MANUAL DE LABORATORIO

CURSO-TALLER:

Diagnóstico de laboratorio de infecciones y enfermedades causadas por Clostridium difficile

ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA UNAH | LIBA | UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

MANUAL DE LABORATORIOCURSO-TALLER: Diagnóstico de laboratorio de Infecciones y enfermedades causadas por Clostridium difficileESCUELA DE MICROBIOLOGÍA – UNAHFACULTAD DE MICROBIOLOGÍA LIBA – UCR2014

PERÍODO 1: Lunes 29 de septiembre

Detección de toxinas A/B de C. difficile en heces para diagnóstico clínico

La prueba C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®  (Techlab) es un cartucho rápido que detecta simultáneamente el antígeno del glutamato deshidrogenasa (GDH) y las toxinas A y B de C. difficile en muestras de heces. La prueba detecta el antígeno de C. difficile, GDH, para determinar su presencia y confirma el hallazgo de la variedad toxígena de C. difficile mediante la detección de las toxinas A y B en muestras de heces de personas con posible enfermedad por C. difficile. Esta prueba se utiliza como ayuda para diagnosticar la enfermedad por C. difficile.

El valor predictivo negativo para la parte de la toxina en comparación con el cultivo de citotoxicidad es del 98,1%.La sensibilidad de la toxina es del 87,8% en comparación con el cultivo de citotoxicidad, en tanto que la especificidad de la toxina es del 99,4% en comparación con el cultivo de citotoxicidad.

Trabajo en 4 – 6 grupos

Procedimiento:

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregar 750 µl de diluente y 1 gota de conjugado.

2. Adicionar a esta mezcla 25 µl de la muestra de heces.

3. Agitar vigorosamente.

4. Transferir 500 µl lentamente de esta mezcla al orificio pequeño en la esquina superior derecha del cartucho de detección.

5. Dejar reposar por 15 minutos a temperatura ambiente.

6. Agregar 300 µl del buffer de lavado en la ventana de detección (grande) del cartucho.

7. Esperar que todo el buffer se absorba.

8. Adicionar 2 gotas de sustrato a la ventana de detección (grande) del cartucho.

9. Dejar reposar 10 min a temperatura ambiente.

10. Leer el resultado. Deben aparecer los 3 puntos en el centro ya que es el control interno.

Antígeno positivo

Toxinas negativa

Antígeno positivo

Toxinas positiva

Antígeno negativa

Toxinas negativa

Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el laboratorio clínico. Parte I

Trabajo Individual

Cultivo bacteriológico de C. difficile: Medios selectivos y ricos

1. Sembrar en agar CCFA y en agar BAK la cepa de C. difficile que recibirá en un vial.

2. Rotular las placas de petri con el nombre, la fecha y el medio.

3. Incubar en jarras de anaerobiosis: incluir el sobre de anaerobiosis y el indicador redox.

4. Incubar las jarras bien cerradas por 48 horas a 35 °C, hasta el período 3.

PERÍODO 2: Martes 30 de septiembre

Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte I

Trabajo individual

Tratamiento con alcohol, inoculación en CCFA y caldo FAB

1. Dispense 1 ml de la muestra de heces líquida en tubos rotulados cónicos para centrifuga de 15 ml.

2. Si la muestra es semi-sólida, dispense 1 ml de una solución estéril de 0.05% de extracto de levadura en el vial de 2 ml en que se recibió la muestra. Luego, dispense 1 ml de la muestra de heces con extracto de levadura en tubos rotulados cónicos de 15 ml para centrifuga.

3. Si la muestra es totalmente sólida, dispense 0.5 ml (500 ul) de una solución estéril de 0.05% de extracto de levadura a tubos cónicos para centrifuga de 15 ml rotulados y con una torunda estéril, pasar un volumen igual de la muestra de heces sólida.

