manual de prÁcticas del curso diagnÓstico molecular

MANUAL DE PRÁCTICAS DEL CURSO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

_______________________________________________________________________________ Alvarado-Gómez, O.G. 2009 2

CONTENIDO

Pág.

Presentación .......................................................................................................... ….3

Requerimientos de un laboratorio de Diagnóstico Molecular ......................................4

Práctica 1. Extracción de ácido desoxiribonucleico.....................................................6

Práctica 2. Electroforesis en geles de agarosa .........................................................10

Práctica 3. PCR Universal para Eucariotes y Plantas ...............................................12



REQUERIMIENTOS DE UN LABORATORIO

DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

1. Materiales

bata

cajas criogénicas para tubos de 1.5 ml

cristalería (probetas, vasos de precipitado y matraces)

gradillas

guantes de latex

papel absorbente

papel dextrasa

parafilm

puntillas de 10, 200 y 1000 µl

hielera

hielo (de preferencia frapé),

marcador para vidrio

morteros y pistilos

pipetas de 10 ml

tubos de 200, 500 y 1500 µl

2. Equipo

autoclave

cámara fotográfica instantánea blanco y negro/cámara digital y filtro naranja

cámara de electroforesis horizontal

campana de flujo laminar ó una estación de trabajo para PCR (no indispensable)

centrifuga ó microcentrifuga (de preferencia refrigerada)

congelador de –20ºC

espectrofotómetro (no indispensable)

flurómetro (no indispensable)



fuente de poder

horno de microondas ó una plancha con calor

máquina para fabricar hielo frapé//trituradora de hielo (no indispensable)

micropipetas (P2, P20, P200, P1000)

refrigerador 4ºC

termociclador

transiluminador con luz ultravioleta

ultracongelador (-70°C)

vortex

3. Reactivos

ácido bórico

alcohol isopropílico

agarosa

agua mili-Q

azul de bromofenol

bromuro de etidio

cloroformo ó bromocloropropano

desoxinucleósidos trifosfatados (individuales ó una mezcla)

EDTA

enzima M-MLV

etanol

kit para extracción de ADN (DNAzol por ejemplo)

kit para extracción de ARN (RNAzol por ejemplo)

marcador de peso molecular

MgCl2

primers o iniciadores universales y específicos

Taq ADN polimerasa u otra polimerasa

trisma base

xilencianol



PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO

DESOXIRIBONUCLEICO (ADN)

INTRODUCCIÓN

El aislamiento de ADN de las muestras a analizar, es generalmente el primer paso en

cualquier manipulación de ácidos nucleicos in vitro. El ADN no existe en forma natural

como una molécula libre, sino que se encuentra asociada con proteínas, ARN, y están

rodeadas de membranas celulares (nucleares y citoplásmicas) y en ocasiones de

pared celular, por lo anterior, el aislamiento de ácidos nucleicos en ocasiones puede

dificultarse. En general, la mayoría de los procedimientos consisten de tres pasos

principales: 1) el rompimiento de las paredes y membranas celulares con el fin de

liberar los complejos ADN-proteína (cromatina); 2) la solubilización y disociación de

estos complejos por medio de surfactantes o agentes desnaturalizantes y 3) la

separación del ADN de otras macromoléculas.

Los métodos de extracción de ADN disponibles son muchos y muy variados,

aquí presentamos sólo uno de ellos el cual está basado en un kit comercial y se

caracteriza por ser rápido, sencillo y versátil.

OBJETIVO GENERAL

Realizar un diagnóstico sobre la ubicación taxonómica, en los niveles superiores

(eucariotes y reino vegetal), de algunas muestras biológicas diversas aplicando

técnicas basadas en la amplificación enzimática de ADN.



OBJETIVO ESPECÍFICO

Aplicar un protocolo de extracción de ADN utilizando un kit comercial en muestras

genéticamente distantes y diversas como plantas, animales y microorganismos.

MATERIALES

Se requieren organismos vegetales (plantas ó vitroplantas), animales (superiores,

insectos) y microbianos (hongos y bacterias).

