aromatasa
en muestras de gónada congeladas. Tras descongelar una porción de gónada (1 g
aproximadamente) de los mismos mubles se homogeneizó en frío utilizando 3 ml de
medio de homogeneización (100 mM de potasio tampón fosfato pH 7,4 que contiene
100 mM KCl y 1 mM EDTA). Los homogenados obtenidos se centrifugaron
consecutivamente a 10.000 g durante 20 min y se eliminó el sobrenadante y se
centrifugó de nuevo a 105.000 g durante 60 min. El sobrenadante resultante se apartó
y el precipitado final se lavó primero con un pequeño volumen de 100 mM de tampón
potasio-fosfato (pH 7,4) y se resuspendió con 1 ml de 100 mM de tampón potasio-
fosfato pH 7,4. Se cuantificó el contenido de proteína total siguiendo el método de
Bradford, utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar (Quick Start
Bradford Dye con BSA kit, Bio-Rad, California, EE.UU.). Después de obtener el
contenido de proteína total, todas las muestras se diluyeron con 100 mM de tampón
potasio-fosfato (pH 7,4) a una concentración final de 2 mg / mL de proteína en un
volumen final de 1 mL. Posteriormente, cada muestra se dividió en dos tubos de
ensayo de 10 mL, conteniendo cada uno 0,5 mL de preparación microsomal, uno para
el control y el otro para mediciones reales. Las preparaciones microsomales de todos
los tubos control se hirvieron, desnaturalizando todas las enzimas presentes en la
preparación, mientras que el resto de las muestras se mantuvieron en frío. Se
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añadieron 0,5 mL de medio de ensayo (1,7 mM NADP, 2,8 mM de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, 1,0 UI glucosa-6-fosfato, 3,3 mM de cloruro de magnesio, 0,1 mM
NADPH y 50 nM testosterona) a cada tubo, y se incubaron durante 30 min a 28 ⁰ C bajo
agitación continua en un baño de agua. La reacción se detuvo manteniendo los tubos
en hielo y la fase orgánica que contiene la hormona estradiol se extrajo como en las
muestras de plasma, descrito en el párrafo anterior. La actividad de la aromatasa se
cuantificó mediante los niveles calculados de estradiol por muestra dividiéndose por
los niveles de proteína total en cada muestra.
TAREA 3: Desarrollo de los métodos de análisis y de muestro pasivo.
Las muestras de bilis se descongelaron y fueron inmediatamente hidrolizadas. En un
vial de vidrio de 10 mL se mezclaron 100 µL de bilis, 1,5 mL de tampón fosfato (0,1 mol
/ L, pH 6,0), 800 µL de agua Milli Q, 50 µL de análogos deuterados (E2-d3 y d4-NP, 2
mg / L) y 200 µL de las correspondientes enzimas (1.000 U / mL de β-glucuronidasa, 2
U / mL para la sulfatasa y 20 U / mL de β-glucosidasa). A continuación, se sumergió 1
cm en la mezcla una sonda de titanio (MS73, diámetro 3 mm, Bandelin, Berlín,
Alemania) acoplada a un sistema de ultrasonidos Bandelin Sonoplus HD 2070 (20 kHz,
70 W, Berlín, Alemania). La hidrólisis enzimática se llevó a cabo durante 20 min a 10%
de amplitud y durante un ciclo. Después de la hidrólisis, se añadieron 300 µL de ácido
acético y 2 mL de agua Milli Q, antes de la limpieza mediante extracción en fase sólida
(SPE).
La bilis hidrolizada se cargó en un cartucho de 200-mg de Oasis HLB, que había sido
previamente acondicionado con 5 mL de metanol (MeOH) y 5 mL de ácido acético al
1% (v/v) en agua Milli Q. El cartucho se enjuagó con 2 mL de agua Milli Q y se secó al
vacío durante 10 min. Los analitos se eluyeron con 8 mL de etilacetato. Finalmente, el
extracto se evaporó a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno en un
evaporador Turbo Vap LV (Zymark, Hopkiton, MA, EE.UU). El extracto concentrado se
disolvió en 125 µL de piridina y 25 µL de BSTFA con un 1% de TMCS y se sometió a una
etapa de derivatización durante 10 min a 80% de amplitud y nueve ciclos en un
sistema de ultrasonidos Bandelin Sonoplus HD 2070 (20 kHz, 70 W, Berlín, Alemania)
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acoplado con un dispositivo de refuerzo BR 30 Cup. El extracto se mantuvo a -20 ° C
antes de proceder a su análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de
masas (GC-MS).
Los analitos derivatizados se analizaron en un cromatógrafo de gases 6890N (Agilent
Technologies, Avondale, PA, EE.UU.). Se inyectó 1 µL del extracto derivatizado en
modo splitless a 280°C en una columna cromatográfica HP5-MS (30 m × 0,25 mm, 0,25
m). Para la separación de los analitos, se utilizaron los siguientes programas de
temperatura: 100°C (5 min), aumento de la temperatura a 20°C min-1 hasta 200°C, un
segundo incremento de 1,5°C min-1 hasta 240°C y una tercera de 20°C hasta 300°C,
donde finalmente se mantuvo durante 2 min. Se uso helio (99,9995%, Carburos
Metálicos, Barcelona, España) como gas portador a un flujo constante de 1 mL min-1.
La temperatura de la línea de transferencia se mantuvo a 310°C, y la fuente de iones y
cuadrupolo a 230°C y 150°C, respectivamente.
En el caso de los sistemas de muestreo pasivo se calibraron los sistemas empleados
(POCIS y Mesco, ver Figura 1). La calibración consistió en la exposición de los sistemas
de muestro pasivo durante un tiempo definido (hasta 16-20 días) a partir de la cual se
calculó la constante de muestreo (L·día-1) y el empleo de PRCs (performance reference
compounds).
