mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a scrapie · prp (prion protein) codificadas...

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Mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a

scrapie

Curso Terapia génica 08-09

Inmaculada Martín Burriel

Encefalopatías EspongiformesTransmisibles

• Especie humana:– Enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob(ECJ)

– Kuru– Insomnio Familiar

Fatal (IFF)– Gerstmann-Straussler-

Scheinker (GSS)

• Especies animales:– Encefalopatía

Espongiforme Bovina (EEB)

– Encefalopatía Transmisible del Visón

– Caquexia Crónica de ciervos (CWD)

– Scrapie de ovino y caprino

Introducción

2

Características EETs

• Enfermedades neurodegenerativas fatales• Origen:

– Genético: ECJ, IFF, GSS– Esporádico: ECJ– Infeccioso o transmitido: Kuru, EEB, scrapie,

nvECJ

Introducción

Agente causal infeccioso

Proteína Proteasa-sensible Proteína Proteasa-resistente

PrP (Prion Protein)

Codificadas por el mismo gen

Misma secuencia aminoacídica

Diferente conformación

PrPC PrPSc

Introducción

3

Características histopatológicas comunes

Vacuolización.Acumulación de PrPSc

Espongiosis

Muerte neuronal

Introducción

Muerte neuronal

• Muerte Celular Programada (Liberski et al.,2004)

– Apoptosis (MCP-I)– Autofagia (MCP-II)– MCP tipo III

• Se ha observado apoptosis en distintos modelos de EETs in vivo* e in vitro**.

• ¿Mecanismos moleculares? ¿Relación con las lesiones histopatológicas?

• Fairbairn et al., (1994)*• Giese et al., (1995)*• Gray et al., (1999)*• Forloni et al., (1993)**• Brown et al., (1996)**• O’Donovan et al., (2001)**

Introducción

4

Apoptosis

• Modificaciones morfológicas características

• No conlleva inflamación

• Requiere de la activación de genes específicos

Introducción

Cascadas moleculares de apoptosis

BAX

5

Vía mitocondrial• In vitro:

– Activación por péptidos PrP– PrPC homología de

secuencia con Bcl-2– PrPC inhibe la apoptosis

inducida por Bax• In vivo:

– Bax Bcl-2 (Park et al. 2000)

– = Bax = Bcl-2 (Siso et al., 2002)

– Tg enfermedad priónicaBax-/- muerte neuronal (Chiesa et al., 2005)

– Bax-/- + EEB = muerte n. (Coulpier et al., 2006)

www.sgul.ac.uk

Introducción

¿Qué ocurre en scrapie?

• Prototipo de enfermedad priónica de origen infeccioso

• ¿Hay cambios en la regulación de Bax o Bcl-2?• ¿Están relacionados con las lesiones de EETs?• ¿Están implicados otros miembros de la familia

de Bcl-2?– Bcl-x(L): neuroprotector in vitro en enfermedades

priónicas (Sakudo et al., 2003)

Introducción

6

Animales

• Ovino con scrapie (n=9)– Hembras– 3-5 años– Genotipo ARQ/ARQ– Rasa Aragonesa– Sintomatología clínica

• Ovino control (n=5)– Igual sexo, edad, genotipo y raza

Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirusanimales

Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)

Médula oblongada

• Núcleo motor del hipogloso (H)• Núcleo del tracto solitario (S)• Núcleo del nervio trigémino

(V,NV)• Núcleo cuneatus medial (ACN)• Núcleo de la oliva (IO)• Núcleo parasimpático del

nervio vago (MX)• Formación reticular (RF)

RF

RNA laterFijación

+Inclusión


7

Expresión génica• Marcadores apoptosis:

– Bax– Bcl-2

45605’-GCATTTGCGTGGACGAT-3’SYBRGREEN5’-ATGCCTCCTGCACCACCA-3’ACTB

40605‘-GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3‘VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC-TAMRA5‘-TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3' GAPDH

3560º5’-GGGTCGGGAGAGCGTAATTT-3’5’-FAM-TCCAAGGAAGGCAGCAGGCGC-TAMRA-3’5’-GGGAATGACGGTTCGATTCC-3’18SRNA

4063º5’-CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3’FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC-TAMRA