Equipo y material de laboratorio:

Microcentrifuga

Micropipetas de 20, 200 y 1000 µl

Tubos de centrifuga de 200 µl y 1.5 ml

Puntillas de 200 y 1000 µl

Guantes de latex

Pistilos

Reactivos y soluciones:

Plant DNAzol (Molecular Research Center)

Cloroformo

Etanol absoluto y solución al 80% (v/v)

Solución amortiguadora TE (Tris 100 mM, EDTA 1 mM)



MÉTODOS

Extracción de ADN por el método del Plant DNAzol (MRC).

Después de haber realizado la colecta del material biológico a utilizar, colóquese un

par de guantes de latex durante todo el proceso de extracción y realice los siguientes

pasos:

1. Pesar 0.1 g de tejido y colocarlo en un tubo de centrifuga nuevo y estéril de 1.5 ml.

Triture el tejido con un pistilo estéril y agregue 0.6 ml del reactivo Plant ADNzol ES y

mezcle la solución en vortex y posteriormente deje reposar durante 5 min a

temperatura ambiente.

2. Agregue 0.6 ml de cloroformo, mezcle vigorosamente y deje reposar por otros 5

min a temperatura ambiente. Centrifugue a 12,000 x g durante 10 min y transfiera el

sobrenadante o fase acuosa, en un tubo de centrifuga nuevo de 1.5 ml.

3. Precipite el ADN mezclando la fase acuosa con 0.75 volúmenes de alcohol etílico

absoluto mezclando las muestras por inversión de los tubos 8 veces y almacénelos a

temperatura ambiente durante 5 min. Precipite el ADN centrifugando a 5,000 x g por 4

min.

4. Prepare una solución de lavado con DNAzol-etanol mezclando un volumen de

DNAzol con 0.75 volúmenes de etanol absoluto. Después de decantar, mezcle 0.6 ml

de la solución anterior con el ADN precipitado. Almacene las muestras durante 5 min

y centrifugue a 5,000 x g por 4 min.

5. Remueva la solución de lavado y lave la pastilla de ADN mezclando vigorosamente

con 0.5 ml de etanol al 80% seguido por una centrifugación de 5,000 x g durante 4

min.



6. Remueva el etanol por decantación y coloque los tubos invertidos en posición

vertical en una sanita estéril por 1-2 min para secar la pastilla de ADN. Disuelva la

pastilla de ADN en 25 µl de buffer TE (pH 8.0) y almacene a -20°C hasta su

utilización.

Determinación de la cantidad y calidad de ADN.

Se pueden utilizar dos métodos para determinar la concentración y calidad de ADN:

por espectrofotometría y por comparación con un indicador de concentración

conocida, en un gel de agarosa. En el primer caso se coloca 1 ml de amortiguador TE

1X en una celda para UV, se calibra a cero el espectrofotómetro y se añade 1 µl de

muestra y se mezcla bien por inversión. Se toman las lecturas de absorbancias a 260

y 280 nm y se calcula la concentración de ADN con la siguiente fórmula:

Concentración ADN (ng/µl)=(factor de dilución)(50)(lectura 260 nm)

Volumen total de la celda

Factor de dilución=

Volumen de la muestra

La calidad del ADN se determina dividiendo la lectura obtenida (absorbancia) a 260

nm entre la lectura a 280 nm. Un ADN de buena calidad deberá tener un valor entre

1.8 y 2.0.

El otro método, basado en una comparación entre el ADN obtenido y un ADN de

concentración conocida, requiere la preparación de un gel de agarosa al 1% y la

separación del ADN por electroforesis (ver práctica 2).



(A) (B)

Figura 1. ADN y marcador cuantitativo de concentración. A) ADN obtenido a partir de

ápices y tubérculos de papa. La flecha señala la posición del ADN en el gel

de agarosa al 1%. B) Escala cuantitativa para la estimación de ADN

usando la escalera de masas (Gibco, BRL).

BIBLIOGRAFÍA

Molecular Research Center. 2001. DNAzol®ES. Manufacturer Protocol.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press.



