MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos

Todos los reactivos y disolventes que se utilizaron se adquirieron de las compañías

Sigma-Aldrich-Fluka y J.T. Baker

Para la síntesis de los precursores tipo diamina previamente obtenidos (2-(3-

((2-aminophenoxy)methyl)benzyloxy)benzenamine y la 2-(4-((2-

aminophenoxy)methyl)benzyloxy)benzenamine), se utilizó: 2-aminofenol-N-

protegido y α-α’dibromo-p-xileno. La amina utilizada para la formación del receptor

monocromofórico fue la 2-benciloxianilina. Para la síntesis de todos los receptores se

emplearon 1 y 2-naftilisocianato y diclorometano anhidro. También se emplearon

K2CO3 y NaOH (98%) como bases.

Por otro lado, se emplearon los siguientes disolventes: dimetilsulfóxido,

DMSO, (99.8%), acetonitrilo, CH3CN, (98%), alcohol etílico absoluto anhidro

(99.6%), diclorometano, CH2Cl2 (99.5%), dimetilformamida (DMF) (99.8%), acetona

(99%), así como los disolventes deuterados acetonitrilo (CD3CN) y dimetilsulfóxido

(DMSO-d6).

Los huéspedes que se utilizaron para reconocimiento molecular fueron los

siguientes aniones: F-, Cl-, Br-, AcO-, C6H5COO-, NO3-, HSO4

-, H2PO4- en su forma

de sales de tetrabutilamonio. De igual forma se prepararon los aniones de los

dicarboxilatos: oxalato, glutarato y suberato, utilizando para ellos los ácidos

correspondientes y el hidróxido de tetrametilamonio.

Equipos

Durante el desarrollo de la parte experimental se emplearon diversos equipos, los

cuales fueron de gran utilidad tanto en la purificación como en la caracterización de

los compuestos obtenidos.

Lámpara UV

Para monitorear las reacciones y confirmar la obtención de los productos se ut Esta

lámpara corresponde al lizo Cromatografía de Capa Fina utilizando una cámara

Spectroline modelo CM-10, que contiene una lámpara UV marca Spectroline modelo

ENF-260C de 115.

Punto de Fusión

Para la determinación del punto de fusión se utilizó el equipo Electrothermal con un

termómetro de mercurio con un rango de 0 a 400°C

Espectrofotómetro UV-Vis

Equipo de Ultravioleta-Visible marca, Agilent 8435 (Agilent Technologies) de

arreglo de diodos, equipado con lámpara de deuterio y de halógeno, con un intervalo

espectral de 187-1100 nm y celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico.

Espectrofotómetro de Emisión Electrónica Fluorescencia.

Equipo de fluorescencia marca Perkin Elmer L3 50B equipado con lámpara de xenón

para un intervalo de 187-900 nm y celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico. También

fue utilizado un equipo de fluorescencia Cary Eclipse Varian, en el Departamento

Química Inorgánica de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma

de México.

Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y 13C

Espectrómetro de RMN marcar Bruker modelo Avance 400 que opera a 400 MHz.

Espectrometría de Masas

Se empleó un equipo de espectrometría de masas de alta resolución JEOL JMS-700

con un modo de ionización positiva de bombardeo atómico acelerado (FAB+).

Programas

Para los ajustes por regresión lineal y no lineal por el método de mínimos cuadrados

se utilizó el programa Microcal Origin versión 8.0 de Microcal Software. Para

obtener los espectros correspondientes a RMN 1H y 13C fueron usados los equipos

MestReNova 6 y MestReC Lite 4. Además, para la representación de las nuevas

moléculas se utilizó el paquete Chem Bio Office Ultra 2010.

Técnicas Empleadas

Métodos Ópticos

La espectroscopia óptica ha sido la técnica más utilizada en los métodos

experimentales para las mediciones de constantes de asociación, particularmente la

técnica de absorción electrónica (UV-Vis) y emisión electrónica (fluorescencia), en

donde características de los espectros como la intensidad y posición espectrales son

sensibles al microambiente de los cromóforos o fluoróforos y es debido a esto que

pueden ser utilizadas para seguir el proceso de complejación

Todos los receptores poseen cromóforos que absorben a conocidas longitudes

de onda, lo cual los hace posible para utilizar algunas de estas dos técnicas.