TAREA 4: Estudio de la acumulación de los contaminantes seleccionados en los
sistemas de muestreo pasivo.
A partir de los calibrados realizados anteriormente se establecieron las
concentraciones presentes en todas las estaciones muestreadas. Para ello se dispuso
de dos sistemas de muestreo (para compuestos polares y no polares) y cada uno de
ellos se realizó por duplicado. En función de la constante de muestreo se obtuvieron
dos momentos para cada sistema pasivo: en condiciones cinéticas (del orden de 4-8
días de exposición) y en condiciones de equilibrio (> 15 días de exposición) (ver Figura
2). Además de los compuestos objeto de estudio se realizó un screening multiresiduo
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para poder disponer de información relativa a la presencia de otros contaminantes que
pudieran enmascarar los resultados
TAREA 5: Caracterización de efectos de disrupción endocrina mediante bioensayos
en efluentes de depuradoras de aguas residuales.
Esta Tarea ha sido una de las más complejas desde el punto de vista experimental.
Ante la imposibilidad de enjaular peces, se decidió realizar la exposición en las
instalaciones acuariológicas del Centro de Investigación en Biología y Biotecnología
Marinas Experimentales (PIE-UPV/EHU). Se obtuvieron alevines de muble de un año de
edad del Centro de Formación Profesional en Acuicultura-Zaporito (Cádiz) que fueron
trasladados al PIE-UPV/EHU. Tras un periodo de aclimatación de 10 días, se expusieron
los peces a dos efluentes de depuradoras de aguas residuales urbanas (EDAR). Los
efluentes seleccionados fueron los de la EDAR de Gernika y EDAR de Galindo. La
selección de ambos efluentes se basó en resultados previos de nuestro grupo,
sospechando la posible presencia de compuestos disruptores endocrinos.
Se evaluó la capacidad estrogénica de cada efluente a tres concentraciones/diluciones
diferentes: 20%, 40% y 75% diluidos en agua de mar. Se incluyó un grupo control que
se mantuvo en agua del acuario. La renovación de agua fue diaria y se alimentaron los
peces de manera rutinaria. El experimento de exposición duró 10 días y en cada grupo
experimental se expusieron 20 peces. Se recogieron muestras tras 2 y 10 de
exposición. El procedimiento de recogida de muestras de los peces siguió el mismo
proceso descrito en la Tarea 1 aunque en este caso solo se analizaron los niveles de
transcripción de vitelogenina en hígado, como biomarcador de estrogenicidad. Junto
con los mubles, también se mantuvieron en los tanques experimentales los
muestreadotes pasivos, para la detección de contaminantes emergentes en los
efluentes analizados.
Además de evaluar la capacidad de causar efectos de disrupción endocrina por los
efluentes en los peces expuestos (ensayo in vivo), tambien se estudió in Vitro la carga
estrogénica del agua de los efluentes y de sedimentos recogidos en la zona de
17
descarga de los efluentes. Para este tipo de bioensayos in Vitro se utilizaron células
transfectadas con el receptor de estrógenos para peces y otras con el receptor de
estrógenos de humanos. Estas células se incubaron con muestras de agua de los
efluentes y la respuesta obtenida se comparó entre ambos tipos celulares. Esta parte
de la Tarea 5 se ha realizado en colaboración con el grupo del Dr JM Navas del
Departamento de Medio Ambiente (INIA) en Madrid.
TAREA 6: Estudio de los posibles efectos tóxicos de sedimentos contaminados
mediante bioensayos con el invertebrado Nereis sp.
Se recogieron muestras de sedimentos de dos zonas (Arteaga y Kanala) de uno de los
sitios de estudio (Urdaibai) del presente proyecto. Los sedimentos se trasladaron al
laboratorio en bolsas refrigeradas. Una vez en el laboratorio, se puso 1 Kg de
sedimento en 3 litros de agua y se introdujeron gusanos del género Nereis en el
sedimento (10 animales por sedimento) y se mantuvieron a temperatura constante (19
ºC) y con aireación durante 21 días en oscuridad. Se tomaron muestras de los gusanos
y se hicieron una serie de medidas biométricas incluyendo peso fresco, peso seco,
longitud total y longitud de los tres primeros segmentos entre otros. Además, se
tomaron muestras de agua, sedimento y gusanos para la cuantificación de los metales
pesados más relevantes en el medio (Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb y Zn) con el fin de observar
el trasiego de metales en los diferentes compartimentos ambientales (agua, sedimento
y organismos) y la capacidad de acumulación de los gusanos. Finalmente, se tomaron
muestras de gusanos y se procesaron de manera rutinaria para el estudio histológico
de las muestras con el fin de observar posibles alteraciones.
TAREA 7: Integración de los resultados y transferencia de las conclusiones a la
Administración.
Durante el desarrollo del proyecto se ha mantenido un contacto constante entre los
grupos e investigadores participantes dentro del proyecto. Además de los grupos de
investigación la Agencia Vasca del Agua ha estado constantemente informada del
progreso del proyecto mediante una reunión inicial en Mayo de 2012 y el informe
18
parcial remitido a URA en noviembre de 2012. Tras la finalización del proyecto todos
los datos obtenidos se han integrado y discutido entre los distintos investigadores
participantes. También se ha redactado la memoria final para su transferencia a la
Administración. A la vista de los resultados obtenidos, se propone a la administración
competente la necesidad de poner en marcha un programa de seguimiento de los
efectos de disrupción endocrina en peces de estuario. Con este fin, nuestro grupo de
investigación se ofrece a colaborar con la Administración o agentes implicados en el
desarrollo de medidas correctoras o de remediación y también colaborará con el
personal responsable de la Administración ofreciendo asesoramiento y apoyo
científico para el desarrollo de propuestas de actuación.