PRÁCTICA 2. ELECTROFORESIS EN GELES

DE AGAROSA

INTRODUCCIÓN

Gracias a la capacidad de las moléculas de adquirir carga, es posible separarlas

cuando se les somete a la influencia de un campo eléctrico. Esta capacidad se

debe a la presencia de grupos con carga positiva o negativa. Cuando las

moléculas con carga en solución negativa como el ADN se someten a una

diferencia de potencial, emigran hacia el ánodo (+). La velocidad de migración

depende de muchos factores como son: el tamaño y carga neta de la molécula,

pureza de la agarosa, voltaje aplicado y buffer de corrimiento. La agarosa es un

polímero que se extrae de un alga marina.

OBJETIVO GENERAL





Observar la calidad y cantidad de ADN obtenido en la práctica de extracción, así

como la visualización de los productos de amplificación por PCR de las muestras

analizadas.



MATERIALES

Reactivos y Equipo

agarosa

agua destilada

buffer TBE

buffer de carga (0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de xilencianol y 30% de

glicerol en agua)

bromuro de etidio

cámara de electroforesis

fuente de poder

transiluminador de luz UV

micropipetas

marcador de peso molecular

MÉTODOS

Procedimiento

Diluir una cantidad adecuada de solución TBE 5X a 0.5X la cual se usará en la

preparación del gel y en el corrimiento.

1. Ensamblado del aparato. Coloque el recipiente plástico adentro de la

estructura, y el molde formador del gel en el centro del recipiente. Selle el

molde colocando un trozo de cinta adhesiva (masking tape) en ambos

extremos, y coloque el peine en la posición deseada.

2. Preparación del gel. Prepare un gel de agarosa al 1% (ó a la

concentración requerida) agregando 0.4 g de agarosa a 40 ml de buffer

TBE 0.5 X (o las proporciones equivalentes). Disuelva la agarosa en el

buffer calentando en el horno de microondas mezclando ocasionalmente

hasta hervir. Enfríe la solución hasta 50°C y agregue 2 µl de una solución

de bromuro de etidio (10 mg/ml). Vierta la solución de agarosa en el molde

formador y deje enfriar hasta su solidificación.



3. Electroforesis. Remueva la cinta selladora del molde y retire el peine.

Vierta de 100 a 150 ml de buffer TBE 0.5X hasta cubrir 1 ó 2 mm por

encima del gel. Cargue las muestras en el fondo de los hoyos dejados por

los dientes del peine mezclando 5 µl de muestra con 1 µl de colorante azul

naranja. Cierre la cubierta y conéctela a la fuente de poder. Encienda la

fuente de poder hasta 64 volts dejando 5 minutos para luego subir a 100 V

por 30 minutos adicionales. Apague la fuente de poder y desconecte los

cables.

4. Observación del gel en luz UV y fotografía. Visualice el gel en el

transiluminador de luz UV. Evite la exposición directa de los ojos y la piel

utilizando la protección adecuada. Para documentar los resultados

anteriormente se utilizaba una cámara fotográfica instantánea con película

667 utilizando un filtro naranja, pero actualmente puede realizarse con

cualquier cámara digital ó un fotodocumentador de geles.

BIBLIOGRAFÍA

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press.



PRÁCTICA 3. PCR UNIVERSAL PARA EUCARIOTES

Y PLANTAS

INTRODUCCIÓN

Los organismos de las diferentes ramas evolutivas provienen de ancestros

comunes de los que han ido divergiendo para progresivamente formar los grupos

que actualmente conocemos como reino, división, clase, orden, familia, género,

especie, variedad, etc. Entre los organismos existen secuencias de ADN

homólogas las cuales han sido conservadas durante el proceso evolutivo y

denotan orígenes comunes. Esta homología ha sido la base para los estudios

taxonómicos, filogenéticos y evolutivos, así como para el diseño de primers

capaces de unirse a secuencias de ADN de organismos aparentemente distantes.

Los genes de los ARN ribosomales eucariotes 18S, 5.8S y 28S son fácilmente

aislados ya que son moderadamente repetitivos y son un atractivo blanco para los

ensayos de PCR. Las secuencias de estos genes ribosomales se encuentran

altamente conservadas y están separadas por dos espacios transcritos internos ó

ITS las cuales son regiones variables entre organismos. Las secuencias más

conservadas se utilizan para la clasificación de niveles taxonómicos superiores (de

género a división), mientras que las secuencias ITS se utilizan a nivel de especie ó

inferior.