Espectroscopia de absorción electrónica. La región ultravioleta visible es el

intervalo espectral donde operan las transiciones electrónicas que muestran gran

cantidad de moléculas orgánicas y también la de los compuestos inorgánicos. Esta

técnica se ha utilizado ampliamente en el análisis cuantitativo desde hace mucho

tiempo principalmente en la región del visible para compuestos coloridos. Las

mediciones mediante esta técnica se basan en la ley de Lambert-Beer que relaciona la

absorción de la radiación contra la concentración de un compuesto en disolución.

Estas relaciones vienen dadas para la absorbancia de A de una sustancia dada, por la

siguiente ecuación:

sclA ⋅⋅= λε (16)

Donde A representa la absorbancia, parámetro óptico adimensional que registra el

espectrofotómetro, l es el espesor de la celda (cm), c, es la concentración molar de la

sustancia y ελ el coeficiente de absorptividad molar (M-1·cm-1) a la longitud de onda a

la cual es realizada la medición (Skoog y Holler, 2001).

Los estudios de complejación mediante esta técnica consisten en obtener los

espectros del anfitrión y del huésped de forma independiente y del complejo en cada

punto de la titulación, tras la adición de microlitros de una solución concentrada del

huésped a una concentración fija del anfitrión, lo que da como resultado la

disminución o el incremento de la absorción de los máximos de absorción en el

anfitrión tras la adición del huésped y calcular la constante de asociación del

complejo, así como parámetros termodinámicos del proceso de reconocimiento

molecular (Turgut et al., 2004; Connors, 1987).

En los estudios de complejacion mediante esta técnica se puede obtener

información acerca de la composición de la solución y en consecuencia de la relación

estequiométrica. La información acerca del número de especies presente puede ser

obtenida del análisis de los espectros de las soluciones en donde en algunos casos

sucede la aparición de un punto isosbéstico, lo cual es indicativo de la presencia de

dos especies en equilibro y por lo tanto los espectros obtenidos a diferentes grados de

complejación deben pasar a través de ese punto. Aunque cabe mencionar que la

formación de más de dos especies con absortividades molares idénticas con la

observación de un punto isosbéstico no excluye la presencia de más de un equilibrio

1:1. Es por ello que en algunos casos las razones estequiométricas pueden ser

obtenidas mediante el método de Job (variaciones continuas), con lo que se determina

la estequiometria del complejo (Schneider y Yatsimirsky, 2000; Connors, 1987).

Una de las desventajas en la espectroscopia de UV-Vis para el estudio de

complejos supramoleculares se debe a que algunas veces los cambios inducidos por

complejación son pequeños. Sin embargo en algunos casos los cambios son grandes y

las moléculas empleadas pueden ser utilizadas como indicadores o sensores.

La ecuación utilizada para el cálculo de la constante de asociación para los

complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica UV-

Vis, es la siguiente:

[ ][ ]T

T

GK

GKAbsAbs

+⋅Δ=Δ

1 (17)

donde:

ΔAbs = Cambio de Absorbancia (Absorbancia substrato complejado– Absorbancia

del substrato libre)

ΔAbs∞ = Cambio de absorbancia máximo del receptor a saturación

X = Concentración del ligante

Estudios en solución mediante fluorescencia. Cuando compuestos

fluoróforos en disolución son excitados mediante radiaciones luminosas en la región

espectral del visible o del ultravioleta próximo, reemiten la energía recibida total o

parcialmente a modo de radiación fluorescente o fosforecente. De acuerdo a la ley de

Stokes, el máximo de emisión de un compuesto fluorescente se sitúa a una longitud

de onda mayor que la que corresponde al máximo de su banda de absorción. Cuando

la excitación cesa, la intensidad de la radiación emitida decrece exponencialmente.