4. Agregar 1 ml de etanol al 96% a la suspensión de heces en los a los tubos cónicos de 15 ml.

5. Mezclar con el vortex vigorosamente y luego incubar a temperatura ambiente por 35 minutos.

6. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos.

7. Decantar el etanol en tubos de desecho. Este líquido descartado debe ser tratado como material biopeligroso.

8. Usando una torunda estéril inocular el sedimento en platos de agar CCFA y rayar con asas estériles para obtener colonias aisladas.

9. Incubar en jarra de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir la jarra en el período 4.y luego examinar los platos en busca de colonias sospechosas,

10. La torunda usada para inocular el agar introducirla en el caldo FAB e incubarlo por el mismo período de tiempo. Este medio funcionará como un respaldo en caso que el cultivo primario sea negativo (inocular el caldo FAB, cada 4 personas).

Diagnóstico molecular. Parte I

Trabajo en 4 – 6 grupos

Preparación de inóculo para extracción del ADN

1. A partir de los medios de cultivo con aislamientos de C. difficile de dos en un vial, inocular 0.2 ml en un caldo BHI pre-reducido.

2. Incubar por 24 horas a 35 °C. Utilizar en el período 3 para la extracción de ADN de los aislamientos de C. difficile.

PERÍODO 3: Miércoles 1 de octubre

Prueba de sensibilidad a los antibióticos en aislamientos clínicos. Parte I

Trabajo en 4 - 6 grupos

1. Abrir las jarras con las placas de BAK incubadas en el período 1.

2. En un tubo con caldo BHI hacer uno inóculo similar al estándar 3 de McFarland con el aislamiento de la placa de BAK.

3. Con ayuda de una torunda, distribuir el inóculo de la bacteria en tres direcciones en un placa de agar E-test.

4. Colocar una tira de E-test de clindamicina y otra de vancomicina, en sentidos contrarios, sobre la bacteria sembrada en el agar E-test.

5. Incubar las placas en jarras de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir hasta el período 5.

Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el laboratorio clínico. Parte II

Trabajo individual

1. Abrir las jarras con las placas de agar CCFA y BAK incubadas en el período 1.

2. Reconocer, describir e identificar la morfología macroscópica y colonial de C. difficile en agar selectivo CCFA y en el medio rico BAK.

3. A partir de los crecimientos en BAK, realizar una tinción de Gram y reconocer la morfología microscópica de C. difficile.

4. Subcultivar los aislamientos de C. difficile en placas de BAK.

5. Incubar en jarras de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir hasta el período 5.

Diagnóstico molecular. Parte II

Trabajo en grupos

Extracción del ADN de aislamientos clínicos de C. difficile

1. Rotular un tubo de microcentrifuga, estéril y libre de nucleasas de 1.5 ml.

2. Preparar un baño a 100 °C y otro a 56 °C. Puede ser de bloque seco o un baño maría.

3. Transferir 400 µl del cultivo en caldo de C. difficile con 8 a 12 horas de crecimiento (inoculados en el período 2) al tubo de microcentrifuga.

4. Centrifugar a 14.000 rpm por 2 minutos.

5. Aspirar el sobrenadante y descartarlo, con mucho cuidado de no causar alteraciones en el “pellet” de bacteria del centrifugado.

6. Resuspender el “pellet” de bacterias en 200 µl del reactivo de InstaGene Matrix (BioRad).

7. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.

8. Incubar el tubo por 15 minutos a 56 °C, en un baño seco o baño maría.

9. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.

10. Calentar la preparación a 100 °C en un baño maría o en agua hirviendo, por 8 minutos.

11. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.