19
RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS
Estudio de efectos de disrupción endocrina en poblaciones de mubles de la costa
vasca
El análisis histológico de la gónada permitió el sexado de los individuos capturados y
la clasificación en base a su estadío gametogénico. En las cinco estaciones de estudio
seleccionadas (Santurtzi, Gernika, Ondarroa, Deba y Pasaia) no se encontraron
desplazamiento significativo en los ratios de los peces capturados. En todas las
poblaciones el ratio machos hembras se acercó al 1:1 esperado para una especie como
el Chelon labrosus. Respecto al estadío gametogénico de la gónada se observaron
diferencias entre sexos y poblaciones. Los machos estaban ligeramente menos
desarrollados que las hembras en las estaciones de Santurtzi, Ondarroa, Deba y Pasaia.
Las gónadas de los machos mostraron estadíos en fases 1-2 con presencia de
espermatogonios y algunos pocos espermatocitos en los folículos espermáticos. En el
caso de las hembras las fases gametogénicas principales fueron 2-3, con ovocitos
previtelogénicos y en fase de córtica alveoli (vitelogénesis temprana) presentes en el
ovario. En Gernika fueron los machos los que estaban ligeramente más desarrollados
que las hembras. Los machos mostraron gónadas en estadío 2-3, con presencia más
elevada de espermatocitos. Las hembras de Gernika mostraron estadíos 1-2, con
ovarios conteniendo principalmente ovocitos previtelogénicos.
Atendiendo al índice morfogénico del índice gonado-somático (GSI), la tendencía fue
la misma que lo observado en histología (Figura 3). En el caso de los machos los valores
GSI más elevados se obtuvieron en Gernika en comparación con el resto de
poblaciones. Por el contrario, las hembras de la población de mubles de Gernika
fueron las que mostraron un GSI más bajo en comparación con el resto de hembras.
El estudio histopatológico de la gónada de los mubles mostró que no habían
alteraciones tipo acumulación de melanomacrófagos ni desestructuración del tejido
gonadal. Sin embargo se detectaron individuos intersex en las poblaciones de mubles
de Gernika y Deba. Los individuos intersex mostraron testículos con algunos gametos
femeninos (ovocitos) dispersos por el tejido. Estos ovocitos fueron siempre
20
previtelogénicos. Atendiendo al grado de presencia de los ovocitos en los testículos de
los peces intersex, todos estos individuos fueron clasificados como nivel 1 (en una
escala de 0 a 5, en la que 0 es testículo normal y 5 completamente feminizado). El
cálculo del GSI para los peces intersex mostró diferencias respecto a los machos de las
mismas poblaciones. La aparición de organismos intersex es un reflejo claro de
exposición de los peces afectados a compuestos con actividad hormonal estrogénica o
feminizante.
Además del estudio histopatológico del tejido gonadal, el trabajo de campo se ha
completado con la cuantificación de los niveles de trascripción del gen de la
vitelogenina en el hígado de los peces (Figura 4). Como ya se ha mencionado
anteriormente en este informe, los niveles de vitelogenina en peces machos están
considerados como el mejor biomarcador de exposición a compuestos estrogénicos
(xenoestrógenos). Son varios los programas de seguimiento de la calidad ambiental de
zonas acuáticas que están incorporando este biomarcador, por ser específico, sensible
y rápido y sencillo de cuantificar. La cuantificación de los niveles de vitelogenina en
hígado de los peces macho demostró la exposición a compuestos xenoestrogénicos en
todas las poblaciones estudiadas. Indicar que los machos de Gernika fueron con
diferencia los que mostraron niveles más elevados de trascripción junto con los peces
intesex de esta misma población. Los niveles de trascripción de vitelogenina en estos
organismos fueron superiores a los cuantificados en todas las hembras del estudio.
Los análisis químicos de muestras de agua recogidas en las cinco zonas de estudio
demostraron la presencia de compuestos disruptores endocrinos (ver Tablas 1 y 2). Se
detectaron compuestos como ftalatos, alquilfenoles, HCHs, DDT y derivados, clorpirifos
y clorfenvinfos (estos últimos considerados contaminantes emergentes). En todos los
casos los niveles fueron siempre en el rango de ng/L. Los niveles de ftalatos más
elevados se cuantificaron en Deba, seguido por Pasaia y Gernika. Los niveles más bajos
se cuantificaron en Santurtzi y Ondarroa. En cuanto a los niveles de alquilfenoles solo
fueron detectables en Gernika y en Santurtzi (en esta última estación de muestreo solo
se detectó la presencia de 4-t-octylphenol). Los resultados de Gernika vuelven a
confirmar la presencia elevada de compuestos tipo alquilfenol, ya detectada en
21
campañas anteriores por nuestro grupo de investigación. Los compuestos halogenados
tipo HCH solo fueron detectados en Gernika, Ondarroa y Deba, siendo Gernika donde
se cuantificaron las concentraciones más elevadas (el doble que en Ondarroa y Deba).
Respecto a los compuestos tipo DDT y derivados los niveles siempre estuvieron por
debajo de los límites de detección en todas las estaciones estudiadas. Finalmente,
entre los contaminantes emergentes detectados los niveles de clorpirifos fueron
elevados en Gernika, Ondarroa y Deba en comparación con las otras estaciones. En
cuanto a los niveles de clorfenvinfos siempre estuvieron por debajo de los límites de
detección en todas las estaciones analizadas. Por lo tanto, se observa que el patrón de
contaminación es bastante diverso entre las estaciones estudiadas. Seguimos
caracterizando y analizando las muestras recogidas para abrir el abanico de
compuestos disruptores endocrinos que ayuden a explicar los efectos detectados
mediante los estudios biológicos.