Una relación consistente entre la intensidad de fluorescencia y la concentración del

fluoróforo es la siguiente (Lakowicz, 1999; Rouessac y Rouessac, 2003; Valeur,

2002; Skoog y Holler, 2001):

Absf II ⋅= ϕ (18)

Donde If es la intensidad de fluorescencia, φ es la eficiencia cuántica, la cual se define

como la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al

número total de moléculas excitadas e Iabs es la intensidad de la luz absorbida por el

fluorofóro. La ecuación anterior se puede expresar como un exponencial en función

de la absorbancia donde I0 es la intensidad de la luz proveniente de la fuente:

)/log( 00 AbsIIIA −= (19)

)101(0A

Abs II −−= (20)

Por lo que:

)101(0A

f II −−⋅= ϕ (21)

El término exponencial de la ecuación 20 requiere un desarrollo matemático

(serie de Mc Laurin) en donde se obtiene un término 10-A = 1-2.3 y junto con la ley

de Lambert-Beer se puede mostrar la siguiente ecuación:

bCII f εϕ 03.2 ⋅= (22)

La ecuación anterior demuestra que la concentración es directamente

proporcional a la fluorescencia, siendo posible lograr un intervalo de linealidad en

soluciones muy diluidas pero a altas concentraciones la fluorescencia tiene a saturar

debido a que la luz incidente no llega completamente al centro de la celda y no todas

las moléculas llegan a ser excitadas.

Por otro lado, la fluorescencia es mucho más sensible al microambiente del

soluto comparada con las mediciones realizadas mediante absorbancia. Aunque la

precisión de las mediciones fluorométricas son usualmente más bajas que las

mediciones de absorbancia debido a interferencias como impurezas o dispersión de la

luz por partículas de polvo que puedan encontrarse en la solución (Connors, 1987;

Schneider y Yatsimirsky, 2000; Skoog y Holler, 2001; Valeur, 2002).

La ecuación empleada para el cálculo de la constante de asociación para los

complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica de

fluorescencia es la siguiente:

XK

XKIII S

⋅+⋅⋅+

= ∞

1

(23)

donde:

Is = Intensidad del substrato libre

I∞ = Intensidad del substrato enlazado a saturación

X = Concentración del ligante

RMN de 1H

La RMN es una de las técnicas es una de las más importantes para los estudios de

complejación, ya que presenta las siguientes ventajas: En contraste con los métodos

de absorción y emisión electrónica, UV/VIS y fluorescencia, la RMN no está sujeta a

malas interpretaciones a causa de la presencia de impurezas. Por otro lado,

proporciona un gran número de señales independientes para la evaluación de los

equilibrios supramoleculares con valores de constantes que difieren por menos de

10% y precisiones de ±1%. Finalmente, proporciona información de la estructura del

complejo, es decir, permite determinar si la interacción del huésped con el anfitrión es

de asociación o bien de inclusión en una cavidad (Schneider y Yatsimirsky, 2000).

En cuanto a los estudios de complejación, el método cualitativo de estudio

consiste en obtener los espectros del anfitrión y del huésped en forma independiente,

y después del complejo formado a una concentración fija del anfitrión y del huésped.

Se obtienen los desplazamientos químicos de los protones del receptor en su forma

libre y los desplazamientos químicos de los protones del receptor como complejo (en

presencia de huésped). Finalmente estos últimos valores se emplean para calcular el

cambio de desplazamiento químico (Δδ = δsubstrato-complejado - δsubstrato-libre). Aquellos

protones que presentan el cambio más grande de desplazamiento químico

proporcionan información acerca de la estructura del complejo. Por otro lado,

también se espera que el receptor presente en general cambios más significativos de

los desplazamientos químicos de sus protones cuando esté en presencia de huéspedes

con los que tenga una mayor afinidad (Ochoa Lara, 2003).