5’-GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3’Bax

40605’-TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3’FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TANRA5’-TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3’Bcl-2

CyclesTaPr. ReverseSondaPr. ForwardGen

• Factor Normalización*:– ACTB– 18SRNA– GAPDH

*Vandesompele et al. (2002)

Media geométrica

• Diferencias entre grupos:– T Student


Determinación IHQ• Marcadores de apoptosis:

– Bax (1:300; rabbit polyclonal P-19; Santa Cruz)– Bcl-2 (1:200; rabbit polyclonal; Upstate)

• Lesiones EETs:– PrPSc: L42 (1:500; R-Biopharm, Germany) – HE (vacuolización, espongiosis)

• Apoptosis:– Apoptag ® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit

(Chemicon International) – Caspasa-3 activa (1:40; mouse monoclonal Ab-4;

Calbiochem) Utilizada en la identificación de la apoptosis en Alzheimer (Stadelmann et al., 1999)

0-3


8

Análisis estadístico• Análisis no paramétricos:

– Diferencias entre grupos• Test Mann-Whitney

– Efecto del área• Test ANOVA Kruskal-Wallis• Test Mann-Whitney

– Relación entre valores de inmunomarcaje de Bax y lesiones histopatológicas

• Correlación de Spearman

• Test Chi cuadrado:– Relación Bax/Vacuolización (H, MX)


Resultados: Expresión génica

Control

Scrqpie

Control

Scrqpie

Control

Scrqpie

Aumento de la expresión del factor pro-apoptótico BAX en ovino infectado de forma natural con scrapie.


9

Resultados IHQ

Scrapie Control Scrapie

PrPSc H-E

Bax +

Bax -

- Sobre-expresión de Bax en neuronas de ovino con scrapie (Mann-Whitney U test p<0.001)- No hay un efecto significativo del área en la expresión de Bax- No se observan cambios en Bcl-2


Correlación Bax y PrPSc

• Correlación significativa entre Bax intraneuronal y depósito intraneuronal de PrPSc (rs=0.429; p<0.01 ) y en neuropilo (rs=0.297; p<0.05 )

• Efecto significativo de PrPSc en los valores de Bax (Kruskal-Wallis test p<0.01)

• Correlación entre Bax y las áreas de vacuolización (rs=0.362; p<0.05)

Bax y vacuolizaciónson procesos independientes


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Apoptosis

TUNEL

TUNEL:-Glías positivas en scrapie y control- No marcaje en neuronas

Caspasa-3

Caspasa-3Caspasa-3

CASPASA-3 ACTIVA:- Se observa en neuronas sin aspecto apoptótico tanto en scrapie como control- Glías apoptóticaspositivas en scrapie y control

No existen evidencias de apoptosis


Falta de evidencias de apoptosis

Poca densidadneuronal en la

médula oblongaday/o PrPSc

Bloqueo de apoptosis por vía

mitocondrial/ inducción otras

vías(Liberski et al., 2004)


11

Animales

• Ovino con scrapie (n=13)– Hembras– 3-5 años– Genotipo ARQ/ARQ– Rasa Aragonesa– Sintomatología clínica

• Ovino control (n=5)– Igual sexo, edad, genotipo y raza

Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirusanimales

Regiones del SNC

RNAIHQ

Basal ganglia

HippocampusCortex

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Expresión de Bax

• Cálculo del Factor de Normalización*:– Media geométrica de los 3 o 4 genes más

estables en cada área (Objetivo 4) *Vandesompele et al. (2002)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