OBJETIVO GENERAL







Amplificación in vitro de ADN de muestras vegetales, animales y microbianas

utilizando primers universales y genéricos.

MATERIALES

Consumibles, reactivos y equipo

Tubos de centrifuga de 0.5 y 0.2 ml

Puntillas para micropipeta

Micropipetas

ADN molde

Buffer de PCR

MgCl2

Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTP’s)

Oligonucleótidos sintéticos (primers)

Taq ADN polimerasa

Agua grado Mili-Q (18 mohms, libre de nucleasas)

Termociclador

Se realizarán un número variable de reacciones de PCR utilizando el ADN

obtenido por los estudiantes en la práctica anterior, además de un testigo negativo

(sin ADN) siguiendo el procedimiento descrito a continuación. En los siguientes

pasos observe las siguientes recomendaciones: para evitar contaminar las

soluciones, asegúrese cambiar la puntilla de la micropipeta cada vez,

asegurándose de no rozar la puntilla con ningún objeto, evitar movimientos

bruscos que produzcan corrientes de aire. Evite platicar, estornudar ó cualquier

acción que produzca aerosoles. Las soluciones que van a trabajar son muy

delicadas, así que no olvide mantenerlas siempre en hielo.

En un tubo de centrifuga de 0.5 ml se preparará un coctel (mezcla) con los

siguientes reactivos en solución:



Reactivo/solución Cantidad unitaria

(µl)

Volumen

total (µl)

Concentración

final

Buffer de PCR 5X 5 1X

MgCl2 25 mM 2 2.5 mM

dNTP’s (2.5 mM) 2 0.2 mM

Primer antisentido (10 µM) 2 20 pmoles

Primer sentido (10 µM) 2 20 pmoles

Go Taq DNA polimerasa (5u/µl) 0.2 1 unidad

Agua grado Mili-Q 9.8 25 �L

Mezclar el coctel y distribuir 23 µl de la mezcla en tubos de 0.2 µl. Agregar 2 µl de

ADN. Mezclar y dar un “golpe” de centrifuga en caso de ser necesario. Colocar las

muestras en el termociclador con los programas ITS y Plantas.

Los primers que se utilizarán y sus secuencias son las siguientes:

a) 16S-anti/16S-sen

b) ITS-1/ITS-2 (Nazar y cols., 1991)

Nombre del primer Secuencia Blanco C015-04 (ITS-1) 5’-caa ggt ttc cgt agg tg-3’ Eucariotes C021-01 (ITS-2) 5’-cgc tta ttg ata tgc tt-3’ Eucariotes 16S sentido 5’-tga gaa tgg ata aga ggc tc-3’ DNA cloroplasto 16S antisentido 5’-tgt tgt tcc cct ccc aag gg-3’ DNA cloroplasto

El programa térmico ITS consiste en lo siguiente:

94ºC 1 minuto

94-48-74 durante 30”-50”-80” 34 ciclos

74ºC 4 minutos

El programa térmico Plantas consiste en lo siguiente:

92ºC 1 minuto

92-60-74 durante 60”-20”-30” 35 ciclos

74ºC 4 minutos



Al término de la reacción (2 horas 3 min/1 hora 35 min), se carga un gel de

agarosa al 1% previamente teñido con 0.5 µg µl-1 de bromuro de etidio, con 10 µl

del producto amplificado (incluyendo el testigo negativo) y un marcador de peso

molecular (ladder 100). El fragmento esperado es de 330 pb para Plantas y 690

para ITS. Se observa el resultado en un transiluminador de luz UV y se toma una

fotografía.

BIBLIOGRAFÍA

Nazar, R.N., X. Hu, J. Schmide, D. Gelham, and J. Robb. 1991. Potential use of

PCR amplified ribosomal intergenic sequences in detection and differentiation

of Verticilum wilt pathogens. Physiol. and Mol. Plant Pathol. 39:1-11.

manual de prÁcticas del curso diagnÓstico molecular

Documents