La ecuación utilizada para el cálculo de la constante de asociación para los

complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica de

RMN de 1H, la cual considera el balance de masas, es la siguiente:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ]

⋅−

++−++

Δ+= ∞T

TTTTTT

Hobs H

GHK

GHK

GH 411

5.0

2

δδδ (24)

donde: δH= desplazamiento químico del protón

∞Δδ = cambio máximo de desplazamiento químico inducido por complejación

[ ]TG =Concentración total del huésped

[ ]TH =Concentración total del receptor

K=Constante de asociación

Síntesis de los Receptores Mono- y Bi-cromofóricos

Para la síntesis de los receptores bicromofóricos se hizo reaccionar las dos diaminas

previamente sintetizadas, con el 1 y el 2-naftilisocianato. Para el receptor

monocromofórico se utilizó la 2-benciloxilianilina y el 1 naftilisocianato. Las cinco

reacciones se utilizaron las mismas condiciones: como disolvente CH2Cl2 anhidro,

temperatura de reacción de 30 °C, atmósfera de nitrógeno y agitación constante por

aproximadamente 12 horas; en todos los casos, la obtención de producto se manifestó

por la formación de un precipitado. El avance de la reacción, así como la obtención

de los productos se monitoreo mediante cromatografía en capa fina (CCF), en la que

se observó la desaparición de la señal correspondiente a la materia prima y la

aparición de una nueva señal, propia de los productos. Posteriormente se procedió a

realizar la purificación.

Síntesis de los Receptores con Fluoroforo 1-naftil

Para la formación de la urea monocromofórica (1-B) el procedimiento fue el

siguiente: se colocó en un matraz de tres bocas de 100 mL a la 2-bencioloxianiliana

en CH2Cl2 anhidro, que se hizo reaccionar con 1-naftilisocianato disuelto de igual

forma en CH2Cl2 anhidro utilizando una estequiometria 1:1 y añadiendo un pequeño

exceso de este último (Esquema 1a).

Para la formación del receptor bis-urea bicromofórico (1-M, 1-P) se siguió el

procedimiento antes mencionado, siguiendo una estequiometría 1:2 con un pequeño

exceso del isocianato (Esquema 1b).

O

NH2

+

NCOCH2Cl2Ref lujo

ReceptorMonocromof órico

a)

O

NH2

+

CH2Cl2Reflujo

ReceptoresBicromofóricosO

H2N

=

m-xililen p-xililen

NCO

b)

Esquema 1. a) Síntesis de la urea monocromofórica 1-B; b) Síntesis de los receptores

bisurea bicromofóricos 1-M y 1-P.

Sintesis de los Receptores con Fluoroforo 2-naftil

Para la síntesis de estos dos receptores bicromofóricos (2-M y 2-P) se emplearon el 2-

naftilisocianato y las diaminas correspondientes. Siguiendo el procedimiento antes

mencionado, con una estequiometría 1:2 y con un pequeño exceso del isocianato

(Esquema 1b).

Espectroscopia de Absorción Electrónica (UV/Vis)

Cálculo de Coeficiente de Extinción Molar

Se prepararon soluciones madre de todos los receptores, a partir de la cual se

prepararon soluciones con una concentración de 1.063 mM en una mezcla de CH3CN:

DMSO (90:10) y se procedió a registrar los espectros a diferentes concentraciones de

todos los receptores. En una celda de cuarzo se agregaron 2.5 mL de la mezcla de

disolventes, tomándose una primera lectura. Posteriormente, se añadieron alícuotas de

10µL y se mantuvo en agitación por 5 minutos a 25 °C y pasados estos, se realizó la

primera lectura. La concentración final leída fue de 5.65 x10-5 M

Estudios de Complejación

Uv-Vis

Soluciones 1-B, 1-M y 1-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la

sección anterior, se consideró que la concentración adecuada del receptor 1-B para los

estudios en solución es 3.5x10-5 M; en el caso de los receptores 1-M y 1-P la

concentración a utilizar es 3.0x10-5 M. Se utilizó una mezcla de CH3CN:DMSO

(90:10).

Soluciones 2-M y 2-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la sección

anterior, se consideró que la concentración adecuada para ambos receptores fue de

1.0x10-5 M en una mezcla de CH3CN:DMSO (90:10).