Medula Obl. Diencéfalo Cerebelo Corteza AF

ControlScrapie

**

Determinación tisular Bax

CerebeloHipocampo

Hipotálamo Médula oblongada

-++++++

13

+/+++/++

+/++/+-/-+/++/++/++

++/+n.d.n.d.++/+++/+++/+SC90-248

+/+-/-+/++/+-/--/--/-+/+++/++++/++

++/++++/++/+-/-SC80-139

+/++/++/++/+-/--/--/-+/+-/-+/++++/++++/+++/++++/++SC70-138

+/+-/-+/+++/+

-/--/-+/+-/-++/+++/+++/+++++/+

++/++++/+SC60-122

++/+-/-+/++/+-/--/-+/+-/-+/+-/-++/++++/++

++/+++/+SC50-120

+++/+++/++/++/++/+

-/--/--/-+/+-/-++/+++/++

++/+++/+SC40-107

+++/++++/++++/+++

++/+

-/-+/++/+++/+

-/--/-+++/+++

+++/++

++/+++/+++SC30-86

++/+++/++/++/++/+

+/++/++/+++/+++/+++/++++/++++/++/+SC20-85

++/+++/++++/+++

++/+

+/+

+/++/+-/-++/+++/++

+++/+++

+++/++

++/++/++SC10-73

+/+-/-+/++/+-/--/--/--/-++/++++/++

++/+++/+++/++/+C40-442

+/+-/--/-+/+-/--/--/--/--/--/-+/+++/+n.d.n.d.C30-441

+/+-/--/-+/++/+

-/-+/++/+++/++/+++/+++/++/+-/-C20-439

+/++/++/+++/+

+/+

+/+++/+++/+++/++++/+++/+++/++

++/++++/++C10-438

PcOcFcCcCvWMGM

CoHHtTCortezaBgCerebeloPMoScAnimal

Marcaje intraneuronal

Gran variedad interindividual

Sobre-expresión de Bax IN

Correspondencia de Bax IN con las zonas donde se observa un mayor depósito de PrPSc pérdida acción neuroprotectora de PrPC

Causas de la muerte neuronal (Liberski et al.; 2004) :- Acción tóxica de PrPSc

- Muerte en zonas con poco depósito

- Pérdida de acción neuroprotectora de PrPC:

- Muerte en zonas con acumulación de PrPSc

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Apoptosis (caspasa-3)

No existen diferencias en scrapie y control

Gran variabilidad interindividual

Punteado fino en el citoplasma neuronal

Células de cerebelo con morfología apoptóticaNunca C. PurkinjesCerebelo Cerebelo

Cerebelo Médula espinal

Resultados similares en cerebelo de CJD (Puig y Ferrer, 2001)

Falta de evidencias de apoptosis

Poca densidadneuronal en la

médula oblongada/ PrPSc

Bloqueo de apoptosis por vía

mitocondrial/ inducción otras

vías


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Cascadas moleculares de apoptosis

BAXBCL2

BAK BAD

BCLXS

BCLXL

MCL1

AIF

APAF1

FASL/TNFα

FAS/TNFR1/TNFR2

TGF-β

PARP1

HSP70

HSP70

HSP90

HSP27

HSP70HSP90

HSP27

HSP70 HSP70

HSP90

HSP27

Expresión génica

40605‘-GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3‘VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC-TAMRA

5‘-TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3'Bak

45595‘-GGCTGTTAGCCAGTGCTTG-3'SYBRGREN5‘-CAGAGTTTGAGCCGAGTGAG-3' Bad

45605‘-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3'SYBRGREEN5‘-TCAGAGCTTTGAACAGGACACG-3'Bcl-xS

45605‘-TCCCGGAAGAGTTCATTCAC-3'FAM-CGACCTGACGTCCCAGCTCCACA-TAMRA5‘-CAGGCGATGAGTTTGAACTG-3'Bcl-xL

40605‘-GAGTCACAATCCTGCCCCAG-3'FAM-TCGAGTGATGGTTCATGTTTTCAGTGACG-TAMRA

5’-GGCTTTCCAAGGCATGCTT-3´Mcl-1

40635’-CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3’FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC-TAMRA

5’-GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3’Bax

40605’-TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3’FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TAMRA5’-TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3’Bcl-2

CTaPr. ReverseSondaPr. ForwardGen

Análisis mediante RT-PCR en Tiempo RealT Student

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Expresión de genes de apoptosis y gliosisMATERIAL Y MÉTODOSPCR a Tiempo Real DISEÑO DE CEBADORES Y SONDAS

Gen Número de acceso Cebadores y sondas (5’→ 3’) pb Tª (ºC)