12. Centrifugar a 14.000 rpm por 2 minutos para sedimentar la matriz del reactivo.

13. Usar 2 µL del sobrenadante para cualquier reacción de PCR con un volumen final de 25 µL.

14. Guardar el ADN a 4 °C.

PERÍODO 4: Jueves 2 de octubre

Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte II

Trabajo individual

Recuperación de aislamientos en CCFA y subcultivo en agar BAK

1. Abrir las jarras con CCFA y caldo FAB cultivadas con las muestras de heces en el período 2.

2. Reconocer, analizar e identificar las colonias sospechosas de C. difficile en agar CCFA.

3. Subcultivar una colonia sospechosa de C. difficile a partir del aislamiento primario de CCFA en agar BAK.

4. Si las placas de CCFA están negativas por C. difficile, entonces sembrar con asa bacteriológica el caldo FAB en otro CCFA.

5. Incubar el agar BAK y los posibles agar CCFA en jarra de anaerobiosis, a 35 °C por 48 horas. Abrir hasta el período 5.

PERÍODO 5: Viernes 3 de octubre

Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el laboratorio clínico. Parte III

Trabajo individual

Identificación presuntiva de cepas de C. difficile

1. Abrir las jarras incubadas en el período 3 con las placas de agar BAK.

2. Comprobar la emisión de fluorescencia al exponer los aislamientos en BAK ante la luz UV.

3. Realizar una tinción de Gram y reconocer la morfología microscópica de C. difficile.

4. Reconocer la morfología macroscópica de C. difficile en agar BAK.

5. Realizar la prueba de aglutinación en látex para la identificación de C. difficile.

Prueba de aglutinación en látex (C. difficile Test Kit, Oxoid®)

En esta prueba, las partículas de látex están sensibilizadas con anticuerpos IgG específicos para antígenos de la pared de C. difficile. Al mezclarse con un caldo de enriquecimiento o selectivo conteniendo el microorganismo o con una suspensión de colonias de C. difficile provenientes de un medio sólido, las partículas de látex se aglutinan y forman grandes aglomeraciones visibles en 2 minutos. Pocas veces, el kit puede dar falsos positivos. Por ejemplo, con otras especies como C. innocum y C. bifermentas.

1. Dejar que el C. difficile Test Kit® alcance la temperatura ambiente.

2. En una tarjeta reactiva del kit, añadir 1 gota solución isotónica salina 0.85%.

3. Con un palillo o asa de inoculación estéril emulsificar una colonia típica de C. difficile que provenga de agar BAK. en la solución salina estéril, hasta producir una suspensión espesa y uniforme

4. Añadir 1 gota del reactivo de látex sensibilizado (C. difficile latex reagent) al lado de la suspensión de la bacteria.

5. Mezclar el reactivo y la suspensión bacteriana con un palillo de madera estéril, extendiendo la mezcla sobre toda la superficie del pocillo de la tarjeta de reacción.

6. Agitar la tarjeta de reacción con lentos movimientos circulares por 2 minutos y examinar la aparición de aglutinación en ese plazo máximo.

Prueba de sensibilidad a los antibióticos en aislamientos clínicos. Parte II

Trabajo en grupos

1. Abrir las jarras incubadas en el período 3 con las placas de agar E-test.

2. Determinar la MIC (concentración mínima inhibitoria)para cada antibiótico y aislamiento utilizado. Esta es la concentración del antimicrobiano de la tira en donde se ha formado una zona de inhibición en forma elíptica alrededor de la tira de E-test.

Clindamcina (S ≤ 4 µg/ml / R≥ 8 µg/ml)

________________________________

Vancomicina

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Diagnóstico molecular. Parte III

Trabajo en grupos

PCR para la detección de genes de toxinas y tpi (identificación definitiva)

Estos PCRs para C. difficile se conforman de dos multiplex (MP) separados: el MPI que detecta los genestcdA, tcdBy cdtB y el MPII que detecta los genestcdCy tpi.