Soluciones de aniones. Se prepararon soluciones madre 0.4 M en DMSO para

los aniones F-, HSO4-y H2PO4

- en formas de sales de tetrabutilamonio (TBA); a partir

de dichas disoluciones, se llevó a cabo una dilución con concentración final de 0.02

M en un sistema de disolventes CH3CN:DMSO (90:10). Para el anión acetato, se

preparó una solución 0.1 M en CH3CN:DMSO (90:10). Dichas disoluciones fueron

utilizadas para llevar a cabo las titulaciones frente a los receptores, como parte de los

estudios de reconocimiento molecular.

Las sales de los aniones dicarboxilatos fueron preparados in-situ, utilizando

los ácidos dicarboxílicos e hidróxido de tetrametilamonio (Me4NOH), la reacción se

realizó de la siguiente forma:

HOOC-R-COOH + Me4NOH = TMA-OOC-R-COO-TMA + H2O

Se prepararon disoluciones madres 0.2 M en DMSO para los aniones oxalato,

succinato, glutarato y suberato. A partir de dichas disoluciones, se llevó a cabo una

dilución con concentración final de 0.02 M en un sistema de disolventes

CH3CN:DMSO (90:10).

Titulación Espectrofotométricas

Cada una de las titulaciones fueron realizadas de la siguiente manera. En una celda de

cuarzo de 3 ml de volumen y 1 cm de paso óptico, se agregaron 2500 µL de los

receptores a una concentración definida. Se tomó un primer espectro, en ausencia del

huésped. Posteriormente, se adicionó una alícuota de una solución madre de un

huésped en específico. Para alcanzar el equilibrio, la solución en la celda se mantuvo

a agitación y temperatura constante por 5 minutos. En seguida se procedió a registrar

el espectro de absorción para este primer punto de la titulación. La variación del

volumen en la celda no fue mayor del 6% y la concentración máxima obtenida de los

huéspedes fue de 1.163 mM.

Fluorescencia

Con el fin de conocer la concentración adecuada de cada receptor para realizar

titulaciones, se prepararon soluciones madre 5.0 x10-5 M en CH3CN:DMSO (90:10)

de todos los receptores y se procedió a tomar los espectros a diferentes

concentraciones de todos los receptores. En una celda de cuarzo se agregaron 3 mL

de la mezcla de disolventes, tomándose una primera lectura. Posteriormente, se

añadieron diferentes alícuotas de 5µL de soluciones madre de cada receptor de

0.01063 M en una mezcla de disolventes CH3CN:DMSO (90;10), se mantuvo en

agitación por 5 minutos a 25 °C y pasados estos, se realizó la primera lectura.

Soluciones 1-B, 1-M y 1-P. De acuerdo a los espectros obtenidos de la

sección anterior, se consideró que tanto para el receptor monocromofórico, como para

los receptores 1-M y 1-P la concentración adecuada es 5.0 x10-7 M.

Soluciones 2-M y 2-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la sección

anterior, se consideró que la concentración adecuada para ambos receptores fue de

2.0 x10-7 M.

Soluciones de aniones. Se prepararon soluciones madre 0.02 M en

CH3CN:DMSO para los aniones Cl-, NO3-, HSO4

-, H2PO4- y AcO- en formas de sales

de tetrabutilamonio (TBA). Para el anión acetato, se preparó un disolución de 0.1 M.

Dichas disoluciones fueron utilizadas para llevar a cabo titulaciones, como parte de

los estudios de reconocimiento molecular.