TNF-α X56756 F: CCCTTCCACCCCCTTGTTCR: GGCTCTTGATGGCAGAGAGGAT 277 60

TNFR1 U90937 F: CTCAGGACCCAGGCACTACAGR: CCCGCAAATGATGGAGTAGAG 134 59

TNFR2 NM_001040490 F: GATGGGTCCTGTCTTGGTGTGTR: CAAAACAACAAGGGCTCCAGAA 144 60

FAS AB011671 F: CTGGAGCAAGTTCCTGCCAAR: CTCCGTCGCGTTTGCAAT 105 60

FASL XM_584322F: GAAGAGGAGGGACCACAACACAR: CTTTGGCTGGTGGACTCTCTGAS: FAM-TGGTGGCCCTGGTTGGATTGGG-TAMRA

147 61

TGF-β1 X76916 F: GCACGTGGAGCTGTACCAGAAR: GCCACTGCCGCACAACTC 125 60

AIF AF529274 F: TGGAGGCACAGCTGCTTTTR: CGGCAGCTCAGGATCTTCA 94 59

APAF1 XM_617966 F: GCCAAGCAGGAGGTCGATAAR: GCAAGCATGGTAAACAGCATCT 117 60

PARP1 D90073 F: AGTGAAGGCCACGATTGAGAAR: TCAGACACGACACGGATGTTG 147 59

Cálculo Factor de Normalización• Cálculo del Factor Normalización

*Vandesompele et al. (2002)

Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path)

Tyrosine 3-monooxygenase/ tryptophan 5-monooxygenaseactivation protein, zeta polypeptideYWHAZ

Succinate dehydrogenase complex, subunit ASDHA

Ribosomal protein L32RPL-32

Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1HPRT1

18S ribosomal RNA18S rRNAGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPD

Glucose-6-phosphate dehydrogenaseG6PDH

Beta actinACTB

NameSymbol

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Análisis GeNorm

GAPDHSDHASDHASDHA

rRNAHPRTHPRT RPL32

SDHARPL32RPL32rRNA

ACTBrRNArRNAG6PDH

YWHAZGAPDHACTBHPRT

HPRT YWHAZG6PDHYWHAZ

RPL32ACTBGAPDHGAPDH

G6PDH G6PDH YWHAZ ACTBMédula oblongadaCerebeloDiencéfaloCorteza Frontal

- Todos los HK mostraron valores de estabilidad M<1.5 (recomendado por Vandesompele et al. (2002))- GeNorm ordena los HK en función de su estabilidad


Análisis GeNorm

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Corte

xCo

rtex_

healt

hyCo

rtex_

scra

pie

Cere

bellu

mCe

rebe

llum

_hea

lthy

Cere

bellu

m_s

crap

ieM

.obl

onga

taM

.obl

onga

ta_h

ealth

yM

.obl

onga

ta_s

crap

ie

Thal

lam

usTh

alla

mus

_hea

lthy

Thal

lam

us_s

crap

ie

Valo

res

de V

n/Vn

+1

V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8

V: variación entre dos FN secuenciales

V>0.15 es necesario añadir un nuevo HK


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Series de HK

rRNAHPRTHPRT RPL32

SDHARPL32RPL32rRNA

ACTBrRNArRNAG6PDH

YWHAZGAPDHACTBHPRT

HPRT YWHAZG6PDHYWHAZ

RPL32ACTBGAPDHGAPDHG6PDH / GAPDHG6PDH /SDHAYWHAZ /SDHAACTB/SDHA

Médula oblongadaCerebeloDiencéfaloCorteza Frontal

Media geométrica FN


Medulla Oblongata

050

100

150

200

250BAD

BAKBAX *

BCL-2

BCL-XL

BCL-XS *

MCL-1 *AIF *

APAF1TNFa *TNFR1* TNFR2

* FAS

FASL

TGFB1

PARP1

HSP27

HSP72

HSP73HSP90

Diencephalon

Cerebellum

0

50

100

150

200

250

BADBAK

BAX

BCL-2 *

BCL-XL *

BCL-XS

MCL-1 *

AIF

APAF1 *TNFa

TNFR1TNFR2

FAS

FASL

TGFB1

PARP1

HSP27

HSP72

HSP73HSP90

Prefrontal cortex

0

50

100

150

200

250BAD

BAK *BAX

BCL-2 *

BCL-XL *

BCL-XS

MCL-1

AIF

APAF1TNFa

TNFR1TNFR2

* FAS

FASL

TGFB1

PARP1

* HSP27

HSP72

HSP73* HSP90

Perfiles de expresión génica de marcadores de apoptosis

0

50

100

150

200

250

BADBAK*

BAX*BCL2

BCL-XL

BCL-XS

MCL-1

AIF

APAF1TNFa

TNFR1TNFR2

*FAS

FASL

TGFB1

PARP1

HSP27

HSP72

*HSP73HSP90

-1

0

1

2

3

4

5

6

Priondeposition

Gliosis Spongiosis Neuronalvacuolization

0

1

2

3

4

5

6

Priondeposition

Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization

- Inducción de las vías mitocondrial y extrínseca- Cambios de expresión relacionados con gliosis- Efecto neuroprotector de Mcl-1 y Hsp70- Inducción de vías independiente de caspasas (AIF)

-10123456

Priondeposition

Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization -1

0123456

Priondeposition

Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization

- Inducción de distintos mecanismos de la vía mitocondrial- Efecto neuroprotector de Mcl-1- Facilitar la deposición temprana del prión (Hsp27, Hsp90)

ControlScrapie

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Conclusiones vía Mitocondrial

• En scrapie natural ovino se induce la expresión de Bax.

• La correlación de Bax con PrPSc indica que la inducción de Bax puede ser consecuencia de la pérdida de actividad neuroprotectora de PrPC

• El incremento de Bax no lleva asociada la detección de apoptosis no tiene un papel relevante en la inducción de apoptosis en scrapie ovino

Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res

Conclusiones vía mitocondrial

• La represión de Bcl-2 y Bcl-xL y el aumento de Bak y Bcl-xs pueden estar asociados a la neuropatología de scrapie

• Podría existir apoptosis independiente de caspasas

• Se observan mecanismos neuro-protectores (Mcl-1) que podrían ralentizar la apoptosis

20

9. El incremento de expresión de los factores TNF-α y TNFR2 en médula oblonga de ovino con scrapie natural se correlaciona con el alto grado de gliosisobservado en esta zona.

10. En los tejidos altamente lesionados, médula oblonga y diencéfalo, los factores involucrados en las vías de apoptosis mitocondrial (AIF) y extrínseca (TNF-α, TNFR2 y FAS) pueden participar en la pérdida neuronal descrita en estas áreas.

11. En el diencéfalo el abundante depósito de PrPSc induce la síntesis de miembros de la familia HSP70 que podrían actuar como factores neuroprotectores frente a la inducción de apoptosis por vía mitocondrial y extrínseca. En áreas menos afectadas como la corteza anterior frontal la reducción de HSP90 y HSP27 podría contribuir a la acumulación de proteína prión en estadios tempranos de scrapie.

12. El incremento de la expresión de Hsp90 en las células de Purkinje en animales con scrapie podría tener un efecto neuroprotector frente al estrés inducido por la proteína prión en cerebelo.

CONCLUSIONES VÍA EXTRÍNSECA y HSP

Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res

Trabajo futuro

• Confirmar la localización tisular de los miembros de Bcl-2 que han mostrado cambios significativos

• Determinación de factores que participan en las vías de apoptosis independiente de caspasas

• Aparición de estrés oxidativo en fases preclínicas (Yun et al., 2006): ¿La apoptosis también ocurre en estadíos tempranos asintomáticos?Análisis de ovino preclínico

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Equipo de Trabajo• Investigadores del Laboratorio de Genética

Bioquímica de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza– Dr. Jaber Lyahyai Lamarti– Dra. Carmen Serrano Calvo– Dra. Rosario Osta Pinzolas– Dra. Pilar Zaragoza Fernández

• Investigadores del Grupo de investigación en enfermedades priónicas y lentivirus– Dra. Rosa Bolea Bailo– Dra. Eva Monleón– Dr. Juan J. Badiola Díez

mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a scrapie · prp (prion protein) codificadas...

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