Desarrollo de protocolos específicos para la cuantificación de actividades
esteroidogénicas en gónada de mubles.
Partiendo de muestras congeladas de tejidos de muble almacenados en el BBABB de la
UPV/EHU hemos conseguido caracterizar el proceso hormonal que controla la
gemtogénesis en mubles. El conocer este proceso es esencial para comprender el
comportamiento reproductor del muble y poder definir y desarrollar nuevos
biomarcadores que ayuden a interpretar mejor los efectos de disrupción endocrina en
esta especie.
Se han clonado tres nuevas secuencias génicas de genes asociados con la
esteroidogénesis en mubles y que vienen a sumarse a los ya existentes. Estas tres
nuevas secuencias corresponden a los genes StAR (steroid acute regulatory protein),
cyp11b (11b-hidroxilasa) y sult (sulfotransferasa). Las tres secuencias han sido
aceptadas para su publicación en la base de datos pública del NCBI con los siguientes
códigos de acceso: StAR JX294414; cyp11b JX294416; sult JX294415. Tras la obtención
de estas secuencias génicas se han desarrollado protocolos para la cuantificación de su
22
trascripción en tejidos de mubles. Este protocolo está basado en tecnología de PCR a
tiempo real (qPCR) utilizando SYBRgreen como marcador de fluorescencia.
Tras el desarrollo y optimización del protocolo para la cuantificación de los niveles de
trascripción de los genes reguladores de la esteroidogénesis en mubles, se estudió su
patrón de expresión durante el desarrollo gametogénico. Así, en los individuos machos
la expresión de StAR fue más alta en las gónadas maduras y en puesta que en los
estadíos de inmadurez y postpuesta. Los niveles de cyp11b y cyp19a1 (aromatasa) sin
embargo, fueron más elevados durante las primeras fases de la gametogénesis para
luego descender en la madurez y puesta de gametos. En cuanto a los genes
reguladores del proceso de catabolismo de hormonas esteroidogénicas, se observó
que tanto sult como ugt (glucotransferasa) fueron elevados en la fase de inmadurez y
más bajos durante el proceso de gametogénesis. En el caso de los individuos hembra
los niveles de StAR fueron más elevados en la fase de madurez, bajando
posteriormente durante la puesta y post-puesta. Los niveles de cyp11b no variaron a lo
largo del proceso de gametogénesis y siempre fueron más bajos que los cuantificados
en machos. Los niveles de expresión de cyp19a1 fueron elevados durante la
gametogénesis, para luego descender durante las fases de puesta y post-puesta. En
cuanto a los genes sult y ugt ambos mostraron los niveles de expresión más elevados
en hembras en fases de puesta y post-puesta, en comparación con los niveles
cuantificados en las fases de desarrollo gametogénico. Un análisis holístico de los
resultados de trascripción de los genes reguladores de la esteroidogénesis demuestra
diferencias en los patrones de expresión entre machos y hembras, algo lógico y
esperable en base a la diferencia fisiológica entre ambos sexos. Lo que sí es
remarcable, es que la menor variabilidad entre individuos y menor efecto de las
hormonas endógenas sobre la expresión de los genes reguladores de la
esteroidogénesis ocurre en las fases de inmadurez o gametogénesis temprana. Por lo
que se recomiendan estas fases para realizar estudios de disrupción endocrina en
mubles. Este resultado coincide con lo observado en los estudios histológicos
realizados anteriormente en mubles.
23
Junto con los niveles de expresión génica, se cuantificaron también los niveles de
hormonas esteroides en muestras de plasma de mubles en distintas fases
gametogénicas. Los resultados demuestran que por lo general, los niveles de
estrógenos fueron más elevados en hembras que en machos y viceversa para los
niveles de 11-ketotestosterona. Estos resultados, eran perfectamente esperables y se
ajustan correctamente con los patrones de expresión de los genes reguladores de la
esteroidogénesis en mubles. Además, hemos puesto a punto un protocolo específico
para la cuantificación de la actividad de la enzima aromatasa cyp19a1, responsable de
la síntesis de estrógenos. La actividad de la aromatasa en muestras de gónada de
mubles fue, por lo general, más elevada en hembras que en machos. Lo que coincide
perfectamente con lo observado en los niveles de estrógenos en plasma de los mubles.
En los mubles hembras el patrón de actividad es más elevado en la fase de madurez,
subiendo durante la gametogénesis, para luego descender rápidamente durante la
puesta y post-puesta. En machos la tendencia fue la misma, pero los niveles de
actividad siempre fueron inferiores a los cuantificados en hembras. Estos resultados se
ajustan perfectamente a lo observado en los niveles de trascripción génica para el
cyp19a1. Se demuestra además, que el mejor momento para evaluar posibles
impactos causados por disruptores endocrinos es las fases tempranas del desarrollo
que es cuando existe mayor capacidad de respuesta.
Evaluación de la actividad xenoestrogénica de efluentes de depuradoras.
Dentro de este apartado se incluyen las Tareas 3, 4 y 5 ya que dependen en gran
medida del experimento realizado en el laboratorio. En este experimento se
expusieron alevines de muble a dos efluentes de depuradoras de aguas residuales
urbanas: EDAR Galindo y EDAR Gernika. El protocolo de experimentación ya ha sido
descrito en el aparatado anterior.