1. Las mezclas separadas de los multiplex PCR deberán estar conformados así:

MP I

MP II

Componente

Volumen (µl)

Componente

Volumen (µl)

Master Mix 2X

12.5

Master Mix 2X

12.5

cdtB F1/R1 (10 µM)

0.75

tpi F/R(10 µM)

0.5

tcdA F/R-A3B (10 µM)

0.75

Pal F15/R16 (10 µM)

0.5

tcdB F3/R4 (10 µM)

0.75

Agua PCR

8.5

Agua PCR

9.5

ADN

2.0

ADN

2.00

Características de primers utilizados

Nombre del Primer

Gen

Tamaño del producto

Descripción

cdtB F1/R1

cdtB

582 bp

Subunidad B de la toxina binaria

tcdA F/R-A3B

tcdA

420 o 150 bp

Toxina A

tcdB F3/R4

tcdB

329 bp

Toxina B

tpi F/R

tpi

230 bp

Triosa-fosfato isomerasa específica de

C. difficile

Pal F15/R16

tcdC

673 bp

(posible deleción)

Regulador negativo del PaLoc

2. Se recibirán tubos de PCR con la mezcla de los primers para MPI y MPII ya diluidos en agua para PCR.

3. Agitar vigorosamente el ADN extraído en el período 3 y centrifugar a 14.00 rpm por 2 minutos.

4. Agregar 2 µl de ADN a los tubos de MPI y MPII de cada uno de los ADN extraídos, y por separado de los ADN control (cepa NAP1, NAP7 y una cepa A-B+).

5. Agregar 12.5 µl del master mix a cada tubo y así obtener un volumen final de reacción de 25 µl.

6. Dejar reposar por 2 minutos los tubos de reacción de PCR y transferirlos a un termociclador con las siguientes condiciones:

A. 1 ciclo a 95 °C por 15 minutos

B. 30 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 57 °C por 90 segundos y 72 °C por 60 segundos

C. 1 ciclo de extensión final a 72 °C por 7 minutos

D. Dejar a 4 °C.

PERÍODO 6: Sábado 4 de octubre

Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte III

Trabajo en grupos

Identificación definitiva por métodos bioquímicos (Rap ID 32A)

1. Abrir las jarras con los aislamientos subcultivos en agar BAK del período 4.

2. Abrir una ampolla de API Suspension Medium de 2 ml.

3. Con la ayuda de una torunda preparar una suspensión igual al 3 de McFarland a partir del cultivo de BAK.

4. Homogenizar la ampolla e inocular en cada pocillo de la galería 55 µl por cúpula de la prueba de RapID 32A.

5. Recubrir el test URE con 2 gotas de aceite mineral.

6. Poner la tapa sobre la galería.

7. Incubar a 35 °C por 4 h, en aerobiosis.

8. Revelar las reacciones de la fila 0 añadiendo 1 gota de NIT1 y NIT2 para la cúpula NIT, 1 gota de James para la cúpula IND y 1 gota de FB para las pruebas de PAL a SerA.

9. Refiérase a la base de datos del RapID 32 A para interpretación e identificación final.

Diagnóstico molecular. Parte IV

Trabajo en grupos

Electroforesis e interpretación del PCR

1. Preparar dos geles de 1.5% de agarosa en buffer TBE al 0.5X con el reactivo de tinción del ADN (GelRed, sustituto de bromuro de etidio).

2. Chorrear el gel en la cámara de electroforesis para ADN con el peine correspondiente y esperar que se gelifique. Un gel será para el MPI y otro para el MPII.

3. Cargar en los pocillos extremos de las muestras un GeneRuler (GR) de 50 bp, seguido de los amplicones del ADN control:

GR – NAP1 – Toxina A- Toxina B+ - NAP7 – Muestras -NAP1 -Toxina A- Toxina B+ - NAP7 – GR

4. Correr una electroforesis a 100V por 90 min

5.Visualizar en un capturador de imágenes de geles al exponerlo a luz UV.

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MANUAL DE LABORATORIO

Dr. Carlos Quesada Gómez (CQ) | Dra. Evelyn Rodríguez Cavallini (ER) | Dipl. Robin Cárdenas Mora (RC)

Laboratorio de Investigación en Bacteriología Anaerobia, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica