manual nmp

ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS PROBABLE EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.

MANUAL ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS 226

Materiales & Equipos:

• Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.) • Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro) • Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl • Micropipetas de 20 µl • Puntas para micropipeta • Incubadora a 25°C • Vortex

Metodología 1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios

lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas. 2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células

podrán ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.

3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.

4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inculado:

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

EL NUMERO MAS PROBABLE 227

5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución:

6. Permita que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con una tirilla de parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.

7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en ascendencia evalúe el crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica inoculada. Reporte los resultados como se indican en el ejemplo a continuación:

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Diluciones 10-3 - 10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0 Datos & Análisis: Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216) como el resultado más apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección de volumen (ver nota Tabla 1) por el recíproco del factor de dilución menor inoculado en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108 células/g de suelo). A continuación un ejemplo


COMO LEER LOS RESULTADOS DEL NMP

A. Organizar la data en forma de tabla donde cada columna representa una dilución y cada fila representa una replica.

Negro = positivo, Blanco = negativo

B. Determinar el numero de tubos positivos por dilución

# de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 2 1 0

C. Identificar la dilución mas alta con menos de 5 positivos pero que no sea 0. D. A partir de la dilución que identificó en el paso anterior anote el número de

positivos de las diluciones a la izquierda dependiendo de la tabla de NMP que este utilizando (en nuestro caso son 6 diluciones) Este número será el que usted buscará en la tabla de NMP para obtener la densidad aproximada.

# de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 2 1 0

E. Calcule la densidad del cultivo utilizando la siguiente ecuación:

!

Densidad =#valor de la tabla* "

1

Factor de dilución

#

$ %

&

' (

**

"volumen de la tabla

volumen de inóculo

#

$ %

&

' (

***

*Se obtendrá del código numérico derivado en el paso D **Se obtendrá de la dilución mas concentrada en su código numérico ***Esto es un factor de corrección en el caso de que el volumen de inóculo sea distinto al de la tabla.


En el caso del ejemplo anterior utilizamos 0.1 ml de inóculo y la tabla de NMP es de 1.0 ml. Entonces tendremos:

!

Densidad = 69,148 "1

10#3

$

% &

'

( ) "

1.0 ml

0.1ml

$

% &

'

( )

Densidad= 6.9x108 células/ml


Tabla 1. El número más probable para series de diluciones en réplicas de cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994)*.

Núm. Respuestas Pos. por Nivel de

Dilución

Población estimada

Núm. Respuestas Pos. por Nivel de

Dilución

Población estimada

1-2-3-4-5-6 1-2-3-4-5-6 1-0-0-0-0-0 1-1-0-0-0-0 2-0-0-0-0-0 2-1-0-0-0-0 3-0-0-0-0-0 3-1-0-0-0-0 3-2-0-0-0-0 4-0-0-0-0-0 4-1-0-0-0-0 4-2-0-0-0-0 4-3-0-0-0-0 5-0-0-0-0-0 5-0-1-0-0-0 5-1-0-0-0-0 5-1-1-0-0-0 5-2-0-0-0-0 5-2-1-0-0-0 5-3-0-0-0-0 5-3-1-0-0-0 5-3-2-0-0-0 5-4-0-0-0-0 5-4-1-0-0-0 5-4-2-0-0-0 5-4-3-0-0-0 5-5-0-0-0-0 5-5-0-1-0-0 5-5-1-0-0-0 5-5-1-1-0-0 5-5-2-0-0-0 5-5-2-1-0-0 5-5-3-0-0-0 5-5-3-1-0-0 5-5-3-2-0-0 5-5-4-0-0-0 5-5-4-1-0-0

1.9 4.0 4.4 6.8 7.7 10 13 12 16 21 27 23 31 33 45 49 69 78 107 138 127 169 216 270 230 312 327 453 488 692 780

1070 1383 1275 1690

5-5-4-2-0-0 5-5-4-3-0-0 5-5-5-0-0-0 5-5-5-0-1-0 5-5-5-1-0-0 5-5-5-1-1-0 5-5-5-2-0-0 5-5-5-2-1-0 5-5-5-3-0-0 5-5-5-3-1-0 5-5-5-3-2-0 5-5-5-4-0-0 5-5-5-4-1-0 5-5-5-4-2-0 5-5-5-4-3-0 5-5-5-5-0-0 5-5-5-5-0-1 5-5-5-5-1-0 5-5-5-5-1-1 5-5-5-5-2-0 5-5-5-5-2-1 5-5-5-5-3-0 5-5-5-5-3-1 5-5-5-5-3-2 5-5-5-5-4-0 5-5-5-5-4-1 5-5-5-5-4-2 5-5-5-5-4-3 5-5-5-5-4-4 5-5-5-5-5-0 5-5-5-5-5-1 5-5-5-5-5-2 5-5-5-5-5-3 5-5-5-5-5-4

2159 2716 2305 3126 3282 4532 4922 6918 7797

10702 13826 12753 16902 21589 27150 23054 31225 32720 45261 49224 69148 78127

107022 138269 127528 169028 215899 271557 334051 230546 328192 492238 781272 1312535

*Esta es la densidad poblacional estimada asumiendo 1 ml de inóculo. Este valor debe ser ajustado por el factor de dilución y el volumen de inóculo (por ejemplo, si usted inoculó en cada placa un volumen de 10 µl, entonces el valor de la tabla debe ser corregido multiplicándolo por 100 [10 X 100 = 1,000 µl ó 1 ml]).


Observaciones:

1. ¿Qué tiempo de incubación de sería el más apropiado? 2. ¿Cuáles son algunas desventajas del método de NMP? 3. ¿Qué otras aplicaciones tiene este método? 4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta 10-6 de una muestra de

una laguna usted obtuvo un patrón de respuestas positivas 5-5-4-3-1, ¿Cuál es la densidad poblacional en la laguna?

5. ¿Qué tendría usted que hacer si luego de incubar los resultados son 5-5-5-5-5-

5?

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