Las soluciones de los aniones dicarboxilatos fueron preparados in-situ, como

se mencionó antes. Se prepararon disoluciones madres 0.5 M en DMSO para los

aniones glutarato y suberato. A partir de dichas disoluciones, se llevó a cabo una

dilución con concentración final de 0.02 M en un sistema de disolventes

CH3CN:DMSO (90:10). Para el anión oxalato se preparó una solución 0.5 M en un

mezcla de disolventes DMSO:H2O (50:50); a partir de esta, se hizo una dilución de

0.02 M en un sistema de mezclas de CH3CN:DMSO:H2O (96:2:2).

Titulaciones por Fluorescencia

Cada una de las titulaciones fueron realizadas de la siguiente forma: en una celda de

cuarzo de 3.0 ml de volumen y 1 cm paso óptico, se agregaron 2500 µL de los

receptores a una concentración definida. Se tomó un primer espectro, en ausencia del

huésped. Posteriormente, se adicionó una alícuota de una solución madre de un

huésped en específico. Para alcanzar el equilibrio, la solución en la celda se mantuvo

a agitación y temperatura constante por 5 minutos. En seguida se registró el espectro

de emisión para este primer punto de la titulación. La variación del volumen en la

celda no fue mayor del 6% y la concentración máxima obtenida de los huéspedes fue

de 1.084 mM.

RMN 1H

Los estudios realizados mediante esta técnica, no fueron realizados para todos los

receptores, ni se usaron todos los aniones. Solo se analizaron los receptores y aniones

que arrojaron resultados y cambios más notables, originados de los estudios mediante

fluorescencia y UV-Vis.

Para realizar los estudios de complejación mediante está técnica,

primeramente se preparó una solución madre de 24.3 mM en DMSO-d6 a partir de la

cual, se realizó una dilución con una concentración de 2.43 mM en CD3CN, de tal

manera que se obtuvó una mezcla final de CD3CN:DMSO-d6 en proporción 90:10. La

solución final, fue depositada en una celda para RMN, para llevar a cabo titulaciones.

Solución de aniones. Se prepararon disoluciones madre 0.4 M en

CD3CN:DMSO-d6 (90:10) para los aniones Cl-, Br-, NO3-, HSO4

-, H2PO4-, AcO- y

benzoato en formas de sales de tetrabutilamonio (TBA). A partir de estas soluciones

madres, se preparó una dilución 0.2 M en la misma mezcla de disolventes. Ambas

soluciones fueron utilizadas para llevar acabo titulaciones por RMN 1H.

Titulaciones por RMN 1H

Cada una de las titulaciones fue realizadas de la siguiente manera: en una celda para

RMN, se agregaron 500 µL de los receptores. Se tomó un primer espectro, en

ausencia del huésped. Las primeras dos adiciones del huésped específico se toaron de

la solución madre y las alícuotas posteriores, de la dilución. Para alcanzar el

equilibrio, la solución en la celda se mantuvo a agitación y temperatura constante por

5 minutos. En seguida se registró el espectro correspondiente tras esta adición. El

volumen en la celda varió un 10% y la concentración máxima presente de los

huéspedes fue de 35.4 mM.

Método de Job Este estudio, es utilizado para determinar la relación estequiométrica en la formación

del complejo. El estudio fue realizado por la técnica de RMN 1H utilizando el

receptor 2-M y el huésped acetato. Para lo anterior, se preparó una solución de 2-M

0.152 M en DMSO-d6 y una solución del huésped 0.083 M en DMSO-d6. Se

prepararon 8 muestras, donde la fracción molar de ambas especies fue variando y

siempre procurando que el volumen total final fuese de 500 µL y la mezcla de

disolvente final resultase ser CD3CN:DMSO-d6 (90:10). Las adiciones fueron

realizadas como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Experimento Job: 2-M y acetato.

2-M, mM

Acetato, mM

Adición 2-M (μL)

Adición Acetato

(μL)

DMSO-d6 (μL)

Adición DMSO-d6

(μL)

Adición CD3CN

(μL)

X anfitrión

7 0 23.02 0 23.02 26.98 450 1 6 1 19.73 6.03 25.76 24.25 450 0.86 5 2 16.45 12.06 28.5 21.5 450 0.715 4 3 13.15 18.09 31.24 18.76 450 0.571 3 4 09.87 24.12 33.99 16.00 450 0.423 2 5 06.59 30.15 36.74 13.26 450 0.285 1 6 03.29 36.18 39.47 10.53 450 0.143 0 7 0 42.21 42.21 7.80 450 0