La exposición a ambos efluentes causó la inducción de la expresión de los genes
vitelogenina y cyp19a2 (aromatasa cerebral) en los peces expuestos, indicando la
presencia de compuestos xenoestrogénicos. Los niveles de trascripción de vitelogenina
en hígado (Figura 5), fueron elevados en los peces expuestos al efluente de Galindo al
de 2 días y se mantuvieron elevados hasta la finalización del experimento (10 días). Los
24
peces expuestos al efluente de Gernika, no mostraron cambios en la expresión de
vitelogenina tras 2 días de exposición, pero al de 10 días de exposición los niveles de
trascripción fueron muy elevados, superando incluso los niveles cuantificados en los
mubles expuestos al efluente de Galindo. En cuanto a la respuesta del gen cyp19a2 los
niveles de trascripción no se elevaron hasta los 10 días de exposición en ambos
efluentes (Figura 6), siendo la respuesta mucho más marcada en los mubles expuestos
al efluente de Galindo que en los de Gernika. Estos resultados basados en
biomarcadores demuestran la presencia de compuestos disruptores endocrinos con
actividad estrogénica en los efluentes estudiados. En estos momentos se están
terminando los análisis químicos de los efluentes, con lo que podremos en breve
determinar los posibles compuestos químicos responsables de estos efectos
estrogénicos.
Además del estudio utilizando mubles in vivo, también se han recogido muestras de
agua de los efluentes analizados y de sedimentos de las zonas de vertido, para
evaluarlo mediante bioensayos in vitro. Estos trabajos todavía no están
completamente finalizados, pero los primeros resultados demuestran que ambos
efluentes son capaces de activar la respuesta dependiente del receptor de estrógenos
en los modelos celulares utilizados. Por lo tanto, se confirma los resultados obtenidos
con la exposición de los alevines de mubles.
Estudio de los posibles efectos tóxicos de sedimentos contaminados mediante
bioensayos con el invertebrado Nereis sp.
Los resultados del análisis químico en las muestras de sedimento indicaron que tanto
la muestra de Kanala como la de Arteaga presentaban niveles bajos de
concentraciones de metales pesados (Tabla 3). Así, solamente en el caso del Zn los
valores obtenidos estuvieron por encima de valores considerados como ligeramente
contaminados de acuerdo con los estándares holandeses (Dutch SQG), teniendo un
valor de clase 1 (ligeramente contaminado) mientras el resto de metales estudiados
presentaron valores con niveles de clase 0 (no contaminados). Por otra parte, no
pareció ocurrir trasvase de metales del sedimento al agua ya que ésta presentó
25
constantemente niveles de metales inferiores al límite de detección. En cuanto a los
gusanos, las concentraciones de metales pesados medidas en los tejidos presentaron
concentraciones bajas de contaminantes, similares a los valores de Nereis en el tiempo
0 de exposición (Tabla 3). En cuanto a la capacidad de bioacumulación de los gusanos,
para todos los metales estudiados (excepto el Zn) encontramos que el índice de
bioacumulación fue menor que 1 y en el caso del Zn fue sólo ligeramente superior a 1
tanto para los sedimentos de Arteaga como para los sedimentos de Kanala.
El cálculo de los índices de condición basados en medidas biométricas demostró que
hubo un aumento en los animales expuestos al sedimento de Artega y Kanala; en el
caso de Artega, además este aumento fue estadísticamente significativo (Figura 7).
Este aumento en la relación L3/peso fresco reflejó que para el mismo tamaño de
animal (mismo L3) la exposición a los sedimentos de Kanala y sobre todo Arteaga,
implicaron un descenso en el peso de los poliquetos indicando una situación de estrés.
Sin embargo, teniendo en cuenta los valores obtenidos y comparándolos con los
valores obtenidos en estudios previos, los resultados de las medidas biométricas
observados en el presente estudio son similares a los obtenidos en el estuario del
Authie (Francia en 2002-2004) considerado un estuario poco contaminado.
En cuanto al estudio histológico de las muestras, se observó que las lombrices
presentaron en general un desarrollo gametogénico muy temprano y por lo tanto los
ovocitos observados fueron en todos los casos muy pequeños y fue imposible realizar
un estudio de la distribución de tamaños de los ovocitos y comparar la diferentes
situaciones experimentales. Sin embargo, sí se observaron diferencias en el tegumento
y en epitelio digestivo de las lombrices en diferentes situaciones experimentales. Por lo
tanto parece que son éstos (el tracto digestivo y el tegumento) los órganos más
sensibles y los que responden de manera más acusada a diferentes situaciones
experimentales y por lo tanto los órganos a tener en cuenta para futuros trabajos. Así,
en las lombrices expuestas a sedimentos de Kanala y Arteaga se observó una pérdida
de cilios y una disminución en la altura del tegumento así como un descenso en el
número y/o tamaño de las células mucosas que se encuentran en la epidermis de las
lombrices (Figura 8). En cuanto al tracto digestivo, en general se observó un ligero
26
descenso en la altura del epitelio, así como en algunos individuos un descenso en la
cantidad y altura de los pliegues intestinales. Esta respuesta, sin embargo, no se
observó en todos los individuos. Por otra parte, en las lombrices expuestas a
sedimentos también se observó un aumento en la actividad del sistema inmune, con
una mayor presencia de células inmunitarias en los diversos tejidos (Figura 8). Debido
a la poca información de alteraciones histopatológicas medidas en poliquetos del
género Nereis, es difícil hacer una evaluación robusta de la salud de las lombrices
basándonos únicamente en las alteraciones observadas. En el presente estudio,
aunque se han observado algunas alteraciones, en general parece que dichas
alteraciones no son demasiado relevantes (no se ha observado atrofia ni necrosis en el
tracto digestivo) y parece que las lombrices expuestas a sedimento de Arteaga y
Kanala, aunque presentaron algún síntoma de estrés, éste no fue demasiado elevado.
Otros logros de interés del proyecto
Dentro del proyecto se ha estrechado la colaboración con el grupo de investigación de
Dr. José María Navas perteneciente al Departamento de Medio Ambiente del INIA en
Madrid. Su experiencia en bioensayos con células transfectadas para la detección de
actividad estrogénica, redundará en una mejor comprensión de los mecanismos de
acción de los compuestos xenoestrogénicos en organismos acuáticos. Destacar
también, el hecho de que el CIFP-Zaporito junto con el CTAQUA de la Junta de
Andalucia se han mostrado muy interesados en los resultados de este trabajo. Esto
abrirá nuevas colaboraciones para futuros proyectos.
27
CONCLUSIONES
1- Se ha demostrado la presencia de efectos de disrupción endocrina en varias
poblaciones de mubles de los estuarios vascos. La estrategia basada en biomarcadores
tempranos de disrupción endocrina ha demostrado ser una herramienta rápida y
sensible para su aplicación en programas de seguimiento de la calidad de los medios
acuáticos. La combinación de medidas biológicas rápidas junto con la cuantificación de
niveles de contaminantes puede ayudar a interpretar los resultados obtenidos y poder
agilizar la toma de medidas correctoras.
2- El proceso de esteroidogénesis en mubles es similar al descrito para otros peces
teleósteos, lo que confirma su utilidad como modelo de organismo centinela de la
contaminación ambiental.
3- La exposición de alevines de muble a los efluentes finales de las EDAR de Galindo y
Gernika, ha demostrado la presencia de compuestos con actividad estrogénica en
estos efluentes. Estos resultados deberían servir de base para desarrollar nuevas
tecnologías que permitan la reducción en la actividad hormonal de los efluentes de
depuradoras de aguas residuales urbanas.
4- Los bioensayos basados en gusanos poliquetos del género Nereis, pueden ser una
herramienta muy útil para la evaluación de la toxicidad de sedimentos. La falta de test
basados en invertebrados hace que los resultados del presente proyecto sean muy
prometedores. De todas formas, este trabajo pionero necesita mayor estudio para la
optimización de protocolos que puedan estandardizase.
28
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO
En base a los resultados obtenidos y las conclusiones derivadas del presente proyecto,
se observa la necesidad de desarrollar un programa de seguimiento de efectos de
disrupción endocrina en nuestros estuarios y ecosistemas acuáticos. Esta
recomendación no está exclusivamente basada en lo detectado en el actual proyecto,
ya que en los proyectos URA10/02 y URA11/03 ya se llegó a unas conclusiones
similares. Parece claro que la presencia de compuestos disruptores endocrinos es
bastante amplia en la costa vasca y que las poblaciones de peces, mubles, que habitan
en las zonas impactadas muestran respuestas biológicas específicas de estrogenicidad.
En base a las recomendaciones de la DMA y de la Estrategia Marina Europea, para la
implementación de programas de monitoreo biológico para establecer la salud de los
ecosistemas acuáticos con el fin de conseguir una calidad y gestión del medio acuático
optimo, se propone incluir en los programas de seguimiento de calidad de las masas de
agua de la Comunidad Autónoma Vasca una serie de medidas para estudiar efectos de
disrupción endocrina. Esta implementación en los programas de seguimiento
convencionales se está debatiendo actualmente y en Suecia, la Agencia de Medio
Ambiente ya ha propuesto la inclusión de biomarcadores en sus programas de
seguimiento ambiental. Recientemente, la OMS ha sugerido también la necesidad de
prestar atención a la presencia de compuestos disruptores endocrinos en los
ambientes acuáticos. La organización ICES, que desarrolla tareas de seguimiento
ambiental en varias zonas costeras europeas, ya incluye la cuantificación de
vitelogenina en peces machos como biomarcador especifico de estrogenicidad.
Nuestra propuesta se basa de un seguimiento en dos etapas:
1- Recogida de muestras de plasma, bilis, hígado y gónada de mubles en zonas
seleccionadas de la costa vasca, en base a su contaminación histórica o a la sospecha
de la presencia de contaminantes emergentes. Estas muestras se almacenarían en el
Banco de Especimenes Biológicos de la Bahía de Bizkaia, PIE-UPV/EHU, hasta sus
29
análisis. En esta primera fase se analizarían los niveles de vitelogenina como
biomarcador de efectos estrogénicos. La cuantificación de vitelogenina podría hacerse
mediante detección de la proteína en el plasma de los mubles, utilizando un sistema
ELISA específico para el muble, o mediante la cuantificación de los niveles de
trascripción del gen de la vitelogenina en hígado. La elección de una u otra técnica
dependería de los recursos disponibles en cada momento. Junto con la cuantificación
de los niveles de vitelogenina, tambien se recomienda en este primer paso realizar un
estudio histológico de la gónada de los mubles para la detección de alteraciones tipo
intersex.
2- En base a los resultados obtenidos en la primera etapa, se procedería a una segunda
fase de análisis. Si se detectasen casos de disrupción endocrina en la etapa 1 y con el
fin de determinar el origen de los compuestos causantes de estos efectos, se
procedería a analizar las muestras de bilis y los niveles de expresión génica de genes
asociados con la esteroidogénesis y receptores de hormonas. Así, utilizando
herramientas analíticas se podrían detectar y cuantificar los niveles de contaminantes
en bilis. Junto con un estudio más completo de los genes esteroidogénicos en mubles
se conseguiría explicar el origen y causas de los efectos detectados, y desarrollar los
pasos para establecer las medidas correctoras necesarias.
Esta propuesta base se podría incluir perfectamente en los programas que están
actualmente en marcha, aprovechando el trabajo que se está desarrollando. Los
análisis de la etapa 1 pueden tener un coste aproximado de unos 1000-2000 euros
(excluyendo los costes de personal) para una sola población de estudio, compuesta por
unos 20-30 mubles. Los estudios de la etapa 2 serían más costosos y dependería
mucho del tipo de compuestos que quieran analizarse. Estos trabajos se deberían
llevar a cabo cada 3-4 años para poder estudiar la evolución de las poblaciones de
estudio.
Además de la propuesta de un programa de seguimiento específico de disrupción
endocrina en la costa vasca, y en base a los resultados obtenidos con los efluentes de
las EDAR estudiados, se propone implementar también este tipo de herramientas en
estrategias para la evaluación de zonas hot spot. Esto permitiría hacer un seguimiento
30
exhaustivo de zonas en la que existe la sospecha de impacto por disruptores
endocrinos.
31
PLAN DE FORMACIÓN, DIFUSION Y TRANSFERENCIA
Parte de los trabajos desarrollados han sido presentados en congresos científicos
internacionales:
- C. Bizarro, P. Aragon, A. Maquieira, M.P: Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia. “Purification
of Chelon labrosus egg-shell protein choriogenin and development of a specific
immunoassay (ELISA)” 28th Congress of ESCPB, Bilbao, 2012.
- C. Bizarro, P. Aragon, A. Maquieira, M.P: Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia.
“Characterization by histological and molecular tools of the reproductive cycle and
endocrine disruption effects on a thicklip grey mullet (Chelon labrosus) population from
the South Bay of Biscay” 28th Congress of ESCPB, Bilbao, 2012.
- I.M.K. Abumourad, C. Bizarro, P. Aragón, A. Maquieira, A. Vallejo, O. Zuloaga, M.
López de Alda, J.P. Bayona, D. Barceló, M.P. Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia. “A
biomarker and chemical approach for the study of endocrine disruption effects in
marine fishes using the sentinel species thicklip grey mullets (Chelon labrosus) from the
Basque coast (Bay of Biscay)” 28th Congress of ESCPB, Bilbao, 2012.
- C. Bizarro, P. Aragon, A. Maquieira, M.P: Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia.
“Development of histological and molecular tools to characterize endocrine disruption
effects on thicklip grey mullet (Chelon labrosus) populations from the Basque Coast”
XVII SIEBM, Donostia, 2012.
Parte de los resultados han sido enviados o están en preparación para su publicación
en revistas científicas internacionales:
- C. Bizarro, M.P. Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia “Histological and molecular
characterization of the reproductive cycle of Chelon labrosus from the Basque coast
(Bay of Biscay)” Marine Ecology Progress Series, en preparación.
32
- I.M.K. Abumourad, C. Bizarro, P. Aragón, A. Maquieira, A. Vallejo, O. Zuloaga, M.
López de Alda, J.P. Bayona, D. Barceló, M.P. Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia. “A
biomarker and chemical approach for the study of endocrine disruption effects in
marine fishes using the sentinel species thicklip grey mullets (Chelon labrosus) from the
Basque coast (Bay of Biscay)” Chemosphere, en preparación.
- A. Sardi, C. Bizarro, M. Ortiz-Zarragoitia, M. P. Cajaraville “Changes in P450 aromatase
activity and in transcription levels of steroid and phase II metabolism genes in female,
male and intersex gonads at different gametogenic stages of the thicklip grey mullet
Chelon labrosus” General and Comparative Endocrinology, en preparación.
En caso necesario, se prevé además la difusión de los resultados obtenidos en el
proyecto mediante su publicación en revistas de carácter divulgativo. Hemos recibido
contactos por parte de la revista de divulgación científica Elhuyar, para preparar un
artículo el próximo verano 2013. Recientemente parte de la actividad dentro de este
proyecto ha sido publicitado en la página web www.misPeces.com
En cuanto al carácter formativo del presente proyecto, destacar que el proyecto de
Master de la estudiante Adriana Sardi ha comprendido parte de los resultados del
presente proyecto. Este trabajo fue defendido en Septiembre de 2012 con la
calificación de sobresaliente y obteniendo el premio del Tribunal de Tesinas de Master
al mejor trabajo desarrollado:
A. Sardi “Changes in P450aromatase activity and in transcription levels of steroid
metabolism enzymes in female, male and intersex gonads at different gametogenic
stages of the thicklip grey mullet Chelon labrosus” Plentzia, 2012.
Además, dentro del presente proyecto de investigación la investigadora pre-doctoral
C. Bizarro está desarrollando gran parte de su Tesis doctoral realizando la
cuantificación de biomarcadores de disrupción endocrina en mubles.
Finalmente mencionar que nuestro grupo de investigación estaría dispuesto a
colaborar con las administraciones/gestores implicados en el desarrollo de un plan
33
específico de biomonitoreo de los efectos disruptores endocrinos en poblaciones de
peces de la costa vasca. Asimismo, también mostramos nuestra disposición a transferir
nuestra experiencia y conocimiento en la formación de personal cualificado para
realizar las tareas descritas en el presente proyecto.
34
TABLAS
Tabla 1. Resumen final de las concentraciones (en ng/l) de micro-contaminantes orgánicos (intervalo de concentraciones) en los efluentes de las dos plantas de tratamiento de aguas residuales (LOD = Límite de detección, ver tabla 2)
Familia Acrónimo Compuesto Gernika Galindo 4tOP 4-tert-Octylphenol 40-98 <LOD
NP mix Nonylphenols ( technical mixture) 110-185 90-127 Alquil
Fenoles 4nOP n-Octylphenol <LOD <LOD
HHCB Galaxolide 488-1330 1120-1657 Fragancias Musks
AHTN Tonalide 51-145 46-239
BBP n-butyl benzyl phthalate 380-1550 360-940
DEHP Bis (2-ethylhexyl) phthalate 982-23000 3000-8000
Ftalato
DOP Di-n-Octyl phthalate LOD-111 LOD-185
α-HCH α- Hexachlorobentzeno <LOD <LOD
β-HCH β- Hexachlorobentzeno <LOD <LOD
γ-HCH γ- Hexachlorobentzeno <LOD <LOD
δ-HCH δ- Hexachlorobentzeno <LOD <LOD
Chlorp. Chlorpyriphos <LOD <LOD
Chlorf. Chlorfenvinphos <LOD <LOD
2,4-DDD 1-chloro-2-[2,2-dichloro-1-(4chlorophenyl)ethyl]
<LOD <LOD
4,4-DDD 2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane <LOD <LOD
2,4-DDT 1-chloro-2-[2,2,2-trichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]
<LOD <LOD
Pesticidas
4,4-DDT 1,1’-(2,2,2-trichloroethylidene)bis[4-chloro]
<LOD <LOD
BPA Bisphenol-A 600-11064 270-9400
E2 17β-estradiol LOD-31 <LOD
Hormonas
EE2 17α-ethynilestradiol <LOD <LOD
35
Tabla 2. Concentraciones de micro-contaminantes orgánicos en los puertos estudiados
(campaña Mayo 2012 y campaña Octubre 2012).
Concentración (ng/l)
Gernika Pasaia Ondarru Mutriku
Límite de detección
(ng/l) BBP 19 20 16 20 8
DEHP 641 806 350 1595 32
DOP <LOD <LOD <LOD <LOD 20
HHCB 1528 144 81 82 9
AHTN 1089 586 40 37 17
alfa-HCH <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ 527
delta-HCH 321 <LOD 115 124 119
2,4´-DDD <LOD <LOD <LOD <LOD 8
4,4´-DDD <LOD <LOD <LOD <LOD 5
2,4´-DDT <LOD <LOD <LOD <LOD 9
4,4´-DDT <LOD <LOD <LOD <LOD 12
Clorpy <LOQ <LOQ 777 1598 123
Clorfen <LOQ <LOD <LOQ <LOD 36
Concentración (ng/l)
Gernika Ondarru Deba Santurtzi
Límite de detección
(ng/l)
BBP <LOD <LOD <LOD <LOD 38
DEHP nq nq nq nq
DOP <LOD <LOD <LOD <LOD 48
HHCB 227 34 44 23 12
AHTN 110 <LOD <LOD <LOD 34
alfa-HCH <LOD <LOD <LOD <LOD 64
delta-HCH <LOD <LOD <LOD <LOD 46
2,4´-DDD <LOD <LOD <LOD <LOD 3
4,4´-DDD <LOD <LOD <LOD <LOD 25
2,4´-DDT <LOD <LOD <LOD <LOD 10
4,4´-DDT <LOD <LOD <LOD <LOD 6
Clorpy 1213 <LOQ <LOQ <LOQ 51
Clorfen nq nq nq nq
4tOP 41 <LOQ <LOD 17 12
NP mix 75 <LOQ <LOD <LOD 45
4nOP 22 <LOD <LOD <LOD 15
36
Tabla 3: Niveles de metales en µg/g peso seco (media ± desviación estándar) de los
metales medidos en agua, sedimento y lombrices de las diferentes situaciones
experimentales. (d.l.d. indica valores por debajo del límite de detección)..
Cr Cu Fe Ni Pb Zn
Arteaga sed 46,31 31,79 38407,258 32,82 36,39 167,94
Kanala sed 36,55 26,31 26062,124 27,32 43,81 159,99
Nereis control 3,825±2,28 10,57±7,77 605,82±302,08 4,41±2,34 d.l.d. 209,51±91,87
Nereis Arteaga 19,87±23,52 d.l.d. 519,91±459,87 11,95±4,31 d.l.d. 235,46±199,153
Nereis kanala 8,49±6,37 4,68±2,25 568,73±315,43 4,86±3,23 d.l.d. 257,65±122,382
37
ANEXO IMÁGENES
Figura 1. Sistema experimental de calibrado de los sistemas de muestreo pasivo (para Twisters, tubos de silicona o PES) y el CFIS (de color azul)
38
Figura 2. Curvas de disipación del PRC (d6-fenantreno, arriba) y de acumulación de un analito (AHTN, tonalide, abajo).
39
Figura 3: Valores del índice gonado-somático (GSI) en los mubles de las poblaciones
estudiadas. F: hembras; I: intersex; M: machos.
40
Figura 4: Niveles de expresión en hígado de los mubles para vitelogenina cuantificados
mediante PCR a tiempo real (qPCR). F: hembras; I: intersex; M: machos.
41
Figura 5: Niveles de expresión en hígado de los mubles para vitelogenina cuantificados
mediante PCR a tiempo real (qPCR).
42
Figura 6: Niveles de expresión en cerebro de los mubles para aromatasa cyp19a2
cuantificados mediante PCR a tiempo real (qPCR)..
43
Figura 7: Relación entre la distancia de los tres primeros segmentos (L3) y el peso seco
de las lombrices. Los asteriscos indican diferencias significativas (p<0,05)..
0
2
4
6
8
10
12
T0 Arteaga Kanala
*
L3 (m
m)/
peso
fre
sco
(g)
44
Figura 8: Micrografías del tegumento y el tracto digestivo de lombrices en el tiempo 0
(A) y después de tres semanas exposición al sedimento de Arteaga (B y C) y Kanala (D).
Nótese la diferencia en la cantidad de cilios y la altura del epitelio del tegumento y la
presencia de células del sistema inmune en el celoma rodeando el epitelio digestivo.
Barra de escala 200 µm Ay c; 100µm B y D.
A B
C D